KR100868883B1 - Detection of Neuroblastoma Cell - Google Patents
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Abstract
본 발명은 (a) 생물학적 시료에서 총 RNA를 수득하는 단계; (b) 상기 총 RNA를 사용하여 cDNA를 수득하는 단계; (c) 상기 cDNA 상의 타이로신 하이드록실아제(tyrosine hydroxylase: TH)-코딩 뉴클레오타이드 타깃 서열에 혼성화 되는 1종의 프라이머쌍 및 2종의 프로브를 사용하여 실시간(real time) PCR을 수행하는 단계로서, 상기 2종의 프로브는 상기 프라이머쌍이 혼성화 되는 상기 타깃 서열의 내부 서열에 혼성화되며, 상기 2종의 프로브 각각은 형광 공명 에너지 전이쌍으로 표지되어 있으며; 및 (d) 상기 단계 (c)의 PCR 반응 결과물을 분석하는 단계를 포함하는 신경모세포종 세포의 검출방법, 그리고 이에 이용되는 키트에 관한 것이다. 본 발명에 따르면, 높은 민감도[약 1 신경세포종 세포/105 PBMC(peripheral blood mononuclear cell)] 및 특이도(약 100%)로 환자의 말초혈액 또는 골수혈액 내에 존재하는 미세 잔존 신경모세포종을 검출할 수 있으며, 이에 최종 치료 결정 시기 및 재발의 조기 발견 등에 대한 유용한 임상적 정보를 얻을 수 있다.The present invention comprises the steps of (a) obtaining total RNA from a biological sample; (b) obtaining cDNA using the total RNA; (c) performing real time PCR using one primer pair and two probes hybridized to a tyrosine hydroxylase (TH) -coding nucleotide target sequence on the cDNA, wherein Two probes hybridize to an internal sequence of the target sequence to which the primer pair hybridizes, each of the two probes labeled with a fluorescence resonance energy transfer pair; And (d) relates to a method for detecting neuroblastoma cells comprising the step of analyzing the PCR reaction product of step (c), and the kit used therein. According to the present invention, it is possible to detect microscopic residual neuroblastoma present in peripheral blood or bone marrow blood of a patient with high sensitivity [about 1 neurocytoma cell / 10 5 PBMC (peripheral blood mononuclear cell)] and specificity (about 100%). This may provide useful clinical information about the timing of the final treatment decision and early detection of recurrence.
신경모세포종, PCR, 실시간 PCR, 프라이머, 프로브 Neuroblastoma, PCR, Real-Time PCR, Primers, Probes
Description
도 1은 TH(tyrosine hydroxylase) 유전자 지도 및 TH 프라이머 세트의 위치를 보여주는 모식도이다.1 is a schematic diagram showing the location of a tyrosine hydroxylase (TH) gene map and a set of TH primers.
도 2는 네스티드 PCR 방법의 민감도 시험 결과를 보여주는 젤 사진이다.Figure 2 is a gel photograph showing the results of the sensitivity test of the nested PCR method.
도 3은 네스티드 PCR 방법의 특이도 시험 결과를 보여주는 젤 사진이다.Figure 3 is a gel photograph showing the specificity test results of the nested PCR method.
도 4는 TH 및 DBH(dopamine β-hydroxylase)에 대한 특이도 시험 결과를 보여주는 젤 사진이다.4 is a gel photograph showing the results of specificity test for TH and dopamine β-hydroxylase (DBH).
도 5는 발현된 TH 유전자를 SYBR Green 실시간 PCR 방법에 의해 검출한 결과를 보여주는 그래프이다. 주형으로써 IMR 32 세포주의 cDNA를 이용하였다.5 is a graph showing the result of detecting the expressed TH gene by the SYBR Green real-time PCR method. As a template, cDNA of the
도 6은 발현된 DBH 유전자를 SYBR Green 실시간 PCR 방법에 의해 검출한 결과를 보여주는 그래프이다. 주형으로써 IMR 32 세포주의 cDNA를 이용하였다.6 is a graph showing the results of detecting the expressed DBH gene by the SYBR Green real-time PCR method. As a template, cDNA of the
도 7은 SYBR Green 실시간 PCR 방법의 TH 및 DBH 유전자에 대한 민감도 시험 결과를 보여주는 그래프이다.Figure 7 is a graph showing the sensitivity test results for the TH and DBH gene of the SYBR Green real-time PCR method.
도 8은 SYBR Green 실시간 PCR 방법의 TH 유전자에 대한 특이도 시험 결과를 보여주는 그래프이다.8 is a graph showing the specificity test results for the TH gene of the SYBR Green real-time PCR method.
도 9는 Taqman 프로브 실시간 PCR 방법에 이용되는 프라이머 및 프로브 세트의 위치를 보여주는 모식도이다.9 is a schematic diagram showing the positions of primers and probe sets used in the Taqman probe real-time PCR method.
도 10은 Taqman 프로브 실시간 PCR 방법에서 PCR 조건을 확립하기 위한, 어닐링 온도 시험(패널 a), 프라이머 농도 시험(패널 b) 및 주형 농도 시험(패널 c)의 결과를 보여주는 그래프이다.FIG. 10 is a graph showing the results of annealing temperature test (panel a), primer concentration test (panel b) and template concentration test (panel c) to establish PCR conditions in Taqman probe real-time PCR method.
도 11은 Taqman 프로브 실시간 PCR 방법의 민감도 시험 결과를 보여주는 그래프이다. 그래프에서 GAPDH amplification은 대조군으로 이용된 GAPDH(Glyseraldehyde-3-phosphate dehydrogenase) 유전자의 증폭 결과를 보여준다.11 is a graph showing the sensitivity test results of the Taqman probe real-time PCR method. GAPDH amplification in the graph shows the result of amplification of the Glyseraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) gene used as a control.
도 12는 본 발명의 혼성화 프로브 실시간 PCR 방법에서 어닐링 온도에 따른 TH 유전자의 증폭 결과를 보여주는 그래프이다.12 is a graph showing the amplification result of TH gene according to the annealing temperature in the hybridization probe real-time PCR method of the present invention.
도 13은 본 발명의 혼성화 프로브 실시간 PCR 방법에서 프라이머 농도에 따른 TH 유전자의 증폭 결과를 보여주는 그래프이다.Figure 13 is a graph showing the result of amplification of TH gene according to the primer concentration in the hybridization probe real-time PCR method of the present invention.
도 14는 본 발명의 혼성화 프로브 실시간 PCR 방법에서 MgCl2 농도에 따른 TH 유전자의 증폭 결과를 보여주는 그래프이다.14 is a graph showing the result of amplification of TH gene according to MgCl 2 concentration in the hybridization probe real-time PCR method of the present invention.
도 15는 본 발명의 혼성화 프로브 실시간 PCR 방법의 민감도 시험(패널 a) 및 특이도 시험(패널 b)의 결과를 보여주는 그래프이다. GAPDH는 대조군으로 이용된 GAPDH(Glyseraldehyde-3-phosphate dehydrogenase) 유전자의 증폭 결과를 보여준다.15 is a graph showing the results of a sensitivity test (panel a) and specificity test (panel b) of the hybridization probe real-time PCR method of the present invention. GAPDH shows the result of amplification of the Glyseraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) gene used as a control.
도 16은 본 발명의 혼성화 프로브 실시간 PCR 방법에서 이용되는 프라이머 및 프로브의 위치를 보여주는 모식도이다.16 is a schematic diagram showing the positions of the primers and probes used in the hybridization probe real-time PCR method of the present invention.
본 발명은 신경모세포종에 대한 골수 내 잔존 세포종(minimal residual neuroblastoma)을 검출하기 위한 방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 잔존 세포종의 존재여부를 파악할 수 있는 타이로신 하이드록실아제(tyrosine hydroxylase: TH)를 검출하는 방법 및 상기 방법에 사용되는 키트에 관한 것이다. The present invention relates to a method for detecting minimal residual neuroblastoma in neuroblastoma, and more specifically, detects tyrosine hydroxylase (TH), which can determine the presence of residual cell tumor. And a kit used in the method.
신경모세포종은 주로 소아에서 발병하며, 부신 수질 또는 교감신경절이 있는 부위에서 발생하는 미분화 종양이다. 신경모세포종은 영아기(1세미만)에서 발생하는 종양 중 가장 빈발하는 종양으로서 연령별로는 0-4세 범위가 가장 많으며, 나이가 많아지면서 그 빈도는 감소하는 경향이 있으며, 남녀 비율이 1.3:2인 것으로 보고 되어 있다. 신경모세포종의 원인은 아직 분명히 알려진 것은 없으나, 지금까지 밝혀진 바에 의하면 1번 염색체 단완의 결실 혹은 2번 염색체 단완에 존재하는 N-myc 유전자 부분의 증폭 등과 연관될 수 있다는 보고가 있고, 태아가 하이단토인, 페노바비탈과 같은 항경련제나 알코올에 노출되면 상기 종양의 발생 위험이 커진다고 알려져 있다.Neuroblastoma mainly occurs in children and is an undifferentiated tumor that develops at the site of the adrenal medulla or sympathetic ganglia. Neuroblastoma is the most frequent tumor in infancy (less than 1 year old), and the most common age ranges from 0 to 4 years, and the frequency tends to decrease with age. It is reported to be. The cause of neuroblastoma is not yet known, but it has been reported to be related to the deletion of
신경모세포종의 진단은 70% 정도가 주로 복부에 발생하기 때문에 촉진으로 진단되는 경우가 많으나, 기본적으로 엑스레이 검사, 컴퓨터 단층촬영, 골수천자, 소변검사, 혈청검사 및 조직검사 등이 실시된다. 또한 진단이 된 후에는 전이 여부를 판단하기 위하여 골수검사나 방사선 동위원소 촬영 등을 실시하게 된다. 근래에는 신경모세포에만 선택적으로 흡착되는 방사선 동위원소를 이용한 MIBG 촬영을 시행하기도 한다.Neuroblastoma is usually diagnosed as palpation because about 70% occurs in the abdomen. Basically, X-ray examination, computed tomography, bone marrow puncture, urinalysis, serum test, and biopsy are performed. In addition, after diagnosis, bone marrow examination or radioisotope is performed to determine metastasis. Recently, MIBG imaging using radioisotopes, which are selectively adsorbed only to neuroblasts, has been performed.
신경모세포종의 치료는 환자의 연령과 병기에 따라 다르므로 정확한 병기 분류따라 시술하며, 저 위험군에서는 수술과 보조 요법만으로 그리고 중간 위험군이나 고위험군에서는 화학요법, 수술, 방사선요법 등을 하게 된다. 전이 범위가 넓을 경우에는 우선 화학 요법으로 세포 감소를 유발토록 한 후 수술을 시행하고, 수술로 완전히 제거하지 못한 종양이나 화학요법에 충분히 반응하지 않은 종양, 신경증상이나 동통이 심한 경우에는 방사선 치료를 하게 된다. 화학요법에 사용되는 항암제로는 사이클로포스파미드(cyclophosphamide), 시스플라틴(cisplatin), 카보플라틴(carboplatin), 독소루비신(doxorubicin), 에토포사이드(etoposide), 이포스파미드(ifosfamide), 빈크라이스틴(vincristine) 등이 사용되고 있으며, 근래에는 고위험군의 신경모세포종인 경우 고용량 화학요법을 시행한 후에 골수 이식과 MIBG(131I-metaiodobenzylguanidine)처방이 시술되고 있다. Neuroblastoma treatment depends on the age and stage of the patient, so it is treated according to the correct stage of classification. In low risk group, surgery and adjuvant therapy are used, and in the middle or high risk group, chemotherapy, surgery, and radiation therapy are performed. If the metastasis range is large, chemotherapy first causes cell reduction, then surgery is performed. If the tumor is not completely removed by surgery, tumors that are not fully responsive to chemotherapy, or neurological symptoms or pain are severe, radiation therapy is needed. Done. Anti-cancer agents used in chemotherapy include cyclophosphamide, cisplatin, carboplatin, doxorubicin, etoposide, ifosfamide and vincristine ( vincristine), and recently, high-risk neuroblastoma has undergone high-dose chemotherapy followed by bone marrow transplantation and MIBG (131I-metaiodobenzylguanidine).
신경모세포종의 예후는 환자의 연령과 병의 단계에 따라 많은 차이가 난다. 즉 1세 미만의 영아에게는 1세 이상의 소아에 비해 같은 단계라도 좋은 생존율을 나타낸다. 영아에게 낮은 단계는 생존율이 90% 이상 되며, 전이가 있는 군에서도 장기 생존율이 50% 이상 된다. 그러나 나이가 많고 전이가 광범위할수록 예후가 좋지 않아서 강력한 치료를 하더라도 생존율이 20%를 넘기가 힘들다. 주요 예후 인자로는 N-myc 카피수, 조직 소견 등과 페리틴(ferritin), NSE, LDH 등이 종양 표지자로서 검사에 사용되나 표지자가 확실하지 않은 경우도 많기 때문에 모든 환자에 대해서 명확한 진단을 내리기에는 다소 불확실한 면이 있다. 그러나 이를 극복하기 위한 목적으로 진단 당시 혹은 치료 중에 혈액 내 잔존하는 미세잔류 종양 표지자를 예민하게 검출하는 방법이 개발된다면, 보다 정확한 병기의 판정, 치료방침의 결정, 치료반응에 대한 평가, 조혈모세포이식 시기의 결정, 채집된 혈액 분획의 적정성 평가, 치료 종결시기의 결정, 재발의 조기 발견 등으로 최선의 치료가 제공됨으로써 생존율이 증대될 것이다.The prognosis of neuroblastoma varies greatly depending on the age and stage of the patient. In other words, infants under one year of age have a better survival rate than children over one year of age. Infants at low stages have a survival rate of over 90% and long-term survival rates of over 50% in groups with metastases. However, the older the age and the wider the metastasis, the poorer the prognosis, so even with strong treatment, survival is unlikely to exceed 20%. The major prognostic factors such as N-myc copy number, histologic findings, and ferritin, NSE, LDH are used as tests for tumor markers, but the markers are often unclear. There is an uncertainty. However, in order to overcome this problem, if a method for sensitive detection of residual microscopic tumor markers in the blood at the time of diagnosis or treatment is developed, more accurate determination of stage, determination of treatment policy, evaluation of treatment response, hematopoietic stem cell transplantation Survival will be increased by providing the best treatment by determining timing, evaluating the adequacy of collected blood fractions, determining the end of treatment, and early detection of relapse.
상기 신경모세포종 진단을 목적으로 하는 종양표지자 검출 방법으로는 골수에서 TH를 효소중합연쇄반응법(Polymerase Chain Reaction: PCR)으로 검출하는 방법이 현재 해외에서 사용되고 있다. 그러나 PCR이 갖는 실험적 특성으로 인하여 위양성으로 판명될 소지가 많고, 특히 네스티드 PCR 법은 과다하게 유전자 증폭이 이루어지므로 시료에 극소량의 유전자 오염이 있을 경우에는 전혀 다른 결과를 도출할 수 있는 위험성이 클 뿐만 아니라 정량적인 판정이 어렵다는 단점이 있었다. As a method for detecting tumor markers for the purpose of diagnosing neuroblastoma, a method of detecting TH from bone marrow by polymerase chain reaction (PCR) is currently used overseas. However, due to the experimental characteristics of PCR, it is likely to be false positive. Especially, nested PCR method is amplified excessively, so there is a high risk of producing very different results when there is a very small amount of gene contamination in the sample. In addition, there was a disadvantage that quantitative determination is difficult.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.Throughout this specification, many papers and patent documents are referenced and their citations are indicated. The disclosures of cited papers and patent documents are incorporated herein by reference in their entirety, and the level of the technical field to which the present invention belongs and the contents of the present invention are more clearly explained.
본 발명자들은 대표적인 소아 고형암인 신경모세포종의 완치율과 생존율을 증대시키기 위한 목적으로, 미세잔류 신경모세포종의 TH 종양표지자를 예민하게 검출할 수 있는 프로브를 개발하여 실시간(real-time) PCR 방법에 적용하였으며, 상기 방법이 미세잔류 신경모세포종을 검출하는데 있어서 특이도와 민감도가 우수한 결과를 도출한다는 사실을 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다. The present inventors developed a probe capable of sensitively detecting TH tumor markers of microremnant neuroblastomas and applied them to a real-time PCR method for the purpose of increasing the cure rate and survival rate of a typical pediatric solid cancer. The present invention has been completed by confirming that the method results in excellent specificity and sensitivity in detecting microretent neuroblastoma.
따라서 본 발명의 목적은 신경모세포종 세포의 검출방법을 제공하는 데 있다. Accordingly, an object of the present invention is to provide a method for detecting neuroblastoma cells.
본 발명의 다른 목적은 신경모세포종 세포를 검출하기 위한 키트를 제공하는 데 있다.Another object of the present invention is to provide a kit for detecting neuroblastoma cells.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.Other objects and advantages of the present invention will become apparent from the following detailed description, claims and drawings.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 신경모세포종 세포의 검출방법을 제공한다: (a) 생물학적 시료에서 총 RNA를 수득하는 단계; (b) 상기 총 RNA를 사용하여 cDNA를 수득하는 단계; (c) 상기 cDNA 상의 타이로신 하이드록실아제(tyrosine hydroxylase: TH)-코딩 뉴클레오타이드 타깃 서열에 혼성 화 되는 1종의 프라이머쌍 및 2종의 프로브를 사용하여 실시간(real time) PCR을 수행하는 단계로서, 상기 2종의 프로브는 상기 프라이머쌍이 혼성화 되는 상기 타깃 서열의 내부 서열에 혼성화되며, 상기 2종의 프로브 각각은 형광 공명 에너지 전이쌍으로 표지되어 있으며; 및 (d) 상기 단계 (c)의 PCR 반응 결과물을 분석하는 단계.According to one aspect of the present invention, the present invention provides a method for detecting neuroblastoma cells, comprising the steps of: (a) obtaining total RNA from a biological sample; (b) obtaining cDNA using the total RNA; (c) performing a real time PCR using one primer pair and two probes hybridized to a tyrosine hydroxylase (TH) -coding nucleotide target sequence on the cDNA, The two probes hybridize to an internal sequence of the target sequence to which the primer pair hybridizes, each of the two probes labeled with a fluorescence resonance energy transfer pair; And (d) analyzing the PCR reaction product of step (c).
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 타이로신 하이드록실아제(tyrosine hydroxylase: TH)-코딩 뉴클레오타이드 서열에 혼성화 되는 1종의 프라이머쌍 및 2종의 프로브를 포함하며, 상기 2종의 프로브는 상기 프라이머쌍이 혼성화 되는 상기 타깃 서열의 내부 서열에 혼성화되며, 상기 2종의 프로브 각각은 형광 공명 에너지 전이쌍으로 표지되어 있는 것을 특징으로 하는 실시간(real time) PCR에 의해 신경모세포종 세포를 검출하기 위한 키트를 제공한다.According to another aspect of the invention, the invention comprises one primer pair and two probes which hybridize to a tyrosine hydroxylase (TH) -coding nucleotide sequence, wherein the two probes comprise the primers A kit for detecting neuroblastoma cells by real time PCR, wherein the pairs hybridize to an internal sequence of the target sequence to hybridize, and each of the two probes is labeled with a fluorescence resonance energy transfer pair. to provide.
본 발명자들은 통상적으로 사용되는 TH 검사법을 정량 PCR 법으로 개발하고 표준화 시키고자 노력하였다. 이를 목적으로 i)사이버 그린(SYBR Green) 실시간 PCR 방법을 이용하여 네스티드 PCR의 위양성 문제를 해결할 수 있는 지를 알아보고, ii) 실시간 PCR 프로브 방식에서 서로 다른 두 가지 종류의 프로브, 즉 혼성화 프로브(hybridization probe: Roche system)와 Taqman® 프로브(Taqman® probe: ABI systems, USA)를 사용하여 서로의 민감도와 특이도의 차이를 조사하였다. 그 결과, TH 유전자를 혼성화 프로브 방식의 실시간 PCR을 실시하면, 위양성이 낮 은 보다 특이적이며 예민하게 미세잔존 신경모세포종을 검출할 수 있다는 사실을 발견하였다. The present inventors have endeavored to develop and standardize a commonly used TH assay by quantitative PCR. To this end, i) find out whether we can solve the false positive problem of nested PCR using the SYBR Green real-time PCR method, and ii) two different types of probes in the real-time PCR probe, that is, hybridization probe (hybridization) probe: Roche system) and Taqman® Probe (Taqman® probe: ABI systems, USA) to investigate the difference in sensitivity and specificity of each other. As a result, it was found that real-time PCR of the TH gene by hybridization probe method can detect microremnant neuroblastomas with lower specificity and more specificity.
본 발명은 생물학적 시료에 있는 신경모세포종 세포의 검출, 보다 상세하게는 신경모세포종 세포의 TH를 높은 민감도 및 특이도로 검출하는 새로운 전략을 제시한다. 신경모세포종은 카테콜아민(catecholamine)과 같은 특이적 대사산물의 발현이 높다는 특징이 있으며, 이러한 대사산물은 혈액 내에서 신규의 종양 표지자로서 이용을 가능케 한다. 또한, 상기 대사물의 합성 과정은 TH의 촉매작용에 의하여 합성 개시 및 반응속도의 조절을 받기 때문에 상기 효소를 신경모세포종을 검출하는 간접적인 표지자로 사용할 수 있다. 본 발명자들은, 카테콜아민의 생합성에 관여하는 TH가 미세잔존 신경모세포종의 세포를 검출하는 데 가장 우수한 표지자라는 것을 규명하고, 이를 본 발명에서의 표지자로 채택하였다.The present invention presents a novel strategy for the detection of neuroblastoma cells in a biological sample, and more particularly for the detection of TH of neuroblastoma cells with high sensitivity and specificity. Neuroblastomas are characterized by high expression of specific metabolites, such as catecholamines, which make them available as novel tumor markers in the blood. In addition, since the synthesis process of the metabolite is controlled by the synthesis of TH and the reaction rate by the catalysis of TH, the enzyme may be used as an indirect marker for detecting neuroblastoma. The inventors have found that TH involved in the biosynthesis of catecholamines is the best marker for detecting cells of microremnant neuroblastoma, and has adopted it as a marker in the present invention.
본 발명에 사용할 수 있는 생물학적 시료는 바람직하게는, 조직, 세포, 혈액, 림프, 골수액, 타액, 안구액, 정액, 뇌 추출물, 척수액, 관절액, 흉선액, 복수, 양막액 및 세포 조직액, 보다 바람직하게는, 조직, 세포, 혈액, 보다 더 바람직하게는, 조직, 세포 골수 및 혈액, 가장 바람직하게는, 혈액을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 생물학적 시료로서 혈액은 전혈, 혈장, 또는 혈청이며, 바람직하게는 전혈 시료이다. 보다 바람직하게는, 본 발명에 사용되는 생물학적 시료는 말초혈액 또는 골수혈액이다.Biological samples that can be used in the present invention are preferably tissue, cells, blood, lymph, bone marrow fluid, saliva, ocular fluid, semen, brain extracts, spinal fluid, joint fluid, thymus fluid, ascites, amniotic fluid and cell tissue fluid, more Preferably, it includes, but is not limited to, tissue, cells, blood, even more preferably tissue, cellular bone marrow and blood, most preferably blood. As a biological sample, the blood is whole blood, plasma, or serum, preferably a whole blood sample. More preferably, the biological sample used in the present invention is peripheral blood or bone marrow blood.
본 발명의 방법에 따르면, 우선 생물학적 시료에서 총 RNA(total RNA)를 수득한다. 총 RNA를 분리하는 단계는 당업계에 공지된 통상의 방법에 따라 실시될 수 있다 (참조: Sambrook, J. et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001); Tesniere, C. et al., Plant Mol . Biol . Rep., 9:242(1991); Ausubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Willey & Sons(1987); 및 Chomczynski, P. et al., Anal. Biochem . 162:156(1987)). 예컨대, Trizol을 이용하여 용이하게 세포내의 총 RNA를 분리할 수 있다.According to the method of the present invention, first, total RNA is obtained from a biological sample. Isolating the total RNA can be carried out according to conventional methods known in the art (see Sambrook, J. et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual , 3rd ed. Cold Spring Harbor Press (2001); Tesniere, C. et al., Plant Mol . Biol . Rep. , 9: 242 (1991); Ausubel, FM et al., Current Protocols in Molecular Biology , John Willey & Sons (1987); and Chomczynski, P. et. al., Anal. Biochem . 162: 156 (1987)). For example, Trizol can be used to easily isolate total RNA in cells.
상기 분리된 총 RNA를 이용하여 TH의 cDNA를 제조한다. 본 발명의 총 RNA는 동물, 특히 인간의 세포로부터 분리되는 것이기 때문에, 이에 포함되어 있는 mRNA의 말단에는 폴리-A 테일을 갖고 있으며, 이러한 서열 특성을 이용한 올리고 dT 프라이머 및 역전사 효소를 이용하여 cDNA을 용이하게 합성할 수 있다(참조: PNAS USA, 85:8998(1988); Libert F, et al., Science, 244:569(1989); 및 Sambrook, J. et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001)).The isolated total RNA is used to prepare cDNA of TH. Since the total RNA of the present invention is isolated from cells of animals, especially humans, the mRNA contained therein has a poly-A tail at its ends, and cDNAs can be purified using oligo dT primers and reverse transcriptases using these sequence characteristics. Can be readily synthesized ( PNAS USA , 85: 8998 (1988); Libert F, et al., Science , 244: 569 (1989); and Sambrook, J. et al., Molecular Cloning. , 3rd ed.Cold Spring Harbor Press (2001).
상기 제조된 TH의 cDNA를 주형으로 하고, TH에 특이적으로 결합하는 프라이머 1쌍 및 프로브 2종을 이용하여 실시간 PCR을 실시하여, TH 유전자의 일부 서열을 증폭한다. 상기 프라이머 및 프로브가 어닐링 또는 혼성화 되는 TH의 cDNA 서열은 서열목록 제5서열에 기재되어 있다.Using the prepared cDNA of TH as a template, real-time PCR is performed using a pair of primers and two probes specifically binding to TH to amplify some sequences of the TH gene. The cDNA sequence of TH in which the primers and probes are annealed or hybridized is described in SEQ ID NO: 5.
본 명세서에서, 용어 “프로브”는 자연의 또는 변형된 모노머 또는 연쇄 (linkages)의 선형 올리고머를 의미하며, 디옥시리보뉴클레오타이드 및 리보뉴클레오타이드를 포함하고 타깃 뉴클레오타이드 서열에 특이적으로 혼성화할 수 있으며, 자연적으로 존재하거나 또는 인위적으로 합성된 것이다. 본 발명의 프로브는 바람직하게는 단일쇄이다. 바람직하게는, 프로브는 올리고디옥시리보뉴클레오타이드이다. As used herein, the term “probe” refers to a linear oligomer of natural or modified monomers or linkages, including deoxyribonucleotides and ribonucleotides, capable of specifically hybridizing to a target nucleotide sequence, and naturally occurring Or artificially synthesized. The probe of the present invention is preferably single chain. Preferably, the probe is an oligodioxyribonucleotide.
본 명세서에서 용어 “프라이머”는 적합한 온도에서 적합한 완충액 내에서 적합한 조건(즉, 4종의 다른 뉴클레오사이드 트리포스페이트 및 중합반응 효소) 하에서 주형-지시 DNA 합성의 개시점으로 작용할 수 있는 단일-가닥 올리고뉴클레오타이드를 의미한다. 프라이머의 적합한 길이는 다양한 인자, 예컨대, 온도와 프라이머의 용도에 따라 변이가 있지만 전형적으로 15-30 뉴클레오타이드이다. 짧은 프라이머 분자는 주형과 충분히 안정된 하이브리드 복합체를 형성하기 위하여 일반적으로 보다 낮은 온도를 요구한다.As used herein, the term “primer” refers to a single-strand that can act as an initiation point for template-directed DNA synthesis under suitable conditions (ie, four different nucleoside triphosphates and polymerases) at a suitable temperature. Oligonucleotides. Suitable lengths of primers are typically 15-30 nucleotides, although varying depending on various factors, such as temperature and the use of the primer. Short primer molecules generally require lower temperatures to form a hybrid complex that is sufficiently stable with the template.
프라이머의 서열은 주형의 일부 서열과 완전하게 상보적인 서열을 갖을 필요는 없으며, 주형과 혼성화 되어 프라이머 고유의 작용을 할 수 있는 범위 내에서의 충분한 상보성을 갖으면 충분하다. 따라서, 본 발명에서의 프라이머 세트는 주형인 TH 유전자에 완벽하게 상보적인 서열을 갖을 필요는 없으며, 이들 유전자 서열에 혼성화되어 프라이머 작용을 할 수 있는 범위 내에서 충분한 상보성을 갖으면 충분하다. 바람직하게는, 본 발명에서 이용되는 프라이머는 주형인 TH-코딩 서열에 대하여 완전하게 상보적인 서열을 갖는다. 본 명세서에서 용어 “프라이머쌍”은 전방향 프라이머 및 역방향 프라이머로 구성된 프라이머 세트를 의미한다.The sequence of the primer does not need to have a sequence that is completely complementary to some sequences of the template, and it is sufficient that the primer has sufficient complementarity within a range capable of hybridizing with the template to perform a primer-specific function. Therefore, the primer set in the present invention does not need to have a sequence that is perfectly complementary to the TH gene as a template, and it is sufficient to have sufficient complementarity within a range capable of hybridizing to these gene sequences to act as a primer. Preferably, the primers used in the present invention have a sequence that is completely complementary to the TH-coding sequence as a template. As used herein, the term "primer pair" refers to a primer set consisting of forward and reverse primers.
본 발명에서 이용되는 프라이머의 디자인은 주형(TH의 뉴클레오타이드 서열)의 서열을 참조하여 당업자에 의해 용이하게 실시할 수 있으며, 예컨대 프라이머 디자인용 프로그램(예: PRIMER 3 프로그램)을 이용하여 할 수 있다.The design of the primer used in the present invention can be easily carried out by those skilled in the art by referring to the sequence of the template (nucleotide sequence of TH), for example, by using a primer design program (eg,
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명에서 이용되는 프라이머쌍에서 하나의 프라이머는 TH-코딩 뉴클레오타이드 서열의 엑손 5, 다른 하나의 프라이머는 엑손 6과 7에 특이적으로 어닐링되는 것이다(참조: 도 16). “엑손 5에 특이적으로 어닐링된다”는 표현은 본 발명에서 이용되는 프라이머가 엑손 5의 일부 서열에 특이적으로 어닐링되는 것을 의미한다. “엑손 6과 7에 특이적으로 어닐링된다”는 표현은, 본 발명에서 이용되는 프라이머가 엑손 6과 7의 경계에 있는 서열에 상보적인 서열을 가지고 있어 엑손 6의 일부 서열과 엑손 7의 일부 서열에 특이적으로 어닐링되는 것을 의미한다. TH 유전자의 엑손 5-7은 서열목록 제6-8서열에 기재되어 있다.According to a preferred embodiment of the present invention, one primer in the primer pair used in the present invention is specifically annealed to
본 발명의 가장 바람직한 구현예에 따르면, 상기 프라이머쌍에서 각각의 프라이머는 서열목록 제 3 서열 및 제 4 서열의 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.According to the most preferred embodiment of the present invention, each primer in the primer pair comprises a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 and 4 sequences.
실시간 PCR 증폭 방법은 다양한 방식이 이미 알려져 있다. 본 발명은 실시간 PCR의 다양한 방식 중에서, 2종의 프로브를 이용하는 “혼성화 프로브 실시간 PCR” 방식을 이용한다. 본 명세서에서 용어 “혼성화 프로브 실시간 PCR”은 실시간 PCR 방법 중에서, 타깃 서열에 특이적으로 결합하는 1쌍의 프라이머 및 2종의 프로브를 이용하며, 상기 프로브는 형광 공명 에너지 전이(fluorescence resonance energy transfer: FRET) 쌍으로 표지(labelling)되어 있는 것을 특징으로 하는 실시간 PCR을 의미한다. 용어 “혼성화 프로브 실시간 PCR”은 당업계에서 사용되는 용어 “바이너리 혼성화 프로브 실시간 PCR”과 동일한 의미를 갖는다.Real-time PCR amplification methods are known in various ways. The present invention uses the "hybridization probe real time PCR" method using two probes, among various methods of real time PCR. As used herein, the term “hybridization probe real-time PCR” uses a pair of primers and two types of probes that specifically bind to a target sequence, among the real-time PCR methods, and the probes include fluorescence resonance energy transfer: FRET) means a real-time PCR characterized in that it is labeled (pair). The term “hybridization probe real time PCR” has the same meaning as the term “binary hybridization probe real time PCR” used in the art.
본 명세서에서 용어 “형광 공명 에너지 전이쌍”은 주게 형광단(donor fluorophore) 및 받게 형광단(acceptor fluorophore)을 포함하는 형광단의 한 쌍을 의미한다. 상기 주게 형광단은 공명 에너지를 받게 형광단에 전이시킬 수 있다. 즉, 주게 형광단의 발광 스펙트럼은 받게 형광단의 흡수 스펙트럼과 중첩된다. As used herein, the term “fluorescence resonance energy transfer pair” refers to a pair of fluorophores, including donor fluorophores and acceptor fluorophores. The fluorophore can be transferred to the fluorophore under resonance energy. In other words, the emission spectrum of the fluorophore is superimposed with the absorption spectrum of the fluorophore.
본 발명에서 이용되는 2종의 프로브는 각각 형광 공명 에너지 전이쌍의 받게 형광단 및 주게 형광단으로 표지되어 있다. 따라서, 2종의 프로브가 적합한 위치(인접한 위치)에서 타깃 서열에 모두 혼성화 되면, 형광 공명 에너지 전이가 이루어지며, 이 때 강력한 형광이 발생하게 된다.The two probes used in the present invention are labeled with a fluorophore and a donor fluorophore, respectively, of a fluorescence resonance energy transfer pair. Therefore, when both probes hybridize to the target sequence at suitable positions (adjacent positions), fluorescence resonance energy transfer occurs, and strong fluorescence is generated at this time.
보다 상세하게는, 검출 대상의 시료가 TH 유전자를 발현하여 TH mRNA를 포함하는 경우, 이 mRNA가 PCR 증폭되고 이 증폭산물에 상기 2종의 프라이머가 인접하여 결합하는 경우에만, 형광이 PCR 사이클-의존적으로 검출될 수 있다.More specifically, when the sample to be detected expresses the TH gene and contains TH mRNA, the fluorescence is PCR cycle- only when the mRNA is PCR amplified and the two primers are adjacently bound to this amplification product. Can be detected dependently.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 형광 공명 에너지 전이쌍은 플루오레신/로다민, 피코에리트린/Cy7, 플루오레신/Cy5, 플루오레신/Cy5.5, 플루오레신/LC Red 640 또는 플루오레신/LC Red 705이다.According to a preferred embodiment of the present invention, the fluorescence resonance energy transfer pair is fluorescein / rhodamine, phycoerythrin / Cy7, fluorescein / Cy5, fluorescein / Cy5.5, fluorescein / LC Red 640 Or fluorescein / LC Red 705.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 2종의 프로브 중 하나는 TH-코딩 뉴클레오타이드 서열의 엑손 5와 6, 다른 하나는 엑손 6에 특이적으로 혼성화 되는 것이며(참조: 도 16), 가장 바람직하게는 상기 2종의 프로브 각각은 서열목록 제 1 서열 및 제 2 서열의 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. “엑손 6에 특이적으로 혼성화된다”는 표현은 본 발명에서 이용되는 프로브가 엑손 6의 일부 서열에 특이 적으로 혼성화되는 것을 의미한다. “엑손 5와 6에 특이적으로 혼성화된다”는 표현은, 본 발명에서 이용되는 프로브가 엑손 5와 6의 경계에 있는 서열에 상보적인 서열을 가지고 있어 엑손 5의 일부 서열과 엑손 6의 일부 서열에 특이적으로 혼성화되는 것을 의미한다.According to a preferred embodiment of the present invention, one of the two probes is specifically hybridized to
상기 1종의 프라이머쌍 및 2종의 프로브를 사용하여 실시간 PCR(polymerase chain reaction)을 실시한다. 실시간 PCR은 당업계에 공지된 통상의 프로토콜에 따라 실시될 수 있다. 예를 들어, 상기 1종의 프라이머쌍 및 2종의 프로브를 사용하면서 전형적인 PCR 프로토콜에 따라 반응을 진행시킴으로써, 실시간 PCR을 수행할 수 있다. PCR의 전형적인 방법은 미국 특허 제4,683,195호, 제4,683,202호 및 제4,800,159호에 개시되어 있다.Real time PCR (polymerase chain reaction) is carried out using the one primer pair and two probes. Real-time PCR can be carried out according to conventional protocols known in the art. For example, real time PCR can be performed by proceeding with a reaction according to a typical PCR protocol while using the one primer pair and two probes. Typical methods of PCR are disclosed in US Pat. Nos. 4,683,195, 4,683,202 and 4,800,159.
예를 들어, 변성, 어닐링 및 연장반응의 반복적인 사이클을 통하여 타깃 서열을 증폭한다. 변성 반응에서 이중쇄의 주형을 단일쇄로 만든다. 쇄를 분리하는 방법은, 열, 알카리, 포름아미드, 우레아 및 글리콕살 처리, 효소적 방법(예, 헬리카아제 작용) 및 결합 단백질을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 예를 들어, 쇄 분리는 80-105℃의 온도로 열 처리하여 달성될 수 있다. 상술한 처리의 일반적인 방법은 Joseph Sambrook, 등, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001)에 개시되어 있다. 이어, 본 발명에 이용되는 프라이머 및 프로브를 주형의 한 부위에 어닐링 및 혼성화시켜 이중쇄 구조를 형성한다. 이러한 이중쇄 구조를 형성하는 데 적합한 핵산 혼성화의 조건은 Joseph Sambrook, 등, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001) 및 Haymes, B. D., 등, Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach, IRL Press, Washington, D.C. (1985)에 개시되어 있다. For example, target sequences are amplified through repeated cycles of denaturation, annealing and extension. In the denaturation reaction, the double chain template is made into a single chain. Methods for separating chains include, but are not limited to, heat, alkali, formamide, urea and glycoxal treatments, enzymatic methods (eg helicase action) and binding proteins. For example, chain separation can be accomplished by heat treatment to a temperature of 80-105 ° C. General methods of such treatments are disclosed in Joseph Sambrook, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual , Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (2001). The primers and probes used in the present invention are then annealed and hybridized to one site of the template to form a double chain structure. Conditions for nucleic acid hybridization suitable for forming such double chain structures are described by Joseph Sambrook, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual , Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (2001) and Haymes, BD, et al., Nucleic Acid Hybridization , A Practical Approach , IRL Press, Washington, DC (1985).
다양한 DNA 중합효소가 PCR 증폭에 이용될 수 있으며, E. coli DNA 중합효소 I의 클레나우 단편, 열안정성 DNA 중합효소 및 박테리오파아지 T7 DNA 중합효소 등을 이용할 수 있다. 바람직하게는, 중합효소는 다양한 박테리아 종으로부터 얻을 수 있는 열안정성 DNA 중합효소이고, 이는 Thermus aquaticus(Taq), Thermus thermophilus(Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis, 및 Pyrococcus furiosus(Pfu)를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. PCR 반응을 실시할 때, 반응물에 반응에 필요한 성분들을 과량으로 제공하는 것이 바람직하다. 증폭 반응에 필요한 성분들의 과량은, 증폭반응이 성분의 농도에 실질적으로 제한되지 않는 정도의 양을 의미한다. Mg2 +와 같은 조인자, dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP를 소망하는 증폭 정도가 달성될 수 있을 정도로 반응 혼합물에 제공하는 것이 바람직하다.Various DNA polymerases can be used for PCR amplification, and Klenow fragments of E. coli DNA polymerase I, thermostable DNA polymerase and bacteriophage T7 DNA polymerase can be used. Preferably, the polymerase is a thermostable DNA polymerase obtained from various bacterial species, which is Thermus aquaticus (Taq), Thermus thermophilus (Tth), Thermus filiformis , Thermis flavus , Thermococcus literalis , and Pyrococcus furiosus (Pfu), including but not limited to. When conducting a PCR reaction, it is desirable to provide the reactant with an excess of components necessary for the reaction. Excess of components required for the amplification reaction means an amount such that the amplification reaction is not substantially limited to the concentration of the components. So that the degree of amplification to a desired joinja, dATP, dCTP, dGTP and dTTP, such as Mg 2 + can be achieved to provide the reaction mixture is preferred.
본 발명의 구체적인 일 실시예에 따르면, 실시간 PCR 증폭 단계에서, 온도 사이클은 변성 95℃에서 5초, 어닐링 62℃에서 15초 및 신장 반응 72℃에서 5초이다. 또한, 본 발명의 구체적인 일 실시예에 따르면, 실시간 PCR 증폭의 반응 혼합물은 0.5 μM의 프라이머, 0.2 μM의 프로브 및 2 mM의 MgCl2를 포함한다.According to a specific embodiment of the present invention, in the real time PCR amplification step, the temperature cycle is 5 seconds at
본 발명에서의 실시간 PCR은 당업계에서 구입가능 한 GeneAmp 5700 시스 템(Perkin-Elmer Biosystems), ABI Prism 7700(Applied Biosystems) 또는 LightCycler(Roche)를 이용하여 실시할 수 있다.Real-time PCR in the present invention can be carried out using a GeneAmp 5700 system (Perkin-Elmer Biosystems), ABI Prism 7700 (Applied Biosystems) or LightCycler (Roche) available in the art.
형광 공명 에너지 전이쌍으로 각각 표지된 2종의 프로브를 이용하는 본 발명의 실시간 PCR 방법은 미국 특허출원 공개 제2002-0123062호 및 Lee L.G., et al., Nucleic Acids Res. 21:3761-3766(1993)에 개시된 방법에 따라 실시될 수 있으며, 상기 문헌은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.Real-time PCR methods of the present invention using two probes each labeled with a fluorescence resonance energy transfer pair are described in US Patent Application Publication Nos. 2002-0123062 and Lee LG, et al., Nucleic Acids Res. 21: 3761-3766 (1993), which is incorporated herein by reference.
본 발명의 방법에 따르면, 최종적으로 단계 (c)의 PCR 반응 결과물을 분석한다. 즉, 단계 (c)에서 실시되는 PCR 증폭에 의해 생성되는 결과물을 정량적으로 분석한다. PCR 반응 결과물은 프로브에 결합되어 있는 형광물질에서 발생하는 형광을 검출함으로써 실시된다. 즉, 실시간 PCR 증폭 동안에 타깃 DNA에 있는 인접 서열에 서로 근접하여 2종의 프로브가 혼성화될 때, 프로브에 결합된 형광물질로부터 형광이 발생하게 되며 이 형광을 측정함으로써, 시료 내에 발현된 TH 유전자의 존재 여부 및 양을 분석할 수 있다.According to the method of the present invention, the PCR reaction product of step (c) is finally analyzed. That is, the result generated by the PCR amplification carried out in step (c) is quantitatively analyzed. The PCR reaction product is performed by detecting fluorescence generated from the fluorescent material bound to the probe. That is, when two probes hybridize to each other in close proximity to adjacent sequences in the target DNA during real-time PCR amplification, fluorescence is generated from the fluorescent material bound to the probe, and the fluorescence is measured to determine the expression of the TH gene expressed in the sample. The presence and amount can be analyzed.
신경모세포종 세포를 검출하기 위한 본 발명의 키트는 TH-코딩 뉴클레오타이드 서열에 혼성화 되는 1종의 프라이머쌍 및 2종의 프로브 이외에, 선택적으로, PCR 증폭에 필요한 시약, 예컨대, 완충액, DNA 중합효소(예컨대, Thermus aquaticus (Taq), Thermus thermophilus (Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis 또는 Pyrococcus furiosus (Pfu)로부터 수득한 열 안정성 DNA 중합효소), DNA 중합 효소 조인자 및 dNTPs를 포함할 수 있다. 본 발 명의 키트는 상기한 시약 성분을 포함하는 다수의 별도 패키징 또는 컴파트먼트로 제작될 수 있다.Kits of the invention for detecting neuroblastoma cells may optionally contain reagents such as buffers, DNA polymerases (e.g., buffers, DNA polymerases, etc.) in addition to one primer pair and two probes that hybridize to a TH-coding nucleotide sequence. , Thermus aquaticus (Taq), Thermus thermophilus (Tth), Thermus filiformis , Thermis flavus , Thermococcus thermally stable DNA polymerases obtained from literalis or Pyrococcus furiosus (Pfu)), DNA polymerase cofactors and dNTPs. Kits of the present invention can be made in a number of separate packaging or compartments containing the reagent components described above.
본 발명에 따르면, 높은 민감도[약 1 신경세포종 세포/105 PBMC(peripheral blood mononuclear cell)] 및 특이도(약 100%)로 환자의 말초혈액 또는 골수혈액 내에 존재하는 미세 잔존 신경모세포종을 검출할 수 있으며, 이에 최종 치료 결정 시기 및 재발의 조기 발견 등에 대한 유용한 임상적 정보를 얻을 수 있다.According to the present invention, it is possible to detect microscopic residual neuroblastoma present in peripheral blood or bone marrow blood of a patient with high sensitivity [about 1 neurocytoma cell / 10 5 PBMC (peripheral blood mononuclear cell)] and specificity (about 100%). This may provide useful clinical information about the timing of the final treatment decision and early detection of recurrence.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples. These examples are only for illustrating the present invention in more detail, it will be apparent to those skilled in the art that the scope of the present invention is not limited by these examples in accordance with the gist of the present invention. .
실시예Example
A. 실험재료A. Experimental Materials
(1) 신경모세포종 세포주(1) neuroblastoma cell line
EMEM 배지(GIBCO BRL)에 10% FBS(GIBCO BRL), 비필수 아미노산(GIBCO BRL), 항생물질(Ampicillin) 및 소듐 피루베이트를 첨가하여 신경모세포종의 세포주인 IMR32(ATCC: American Type Culture Collection, USA)와 SH-SY5Y(ATCC)를 37℃, 5% CO2 배양기에서 배양하였다.10% FBS (GIBCO BRL), non-essential amino acids (GIBCO BRL), antibiotics (Ampicillin) and sodium pyruvate were added to EMEM medium (GIBCO BRL) to form a cell line of neuroblastoma IMR32 (ATCC: American Type Culture Collection, USA ) And SH-SY5Y (ATCC) were incubated at 37 ℃, 5% CO 2 incubator.
(2) 신경모세포종 임상 혈액 샘플(2) neuroblastoma clinical blood samples
신경모세포종의 환자의 말초 혈액과 골수혈을 체취한 후 즉시 실험실 적혈구 용해 용매(RBC lysis buffer)를 5배 첨가하여 얼음에서 약 15분간 정체 인큐베이션 하였다. 그 후 원심분리기로 2000 rpm에서 15분간 원심분리하여 PBMC(peripheral blood mononuclear cell)만을 취하였다. PBMC에 RNA분해억제용액(RNAlater: Ambion)을 첨가하여, -70℃에서 RNA 추출 전까지 보관하였다.Peripheral blood and bone marrow were collected from neuroblastoma patients and immediately incubated on ice for about 15 minutes by adding 5 times of laboratory erythrocyte lysis buffer (RBC lysis buffer). Then, centrifuged at 2000 rpm for 15 minutes to take only PBMC (peripheral blood mononuclear cell). RNA degradation inhibitor solution (RNAlater: Ambion) was added to PBMC, and stored at -70 ° C until RNA extraction.
(3) 민감도 실험(Sensitivity test)(3) Sensitivity test
IMR32 세포주를 배양한 후, 80% 정도의 배양 밀집정도가 되었을 때 수거하였으며, 일부를 이용해 전체 세포수를 계산하였다. 8 개의 튜브에 정상 말초혈액의 PBMC를 107 개의 세포 농도로 균등하게 분주하고, 각각의 상기 튜브의 IMR32 세포를 1 개에서 106개까지 첨가하였다. 원심분리과정을 통하여 침전되어 밀집한 세포만 취하여 RNA을 추출하였다(표 1).After culturing the IMR32 cell line, it was collected when the culture density was about 80%, and the total cell number was calculated using a part. Eight tubes were evenly aliquoted with normal peripheral blood PBMC at a concentration of 10 7 cells, and IMR32 cells from each of these tubes were added from 1 to 10 6 . RNA was extracted by centrifugation and only dense cells were precipitated (Table 1).
(4) 특이도 실험(Specificity test)(4) Specificity test
특이도 실험을 위해, PBMC와 non-NBL 혈액세포를 수집하였다. PBMC는 기부를 통해 얻어진 말초혈액과 골수혈에서 분리하였으며, non-NBL 혈액세포는 삼성 생명과학연구소 조직은행을 통해 수집된 말초혈과 골수혈 중 NBL(neuroblastoma) 환자가 아닌 검체를 이용하여 RNA를 추출하였다.For specificity experiments, PBMC and non-NBL blood cells were collected. PBMC was isolated from peripheral blood and bone marrow obtained through donation.Non-NBL blood cells were collected from non-NBL (neuroblastoma) patients from peripheral blood and bone marrow collected through the Samsung Life Science Institute tissue bank. Extracted.
B. 실험방법B. Experimental Method
(1) 혈액내 RNA 추출 및 cDNA로의 전환합성(1) RNA extraction in blood and conversion to cDNA
말초혈액 또는 골수혈에서 PBMC만을 취한 후, Qiagen RNeasy kit(Qiagen, Germany)를 이용하여 제조사에서 권장하는 추출방법에 따라 RNA를 추출하였다. RNA는 초순수정제수에 용해시켰으며, 추출 후 바로 스펙트로포토미터를 이용해서 추출된 RNA의 상태와 농도를 검사하였다. RNA는 260/280 nm의 OD 값이 1.8 이상이며, 농도는 최소 100 ng/㎕ 이상인 검체를 선택하였다. 추출과정 중에 발생할 수 있는 RNA 손상여부 검사를 위해 0.8% 아가로즈 젤에 전기영동하여 18S와 28S 밴드를 확인하였고, DNA 오염 여부를 동시에 확인하였다.After taking PBMC only from peripheral blood or bone marrow, RNA was extracted using the Qiagen RNeasy kit (Qiagen, Germany) according to the extraction method recommended by the manufacturer. RNA was dissolved in ultrapure purified water, and immediately after extraction, the state and concentration of the extracted RNA were examined using a spectrophotometer. RNA was selected for samples with an OD value of at least 1.8 and a concentration of at least 100 ng / μl at 260/280 nm. To test for RNA damage that may occur during the extraction process, electrophoresis was performed on 0.8% agarose gel to identify 18S and 28S bands, and DNA contamination was simultaneously checked.
추출된 RNA를 cDNA로 전환하기 위하여 역전사효소(Superscript III® : Invitirogen, USA)와 올리고-dT 18-mer(iNtron, Korea)를 이용하였다. RNA 1 ㎍에 올리고-dT와 dNTP만을 첨가하여 95℃에서 5분간 반응시키고, 잠시 얼음에서 역전사효소 반응버퍼(Invitirogen)와 역전사효소, DTT를 첨가하여 55℃에서 60분간 반응시켰다. 효소를 불활성시키기 위해 75℃에서 10분간 추가로 방치하여 반응을 종결시켰다. 제조된 cDNA를 -20℃에 보관하였다.Reverse transcriptase (Superscript III®) to convert extracted RNA into cDNA : Invitirogen, USA) and oligo-dT 18-mer (iNtron, Korea) were used. 1 μg of RNA was added with oligo-dT and dNTP alone for 5 minutes at 95 ° C. The reaction buffer (Invitirogen), reverse transcriptase, and DTT were added and reacted at 55 ° C. for 60 minutes. The reaction was terminated by further left at 75 ° C. for 10 minutes to inactivate the enzyme. The cDNA prepared was stored at -20 ℃.
(2) 네스티드 PCR(2) Nested PCR
프라이머 세트 1을 사용하여 1 차 PCR을 수행하고, 이어 프라이머 세트 2를 사용하여 2차 PCR을 각각 수행하였다. 각각의 반응의 조성은 동일하며, 다만 서로 다른 프라이머 세트만을 첨가하여 반응시켰다. 주형으로 사용된 cDNA는 100 ng을 사용하였으며, 여기에 PCR 마스터 믹스(ABgene, UK), 전방향 프라이머, 역방향 프라이머와 물을 혼합하여 반응시켰다. 반응 후 1.5% 아가로즈 젤에 PCR 산물을 로딩하여, 120 V에서 20분간 전기영동 하였다. PCR 반응 결과에 대한 영상분석은 Geldoc(Bio-rad)을 사용하여 실시하였다.Primary PCR was performed using primer set 1, followed by secondary PCR using primer set 2, respectively. The composition of each reaction was the same, but reacted by adding only different primer sets. 100 ng of cDNA was used as a template, and the reaction was performed by mixing PCR master mix (ABgene, UK), forward primer, reverse primer and water. After the reaction, PCR products were loaded on 1.5% agarose gel and electrophoresed at 120 V for 20 minutes. Image analysis of the PCR reaction results was carried out using Geldoc (Bio-rad).
i) 1차 PCR : 299 bp 산물i) 1st PCR: 299 bp product
센스 프라이머 : 5'-TGTCAGAGCTGGACAAGTGT-3'Sense primer: 5'-TGTCAGAGCTGGACAAGTGT-3 '
안티센스 프라이머 : 5'-GATATTGTCTTCCCGGTAGC-3'Antisense Primer: 5'-GATATTGTCTTCCCGGTAGC-3 '
ii) 2차 PCR : 95 bp 산물(TH 프라이머)ii) Secondary PCR: 95 bp product (TH primer)
센스 프라이머 : 5'-GTTCGACCCTGACCTGGACT-3'Sense primer: 5'-GTTCGACCCTGACCTGGACT-3 '
안티센스 프라이머 : 5'-TGTACTGGAAGGCGATCTCA-3'Antisense Primer: 5'-TGTACTGGAAGGCGATCTCA-3 '
ⅲ) 개량된 2차 PCR (2nd) : 175 bp 산물 (2nd TH 프라이머)Iii) Improved secondary PCR (2 nd ): 175 bp product (2 nd TH primer)
센스 프라이머 : 5'-ACCAAGTTCGACCCTGAC-3'Sense primer: 5'-ACCAAGTTCGACCCTGAC-3 '
안티센스 프라이머 : 5'-GCGTGGTGTAGACCTCCT-3'Antisense Primer: 5'-GCGTGGTGTAGACCTCCT-3 '
(3) 실시간 PCR (3) Real time PCR
SYBR Green을 사용하는 실시간 PCR와 Taqman® 프로브를 사용하는 실시간 PCR은 ABI PRISM 7000(Applied biosystems, USA)기기를 사용하였고, 혼성화 프로브를 사용하는 실시간 PCR은 Lightcycler®(Roche, USA)를 사용하여 수행하였다. cDNA 검체를 제외한 나머지는 모두 각 실시간 PCR 기기 제조사에서 권장하는 시약을 사용하였다.Real-time PCR and Taqman® using SYBR Green Real-time PCR using probes was performed using ABI PRISM 7000 (Applied biosystems, USA), and real-time PCR using hybridization probes was performed using Lightcycler® (Roche, USA). All but the cDNA samples were used reagents recommended by each real-time PCR instrument manufacturer.
a) a) SYBRSYBR Green을 사용하는 실시간 Real time using Green PCRPCR
SYBR Green을 사용하는 실시간 PCR에서는 네스티드 PCR에서 사용한 프라이머 세트 2, SYBR Green 마스터 믹스(Applied biosystems, USA) 및 cDNA 100 ng를 혼합하여 증폭반응이 일어나도록 하였다. PCR은 94℃ 30초, 60℃ 30초, 72℃ 1분의 반응조건을 40 회 반복 수행하였고, 매 회마다 72℃에서 DNA 증폭정도를 관찰하였다. 위양성 검출을 위해 해리 프로토콜(dissociation protocol)을 수행하도록 프로그램하여, 여기에서 도출된 멜팅 커브(melting curve)를 근거로 위양성을 판정하였다.In real-time PCR using SYBR Green, primer set 2 used in nested PCR, SYBR Green master mix (Applied biosystems, USA), and 100 ng of cDNA were mixed to allow amplification reaction. PCR was repeated 40 times with reaction conditions of 94 ℃ 30 seconds, 60 ℃ 30 seconds, 72
b) b) Taqman®Taqman® 프로브를Probe 사용하는 실시간 Real time to use PCRPCR
센스와 안티센스 프라이머 2 개와 프로브 1개로 구성된 Taqman® 프라이머-프로브 세트(Taqman® primer probe set)는 Lambooy, H.의 논문(Clin . Cancer Res. 2003;9(2):812-9)을 참조하여 디자인 하였고, Applied Biosystems사(USA)를 통해 제작하였다. 사용한 프라이머 서열은 하기 표 2에 기재된 프라이머 서열과 동일하며, 프로브 서열은 5’-AGCGCAGGAAGCTGATTGCTGAG-3’이다. Taqman® 프로브 마스터믹스(Applied biosystems)에 cDNA, 프라이머 프로브 세트 및 물을 혼합하여, 50℃ 5분, 95℃ 10분 동안 반응시킨 후, 95℃ 30 초, 60℃ 30 초, 72℃ 1 분의 반응조건을 45회 반복 수행하였다. 72℃에서 매 회마다DNA 증폭정도를 관찰하였다.The Taqman® primer probe set, consisting of two sense and antisense primers and one probe, is described in Lambooy, H., Clin . Cancer Res. 2003; 9 (2): 812-9. It was designed and manufactured by Applied Biosystems (USA). The primer sequence used is the same as the primer sequence described in Table 2 below, and the probe sequence is 5'-AGCGCAGGAAGCTGATTGCTGAG-3 '. After mixing cDNA, primer probe set and water in Taqman® probe mastermix (Applied biosystems) and reacting for 50
c) c) 혼성화Hybridization 프로브(Hybridization probe)를Hybridization probe 사용하는 실시간 Real time to use PCRPCR
PCR 산물에 두 가지의 프로브가 결합해야만 기계적으로 형광인식이 가능하여 결과를 얻을 수 있는 혼성화 프로브 시스템(Hybridization probe system)을 위하여, 표 2에 기재된 프라이머 2 개와 프로브 2 개의 서열을 디자인하고, Roche(USA)에 의뢰하여 제작하였다. 상기 2개의 프로브에는 각각 FL(Fluorescein)과 LC(Light Cycler Red 640) 형광물질이 표지되어 있다. Lightcycler® 마스터 믹스(2 mM MgCl2 포함, Roche), 주형 cDNA(50 ng), 프라이머 세트(0.5 μM), 프로브 세트(0.2 μM) 및 증류수를 혼합하여 반응시켰다. 반응 과정은 95℃에서 10분간 개시 반응하였고, 그 후 95℃ 5초, 62℃ 15초 및 72℃ 5초의 반응을 45회 반복 수행하였다. 72℃에서 매 회마다 반응 정도를 관찰하였다.For a hybridization probe system in which two probes are combined with a PCR product and mechanically fluorescence can be obtained to obtain a result, the sequences of two primers and two probes shown in Table 2 are designed, and Roche ( USA). The two probes are labeled with Fluorescein (FL) and Light Cycler Red 640 (LC) phosphors, respectively. The Lightcycler® Master Mix (2 mM MgCl 2 with Roche), template cDNA (50 ng), primer set (0.5 μM), probe set (0.2 μM) and distilled water were mixed and reacted. The reaction process was initiated at 95 ° C. for 10 minutes, and then the reaction of 95 ° C. 5 seconds, 62 ° C. 15 seconds, and 72 ° C. 5 seconds was repeated 45 times. The degree of reaction was observed at 72 ° C. each time.
C. 실험결과C. Experimental Results
(1) 잔존 신경모세포종 검출을 위한 예비 표지인자 선정(1) Selection of preliminary markers for detection of residual neuroblastoma
a) 카테콜아민 합성과정(a) catecholamine synthesis process ( CatecholaminesCatecholamines pathway) pathway)
신경모세포종은 카테콜아민을 합성하는 특징을 가지고 있기 때문에, 상기 물질의 합성에 관련한 효소들이 특이적으로 과발현될 것으로 기대하였다. 따라서 카테콜아민 대사과정과 연관된 유전자인 타이로신 하이드록실아제(Tyrosine hydroxylase: TH), DOPA 디카르복실아제(DOPA decarboxylase: DDC), 도파민 베타-하이드록실아제(dopamine β-hydroxylase: DBH) 및 페닐에탄올아민 N-메틸트렌스퍼라아제(phenylethanolamine N-methyltransferase: PMNT)를 예비 종양표지인자로 선정하였다.Since neuroblastomas have the characteristic of synthesizing catecholamines, it was expected that enzymes involved in the synthesis of these substances would be specifically overexpressed. Thus, tyrosine hydroxylase (TH), DOPA decarboxylase (DDC), dopamine beta-hydroxylase (DBH) and phenylethanolamine N are genes associated with catecholamine metabolism. -Methyltransferase (phenylethanolamine N-methyltransferase (PMNT)) was selected as a preliminary tumor marker.
b) 예비 b) spare 종양표지자의Tumor marker 민감도 및 특이도 실험 Sensitivity and Specificity Experiments
카테콜아민의 합성과 연관된 상기 4 가지 효소의 유전정보를 이용하여, 적절한 검출방법을 표준화 하였다.Genetic information of the four enzymes involved in the synthesis of catecholamines was used to standardize the appropriate detection method.
각 유전자에 상응하는 특이적인 PCR 프라이머를 제작하였고, 유전자를 가장 잘 검출할 수 있는 적절한 온도 조건과 PCR 횟수의 표준화 실험을 수행하였다. 실험방법은 하나의 검체에 대하여 연속적으로 두 번의 PCR을 수행하는 네스티드 PCR 방법이 가장 적합한 것으로 확인되었다. 그리고 이미 알려져 있는 TH 프라이머보다 민감도가 더 높은 2nd TH 프라이머를 제작하였으며, 상기 프라이머를 사용하여 검사방법을 표준화 하였다(도 1). 표준화한 조건을 이용하여 신경모세포종의 세포주(IMR32 및 SH-SY5Y)를 이용한 민감도 검사를 수행하였으며, 정상의 PBMC에 대한 특이도 검사를 수행하였다.Specific PCR primers corresponding to each gene were prepared, and standardized experiments were conducted on appropriate temperature conditions and PCR times to detect the genes best. The experimental method was found to be the most suitable nested PCR method that performs two PCRs on one sample in succession. And 2 nd TH primer having a higher sensitivity than the known TH primer was prepared, and the test method was standardized using the primer (FIG. 1). Sensitivity tests using neuroblastoma cell lines (IMR32 and SH-SY5Y) were performed using standardized conditions, and specificity tests were performed for normal PBMCs.
민감도 실험결과, DDC 유전자는 1000 개의 PBMC 중 1 개의 종양세포 검출빈도의 낮은 민감도를 나타내어 미세잔존 세포종을 검출하기에는 부적절한 것으로 판단되어 검출 표지자 후보에서 제외하였다. 또한 6 개의 정상혈액세포를 이용한 특이도 검사에선 TH와 DDC, DBH에 대해서는 위양성이 발견되지 않았으나, 오직 PMNT에서만 위양성이 검출되었기 때문에 PMNT 역시 세포종 검출 표지자 후보에서 제외하였다(도 3). 반면에 DBH의 민감도는 1 IMR32/106 PBMCs, TH의 민감도는 1 IMR32/105 PBMCs로서 100,000개의 정상 세포 내에 존재하는 1 개의 신경모종양세포를 검출하는 우수한 민감도를 나타내었다(도 2).As a result of the sensitivity test, the DDC gene was shown to have a low sensitivity of one tumor cell detection frequency among 1000 PBMCs, which was inadequate for detecting micro residual cell tumors and was excluded from the detection marker candidate. In addition, in the specificity test using six normal blood cells, no false positives were found for TH, DDC, and DBH, but PMNT was also excluded from the cell tumor detection marker candidate because false positives were detected only in PMNT (FIG. 3). On the other hand, the sensitivity of DBH was 1 IMR32 / 10 6 PBMCs, and the TH was 1 IMR32 / 10 5 PBMCs, indicating an excellent sensitivity of detecting 1 neuroblastoma cells in 100,000 normal cells (FIG. 2).
c) c) THTH 와 Wow DBHDBH 의 of 네스티드Nested PCRPCR 특이도 실험 Specificity experiment
카테콜아민 합성과정과 관련된 4 종류의 효소 중 TH와 DBH를 세포종 표지자로 선정하였다. 상기 두 표지자 후보에 대한 더욱 유의성 있는 특이도 분석을 위하여 non-NBL 환자에서 채취한 말초혈액(PBMC) 53 검체와 골수혈세포(BM) 33 검체를 이용하여 특이도 실험을 수행하였다. 그 결과, TH는 PBMC에서 11.3%, BM에서 12.1%의 위양성이 검출되었으며, 반면에 DBH는 PBMC에서 16.9%, BM에서 21.2%의 위양성을 나타내었으며, TH 보다 위양성률이 PB에서 5.6%, BM에서 9.1% 더 높게 검출되었다(표 3 및 도 4). Among the four enzymes involved in catecholamine synthesis, TH and DBH were selected as markers of the cell species. For more significant specificity analysis of the two marker candidates, specificity experiments were performed using peripheral blood (PBMC) 53 samples and bone marrow blood cell (BM) 33 samples from non-NBL patients. As a result, TH was 11.3% in PBMC and 12.1% in BM, while DBH showed 16.9% in PBMC and 21.2% in BM, and false positive rate was 5.6% in PB and TH in BM 9.1% higher was detected (Table 3 and FIG. 4).
위 실험 결과, DBH보다 TH가 더 특이적으로 신경모세포종을 검출할 수 있다는 가능성을 알 수 있다.As a result of the above experiments, it can be seen that TH can detect neuroblastoma more specifically than DBH.
(2) 실시간 PCR을 이용한 잔존 신경모세포종의 검사(2) Examination of residual neuroblastoma using real time PCR
a) a) SYBRSYBR Green을 사용하는 실시간 Real time using Green PCRPCR 에 의한 On by THTH , , DBHDBH 검사 방법의 표준화 Standardization of inspection method
네스티드 PCR을 이용한 TH 검사법은 민감도가 높아 적은 수의 종양세포도 검출할 수 있는 것으로 판단되었다. 그러나 그 민감도가 높은 만큼 위양성의 위험성 역시 높다. 상기 특이도 실험에서 볼 수 있듯이, DBH는 BM에서 무려 21.2%의 위양성을 나타내었으며, TH역시 12.1%로서 90% 이하의 특이도를 나타내었다. 새로운 SYBR Green을 이용한 실시간 PCR 방법을 도입하여 민감도는 유지하면서, 동시에 특이도만을 높일 수 있는 방법의 개발을 시도하였다.TH test method using nested PCR was found to be able to detect a small number of tumor cells with high sensitivity. However, the higher the sensitivity, the higher the risk of false positives. As can be seen in the specificity experiment, DBH showed a false positive of 21.2% in BM, and TH was 12.1% and showed a specificity of 90% or less. By introducing a real-time PCR method using the new SYBR Green, we attempted to develop a method to increase specificity while maintaining sensitivity.
SYBR Green을 사용하는 실시간 PCR 방법은 기존의 실시간 PCR 방법과 달리 신규의 프라이머 제작이 필요하지 않으며, 네스티드 PCR에서 사용되는 프라이머를 그대로 이용할 수 있는 장점이 있다. 그러나 일반 PCR과 실시간 PCR의 반응조건에는 차이가 있기 때문에 추후 수행할 실시간 PCR 반응을 위하여, 프라이머의 농도 및 어닐링 온도 조건을 최적화하는 실험을 수행하였다(도 5 및 6). 상기 최적화 실험 수행 결과, SYBR Green을 사용한 실시간 PCR에서는 민감도가 1/103로 급속히 감소하는 것으로 나타났다(도 7).Real-time PCR method using SYBR Green, unlike the existing real-time PCR method does not require the production of a new primer, there is an advantage that can be used as the primer used in nested PCR. However, since the reaction conditions of general PCR and real-time PCR are different, experiments for optimizing primer concentration and annealing temperature conditions were performed for real-time PCR reactions to be performed later (FIGS. 5 and 6). As a result of the optimization experiment, the sensitivity was rapidly reduced to 1/103 in real-time PCR using SYBR Green (Fig. 7).
두 유전자에 대한 특이도 분석에서 신경모세포종 환자의 임상 검체와 non-NBL 혈액 검체를 사용하여 수행한 결과, 모두 양성으로 판명되었지만, 정상인 검체에서의 양성반응은 해리곡선(dissociation plot)의 멜팅(melting) 온도(Tm) 값을 통해 위양성임을 확인할 수 있었다(도 8). 결론적으로 SYBR Green을 사용한 실시간 PCR을 이용한 TH, DBH 검사법은 여전히 낮은 민감도와 특이도를 극복 할 수 없었다. 이러한 결과에 의해 해리곡선을 통한 재확인을 필요로 하였다.Specificity analysis of the two genes showed that both the clinical and non-NBL blood samples of neuroblastoma patients were positive. However, the positive response in the normal sample was melted in the dissociation plot. ) It was confirmed that the false positive through the temperature (Tm) value (Fig. 8). In conclusion, TH and DBH assays using real-time PCR using SYBR Green could not overcome low sensitivity and specificity. These results necessitated reconfirmation through the dissociation curve.
b) b) TaqmanTaqman 프로브를Probe 사용하는 실시간 Real time to use PCRPCR 에 의한 On by THTH 검사방법의 표준화 Standardization of inspection method
신기술인 Taqman 프로브를 사용하는 실시간 PCR을 실시하기 위하여, Lambooy, H 박사의 논문을 참조하여, 새로운 프라이머와 5’ 및 3’에 FAM(6-carboxyfluorescein)와 TAMRA (6-carboxytetramethylrhodamine) 형광물질이 각각 표지되어 있는 프로브를 제작하였다(도 9). Taqman® 프로브의 사용기술은 3 가지의 올리고 뉴클레오타이드를 사용하고, 이 3 가지 서열이 모두 주형과 일치하여 결합해야 비로소 유전자가 증폭되어 그래프로 확인을 할 수 있다. 먼저 프라이머 농도 및 어닐링 온도에 대한 PCR 조건을 확립하였다(도 10).To perform real-time PCR using the new Taqman probe, referring to Dr. Lambooy, Dr. H, the new primers and the FAM (6-carboxyfluorescein) and TAMRA (6-carboxytetramethylrhodamine) phosphors at 5 'and 3', respectively, Labeled probes were made (FIG. 9). Taqman® probe technology uses three oligonucleotides, all of which must be combined to match the template so that the gene can be amplified and identified. First PCR conditions for primer concentration and annealing temperature were established (FIG. 10).
Taqman® 프로브를 사용하는 실시간 PCR 방법에 따른 TH 검사를 수행한 결과, 네스티드 PCR 검사법과 동일한 1 NBL/106 정상세포의 민감도를 나타내었으며, 반면에 특이도 검사에서는 음성 검체 48 검체 중 2 검체만이 위양성으로 판정되어, 95.8%(46/48)의 특이도를 나타내는 것으로 분석되었고, 이는 네스티드 PCR의 88.4% (76/86) 수치보다 높은 특이도이다(표 4 및 도 11). 상기 결과를 근거로 Taqman® 프로브를 사용하는 실시간 PCR 검사법이 네스티드 PCR보다 더 특이적임을 입증하였다.The TH test using a real-time PCR method using Taqman® probe showed the same sensitivity of 1 NBL / 10 6 normal cells as the nested PCR test, whereas in the specificity test, 2 of 48 negative samples were tested. Only false positives were analyzed and showed a specificity of 95.8% (46/48), which is higher than the 88.4% (76/86) value of nested PCR (Table 4 and FIG. 11). Based on the results, real-time PCR assays using Taqman® probes proved more specific than nested PCR.
c) c) 혼성화Hybridization 프로브를Probe 사용하는 실시간 Real time to use PCRPCR 에 의한 On by THTH 검사방법의 표준화 Standardization of inspection method
혼성화 프로브 시스템은 Taqman® 프로브 시스템과는 다른 방식의 실시간 PCR 방법이다. 혼성화 프로브의 특징은 2 개의 프라이머와 2 개의 프로브를 사용하는 것을 특징으로 하며, 총 4 개의 서열이 주형과 일치하여야만 유전자 증폭이 이루어진다. 따라서 3 개의 올리고 뉴클레오타이드를 이용하는 Taqman® 프로브 시스템보다 더 특이적인 검사법으로서의 가능성을 보였다.Hybridization probe systems are a different real-time PCR method than Taqman® probe systems. Characterization of the hybridization probe is characterized by using two primers and two probes, gene amplification is required only when the total of four sequences match the template. Thus it has shown potential as a more specific assay than the Taqman® probe system using three oligonucleotides.
TH 유전자에 대해 혼성화 검사법에 적합한 프라이머와 프로브를 본 발명자가 직접 디자인 하였으며, Roche사에 의뢰하여 주문 제작하였다. PCR을 수행하기 위한 최적의 조건을 파악하기 위하여, 상기 제작된 프라이머-프로브 세트를 이용하여 적정 어닐링 온도, 프라이머와 프로브의 농도 그리고 MgCl2 농도를 예비 실험을 통해 확정하였다(도 12-14).Primers and probes suitable for the hybridization assay for the TH gene was designed by the inventors, and custom-made by Roche. In order to determine the optimal conditions for performing PCR, using the prepared primer-probe set, the proper annealing temperature, the concentration of primer and probe and the concentration of MgCl 2 were confirmed through preliminary experiments (FIGS. 12-14).
혼성화 프로브를 사용하는 실시간 PCR에 의한 TH 검사법의 결과에 따르면, 민감도는 1 NBL/105 정상세포로 나타났으며, 특이도 실험에서 18 개의 정상 혈액 검체에 대해 모두 음성으로 판정되어 100% (18/18)의 특이도를 나타내었다(도 15). 본 실험 결과는 Taqman® 프로브를 사용하는 실시간 PCR 방법에 비해 민감도는 조금 낮았지만, 특이도면에서 매우 우수하였다. The results of the TH test by real-time PCR using a hybridization probe showed that the sensitivity was 1 NBL / 10 5 normal cells, and all of the 18 normal blood samples in the specificity experiments were negative and were 100% (18 / 18) specificity (FIG. 15). The results of the experiments were slightly lower in sensitivity compared to real-time PCR using Taqman® probe, but were very good in specificity.
(4) 네스티드 PCR과 실시간 PCR간의 비교(4) Comparison between Nested PCR and Real-Time PCR
혼성화 프로브를 사용하는 실시간 PCR이 TH에 대한 PCR을 수행하였을 경우, 100%의 특이도를 기록하여 특이도 면에서는 가장 우수하였다. 네스티드 PCR 방법이 83%로 가장 낮은 특이도를 나타내었으며, 민감도는 100%로 모두 동일하였다. 민감도에서는 Taqman® 프로브를 사용하는 실시간 PCR이 가장 민감도 높은 1 NBL/106의 수치를 나타냈다(표 5).Real time PCR using hybridization probe was the best in terms of specificity when 100% specificity was recorded when PCR was performed for TH. Nested PCR showed the lowest specificity (83%) and the sensitivity was the same at 100%. For sensitivity, real-time PCR using Taqman® probes showed the highest sensitivity of 1 NBL / 10 6 (Table 5).
결론적으로 민감도 테스트에 있어서는 두 가지 실시간 PCR 방법이 모두 우수한 것으로 나타났으나, 특이도 테스트에 있어서는 Taqman® 프로브를 사용하는 실시간 PCR보다 혼성화 프로브를 사용하는 실시간 PCR이 우수한 것으로 확인하였다. 따라서 이를 임상진단에 이용할 경우에는 보다 정확한 진단이 요구된다는 점을 바탕으로 판단할 때 Taqman® 프로브를 사용하는 실시간 PCR보다는 혼성화 프로브를 사용하는 실시간 PCR 방법이 보다 효율적인 것으로 판단된다.In conclusion, both real-time PCR methods were superior in the sensitivity test, but the real-time PCR using hybridization probe was superior to the real-time PCR using Taqman® probe in the specificity test. Therefore, based on the fact that more accurate diagnosis is required for clinical diagnosis, real-time PCR method using hybridization probe is more efficient than real-time PCR using Taqman® probe.
위에서 상세히 설명한 바와 같이, 본 발명은 신경모세포종 세포의 검출방법 및 신경모세포종 세포를 검출하기 위한 키트를 제공한다. 본 발명에 따르면, 높은 민감도[약 1 신경세포종 세포/105 PBMC(peripheral blood mononuclear cell)] 및 특이도(약 100%)로 환자의 말초혈액 또는 골수혈액 내에 존재하는 미세 잔존 신경모세포종을 검출할 수 있으며, 이에 최종 치료 결정 시기 및 재발의 조기 발견 등에 대한 유용한 임상적 정보를 얻을 수 있다.As described in detail above, the present invention provides a method for detecting neuroblastoma cells and a kit for detecting neuroblastoma cells. According to the present invention, it is possible to detect microscopic residual neuroblastoma present in peripheral blood or bone marrow blood of a patient with high sensitivity [about 1 neurocytoma cell / 10 5 PBMC (peripheral blood mononuclear cell)] and specificity (about 100%). This may provide useful clinical information about the timing of the final treatment decision and early detection of recurrence.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.Having described the specific part of the present invention in detail, it is apparent to those skilled in the art that the specific technology is merely a preferred embodiment, and the scope of the present invention is not limited thereto. Thus, the substantial scope of the present invention will be defined by the appended claims and equivalents thereof.
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