KR100873353B1

KR100873353B1 - 작물 생육촉진 미생물 불크홀데리아 세파시아 ｓｅ－４ 및이를 이용한 지베렐린의 제조방법

Info

Publication number: KR100873353B1
Application number: KR1020070034118A
Authority: KR
Inventors: 주길재; 강상모; 김상국; 이인중
Original assignee: 경북대학교 산학협력단
Priority date: 2007-04-06
Filing date: 2007-04-06
Publication date: 2008-12-10
Also published as: KR20080090803A

Abstract

본 발명은 작물생육촉진 호르몬인 지베렐린을 생산하는 신규 미생물인 불크홀데리아 세파시아 SE-4 및 이를 배양하는 것을 특징으로 하는 지베렐린(GA)의 제조방법에 관한 것이다.

본 발명에 따른 불크홀데리아 세파시아 SE-4 균주는 GA₃, GA₄, GA₉, GA₂₀ 및 GA₂₄등의 지베렐린을 생성할 수 있고, 상기 지베렐린 생성 균주로 작물의 묘를 처리할 경우, 작물의 생장이 현저하게 촉진되는 효과가 있다.

지베렐린, 작물성장 호르몬, 불크홀데리아 세파시아

Description

작물 생육촉진 미생물 불크홀데리아 세파시아 ＳＥ－４ 및 이를 이용한 지베렐린의 제조방법{Novel Burkholderia cepacia SE-4 and Method for Preparing a Gibberellin Using the Same}

본 발명은 작물생육촉진 호르몬인 지베렐린을 생산하는 신규 미생물인 불크홀데리아 세파시아 (Burkholderia cepacia) SE-4 및 이를 배양하는 것을 특징으로 하는 지베렐린의 제조방법에 관한 것이다.

미생물이 생산하는 작물호르몬으로는 오옥신(auxin, Indoleacetic acid, IAA), 지베렐린(gibberellin, GA), 사이토키닌(cytokinin), 에틸렌(ethylene) 등이 보고되어 있고, 어떤 질소 고정균은 오옥신, 지베렐린, 사이토키닌을 모두 생성한다는 보고가 있으며, Barea 등(J. Appl Bacteriol. 40:129-34. 1976)은 여러 작물의 근권에서 분리한 50종의 미생물에서 각각 86%, 58%, 및 90%가 오옥신, 지베렐린, 사이토키닌을 생성한다고 보고하였다.

특히 지베렐린(GA)을 생산하는 곰팡이류는 지베렐라 푸지쿠로이(Gibbrella fugikuroi), 패오스페리아 속(Phaeospheria sp. L489), 스파세로마 비덴티스(Sphaceloma bidentis), 스파세로마 마니히티코라(Sphaceloma manihiticola), 스 파세로마 멘테아(Sphaceloma menthea), 스파세로마 퍼세아(Sphaceloma perseae), 스파세로마 로이스(Sphaceloma rhois), 푸사리움 프로리퍼라툼 (Fusarium proliferatum) 등 8종이며, 세균류는 불크홀데리아 세파시아 (Acetobacter diazotropicus), 아조토스피리룸 리포페륨(Azotospirillum lipoferum), 아조토스피리룸 브라시렌스(Azotospirillum brasilense), 바실러스 리케니피미스(Bacillus lichenifirmis), 바실러스 푸미러스(Bacillus pumilus), 헤르보스피리룸 세로페디카(Herbospirillum seropedicae), 리조비움 파세오리(Rhizobium phaseoli), 바실러스 시리우스(Bacillus cereus), 바실러스 마크로이더스(Bacillus microides) 등 9종이 지금까지 보고되었다.

지금까지 128종의 고등작물, 8종의 곰팡이 및 9종의 세균으로부터 126종의 지베렐린(GA)들이 발견되었다.

현재까지 우리나라에서는 PGPR이 생산하는 지베렐린에 의한 작물의 생육촉진에 관한 연구가 조금씩 진행되고 있는 실정이나, 외국에서는 미생물로부터 GA 생산에 관한 연구가 많이 진행되어 왔다.

지금까지 곰팡이로부터 분리된 GAs로 GA_1-4, GA₇, GA_9-16, GA₂₀, GA_24-25, GA_36-37, GA_40-42, GA₄₇, GA_54-57, GA₇₈, GA₈₂ 등 28종과 세균으로부터 분리된 GAs로 GA₁, GA₃, GA₄, GA₂₀등 4종 등이 보고되어 있다.

아조토스피리룸 리포페륨(Azotospirillum lipoferum), 아조토스피리룸 브라시렌스(Azotospirillum brasilense) 등은 GA₁및 GA₃을 생산하며, 바실러스 리케니 피미스(Bacillus lichenifirmis), 바실러스 푸미러스(Bacillus pumilus)는 GA₁, GA₃, GA₄ 및 GA₂₀을 생산하며, 헤르보스피리룸 세로페디카(Herbospirillum seropedicae)는 GA₃을 생산하며, 리조비움 파세오리(Rhizobium phaseoli)는 GA₁및 GA₄를 생산하는 것으로 보고되었다.

본 발명자에 의하여 2001년 바실러스 시리우스(Bacillus cereus), 바실러스 마크로이더스(Bacillus microides), 바실러스 푸밀러스(Bacillus pumilus) 등의 고초균에서 GA _1, GA _3, GA _4, GA _5, GA _7, GA _9, GA _12, GA _19, GA _20, GA _24, GA _34, GA _36, GA _44, 및 GA ₅₃ 등의 지베렐린을 생산하는 것이 보고되었다.

그러나 아직 불크홀데리아 세파시아 (Burkholderia cepacia)에서 지베렐린을 생산하는 보고는 없는 상황이다.

이에 본 발명에서는 신규 미생물 불크홀데리아 세파시아 (Burkholderia cepacia) SE-4가 지베렐린을 생산하고, 또한 상기 불크홀데리아 세파시아 SE-4가 오이 플러그묘의 생육을 촉진시키는 것을 확인한 것이다.

본 발명의 목적은 작물호르몬 지베렐린을 생산하는 불크홀데리아 세파시아 및 상기 균주를 배양하는 것을 특징으로 하는 지베렐린의 제조방법을 제공하는 데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 작물호르몬 지베렐린을 생산하는 불크홀데리아 세파시아 (Burkholderia cepacia) SE-4 (KCTC 11095BP)을 제공한다.

또한 본 발명은 상기 미생물을 배양하는 것을 특징으로 하는 지베렐린의 제조방법을 제공한다. 본 발명에 있어서, 상기 지베렐린은 GA₃, GA₄, GA₉, GA₂₀ 및 GA₂₄등으로 구성된 군에서 선택된 어느 하나를 특징으로 할 수 있다.

본 발명은 상기의 미생물로 작물의 묘를 처리하는 것을 특징으로 하는 작물의 생육촉진방법을 제공한다.

상기 작물생육 촉진 미생물(PGPR)인 불크홀데리아 세파시아(Burkholderia cepacia) SE-4 균주는 2007년 3월 21일자로 부다페스트 조약에 따른 국제기탁기관인 한국과학기술원 생명공학연구소 내 유전자은행 (Korea Collection for Type Cultures, Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology)에 기탁번호 KCTC 11092BP로 기탁되었다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: 불크홀데리아 세파시아 ( Burkholderia cepacia ) SE-4 균주의 동정

불크홀데리아 세파시아 (Burkholderia cepacia) SE-4 균주는 본 발명의 연 구자들이 작물생육 촉진 미생물 선별과정 실험에서 토양으로부터 분리하였다.

SE-4 균주는 16S rDNA 염기서열 분석방법(16S rDNA sequence method)으로 SE-370 균주의 염색체 DNA를 추출한 후, 27f 프라이머(5'- AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG -3'; 서열 1)와 1492r 프라이머(5'- TAC CTT GTT ACG ACT T -3'; 서열 2)를 이용하여 PCR 산물을 얻고, 상기 PCR 산물의 염기서열의 상동성을 ribosomal database에서 검색하여 동정하였다.

SE-4 균주의 16S rDNA(923bp) 염기서열(서열 3)에 대한 ribosomal database에서의 상동성 검색 결과, 표 1에서와 같이 불크홀데리아 세파시아 (Burkholderia cepacia)와 82.9%의 유사도를 나타내었기에 불크홀데리아 세파시아 (Burkholderia cepacia)로 동정하고, 불크홀데리아 세파시아 (Burkholderia cepacia) SE-4이라 명명하였다.

SE-4 균주의 16S rDNA 염기서열 결정에 의한 동정 자료

SE-4 균주의 16S rDNA의 염기서열 (923 bp); 서열 3
GGTCTACCGTTTGAAATATTTTTGCGGTTCTCGCGCCCAGGTCTGGTC ACCGCCTATTCAATTCGAGGACTCCAGCGTCCATATCCACGAGCGTGGAC GTCTCGGGTAGCGATGNGGATAAGAAATGAATCCCGCACCATTAATTGGA GTCGAATAGGGTTTATTTCNGAGTTTTTATTNGGCTCAGATTGAACGCTG GCGGCATGCCTTACACATGCAAGTCGAACGGCAGCACGGGTGCTTGCACC TGGTGGCGAGTGGCGAACGGGTGAGTAATACATCGGAACATGTCCTGTAG TGGGGGATAGCCCGGCGAAAGCCGGATTAATACCGCATACGATCTACGGA TGAAAGCGGGGGACCTTCGGGCCTCGCGCTATAGGGTTGGCCGATGGCTG ATTAGCTAGTTGGTGGGGTAAAGGCCTACCAAGGCGACGATCAGTAGCTG GTCTGAGAGGACGACCAGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCC TACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATTTTGGACAATGGGCGAAAGCCTGATCC AGCAATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGCACTTTTGT CCGGAAAGAAATCCTTGGTTCTAATATAGCCGGGGGATGACGGTACCGGA AGAATAAGCACCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGG TGCGAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGTGCGCAGGCGGTTTG CTAAGACCGATGTGAAATCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCATTGGTGA CTGGCAGGCTAGAGTATGGCAGAGGGGGGTAGAATTCCACGTGTAGCAGT GAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAATACCGATGGCGAAGGCAGCCCCCTGG GCCAATACTGACGCTCATGCACGAA
동정된 균주명	유사도
Burkholderia cepacia	82.9%

실시예 2: 불크홀데리아 세파시아 SE-4 균주의 배양조건

불크홀데리아 세파시아 SE-4 균주는 GY배지(glucose 1g, yeast extract 2.5g, peptone 5g, agar 15g, NaCl 0.5g, 증류수 1ℓ, pH 7.0)에서 35~37℃로 3일간 진탕배양하였다. 배양액은 지베렐린 분석에 사용하였으며, 오이 생육촉진효과 검정에는 배양한 균체를 원심분리하여 집균하고, 이를 0.1M 인산완충액(pH 7.0)으로 현탁하여 균체수가 10⁹ CFU/ml되게 하여 상토에 처리하였다.

실시예 3: 오이 플러그묘의 생육 촉진 효과

공시작물로는 오이 (Cucumber Cucumis sativus L., Seminis Korea Co., 조은백다다기)를 사용하였으며, 종자를 17~20℃ 물에 12시간 침종한 후 젖은 수건을 이용 28~30℃ 항온실에서 2일간 발아하여 스티로폼 상자 (20 x 30 x 15 cm)에 상토(참흙 50%, 부엽토 30%, 강모래 20%)를 2/3 가량 넣고 수분을 충분히 공급한 후 파종하고 모래로 복토 후 비닐을 덮고 23~27℃ 항온실에서 재배하였다. 파종 30일 후 본엽이 3~4매 때 36구 tray에 이식 (흥농종묘(주) 바이오 상토 이용)하고 충분히 관수하고 밀폐된 육묘장에서 보온 재배하였다.

불크홀데리아 세파시아 SE-4 균주 배양액 (미생물수 2.0 x 10⁸cfu/㎖ 이상)은 원심분리하고 균체를 동일량의 살균수에 현탁하여 36구 tray 당 각각의 미생물 배양액 36㎖를 이식한 오이 유묘에 처리하였다. 육묘관리는 가온 비닐하우스 플러그묘 육묘장(구미시 소재)에서 낮온도 22~25℃, 밤온도 16~22℃로 67일간 재배한 후 플러그묘 초장, 엽수, 경경, 뿌리길이, 생체중 등을 조사하였다.

불크홀데리아 세파시아 SE-4 균주는 표 2에서와 같이 10일 재배후 전체 식물의 길이가 미생물 무처리구에 비해 높게 나타났으며, 뿌리의 길이는 197.7% 이상 증가하는 경향을 나타내었다. 그러나 엽수나 경경은 차이가 거의 없었다. 불크홀데리아 세파시아 SE-4를 처리하여 생산한 오이 플러그묘는 SE-4를 처리하지 않은 대조구에 비해 전체길이는 65.2%, 지상부는 32.4%, 뿌리길이는 197.7%, 생체중은 50.6%, 건물중은 25.0% 증가하였다.

작물생육 촉진 미생물 불크홀데리아 세파시아 SE-4 균주에 의한 오이 플러그묘의 생육촉진 효과

미생물 처리	식물전체 길이(㎝)	지상부 길이(cm)	뿌리길이 (㎝)	건물중 (g/plant)	생체중 (g/plant)
불크홀데리아 세파시아 SE-4 처리구	43.54^*	21.29	20.29	0.30	4.94
무처리구	26.34	16.08	10.26	0.24	2.28

^*: 36구 오이 개체 평균값, 10일 재배

실시예 4: 불크홀데리아 세파시아 SE-4 균주가 생산하는 지베렐린의 분석

불크홀데리아 세파시아 SE-4 균주가 생산하는 지베렐린 추출은 Foster와 Morgan(Plant Physiol. 108: 337-343, 1995) 및 Lee(Plant Growth Regul. 17:185-195, 1988) 등의 방법에 따라 HPLC로 분획하여 GC/MS SIM으로 분석하였다.

내부 표준물질로는 [17.17-²H₂]로 라벨된 지베렐린 [17.17-²H₂] GA₁, GA₃, GA₄, GA₅, GA₇, GA₈, GA₉, GA₁₂, GA₁₅, GA₁₉, GA₂₀, GA₂₄, GA₃₄, GA₃₆, GA₄₄ 및 GA₅₃을 각각 20ng씩 첨가하였다.

표 3은 불크홀데리아 세파시아 SE-4 균주가 생산하는 지베렐린을 분석하기 위하여, 먼저 내부표준물질을 이용하여 지베렐린 함유 구간의 HPLC 분획을 분류하고, 지베렐린 각각의 GC/MS KRI값(Kovats retention index)과 mass spectrum(m/z)을 조사하였다.

표 4는 불크홀데리아 세파시아 SE-4 균주 배양액 200㎖ 내에 존재하는 GA의 종류를 조사한 결과, GA₃, GA₄, GA₉, GA₂₀ 및 GA₂₄등이 존재하였으며, 각각의 지베렐린 함량은 GA₃이 8.63ng,, GA₄가 9.31ng, GA₉가 0.64g, GA₂₀이 1.08ng 및 GA₂₄가 2.27ng 존재하였다.

지금까지 곰팡이로부터 분리된 GAs는 GA_1-4, GA₇, GA_9-16, GA₂₀, GA_24-25, GA_36-37, GA_40-42, GA₄₇, GA_54-57, GA₇₈, GA₈₂ 등 28종이며, 세균으로부터 분리된 GAs는 GA₁, GA₃, GA₄, GA₂₀등 4종으로 보고되어 있다.

또한 GA를 생산하는 세균으로 아세토박터 디아조트로피쿠스 (Acetobacter diazotropicus), 아조토스피리룸 리포페륨(Azotospirillum lipoferum), 아조토스피리룸 브라시렌스(Azotospirillum brasilense), 바실러스 리케니피미스(Bacillus lichenifirmis), 바실러스 푸미러스(Bacillus pumilus), 헤르보스피리룸 세로페디카(Herbospirillum seropedicae), 리조비움 파세오리(Rhizobium phaseoli), 바실러스 시리우스(Bacillus cereus), 바실러스 마크로이더스(Bacillus microides) 등 9종이 보고되었으나, 본 발명에서 신규 미생물 불크홀데리아 세파시아 (Acenetobacter calcoaceticus)가 지베렐린을 생산한다는 것을 확인하였다.

불크홀데리아 세파시아 SE-4 균주 배양액의 지베렐린 분석을 위한 HPLC 분획 및 GC/MS 분석에서의 KRI 값과 mass sperum 비교

Fraction no. in HPLC	GAs identified	KRI^a	m/z(%, relative intensity of base peak)^b
13∼15	GA₁	2674	Sample Standard	506(100) 508(100)	448(20) 450(17)	313(17) 315(15)
13∼15	GA₃	2692	Sample Standard	504(100) 506(100)	208(45) 210(42)	347(10) 349(8)
34∼35	GA₄	2506	Sample Standard	284(100) 286(100)	225(80) 227(78)	289(70) 291(66)
21∼23	GA₅	2477	Sample Standard	416(100) 418(100)	299(25) 301(22)	401(18) 403(16)
34∼35	GA₇	2525	Sample Standard	222(100) 224(100)	223(93) 225(80)	356(66) 356(54)
7∼8	GA₈	2818	Sample Standard	594(100) 596(100)	238(28) 240(28)	448(25) 450(24)
37∼38	GA₉	2305	Sample Standard	298(100) 300(100)	270(78) 272(77)	227(48) 229(50)
42∼44	GA₁₂	2335	Sample Standard	300(100) 302(100)	240(31) 242(28)	328(21) 330(20)
39∼40	GA₁₅	2608	Sample Standard	239(100) 241(100)	284(50) 286(45)	344(23) 346(21)
30∼31	GA₁₉	2600	Sample Standard	434(100) 436(100)	374(59) 376(57)	402(41) 404(40)
25∼26	GA₂₀	2485	Sample Standard	418(100) 420(100)	375(45) 377(40)	403(14) 405(13)
36∼37	GA₂₄	2444	Sample Standard	314(100) 316(100)	226(89) 228(85)	286(77) 288(76)
32∼33	GA₃₄	2665	Sample Standard	506(100) 508(100)	217(22) 219(21)	229(12) 231(10)
28∼29	GA₃₆	2600	Sample Standard	284(100) 286(100)	430(58) 432(56)	312(47) 314(45)
30∼31	GA₄₄	2789	Sample Standard	207(100) 209(100)	432(63) 434(61)	238(41) 240(40)
36∼37	GA₅₃	2450	Sample Standard	448(47) 450(47)	251(30) 253(26)	235(30) 237(26)

^aKRI, Kovats retention index. ^bIdentified as methyl ester trimethylsilyl ether derivatives by comparison with reference spectra and KRI data (Gaskin and MacMillan, 1991).

불크홀데리아 세파시아 SE-4 균주가 생산하는 지베렐린의 종류 및 생산량

GA의 종류	생산량 (ng/배양액 200ml)
GA₁	ND
GA₃	8.63
GA₄	9.31
GA₇	ND
GA₉	0.64
GA₂₀	1.08
GA₂₄	2.27
Total	21.93

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

본 발명은 작물호르몬 지베렐린을 생산하는 불크홀데리아 세파시아 SE-4 균주 및 이를 배양하는 것을 특징으로 하는 지베렐린의 제조방법을 제공하는 효과가 있다.

본 발명에 따른 불크홀데리아 세파시아 SE-4 균주는 GA₃, GA₄, GA₉, GA₂₀ 및 GA₂₄등의 지베렐린을 생성할 수 있고, 상기 지베렐린 생성 균주로 오이의 유묘를 처리할 경우, 작물의 생장이 현저하게 촉진되는 효과가 있다.

<110> Kyungpook National University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> Novel Burkholderia cepacia SE-4 and Method for Preparing a Gibberellin Using the Same <130> KCTC 11092BP <160> 3 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR Primer <400> 1 agagtttgat cctggctcag 20 <210> 2 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR Primer <400> 2 taccttgtta cgactt 16 <210> 3 <211> 923 <212> DNA <213> Burkholderia cepacia <400> 3 ggtctaccgt ttgaaatatt tttgcggttc tcgcgcccag gtctggtcac cgcctattca 60 attcgaggac tccagcgtcc atatccacga gcgtggacgt ctcgggtagc gatgnggata 120 agaaatgaat cccgcaccat taattggagt cgaatagggt ttatttcnga gtttttattn 180 ggctcagatt gaacgctggc ggcatgcctt acacatgcaa gtcgaacggc agcacgggtg 240 cttgcacctg gtggcgagtg gcgaacgggt gagtaataca tcggaacatg tcctgtagtg 300 ggggatagcc cggcgaaagc cggattaata ccgcatacga tctacggatg aaagcggggg 360 accttcgggc ctcgcgctat agggttggcc gatggctgat tagctagttg gtggggtaaa 420 ggcctaccaa ggcgacgatc agtagctggt ctgagaggac gaccagccac actgggactg 480 agacacggcc cagactccta cgggaggcag cagtggggaa ttttggacaa tgggcgaaag 540 cctgatccag caatgccgcg tgtgtgaaga aggccttcgg gttgtaaagc acttttgtcc 600 ggaaagaaat ccttggttct aatatagccg ggggatgacg gtaccggaag aataagcacc 660 ggctaactac gtgccagcag ccgcggtaat acgtagggtg cgagcgttaa tcggaattac 720 tgggcgtaaa gcgtgcgcag gcggtttgct aagaccgatg tgaaatcccc gggctcaacc 780 tgggaactgc attggtgact ggcaggctag agtatggcag aggggggtag aattccacgt 840 gtagcagtga aatgcgtaga gatgtggagg aataccgatg gcgaaggcag ccccctgggc 900 caatactgac gctcatgcac gaa 923

Claims

작물호르몬 지베렐린을 생산하는 작물 생육촉진 미생물 불크홀데리아 세파시아 (Burkholderia cepacia) SE-4 (KCTC 11092BP).
불크홀데리아 세파시아 (Burkholderia cepacia) SE-4 균주를 배양하는 것을 특징으로 하는 불크홀데리아 세파시아 SE-4를 이용한 지베렐린의 제조방법.
제2항에 있어서,

지베렐린은 GA₃, GA₄, GA₉, GA₂₀ 및 GA₂₄으로 구성된 군에서 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 불크홀데리아 세파시아 SE-4를 이용한 지베렐린의 제조방법.