KR20210120737A - The composition for detecting mutations of PIK3CA and the kit consisting of the compounds - Google Patents

Abstract

The present invention relates to a primer and probe set composition for detecting mutations of PIK3CA and a kit comprising the same. Information required for evaluating the prognosis of cancer, predicting the risk of mutation generation, predicting treatment responsiveness to a specific therapeutic agent, or conducting targeted treatment of cancer patients can be provided by using the primer and probe set composition according to the present invention. Accordingly, the composition can be usefully used for the purpose of providing clues about the direction of future treatment and the monitoring of metastasis or recurrence of cancer, as well as decision on need for administration of an anticancer agent.

Description

PIK3CA 돌연변이 검출용 조성물 및 이를 포함하는 키트{The composition for detecting mutations of PIK3CA and the kit consisting of the compounds}The composition for detecting mutations of PIK3CA and the kit consisting of the compounds}

본 발명은 PIK3CA 돌연변이 검출용 조성물 및 이를 포함하는 키트에 관한 것으로, 보다 상세하게는 PIK3CA 돌연변이 검출용 프라이머, 프로브 세트 조성물과 상기 조성물을 포함하는 PIK3CA 돌연변이 검출용 키트 및 상기 조성물을 이용한 암의 예후 평가, 돌연변이 발생 위험도 예측 또는 표적치료에 필요한 정보를 제공하는 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a composition for detecting PIK3CA mutation and a kit comprising the same, and more particularly, to a primer for detecting PIK3CA mutation, a probe set composition, a kit for detecting PIK3CA mutation comprising the composition, and evaluation of cancer prognosis using the composition , to a method for predicting the risk of mutation or providing information necessary for targeted therapy.

유전체(genome)란 한 생물이 가지는 모든 유전 정보를 말한다. 어느 한 개인의 유전체의 시퀀싱(sequencing)을 위하여, DNA 칩 및 차세대 서열화(Next Generation Sequencing) 기술, 차차세대 서열화(Next Next Generation Sequencing) 기술 등 여러 기술들이 개발되고 있다. 핵산 서열, 단백질 등과 같은 유전 정보들은 분석은 당뇨병, 암과 같은 질병을 발현시키는 유전자를 찾거나, 유전적 다양성과 개체의 발현 특성 간의 상관관계 등을 파악하기 위하여 폭넓게 활용된다. 특히, 개인으로부터 수집된 유전 데이터는 서로 다른 증상이나 질병의 진행과 관련된 개인의 유전적인 특징을 규명하는데 있어서 중요하다. 따라서, 개인의 핵산 서열, 단백질 등과 같은 유전 데이터는 현재와 미래의 질병 관련 정보를 파악하여 질병을 예방하거나 질병의 초기 단계에서 최적의 치료 방법을 선택할 수 있도록 하는 핵심적인 데이터이다. 생물의 유전 정보들로서 SNP(Single Nucleotide Polymorphism), CNV(Copy Number Variation) 등을 검출하는 유전체 검출 장비를 활용하여 개인의 유전 데이터를 정확히 분석하고, 개인의 질병을 진단하는 기술들이 연구 중에 있다.Genome refers to all the genetic information of an organism. For the sequencing of an individual's genome, various technologies such as a DNA chip, a next generation sequencing technology, and a next generation sequencing technology are being developed. Analysis of genetic information such as nucleic acid sequences and proteins is widely used to find genes that express diseases such as diabetes and cancer, or to identify correlations between genetic diversity and expression characteristics of individuals. In particular, genetic data collected from individuals is important in identifying the genetic characteristics of individuals related to different symptoms or disease progression. Therefore, genetic data such as an individual's nucleic acid sequence, protein, etc. are key data for preventing disease or selecting an optimal treatment method at an early stage of disease by identifying current and future disease-related information. Research is under way to accurately analyze individual genetic data and diagnose individual diseases using genome detection equipment that detects SNP (Single Nucleotide Polymorphism) and CNV (Copy Number Variation) as genetic information of living things.

한편, 암의 발생에 암유전자(oncogene) 및 종양억제유전자(tumor suppressor gene)의 돌연변이가 관여한다는 사실이 알려지면서 여러 암유전자 및 종양억제유전자의 돌연변이를 검출하는 연구가 다양하게 진행되고 있다. 이에 따라, 암의 발생 및 약물의 예후판단에 관여하는 많은 돌연변이가 발견되고 있다. On the other hand, as it is known that mutations of oncogenes and tumor suppressor genes are involved in the development of cancer, various studies are being conducted to detect mutations in various oncogenes and tumor suppressor genes. Accordingly, many mutations involved in the development of cancer and the prognosis of drugs have been discovered.

이 중 PIK3CA 유전자의 돌연변이는 PI3K(Phosphatidylinositol 3-kinase) 단백질의 활성화를 가져오고 PI3K는 타이로신 키나아제 수용체의 신호전달 체계를 활성화한다. 활성화된 타이로신 키나아제는 세포의 생존과 분열을 억제하는 단백질의 기능과 대사촉진을 방해하며 세포 성장을 돕는 단백질의 기능을 활성화시킴으로써 발암과정에 관여한다. PIK3CA 유전자 돌연변이는 암 진행 속도를 빠르게 하고 전이 빈도를 증가시켜 환자의 예후를 악화시킨다. 또한 인간 표피성장인자류(Human Epidermal Growth Factor, HER family)의 하류부분(downstream)의 신호전달 체계에 속하여 HER 패밀리의 표적 치료제들의 내성에 관여하는 것으로 알려져 있다Among them, the mutation of the PIK3CA gene results in the activation of PI3K (Phosphatidylinositol 3-kinase) protein, and PI3K activates the signaling system of the tyrosine kinase receptor. Activated tyrosine kinase is involved in the carcinogenesis process by activating the function of the protein that inhibits cell survival and division and the metabolic promotion, and activates the function of the protein that helps cell growth. Mutations in the PIK3CA gene accelerate the rate of cancer progression and increase the frequency of metastasis, making the patient's prognosis worse. In addition, it belongs to the signaling system of the downstream part of the Human Epidermal Growth Factor (HER family) and is known to be involved in the resistance of the HER family's target therapeutics.

따라서 암의 예후, 돌연변이 발생 위험도 측정, 특정 치료제에 대한 반응성 예측 또는 암 환자의 약물치료 전략 수립 등을 위한 PIK3CA 유전자 돌연변이 검출 방법이 널리 연구되고 있으나 아직 뚜렷한 성과를 얻지 못하고 있다.Therefore, PIK3CA gene mutation detection methods for cancer prognosis, mutation risk measurement, prediction of responsiveness to specific therapeutic agents, or drug treatment strategies for cancer patients have been widely studied, but no clear results have been obtained yet.

이에 본 발명자들은 PIK3CA 돌연변이를 신속하게 검출하여 PIK3CA 돌연변이와 관련된, 암의 예후, 돌연변이 발생 위험도 측정, 특정 치료제에 대한 반응성 예측 또는 암 환자의 약물치료 전략 수립을 할 수 있는 프라이머/프로브 세트를 발굴하고, 이에 적합한 키트를 개발함으로써 본 발명을 완성하였다.Accordingly, the present inventors discovered a primer/probe set that can rapidly detect PIK3CA mutations and establish a PIK3CA mutation-related, cancer prognosis, mutation risk measurement, responsiveness prediction to a specific therapeutic agent, or drug treatment strategy for cancer patients. , completed the present invention by developing a kit suitable for this.

따라서 본 발명의 목적은 PIK3CA 돌연변이 검출용 프라이머 및 프로브 세트 조성물을 제공하는 것이다.Accordingly, it is an object of the present invention to provide a primer and probe set composition for detecting PIK3CA mutations.

또한 본 발명의 다른 목적은 PIK3CA 돌연변이 검출용 프라이머 및 프로브 세트 조성물을 유효성분으로 포함하는 PIK3CA 돌연변이 검출용 키트를 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a kit for detecting PIK3CA mutations comprising a primer and a probe set composition for detecting PIK3CA mutations as active ingredients.

또한 본 발명의 다른 목적은 PIK3CA 돌연변이 검출용 프라이머 및 프로브 세트 조성물을 이용한 암의 예후 평가 또는 돌연변이 발생 위험도 예측에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a method for providing information necessary for prognostic evaluation of cancer or mutation risk prediction using a primer and probe set composition for detecting PIK3CA mutations.

또한 본 발명의 다른 목적은 PIK3CA 돌연변이 검출용 프라이머 및 프로브 세트 조성물을 이용한 암의 표적치료에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a method for providing information necessary for targeted treatment of cancer using a PIK3CA mutation detection primer and probe set composition.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 PIK3CA 돌연변이 검출용 프라이머 및 프로브 세트 조성물을 제공한다.In order to achieve the above object, the present invention provides a primer and probe set composition for detecting PIK3CA mutation.

본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 PIK3CA 돌연변이 검출용 프라이머 및 프로브 세트 조성물을 유효성분으로 포함하는 PIK3CA 돌연변이 검출용 키트를 제공한다.In order to achieve another object of the present invention, the present invention provides a kit for detecting PIK3CA mutations comprising a primer and a probe set composition for detecting PIK3CA mutations as active ingredients.

또한 본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 PIK3CA 돌연변이 검출용 프라이머 및 프로브 세트 조성물을 이용한 암의 예후 평가 또는 돌연변이 발생 위험도 예측에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.In addition, in order to achieve another object of the present invention, the present invention provides a method for providing information necessary for evaluating the prognosis of cancer or predicting the risk of mutation using a primer and probe set composition for detecting PIK3CA mutations.

또한 본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 PIK3CA 돌연변이 검출용 프라이머 및 프로브 세트 조성물을 이용한 암의 표적치료에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.In addition, in order to achieve another object of the present invention, the present invention provides a method for providing information necessary for targeted treatment of cancer using a PIK3CA mutation detection primer and probe set composition.

다른 정의가 없는 한, 본 명세서에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 당업자들에 의해 통상적으로 이해되는 동일한 의미를 가진다. 다음의 참고문헌은 본 발명의 명세서에 사용된 여러 용어들의 일반적인 정의를 갖는 기술(skill)의 하나를 제공한다: Singleton et al., DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY(2th ed. 1994); THE CAMBRIDGE DICTIONARY OF SCIENCE AND TECHNOLOGY(Walkered., 1988); 및 Hale & Marham, THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY.Unless otherwise defined, all technical and scientific terms used herein have the same meaning as commonly understood by one of ordinary skill in the art. The following references provide one skill with general definitions of several terms used herein: Singleton et al., DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY (2th ed. 1994); THE CAMBRIDGE DICTIONARY OF SCIENCE AND TECHNOLOGY (Walkered., 1988); and Hale & Marham, THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY.

이하 본 발명을 상세히 설명한다. Hereinafter, the present invention will be described in detail.

본 발명은 ⅰ) 서열번호 1의 정방향 프라이머, 서열번호 2의 역방향 프라이머, 서열번호 3의 정방향 프라이머, 서열번호 4의 역방향 프라이머 및 서열번호 15 내지 20으로 이루어진 군에서 선택된 프로브의 폴리뉴클레오티드 세트; The present invention provides a polynucleotide set of probes selected from the group consisting of i) the forward primer of SEQ ID NO: 1, the reverse primer of SEQ ID NO: 2, the forward primer of SEQ ID NO: 3, the reverse primer of SEQ ID NO: 4 and SEQ ID NOs: 15 to 20;

ⅱ) 서열번호 3의 정방향 프라이머, 서열번호 4의 역방향 프라이머, 서열번호 5의 정방향 프라이머, 서열번호 6의 역방향 프라이머 및 서열번호 21 내지 27로 이루어진 군에서 선택된 프로브의 폴리뉴클레오티드 세트;ii) a polynucleotide set of a probe selected from the group consisting of the forward primer of SEQ ID NO: 3, the reverse primer of SEQ ID NO: 4, the forward primer of SEQ ID NO: 5, the reverse primer of SEQ ID NO: 6 and SEQ ID NOs: 21 to 27;

ⅲ) 서열번호 3의 정방향 프라이머, 서열번호 4의 역방향 프라이머, 서열번호 7의 정방향 프라이머, 서열번호 8의 역방향 프라이머 및 서열번호 28 내지 33으로 이루어진 군에서 선택된 프로브의 폴리뉴클레오티드 세트;iii) a polynucleotide set of a probe selected from the group consisting of a forward primer of SEQ ID NO: 3, a reverse primer of SEQ ID NO: 4, a forward primer of SEQ ID NO: 7, a reverse primer of SEQ ID NO: 8 and SEQ ID NOs: 28 to 33;

ⅳ) 서열번호 11의 정방향 프라이머, 서열번호 12의 역방향 프라이머, 서열번호 13의 정방향 프라이머, 서열번호 14의 역방향 프라이머 및 서열번호 34 내지 38으로 이루어진 군에서 선택된 프로브의 폴리뉴클레오티드 세트;iv) a polynucleotide set of a probe selected from the group consisting of a forward primer of SEQ ID NO: 11, a reverse primer of SEQ ID NO: 12, a forward primer of SEQ ID NO: 13, a reverse primer of SEQ ID NO: 14 and SEQ ID NOs: 34 to 38;

ⅴ) 서열번호 3의 정방향 프라이머, 서열번호 4의 역방향 프라이머, 서열번호 13의 정방향 프라이머, 서열번호 14의 역방향 프라이머 및 서열번호 39 내지 41로 이루어진 군에서 선택된 프로브의 폴리뉴클레오티드 세트; 및v) a polynucleotide set of a probe selected from the group consisting of a forward primer of SEQ ID NO: 3, a reverse primer of SEQ ID NO: 4, a forward primer of SEQ ID NO: 13, a reverse primer of SEQ ID NO: 14 and SEQ ID NOs: 39 to 41; and

ⅵ) 서열번호 3의 정방향 프라이머, 서열번호 4의 역방향 프라이머, 서열 번호 9의 정방향 프라이머, 서열번호 10의 역방향 프라이머 및 서열번호 42 내지 43으로 이루어진 프로브의 폴리뉴클레오티드 세트; 로 이루어진 군에서 선택된 세트를 유효성분으로 포함하는 PIK3CA 돌연변이 검출용 프라이머 및 프로브 세트 조성물을 제공한다.vi) a polynucleotide set of a probe consisting of the forward primer of SEQ ID NO: 3, the reverse primer of SEQ ID NO: 4, the forward primer of SEQ ID NO: 9, the reverse primer of SEQ ID NO: 10 and SEQ ID NOs: 42 to 43; It provides a primer and probe set composition for detecting PIK3CA mutation comprising a set selected from the group consisting of as an active ingredient.

상기 “PIK3CA”는 포스파티딜이노시톨 3-키나아제(phosphoinositide 3-kinase, PI3K)의 유전자로, 상기 PI3K는 세포 신호전달에 관여하는, 포스파티딜이노시톨 4,5-비스인산(phosphatidyl-inositol 4,5-bisphosphate, PIP₂)을 포스파티딜이노시톨 3,4,5-트리스인산(Phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate, PIP₃)으로 인산화시키는 반응을 촉매하는 지질 키나아제이다. PI3K는 구조, 작용 기작, 기질 특이성에 근거하여 클래스 I, II, III로 구분된다. 그 중 클래스 IB PI3K는 p110γ를 포함하며, 이는 G단백질 결합 수용체에 의해 활성화된다. p110α를 통한 세포 신호전달 경로는 인간 암세포에서 과다하게 활성화된다. 그리고 PI3K 세포 신호전달 경로가 비정상적으로 조절되면 PIP₃의 수치가 높아져 하위 효소인 Akt를 활성화시키고, 결과적으로 암, 면역 장애, 심혈관 장애에 영향을 미치게 된다. 게다가, p110α를 암호화하는 PIK3CA 유전자는 다양한 원발성 암에서 변이되어 과다 발현된다. The “PIK3CA” is a gene of phosphatidylinositol 3-kinase (phosphoinositide 3-kinase, PI3K), wherein the PI3K is involved in cell signaling, phosphatidyl-inositol 4,5-bisphosphate, It is a lipid kinase that catalyzes the phosphorylation of PIP₂) to phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate (PIP₃). PI3Ks are divided into classes I, II, and III based on structure, mechanism of action, and substrate specificity. Among them, class IB PI3K includes p110γ, which is activated by G protein-coupled receptors. Cell signaling pathways through p110α are over-activated in human cancer cells. And when the PI3K cell signaling pathway is abnormally regulated, the level of PIP₃ increases, which activates the lower enzyme Akt, which in turn affects cancer, immune disorders, and cardiovascular disorders. Furthermore, the PIK3CA gene encoding p110α is mutated and overexpressed in various primary cancers.

PIK3CA 유전자의 돌연변이는 PI3K 단백질의 활성화를 가지고 오며, 이를 통해 타이로신 키나아제 수용체(tyrosine kinase receptor)의 신호전달 체계 활성화를 야기한다. 활성화된 타이로신 키나아제는 세포의 생존과 분열을 억제하는 단백질의 기능과 대사 촉진을 방해하며, 세포 성장을 돕는 단백질의 기능을 활성화시켜 발암 과정에 관여한다.Mutations in the PIK3CA gene lead to activation of the PI3K protein, thereby causing activation of the signaling system of the tyrosine kinase receptor. Activated tyrosine kinase interferes with the function of the protein that inhibits cell survival and division and the promotion of metabolism, and is involved in the carcinogenesis process by activating the function of the protein that helps cell growth.

따라서 상기 PIK3CA 돌연변이를 검출할 수 있는 본 발명의 조성물은 이에 제한되지는 않으나, 암의 예후 평가 또는 돌연변이 발생 위험도 예측에 필요한 정보를 제공하는데 활용될 수 있다. 또한 본 발명의 조성물은 암의 표적 치료에 필요한 정보를 제공하기 위하여 활용될 수 있다.Therefore, the composition of the present invention capable of detecting the PIK3CA mutation is not limited thereto, but may be utilized to provide information necessary for prognosis evaluation of cancer or prediction of mutation risk. In addition, the composition of the present invention may be utilized to provide information necessary for targeted treatment of cancer.

더불어 최근 보고된 논문에 의하면, HER2(Human Epidermal Growth Factor Receptor 2) 유전자가 증폭된 유방암에 티로신 키나제 일종인 허셉틴(Herceptin)이라는 약제의 처방이 치료예후를 좋게 하는 것으로 알려져 있지만, HER2 유전자의 증폭과 더불어 PIK3CA 유전자의 돌연변이를 가질 경우 허셉틴에 대한 내성을 가진다고 보고되어 있다(O'Brien NA et al., Mol Cancer Ther. 2010 Jun;9(6):1489-502 참고). PI3K는 이를 표적으로 하는 치료제의 개발에 중요한 요소로 그 중요성이 증가되고 있다. 따라서 PIK3CA 돌연변이 검출은 인간 표피성장인자를 표적으로 치료하는 방법에 있어 치료효과를 예측할 수 있는 중요한 지표이며 좋은 예후에 결정적인 역할을 할 수 있다.In addition, according to a recently reported paper, the prescription of a drug called Herceptin, a type of tyrosine kinase, for breast cancer in which the HER2 (Human Epidermal Growth Factor Receptor 2) gene is amplified is known to improve the treatment prognosis. In addition, it has been reported that when the PIK3CA gene mutation has resistance to Herceptin (see O'Brien NA et al., Mol Cancer Ther. 2010 Jun; 9(6): 1489-502). PI3K is an important factor in the development of therapeutic agents that target it, and its importance is increasing. Therefore, the detection of PIK3CA mutation is an important indicator for predicting the therapeutic effect in a method for targeting human epidermal growth factor and can play a decisive role in good prognosis.

따라서 본 발명의 조성물은 바람직하게는 PIK3CA 저해제 약물에 대한 치료 반응성(responsiveness) 예측을 위한 것일 수 있다. PIK3CA 저해제 치료법 사용이 고려되는 모든 환자는 PIK3CA 돌연변이 확인을 위한 검사가 수행되어야 한다. 상기 치료법은 바람직하게는 피크레이 (Piqray, alpelisib), 자이델릭 (Zydelig, idelalisib), 알리코파 (Aliqopa, copanlisib), 코픽트라 (Copiktra, duvelisib)으로 이뤄진 군에서 선택된 어느 하나의 PIK3CA 저해제를 사용하는 것일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.Therefore, the composition of the present invention may preferably be for predicting therapeutic responsiveness to a PIK3CA inhibitor drug. All patients for whom PIK3CA inhibitor therapy should be considered should be screened for PIK3CA mutations. The treatment is preferably using any one PIK3CA inhibitor selected from the group consisting of Piqray (Piqray, alpelisib), Zydelig (Zydelig, idelalisib), Aliqopa (Copanlisib), and Copiktra (Copiktra, duvelisib) may be, but is not limited thereto.

따라서 본 발명의 조성물은 바람직하게는 HER2 약물에 대한 치료 반응성 (responsiveness) 예측을 위한 것일 수 있다. 항-HER2 치료법 사용이 고려되는 모든 환자는 PIK3CA 돌연변이 확인을 위한 검사가 수행되어야 하며, PIK3CA 돌연변이가 검출된다면 환자는 항-HER2 치료로부터 배제되어야만 한다. Therefore, the composition of the present invention may preferably be for predicting therapeutic responsiveness to a HER2 drug. All patients contemplated for use of anti-HER2 therapy should be tested for PIK3CA mutations, and if PIK3CA mutations are detected, patients should be excluded from anti-HER2 therapy.

상기 항-HER2 치료요법은 바람직하게는 허셉틴(Herceptin), 페르투주맙(Pertuzumab), MM-111, 네라티닙(Neratinib), 라파티닙(Lapatinib) 및 라파티닙 디토실레이트(lapatinib ditosylate)/타이커브(Tykerb)^®로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 HER2 저해제를 사용하는 것일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. The anti-HER2 therapy is preferably Herceptin, Pertuzumab, MM-111, Neratinib, Lapatinib and Lapatinib ditosylate/Tykerb ) ^® may be to use any one HER2 inhibitor selected from the group consisting of, but is not limited thereto.

본 발명에서 “치료 반응성”은 암의 성장률이 치료제와 접촉하지 않은 경우의 성장과 비교해서 치료제와 접촉한 결과로서 억제된다면 치료제에 대해서 ‘반응성’이라고 정의할 수 있다. 암의 성장률이 치료제와 접촉하지 않은 경우의 성장과 비교해서 치료제와 접촉한 결과로서 매우 낮은 정도로 억제되거나 억제되지 않는다면 치료제에 대해서 “비반응성”이라고 정의할 수 있다. 암의 성장은 종양의 크기 또는 그 종양 유형에 적합한 종양 마커의 발현을 측정하는 방법 등 다양한 방식으로 측정될 수 있다. 또한 상기 “반응성”에는 유의미한 생존곡선상의 생존시기의 증가를 나타낼 수 있으며, “비반응성”의 척도는 환자의 삶의 질, 전이도 등을 비롯하여 종양의 성장 크기를 넘는 추가의 기준을 이용해서 평가될 수 있다. In the present invention, "therapeutic responsiveness" can be defined as 'reactivity' to a therapeutic agent if the growth rate of cancer is inhibited as a result of contact with a therapeutic agent compared to growth when not in contact with the therapeutic agent. Cancer can be defined as “non-responsive” to a treatment if the growth rate of the cancer is suppressed or not suppressed to a very low degree as a result of contact with a treatment compared to growth without contact with the treatment. Cancer growth can be measured in a variety of ways, such as by measuring the size of a tumor or the expression of a tumor marker suitable for that tumor type. In addition, the “reactivity” may indicate a significant increase in survival time on the survival curve, and the measure of “non-reactivity” is evaluated using additional criteria beyond the growth size of the tumor, including the patient's quality of life and metastasis. can be

본 발명의 상기 암은 대장암, 위암, 폐암, 췌장암, 두부 편평상피세포암, 교모세포종, 자궁내막암, 난소암 및 유방암으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.The cancer of the present invention may be one or more selected from the group consisting of colon cancer, stomach cancer, lung cancer, pancreatic cancer, head squamous cell carcinoma, glioblastoma, endometrial cancer, ovarian cancer, and breast cancer, but is not limited thereto.

본 발명에서 “프라이머”는 올리고뉴클레오타이드를 의미하는 것으로, 핵산쇄(주형)에 상보적인 프라이머 연장 산물의 합성이 유도되는 조건, 즉, 뉴클레오타이드와 DNA 중합효소와 같은 중합제의 존재, 그리고 적합한 온도와 pH의 조건에서 합성의 개시점으로 작용할 수 있다. 바람직하게는, 프라이머는 디옥시리보뉴클레오타이드이며 단일쇄이다. 본 발명에서 이용되는 프라이머는 자연(naturally occurring) dNMP(즉, dAMP, dGMP, dCMP 및 dTMP), 변형 뉴클레오타이드 또는 비-자연 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 또한, 프라이머는 리보뉴클레오타이드도 포함할 수 있다.In the present invention, “primer” refers to an oligonucleotide, and conditions that induce the synthesis of a primer extension product complementary to the nucleic acid chain (template), that is, the presence of nucleotides and a polymerization agent such as DNA polymerase, and a suitable temperature and It can serve as a starting point for synthesis under the conditions of pH. Preferably, the primer is a deoxyribonucleotide and is single-stranded. The primer used in the present invention may include naturally occurring dNMP (ie, dAMP, dGMP, dCMP, and dTMP), modified nucleotides, or non-natural nucleotides. In addition, the primer may also include ribonucleotides.

프라이머는, 중합제의 존재 하에서 연장 산물의 합성을 프라이밍시킬 수 있을 정도로 충분히 길어야 한다. 프라이머의 적합한 길이는 다수의 요소, 예컨대, 온도, 응용분야 및 프라이머의 소스(source)에 따라 결정되지만 전형적으로 15-30 뉴클레오타이드이다. 짧은 프라이머 분자는 주형과 충분히 안정된 혼성 복합체를 형성하기 위하여 일반적으로 보다 낮은 온도를 요구한다. 용어 “어닐링” 또는 “프라이밍”은 주형 핵산에 올리고디옥시뉴클레오타이드 또는 핵산이 병치(apposition)되는 것을 의미하며, 상기 병치는 중합효소가 뉴클레오타이드를 중합시켜 주형 핵산 또는 그의 일부분에 상보적인 핵산 분자를 형성하게 한다.The primer should be long enough to prime the synthesis of extension products in the presence of a polymerizer. A suitable length of a primer depends on a number of factors, such as temperature, application, and source of the primer, but is typically 15-30 nucleotides. Short primer molecules generally require lower temperatures to form sufficiently stable hybrid complexes with the template. The term “annealing” or “priming” refers to the apposition of an oligodeoxynucleotide or nucleic acid to a template nucleic acid, wherein the apposition is a polymerase polymerizing the nucleotides to form a nucleic acid molecule complementary to the template nucleic acid or a portion thereof. make it

본 발명에서 “프로브”는 정량적 PCR에 이용되는 taqman probe의 일종으로 디자인된 것이다. 바람직하게는 프로브에는 형광 물질(HEX, VIC, FAM dye)를 부착하였으며, 모든 프로브의 3'쪽에는 ??쳐(quencher)로 BHQ1이 이용될 수 있다. TaqMan probe는 일반적으로 5‘ 말단을 형광 물질로, 3’ 말단을 quencher 물질로 tagging한 oligonucleotide이며, TaqMan probe는 annealing step에서 template DNA에 특이적으로 hybridization하지만, probe의 3‘ 말단에 quencher가 있기 때문에 빛을 주어도 형광을 발하지 못하지만, 다음 과정인 extension step에서 Taq DNA polymerase가 가지고 있는 5’→3‘ exonuclease 활성에 의해, 주형에 hybridization한 TaqMan probe가 분해되면 형광물질이 probe로부터 분리되어 quencher에 의한 억제가 해제되고 형광을 발하게 되는 원리에 의해서 PCR 반응에 따른 형광이 정량적으로 발하게 된다. In the present invention, “probe” is designed as a kind of taqman probe used for quantitative PCR. Preferably, a fluorescent material (HEX, VIC, FAM dye) is attached to the probe, and BHQ1 may be used as a quencher on the 3' side of all probes. TaqMan probes are generally oligonucleotides tagged with a fluorescent material at the 5' end and a quencher at the 3' end. TaqMan probes specifically hybridize to template DNA in the annealing step, but because there is a quencher at the 3' end of the probe. Although it does not emit fluorescence even when given light, when the TaqMan probe hybridized to the template is decomposed by the 5' → 3' exonuclease activity of Taq DNA polymerase in the extension step, the fluorescence material is separated from the probe and suppressed by the quencher According to the principle of releasing and emitting fluorescence, fluorescence according to the PCR reaction is emitted quantitatively.

본 발명에서 프로브는 형광물질과 결합되어 있는 것을 특징으로 하며, 보다 바람직하게는 HEX(hexachlorofluorescein), FAM(fluorescein amidite), EverGreen 형광염료가 결합되는 것을 특징으로 한다. In the present invention, the probe is characterized in that it is combined with a fluorescent material, and more preferably, HEX (hexachlorofluorescein), FAM (fluorescein amidite), and EverGreen fluorescent dye are combined.

구체적으로 프로브에 FAM, HEX 형광염료(형광물질) 또는 EvaGreen 형광염료가 결합된 형태를 사용하였으므로 이들에 대한 형광을 측정하는 것에 의해서 수행될 수 있다. 이와 같은 과정은 상용의 검출장치(예를 들어, biorad사의 Droplet Reader)에 의해서 수행될 수 있으며, 해당 장치내에서 각각의 샘플의 droplet 형광 신호를 각각 감지 및 positive와 negative droplet의 수를 세어 자동으로 분석까지 완료될 수 있다.Specifically, since a form in which FAM, HEX fluorescent dye (fluorescent material) or EvaGreen fluorescent dye is bound to the probe is used, it can be performed by measuring the fluorescence of these. Such a process can be performed by a commercial detection device (eg, droplet reader from biorad), and automatically detects the droplet fluorescence signal of each sample and counts the number of positive and negative droplets in the device. analysis can be completed.

이 때 검출을 위해서 PCR 반응 용액에 첨가되는 프로브 및 표준 PCR 반응 용액에 첨가되는 프로브는 각각 상이한 형광물질과 결합되어 있을 수 있다.At this time, the probe added to the PCR reaction solution and the probe added to the standard PCR reaction solution for detection may be bound to different fluorescent substances, respectively.

본 발명은 본 발명의 프라이머 및 프로브 세트를 포함하는 PIK3CA 돌연변이 검출용 키트를 제공한다.The present invention provides a kit for detecting PIK3CA mutation comprising the primer and probe set of the present invention.

본 발명은ⅰ) 서열번호 1의 정방향 프라이머, 서열번호 2의 역방향 프라이머, 서열번호 3의 정방향 프라이머, 서열번호 4의 역방향 프라이머 및 서열번호 15내지 20로 이루어진 군에서 선택된 프로브의 폴리뉴클레오티드 세트; The present invention provides a polynucleotide set of probes selected from the group consisting of i) a forward primer of SEQ ID NO: 1, a reverse primer of SEQ ID NO: 2, a forward primer of SEQ ID NO: 3, a reverse primer of SEQ ID NO: 4 and SEQ ID NOs: 15 to 20;

ⅱ) 서열번호 3의 정방향 프라이머, 서열번호 4의 역방향 프라이머, 서열번호 5의 정방향 프라이머, 서열번호 6의 역방향 프라이머 및 서열번호 21 내지 27으로 이루어진 군에서 선택된 프로브의 폴리뉴클레오티드 세트;ii) a polynucleotide set of a probe selected from the group consisting of a forward primer of SEQ ID NO: 3, a reverse primer of SEQ ID NO: 4, a forward primer of SEQ ID NO: 5, a reverse primer of SEQ ID NO: 6 and SEQ ID NOs: 21 to 27;

ⅲ) 서열번호 3의 정방향 프라이머, 서열번호 4의 역방향 프라이머, 서열번호 7의 정방향 프라이머, 서열번호 8의 역방향 프라이머 및 서열번호 28 내지 33으로 이루어진 군에서 선택된 프로브의 폴리뉴클레오티드 세트;iii) a polynucleotide set of a probe selected from the group consisting of a forward primer of SEQ ID NO: 3, a reverse primer of SEQ ID NO: 4, a forward primer of SEQ ID NO: 7, a reverse primer of SEQ ID NO: 8 and SEQ ID NOs: 28 to 33;

ⅳ) 서열번호 11의 정방향 프라이머, 서열번호 12의 역방향 프라이머, 서열번호 13의 정방향 프라이머, 서열번호 14의 역방향 프라이머 및 서열번호 34 내지 38으로 이루어진 군에서 선택된 프로브의 폴리뉴클레오티드 세트;iv) a polynucleotide set of a probe selected from the group consisting of a forward primer of SEQ ID NO: 11, a reverse primer of SEQ ID NO: 12, a forward primer of SEQ ID NO: 13, a reverse primer of SEQ ID NO: 14 and SEQ ID NOs: 34 to 38;

ⅴ) 서열번호 3의 정방향 프라이머, 서열번호 4의 역방향 프라이머, 서열번호 13의 정방향 프라이머, 서열번호 14의 역방향 프라이머 및 서열번호 39 내지 41로 이루어진 군에서 선택된 프로브의 폴리뉴클레오티드 세트; 및v) a polynucleotide set of a probe selected from the group consisting of a forward primer of SEQ ID NO: 3, a reverse primer of SEQ ID NO: 4, a forward primer of SEQ ID NO: 13, a reverse primer of SEQ ID NO: 14 and SEQ ID NOs: 39 to 41; and

ⅵ) 서열번호 3의 정방향 프라이머, 서열번호 4의 역방향 프라이머, 서열 번호 9의 정방향 프라이머, 서열번호 10의 역방향 프라이머 및 서열번호 42 내지 43으로 이루어진 프로브의 폴리뉴클레오티드 세트; 로 이루어진 군에서 선택된 세트를 유효성분으로 포함하는 PIK3CA 돌연변이 검출용 키트를 제공한다.vi) a polynucleotide set of a probe consisting of the forward primer of SEQ ID NO: 3, the reverse primer of SEQ ID NO: 4, the forward primer of SEQ ID NO: 9, the reverse primer of SEQ ID NO: 10 and SEQ ID NOs: 42 to 43; It provides a kit for detecting PIK3CA mutations comprising a set selected from the group consisting of as an active ingredient.

본 발명의 키트는 바람직하게는 본 발명의 프라이머/프로브 세트를 이용한 PCR 반응에 의한 PIK3CA 돌연변이 검출에 이용될 수 있다. 본 발명의 키트는 PCR 이나 이의 검출에 사용되는 당 업계에 공지된 도구 및/또는 시약을 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 키트는 필요에 따라 각 성분들을 혼합하는데 사용될 튜브, 웰 플레이트, 사용방법을 기재한 지시자료 등을 추가로 포함할 수 있다.The kit of the present invention can be preferably used for detecting PIK3CA mutation by PCR reaction using the primer/probe set of the present invention. The kit of the present invention may further include tools and/or reagents known in the art for use in PCR or detection thereof. The kit of the present invention may further include a tube to be used for mixing each component, a well plate, instructions for use, and the like, if necessary.

아울러, 본 발명의 키트는 RUO(research use only) 또는 IVD(in vitro diagnostics) 키트일 수 있다. IVD 키트에는 IVD-CDx(in vitro companion diagnostics) 키트도 포함된다.In addition, the kit of the present invention may be a research use only (RUO) or in vitro diagnostics (IVD) kit. IVD kits also include IVD-CDx (in vitro companion diagnostics) kits.

본 발명의 키트는 digital PCR 또는 qPCR (quantitative PCR) 방법에 사용되는 것이며, 상기 digital PCR은 ddPCR(Droplet Digital PCR)인 것이 보다 바람직하다. The kit of the present invention is used for digital PCR or qPCR (quantitative PCR) method, and the digital PCR is more preferably ddPCR (Droplet Digital PCR).

본 발명의 상기 'ddPCR(Droplet Digital PCR)'은 2세대 PCR인 qPCR(quantitative PCR (real-time PCR))이 갖는 PCR의 효율에 따라 결과 값에 편차가 생길 수 있는 단점을 보완하기 위해 고안된 것으로, 20ul의 PCR 반응을 1nl의 수 만개 방울로 쪼개어 증폭시킨 후, target DNA를 계수할 수 있다. 또한 Target DNA의 증폭 여부에 따라 positive와 negative 만을 구분하여 프아송 분포를 통해 Target DNA의 copy를 계산해주기 때문에, 기존의 정량 PCR과는 달리 표준곡선 없이 절대정량이 가능하며 수 만 개의 방울로 쪼개어 PCR 반응을 진행하기 때문에 기존의 qPCR보다 높은 민감도와 정확도를 보여주며, PCR 효율에 따른 영향을 받지 않아 항상 일정한 결과 값을 얻을 수 있다.The 'ddPCR (Droplet Digital PCR)' of the present invention is designed to compensate for the disadvantage that the result value may vary depending on the PCR efficiency of qPCR (quantitative PCR (real-time PCR)), which is the second generation PCR. , After amplifying the PCR reaction by dividing it into tens of thousands of drops of 1nl, the target DNA can be counted. In addition, since the copy of the target DNA is calculated through the Poisson distribution by dividing only positives and negatives according to whether the target DNA is amplified or not, absolute quantification is possible without a standard curve, unlike conventional quantitative PCR, and PCR is divided into tens of thousands of drops. Because the reaction proceeds, it shows higher sensitivity and accuracy than conventional qPCR, and it is not affected by PCR efficiency, so a constant result value can always be obtained.

본 발명의 키트에 적용 가능한 주형은 PIK3CA 돌연변이 검출이 필요하며, PCR 반응이 가능한 것이라면 제한 없이 사용될 수 있으나, 바람직하게는 혈액에서 분리된 무세포 DNA(cell-free DNA, cfDNA), 순환종양세포 (circulating tumor cell, CTC)로부터 유래된 ctDNA (circulating tumor DNA) 또는 포르말린 고정 파라핀 포매(formalin fixed paraffin embedded. FFPE) 조직에서 분리된 DNA 또는 상기 조직 유래의 RNA로부터 역전사 반응에 의해 합성된 cDNA(complementary DNA)를 주형으로 하는 것을 특징으로 한다. The template applicable to the kit of the present invention requires detection of PIK3CA mutation and can be used without limitation as long as a PCR reaction is possible. Preferably, cell-free DNA (cfDNA) isolated from blood, circulating tumor cells ( ctDNA (circulating tumor DNA) derived from circulating tumor cell, CTC) or DNA isolated from formalin fixed paraffin embedded (FFPE) tissue or cDNA (complementary DNA) synthesized by reverse transcription from RNA derived from the tissue ) as a template.

인간 혈장에서 순환하는 cfDNA는 염증성 장애, 산화 스트레스 및 악성 종양 등의 다양한 생리학적 및 병리학적 병태들에서 연구되고 있다. cfDNA의 혈류 방출과 관련된 정확한 기전은 불확실하지만, 아마도 세포자살, 세포괴사 및 세포로부터의 능동적인 방출이 종합적으로 작용하는 것으로 보인다. 혈관을 통해 순환하는 cfDNA는 잠재적으로 유용한 바이오마커이다. DNA 수준과 단편화 패턴은 진단 및 예후 예측 목적으로 흥미로운 가능성을 제시한다. 특히 환자의 혈액에서 간단히 검출할 수 있다는 점에서 삶의 질을 크게 훼손하지 않고 간편하고 신속하게 바이오마커를 검출할 수 있다는 유용성이 있다. Circulating cfDNA in human plasma has been studied in a variety of physiological and pathological conditions, including inflammatory disorders, oxidative stress, and malignancies. Although the exact mechanism involved in the bloodstream release of cfDNA is uncertain, it appears that apoptosis, apoptosis, and active release from cells are likely to act as a synthesizing mechanism. cfDNA circulating through blood vessels is a potentially useful biomarker. DNA levels and fragmentation patterns offer interesting possibilities for diagnostic and prognostic purposes. In particular, in that it can be easily detected in the blood of a patient, there is a usefulness in that a biomarker can be detected simply and quickly without significantly impairing the quality of life.

아울러, 본 발명의 키트는 혈액에서 분리된 CTC(circulating tumor cell)에서 분리된 DNA 또는 상기 CTC 유래의 RNA로부터 역전사 반응에 의해 합성된 cDNA를 주형으로 할 수 있다. CTC는 악성 종양 환자의 말초혈액에서 발견되는 종양세포이다. CTC가 암전이 과정에서 중요한 역할을 하기 때문에 CTC는 암의 연구, 진단 등에 있어서 매우 중요하게 여겨지고 있으나, 말초혈액 내 순환종양세포 존재 수가 매우 드물어, 수백만 개 이상의 정상 혈구세포에 섞여 있는 수십 개 이하의 종양세포를 검출할 수 있는 정도의 민감도가 요구되는 검출 시스템이 필요하다. In addition, the kit of the present invention can use as a template DNA isolated from circulating tumor cells (CTCs) isolated from blood or cDNA synthesized by reverse transcription from the CTC-derived RNA. CTCs are tumor cells found in the peripheral blood of patients with malignant tumors. Because CTCs play an important role in cancer metastasis, CTCs are considered to be very important in cancer research and diagnosis. However, the number of circulating tumor cells in the peripheral blood is very rare. There is a need for a detection system that requires a degree of sensitivity to detect tumor cells.

생검 후 환자에게서 얻은 조직은 통상적으로 포르말린(포름알데히드) 등에 의해서 고정화한다. 고정화한 생물학적 샘플은 일반적으로 탈수시키고, 파라핀 등의 고체 지지체에 포매하며, 이렇게 제조된 시료를 FFPE 시료라고 한다. FFPE 시료 상의 핵산, 특히 DNA는 고정된 세포에 존재하고, 단편화되어 있거나 포르말린에 의해 교차 결합되어 있으므로 파라핀을 제거하고 고정된 세포를 용해하여 DNA를 비롯한 핵산을 세포 내에서 용출시킬 필요가 있다.After the biopsy, the tissue obtained from the patient is usually fixed with formalin (formaldehyde) or the like. The immobilized biological sample is generally dehydrated and embedded in a solid support such as paraffin, and the prepared sample is called a FFPE sample. Nucleic acids, particularly DNA, on FFPE samples exist in fixed cells and are fragmented or cross-linked by formalin, so it is necessary to remove paraffin and lyse the fixed cells to elute nucleic acids including DNA from the cells.

본 발명에 있어서 용어 “파라핀”은 형태학적, 면역조직화학적 및 효소조직화학적인 해석을 포함하는 모든 해석에 있어서 사용되는 생체시료의 포매 매체를 포괄적으로 말하는 것이다. 즉, 본 발명에 있어서의 파라핀은 석유계 파라핀 왁스 단체(單體)여도 되고, 당해 석유계 파라핀 왁스를 기제(基劑)로 하여, 포매 매체의 품질향상 등의 목적으로 첨가될 수 있는 모든 다른 성분을 포함한 것이어도 된다. 여기서, 석유계 파라핀 왁스는 석유에 유래하는 상온에서 고형인 탄화수소류의 혼합물을 말한다.In the present invention, the term “paraffin” refers to the embedding medium of a biological sample used in all analysis including morphological, immunohistochemical and enzymatic histochemical analysis. That is, the paraffin in the present invention may be a single petroleum paraffin wax, and all other substances that can be added for the purpose of improving the quality of the embedding medium using the petroleum paraffin wax as a base material. A component may be included. Here, the petroleum paraffin wax refers to a mixture of hydrocarbons that are solid at room temperature derived from petroleum.

일반적으로 FFPE 처리된 암 환자의 검체 시료를 회전식 미세톱(rotary microtome)으로 5~10μm 의 두께로 절단한 다음 상용의 FFPE 용 핵산 분리 키트 또는 이를 활용하는 장치를 통해 DNA를 포함하는 핵산을 분리할 수 있다. FFPE에서 핵산을 분리하는 키트/장치는 예를 들어 지멘스사의 Tissue Preparation System 및 이와 관련된 시약 (VERSANT tissue preparation reagents)을 들 수 있다.In general, the FFPE-treated cancer patient specimen is cut to a thickness of 5 to 10 μm with a rotary microtome, and then the nucleic acid containing DNA is isolated using a commercially available nucleic acid isolation kit for FFPE or a device utilizing the same. can Kits/devices for isolating nucleic acids from FFPE include, for example, Siemens' Tissue Preparation System and related reagents (VERSANT tissue preparation reagents).

본 발명의 시료에서 분리되는 핵산은 게놈 DNA인 것이 바람직하며, 더 바람직하게는 PIK3CA 돌연변이를 보유하고 있을 것으로 추정되는 게놈 DNA이다. The nucleic acid isolated from the sample of the present invention is preferably genomic DNA, more preferably genomic DNA presumed to have a PIK3CA mutation.

본 발명의 조성물 또는 키트는 바람직하게는 자동화 또는 반자동화된 방법의 PIK3CA 유전자의 돌연변이 검출에 이용될 수 있다. 상기에서 자동화는 샘플(시료)의 투입; 추출, 분리, 반응이 완료된 기재(예를 들어, 튜브, 플레이트)의 재배치 또는 이동; 시약, 버퍼의 스톡(stock)에의 투입, 보충; 장비의 유지관리를 제외한 전부 또는 대부분 과정이 인간 이외의 수단(예를 들어, 로봇)을 통해서 이루어지는 것을 의미한다.The composition or kit of the present invention can be preferably used for detecting mutations in the PIK3CA gene by an automated or semi-automated method. In the above automation, the input of the sample (sample); repositioning or moving of a substrate (eg, tube, plate) on which extraction, separation, and reaction have been completed; addition of reagents, buffers to the stock, replenishment; It means that all or most of the processes except for the maintenance of equipment are performed by means other than humans (eg, robots).

참고로, 상기에서 언급한 뉴클레오티드 작업에는 다음의 문헌을 참조할 수 있다(Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.(1982); Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989); Deutscher, M., Guide to Protein Purification Methods Enzymology, vol. 182. Academic Press. Inc., San Diego, CA(1990); Ausubel et al., Current Protocols of Molecular Biology, John Wiley and Sons(1997); Rupp and Locker, Lab Invest. 56: A67(1987); De Andres et al., BioTechniques 18: 42044(1995); Held et al., Genome Research 6:986-994(1996); T.E. Godfrey et al. J. Molec. Diagnostics 2: 84-91(2000); K. Specht et al., Am. J. Pathol. 158: 419-29(2001)). For reference, for the above-mentioned nucleotide work, reference may be made to the following documents (Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1982); Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989);Deutscher, M., Guide to Protein Purification Methods Enzymology, vol. 182. Academic Press. Inc., San Diego, CA (1990); Ausubel et al., Current Protocols of Molecular Biology, John Wiley and Sons (1997); Rupp and Locker, Lab Invest. 56: A67 (1987); De Andres et al., BioTechniques 18: 42044 (1995); Held et al. ., Genome Research 6:986-994 (1996); TE Godfrey et al. J. Molec. Diagnostics 2: 84-91 (2000); K. Specht et al., Am. J. Pathol. 158: 419-29 (2001)).

본 발명은 암의 예후 또는 돌연변이 발생 위험도 예측에 필요한 정보를 제공하기 위하여, The present invention provides information necessary for predicting the prognosis of cancer or the risk of mutation,

(a) 암 시료 또는 암 돌연변이 발생 의심 시료에서 PIK3CA DNA를 분리하는 단계;(a) isolating PIK3CA DNA from a cancer sample or a sample suspected of having a cancer mutation;

(b) 상기 각각의 분리된 PIK3CA DNA를 주형으로 하고 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 프라이머 및 프로브 세트를 이용하여 중합효소연쇄반응(PCR)을 실시하는 단계;(b) using each of the isolated PIK3CA DNA as a template and performing a polymerase chain reaction (PCR) using the primer and probe set of any one of claims 1 to 6;

(c) 상기 중합효소연쇄반응으로 증폭된 산물의 PIK3CA 유전자의 특정 부위를 확인하는 단계; 및(c) identifying a specific region of the PIK3CA gene of the product amplified by the polymerase chain reaction; and

(d) 상기 암 돌연변이 발생 의심 시료와 암 시료를 비교하여 PIK3CA 유전자 특정 부위의 돌연변이 발생 여부를 확인하는 단계;를 포함하는 시료에서 PIK3CA 돌연변이 검출 방법을 제공한다.(d) comparing the sample suspected of having a cancer mutation with the sample to determine whether a mutation occurs in a specific region of the PIK3CA gene; provides a method for detecting PIK3CA mutation in a sample comprising a.

본 발명은 암의 표적치료에 필요한 정보를 제공하기 위하여,The present invention provides information necessary for targeted treatment of cancer,

(a) 시료에서 PIK3CA DNA를 분리하는 단계;(a) isolating the PIK3CA DNA from the sample;

(b) 상기 분리된 PIK3CA DNA를 주형으로 하고 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 프라이머 및 프로브 세트를 이용하여 중합효소연쇄반응(PCR)을 실시하는 단계;(b) performing a polymerase chain reaction (PCR) using the isolated PIK3CA DNA as a template and using the primer and probe set according to any one of claims 1 to 5;

(c) 상기 중합효소연쇄반응으로 증폭된 산물의 PIK3CA 유전자의 특정 부위를 확인하는 단계; 및(c) identifying a specific region of the PIK3CA gene of the product amplified by the polymerase chain reaction; and

(d) 상기 확인된 PIK3CA 유전자의 돌연변이를 분석하여 표적 약물치료 전략을 설계하는 단계;를 포함하는 시료에서 PIK3CA 돌연변이 검출 방법을 제공한다.(d) designing a target drug treatment strategy by analyzing the mutation of the identified PIK3CA gene; provides a method for detecting PIK3CA mutation in a sample comprising a.

본 발명의 상기 ‘시료’는 혈액 및 생물학적 기원의 기타 액상 시료, 생검 표본，조직 배양과 같은 고형 조직 시료 또는 이로부터 유래된 세포가 포함된다. 보다 구체적으로 예를 들면 이에 한정되지는 않으나 조직, 추출물，세포 용해물，전혈，혈장, 혈청，침，안구액，뇌척수액, 땀, 뇨，젖，복수액, 활액，복막액 등일 수 있다. 상기 시료는 동물, 바람직하게는 포유동물로부터 수득될 수 있으며，가장 바람직하게는 인간으로부터 수득될 수 있다. 또한 상기 시료는 검출에 사용하기 전에 전처리할 수 있다. 예를 들어，여과，증류，추출，농축，방해 성분의 불활성화，시약의 첨가 등을 포함할 수 있다. 바람직하게는 환자로부터 획득한 CTC(circulating tumor cell), 혈액, FFPE(formalin fixed paraffin embedded), cfDNA(cell-free DNA), 신선한 표본(fresh sample) 등일 수 있으며, 가장 바람직하게는 환자로부터 획득한 혈액 또는 FFPE(formalin fixed paraffin embedded)일 수 있고, 전술한 바와 같이 상기 시료로부터 게놈 DNA 또는 PIK3CA 돌연변이를 보유하고 있을 것으로 추정되는 DNA를 분리하여 PIK3CA 돌연변이 검출에 사용할 수 있다. The 'sample' of the present invention includes blood and other liquid samples of biological origin, biopsy samples, solid tissue samples such as tissue culture, or cells derived therefrom. More specifically, for example, but not limited thereto, tissue, extract, cell lysate, whole blood, plasma, serum, saliva, ocular fluid, cerebrospinal fluid, sweat, urine, milk, ascites fluid, synovial fluid, peritoneal fluid, etc. may be. The sample may be obtained from an animal, preferably a mammal, and most preferably from a human. In addition, the sample may be pre-treated prior to use for detection. For example, it may include filtration, distillation, extraction, concentration, inactivation of interfering components, addition of reagents, and the like. Preferably, it may be a circulating tumor cell (CTC), blood, formalin fixed paraffin embedded (FFPE), cell-free DNA (cfDNA), fresh sample, etc. obtained from a patient, most preferably obtained from a patient It may be blood or formalin fixed paraffin embedded (FFPE), and as described above, genomic DNA or DNA presumed to have a PIK3CA mutation may be isolated from the sample and used for PIK3CA mutation detection.

본 발명의 검출방법은 앞서 설명한 바와 같이, digital PCR 방법 또는 qPCR(quantitative PCR) 방법으로 PIK3CA 돌연변이를 검출할 수 있으며, 바람직하게는 상기 digital PCR 방법으로 ddPCR(Droplet Digital PCR)을 사용할 수 있다.As described above, the detection method of the present invention can detect the PIK3CA mutation by a digital PCR method or a qPCR (quantitative PCR) method, and preferably ddPCR (Droplet Digital PCR) can be used as the digital PCR method.

따라서, 본 발명은 PIK3CA 돌연변이 검출용 프라이머 및 프로브 세트 조성물과 이를 포함하는 키트를 제공한다. 본 발명의 방법은 암 환자의 예후 또는 돌연변이 발생 위험도 예측이 가능하며, 암의 표적 치료에 필요한 정보 제공 또는 특정 치료제에 대한 치료 반응성을 예측할 수 있어 항암치료제의 투여 필요성 판단을 비롯하여 향후 치료의 방향에 대한 단서를 제시하는 목적 및 암의 전이 또는 재발에 대한 모니터링 하는 데에 유용하게 이용될 수 있다.Accordingly, the present invention provides a primer and probe set composition for detecting PIK3CA mutation and a kit comprising the same. The method of the present invention is capable of predicting the prognosis or risk of mutation in cancer patients, providing information necessary for targeted treatment of cancer, or predicting the therapeutic response to a specific therapeutic agent, so it can be used in the direction of future treatment, including determining the need for administration of an anticancer drug. It can be usefully used for the purpose of providing clues about cancer and for monitoring the metastasis or recurrence of cancer.

도 1 내지 도 6은 본 발명의 프로브 및 프라이머를 포함하는 PIK3CA 돌연변이 검출 키트의 구성(MMX 1 내지 6)의 성능을 확인한 것으로, 사전 분석 검증(pre-analytical validation)을 시행하여 교차반응을 통해 간섭반응 유무를 확인한 결과이다.
도 7은 본 발명의 프로브 및 프라이머를 포함하는 PIK3CA 돌연변이 검출 키트와 야생형(wildtype) 표준물질을 이용하여 LoB(Limit of Blank) 실험을 수행한 결과이다.
도 8은 본 발명의 프로브 및 프라이머를 포함하는 PIK3CA 돌연변이 검출 키트와 인간 유래 시료를 이용하여 LoB(Limit of Blank) 실험을 수행한 결과이다.
도 9은 LOD(Limit of Detection) 실험을 통해 제작한 표준물질 벡터(mini-clone으로 명명)의 input DNA 양을 연속희석하여 검출되는 최소 농도를 확인한 결과이다.
도 10는 본 발명의 프로브 및 프라이머를 포함하는 PIK3CA 돌연변이 검출 키트의 타당성을 확인한 결과이다.1 to 6 confirm the performance of the configuration (MMX 1 to 6) of the PIK3CA mutation detection kit including the probe and primer of the present invention, and interference through cross-reaction by performing pre-analytical validation. It is the result of confirming the presence or absence of a reaction.
7 is a result of performing a limit of blank (LoB) experiment using a PIK3CA mutation detection kit including a probe and a primer of the present invention and a wildtype standard.
8 is a result of performing a limit of blank (LoB) experiment using a PIK3CA mutation detection kit including a probe and a primer of the present invention and a human-derived sample.
9 is a result of confirming the minimum concentration detected by serially diluting the amount of input DNA of a standard material vector (named mini-clone) produced through a limit of detection (LOD) experiment.
10 is a result confirming the feasibility of the PIK3CA mutation detection kit including the probe and primer of the present invention.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 이에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, preferred examples are presented to help the understanding of the present invention. However, the following examples are only provided for easier understanding of the present invention, and the content of the present invention is not limited thereto.

<실시예 1><Example 1>

프라이머 및 프로브 디자인 및 선발Primer and probe design and selection

본 발명에서 검출하고자 하는 유전자인 PIK3CA의 돌연변이 위치(mutation site) 정보를 확인하고, 해당 위치의 SNP(Single Nucleotide Polymorphism) 여부를 확인하였다. 공용 데이터 베이스(Public data base)를 기반으로 조사하였으며, 이 정보는 ddPCR을 위한 프라이머, 프로브 등의 디자인을 위해 활용하였다.In the present invention, information on the mutation site of PIK3CA, which is a gene to be detected, was confirmed, and whether SNP (Single Nucleotide Polymorphism) of the corresponding position was confirmed. It was investigated based on a public data base, and this information was used for the design of primers and probes for ddPCR.

먼저 대장암(colorectal cancer), 유방암(breast cancer), 위암(gastric cancer의 암종에서, PIK3CA의 돌연변이 위치별 빈도수를 확인하였다. Cosmic 번호(http://cancer.sanger.ac.uk)를 기반으로 정보를 확인하고, 돌연변이 위치를 확인하였다.First, in colorectal cancer, breast cancer, and gastric cancer carcinoma, the frequency of PIK3CA mutation location was confirmed. Based on the Cosmic number (http://cancer.sanger.ac.uk) The information was checked and the mutation location was confirmed.

프라이머 디자인 및 합성을 위하여, 해당 유전자의 엑손(exon)과 인트론(intron) 서열을 확보하고, primer3 프로그램을 이용하여 각 엑손에 적합한 프라이머를 디자인하였다. 이때 인트론과 엑손을 모두 포함하는 서열을 기반으로 프라이머를 디자인하였다. 이 때, 프라이머의 Tm값은 40~60℃로 하였으며 GC%는 40~60%로 디자인하였다.For primer design and synthesis, exon and intron sequences of the corresponding gene were secured, and primers suitable for each exon were designed using the primer3 program. At this time, primers were designed based on sequences including both introns and exons. At this time, the Tm value of the primer was 40 to 60 ℃, and the GC% was designed to be 40 to 60%.

프로브 디자인 및 합성을 위하여, Taqman 방식의 probe를 사용하였으며, 각 프로브의 5‘ -end에 HEX 또는 FAM reporter fluorescence를 부착하여 대상 유전자의 증폭에 따라 형광시그널이 검출 가능하도록 하였다. 한편, background(noise)를 줄이기 위해 돌연변이 위치에 상응하는 서열을 이용하여 non-specific하게 결합하지 못하도록 blocker oligomer를 제작하였다. For probe design and synthesis, a Taqman-type probe was used, and HEX or FAM reporter fluorescence was attached to the 5'-end of each probe so that the fluorescent signal could be detected according to the amplification of the target gene. On the other hand, in order to reduce the background (noise), a blocker oligomer was prepared to prevent non-specific binding by using the sequence corresponding to the mutation site.

<실시예 2><Example 2>

표준 물질의 제작Preparation of standard materials

디자인된 프라이머와 프로브를 검증하기 위해, 그리고 ddPCR 수행에 필요한 표준물질 벡터(mini-clone으로 명명)를 제작하였다. mini-clone의 제작과정은 먼저 PIK3CA의 엑손에서 돌연변이가 일어난 구간을 가운데로 하여 총 길이 약 300bp의 유전자를 합성하였다. 합성된 DNA 단편은 pUC57 벡터에 삽입하고, 제작된 clone은 대장균 DH5α 세포에 형질전환(transformation) 시켰다.To verify the designed primers and probes, and to perform ddPCR, a standard vector (named as mini-clone) was prepared. In the production process of mini-clone, a gene with a total length of about 300 bp was synthesized with the section where the mutation occurred in the exon of PIK3CA in the center. The synthesized DNA fragment was inserted into the pUC57 vector, and the constructed clone was transformed into E. coli DH5α cells.

<실시예 3><Example 3>

표준물질(Miniclone)을 활용한 패널 확정Confirmation of panel using standard material (Miniclone)

상기에서 표준물질로 제작한 miniclone을 enzyme digestion하여 선 형태(linear form)의 DNA 조각(fragment)을 확보하고, 농도를 확인하였다. 정량한 DNA 3.3ng(1,000 copies)을 template로 하여 프라이머, 프로브 등을 이용한 ddPCR을 수행하였다.A DNA fragment of a linear form was obtained by enzyme digestion of the miniclone prepared as a standard material in the above, and the concentration was confirmed. ddPCR was performed using primers and probes using 3.3ng (1,000 copies) of the quantified DNA as a template.

각각의 template에 적합한 프로브의 성능을 확인하기 위하여 해당 프라이머 및 프로브가 해당 template에 특이적으로 반응하고 간섭 및 교차 반응이 없음을 확인한 후, 본 발명의 PIK3CA 돌연변이 검출용 키트 구성인 MMx 패널에 사용할 프라이머 및 프로브를 선정하였다.In order to confirm the performance of the probe suitable for each template, after confirming that the primer and the probe specifically react with the template and there is no interference or cross-reaction, the primer to be used in the MMx panel, which is the kit for detecting PIK3CA mutations of the present invention and probes were selected.

이를 위한 ddPCR은 다음과 같은 방법으로 수행하였다. 상기 ddPCR 과정은 바이오라드 사의 QX200™ Droplet digital PCR system (Bio-RAD, USA)을 이용하여 진행되었다. 샘플 준비는 MMX1 내지 MMX8 mixture를 20.9ul씩 8strip PCR tube에 분주하였고 각 튜브에 Ultrapurewater(NTC), Positive control(PC), 환자 검체로부터 추출한 template DNA를 1.1ul씩 넣어 PCR 반응 혼합물(reaction mix)을 만들었다. ddPCR for this was performed in the following way. The ddPCR process was performed using the QX200™ Droplet digital PCR system (Bio-RAD, USA) of Bio-Rad. For sample preparation, 20.9ul each of MMX1 to MMX8 mixture was dispensed into 8-strip PCR tubes, and 1.1ul of Ultrapurewater (NTC), Positive control (PC), and template DNA extracted from patient samples were added to each tube to prepare a PCR reaction mixture (reaction mix). made.

8-Strip PCR 튜브 캡을 닫고 볼텍싱(vortexing) 한 후 스핀-다운(Spin-down) 하였고 실온에서 10분간 인큐베이션(Incubation)하였다. 이후 액적 생성(Droplet generation) 단계로 준비된 DG 카트리지(cartridge)의 샘플 well에는 PCR 반응 혼합물을, oil well에는 액적 생성 오일(Droplet generation oil)을 70ul씩 넣고 Droplet Generator Gasket에 장착하여 QX200™ Droplet Generator로 Droplet을 형성시켰다. 형성된 40ul Droplet을 96 well plate로 옮기고 Pierceable Foil Heat Seal(BIO-RAD, 181-4040)의 붉은색 선이 아래로 가도록 plate위에 덮고 PX1™ PCR Plate Sealer(180℃, 5초 sealing)에 넣고 밀봉(Sealing)하였다. PCR 증폭과정은 Veriti 96-Well Thermal Cycler를 이용하였고, 증폭된 PCR산물은 QX200 drolet reaker를 사용하여 증폭된 신호를 검출하였다. 결과분석은 Bio-RAD 가 제공하는 QuantaSoft software로 수행하였다.After closing the 8-Strip PCR tube cap, vortexing, and spin-down, it was incubated for 10 minutes at room temperature. After that, put the PCR reaction mixture into the sample well of the DG cartridge prepared in the droplet generation step, and 70ul each of the droplet generation oil into the oil well, and install it in the droplet generator gasket to use the QX200™ Droplet Generator. Droplets were formed. Transfer the formed 40ul droplet to a 96 well plate, cover it with the red line of the Pierceable Foil Heat Seal (BIO-RAD, 181-4040) down, put it on the plate, put it in the PX1™ PCR Plate Sealer (180℃, 5 seconds sealing), and seal ( Sealing). The PCR amplification process was performed using a Veriti 96-Well Thermal Cycler, and the amplified signal was detected using a QX200 drolet reaker for the amplified PCR product. Result analysis was performed with QuantaSoft software provided by Bio-RAD.

이를 통하여 각 돌연변이 위치간의 교차 반응(cross-reactivity) 여부 및 Multiplex probe mix로 인한 간섭 여부를 확인하여 하기 표 1과 같이 패널을 완성하였고, 각각 FAM과 HEX로 유전적 변이를 구분하였다.Through this, cross-reactivity between each mutation site and interference due to the multiplex probe mix were checked to complete the panel as shown in Table 1 below, and genetic mutations were classified by FAM and HEX, respectively.

RUO2.0(PC)RUO2.0(PC) PIK3CA 돌연변이PIK3CA mutation 엑손exons 프라이머primer 채널channel 1 (8, 4)1 (8, 4) E542X (K, G, V)E542X (K, G, V) 9 (PP8-5, PP9-1, 9910)9 (PP8-5, PP9-1, 9910) PC7-F2/R3PC7-F2/R3 FAMFAM K345KK345K 4 (2x PP4-2)4 (2x PP4-2) PC3-F5/R5PC3-F5/R5 HEXHEX + 5x P-ex9-B5, 4x P-ex4-B1+ 5x P-ex9-B5, 4x P-ex4-B1 2 (11, 6)2 (11, 6) E545X (K, Q, G, V, D)E545X (K, Q, G, V, D) 9 (PP11-3, PP12, PP13, PP15, PP16)9 (PP11-3, PP12, PP13, PP15, PP16) PC7-F2/R3PC7-F2/R3 FAMFAM C420RC420R 7 (2x PP6-1)7 (2x PP6-1) PC5-AF1/R1PC5-AF1/R1 HEXHEX + 5x P-ex9-B5+ 5x P-ex9-B5 3 (17, 2)3 (17, 2) Q546X (K, E, P, R, L)Q546X (K, E, P, R, L) 9 (PP17, PP18, PP20-1, PP21)9 (PP17, PP18, PP20-1, PP21) PC7-F2/R3PC7-F2/R3 FAMFAM R108HR108H 1 (2x PP2)1 (2x PP2) PC1-F1/R1PC1-F1/R1 HEXHEX + 5x P-ex9-B5+ 5x P-ex9-B5 4 (25)4 (25) H1047X (R, L, Y)H1047X (R, L, Y) 20 (PP25-1, PP26-1, 2x PP27)20 (PP25-1, PP26-1, 2x PP27) PC3-F3/R3PC3-F3/R3 FAMFAM iQCiQC 4 (2x PP3)4 (2x PP3) PC3/F2/R1PC3/F2/R1 HEXHEX + 4x P-ex20-B3+ 4x P-ex20-B3 5 (28, 22)5 (28, 22) M1043I, G1049RM1043I, G1049R 20 (2x PP24, PP28)20 (2x PP24, PP28) PC23-F3/R3PC23-F3/R3 FAMFAM D549ND549N 9(2x PP22)9 (2x PP22) PC7-F2/R3PC7-F2/R3 HEXHEX 6 (14, 29)6 (14, 29) E545AE545A 9(PP14-2)9 (PP14-2) PC7-F2/R3PC7-F2/R3 FAMFAM R88QR88Q 1(2x PP29)1 (2x PP29) PC29-F2/R2PC29-F2/R2 HEXHEX

<실시예 4><Example 4>

PIK3CA 돌연변이 검출 키트의 간섭반응 유무 확인Check for interference reaction of PIK3CA mutation detection kit

상기 확정된 MMx 패널에 대하여 사전 분석 검증을 시행하여 교차반응을 통해 간섭반응 유무를 확인하였다. 간섭 반응을 확인하기 위하여 제작한 표준물질을 이용하였다. 각 MMX에 포함되어 있는 FAM 프로브에 매치되는 프라이머와 HEX프라이머를 MIX하였을 때 FAM 프로브가 HEX 프라이머에 간섭반응을 보이는지 확인하였다. HEX 프로브도 마찬가지로 FAM 프라이머에 간섭반응을 보이는지 확인하였다.Pre-analysis verification was performed on the confirmed MMx panel, and the presence or absence of an interference reaction was confirmed through cross-reaction. In order to confirm the interference reaction, the prepared standard material was used. When the primer and the HEX primer matching the FAM probe included in each MMX were mixed, it was checked whether the FAM probe showed an interference reaction with the HEX primer. It was confirmed whether the HEX probe also showed an interference reaction with the FAM primer.

그 결과 도 1 내지 도 6와 같이, 각 MMx 패널별로 간섭이 거의 없는 것을 확인하였다.As a result, as shown in FIGS. 1 to 6 , it was confirmed that there was almost no interference for each MMx panel.

<실시예 5><Example 5>

PIK3CA 돌연변이 검출 키트의 비특이적 검출 여부 확인Confirmation of non-specific detection of PIK3CA mutation detection kit

공란한계(Limit of blank, LoB) 실험을 수행하여 비특이적 검출 기준 여부를 확인하였다. A limit of blank (LoB) experiment was performed to confirm whether there was a non-specific detection standard.

이를 위하여 먼저 증류수(Distilled water, DW)(N=7)을 사용하였다.For this, first distilled water (DW) (N=7) was used.

LoB 실험은 MMX별 Mixture를 만들고 표준물질대신 증류수를 이용하여 반복 실험을 하여 MMX 별 비특이적 검출 여부를 확인하였다. In the LoB experiment, a mixture was made for each MMX and repeated experiments were performed using distilled water instead of a standard material to confirm non-specific detection of each MMX.

그 결과 하기 표 2와 같이 모든 패널에서 비특이적 검출이 확인되지 않았다.As a result, non-specific detection was not confirmed in all panels as shown in Table 2 below.

LOBLOB MMx1MMx1 MMx2MMx2 MMx3MMx3 MMx4MMx4 MMx5MMx5 MMx6MMx6 E542XE542X N345KN345K E545XE545X C420RC420R Q546XQ546X R108HR108H H1047XH1047X ICIC M10431M10431
G1049RG1049R D549ND549N E545AE545A BlankBlank 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00

더불어 야생형 표준물질로서 human gDNA를 각각 3.3ng과 10ng씩 이용하여 LoB 실험을 6회 반복 수행하고 각각의 LoB를 산출하여 도 7에 나타내었다(붉은색 글씨, LoB = Mean + 1.645 x SD).In addition, the LoB experiment was repeated 6 times using 3.3ng and 10ng of human gDNA as a wild-type standard, respectively, and each LoB was calculated and shown in FIG. 7 (red text, LoB = Mean + 1.645 x SD).

또한, 인간 유래 정상 조직 FFPE DNA 14개 샘플을 각각 3.3 ng과 10ng씩 이용하여 LoB 실험을 수행하고, 각각의 LoB를 산출하여 도 8에 나타내었다(붉은색 글씨, LoB = Mean + 1.645 x SD).In addition, a LoB experiment was performed using 3.3 ng and 10 ng of 14 human-derived normal tissue FFPE DNA samples, respectively, and each LoB was calculated and shown in FIG. 8 (red text, LoB = Mean + 1.645 x SD) .

그 결과, gDNA 3.3ng으로 반복 확인시 3 카피(copy) 이상을 포지티브 (positive) 카피의 결과라고 확인하며, 농도를 10ng으로 높여서 확인 시 5 카피 이상을 포지티브 카피의 결과라고 판단하였다(도 7). As a result, when repeating confirmation with 3.3ng of gDNA, 3 or more copies were confirmed as the result of positive copy, and when the concentration was increased to 10ng, it was determined that more than 5 copies were the result of positive copy (FIG. 7) .

또한 인간 유래 정상 조직 FFPE DNA로 확인한 결과는 도 8과 같으며, 농도 3.3ng으로 반복 확인시 E542X Mutation은 5 카피 이상을, 나머지 Mutation은 2 카피 이상을 포지티브 결과라고 확인하며, 농도 10ng 으로 높여서 확인 반복실험 한 결과 E542X Mutation은 8 카피 이상 검출을, 나머지 Mutation은 5 카피 이상을 포지티브 결과라고 판단하였다.In addition, the results confirmed with human-derived normal tissue FFPE DNA are as shown in FIG. 8, and when repeatedly confirmed at a concentration of 3.3 ng, E542X Mutation confirms that 5 copies or more, and the remaining mutations confirm that 2 or more copies are positive results, and confirm by raising the concentration to 10 ng As a result of repeated experiments, E542X Mutation detected more than 8 copies, and the remaining mutations judged that more than 5 copies were positive results.

<실시예 6><Example 6>

PIK3CA 돌연변이 검출 키트의 검출 최소 농도 확인Confirmation of the minimum detection concentration of the PIK3CA mutation detection kit

본 발명의 PIK3CA 돌연변이 검출 키트의 검출 최소 농도를 확인하기 위하여, Miniclone의 input DNA 양을 gDNA(3.3ng)에 연속희석(serial dilution)하여 검출한계(Limit of Detection, LoD) 실험을 3번 반복 수행하였으며, 각각의 copy 수를 평균을 내어 확인하였다. In order to confirm the minimum detection concentration of the PIK3CA mutation detection kit of the present invention, the amount of input DNA of Miniclone was serially diluted in gDNA (3.3ng) and the Limit of Detection (LoD) experiment was repeated 3 times. The number of copies was averaged and confirmed.

그 결과 도 9에 나타낸 바와 같이, 각각의 copy수에 대한 R^2값은 0.98로 확인되었다. LOB 결과 3copy 이상을 Positive로 판단할 경우, 검출 최소 농도는 안정적으로 0.5%라고 확인되었다. As a result, as shown in FIG. 9, the R^2 value for each copy number was confirmed to be 0.98. When 3 copies or more were judged as positive as a result of the LOB, the minimum detection concentration was stably confirmed to be 0.5%.

<실시예 7><Example 7>

PIK3CA 돌연변이 검출 키트 구성품의 최종 정보Final Information on PIK3CA Mutation Detection Kit Components

본 발명에 따른 최종 PIK3CA 돌연변이 검출용 프라이머와 프로브의 정보를 각각 하기 표 3 및 표 4에 나타냈다. Information on the final primer and probe for detecting PIK3CA mutations according to the present invention is shown in Tables 3 and 4, respectively.

엑손exons 프라이머primer 명칭 designation 서열order 시작지점starting point 길이length
(bp)(bp) TMTM GC%GC% 서열order
번호number 4(MT)4 (MT) PC3-F5PC3-F5 TTGGGTTATAAATAGTGCACTCAGTTGGGTTATAAATAGTGCACTCAG 158158 2424 57.5257.52 37.537.5 1One PC3-R5PC3-R5 ATCAGCATTTGACTTTACCTTATCATCAGCATTTGACTTTACCTTATC 254254 2424 55.8855.88 33.333.3 22 99 PC7-F2PC7-F2 ACAGCTCAAAGCAATTTCTACAACAGCTCAAAGCAATTTCTACA 124124 2222 56.956.9 36.436.4 33 PC7-R3PC7-R3 CCATTTTAGCACTTACCTGTGACTCCATTTTAGCACTTACCTGTGACT 217217 2424 58.858.8 41.741.7 44 77 PC5-A-F1PC5-A-F1 GGGAAGAAAAGTGTTTTGAAATGTGGGAAGAAAAGTGTTTTGAAATGT 5656 2424 59.8159.81 33.333.3 55 PC5-R1PC5-R1 AACAAGTTTATATTTCCCCATGCAACAAGTTTATATTTCCCCATGC 9898 2323 58.458.4 34.7834.78 66 1One PC1-F1PC1-F1 GGGAAGAATTTTTTGATGAAACAGGGAAGAATTTTTTGATGAAACA 128128 2323 59.3759.37 30.430.4 77 PC1-R1PC1-R1 TATTGTATCATACCAATTTCTCGATATTGTATCATACCAATTTCTCGA 251251 1818 55.6355.63 33.333.3 88 PC29-F2PC29-F2 CAAGAAGCAGAAAGGGAAGACAAGAAGCAGAAAGGGAAGA 115115 2020 57.357.3 4545 99 PC29-R2PC29-R2 CGGTTGCCTACTGGTTCAATCGGTTGCCTACTGGTTCAAT 215215 2020 6060 5050 1010 4(IC)4 (IC) PC3-F2PC3-F2 GAGGATGCCCAATTTGATGTGAGGATGCCCAATTTGATGT 2727 2020 59.859.8 4545 1111 PC3-R1PC3-R1 CATTCATATATGGTGTAGCTGTGGCATTCATATATGGTGTAGCTGTGG 145145 2424 58.558.5 41.741.7 1212 2020 PC23-F3PC23-F3 ACCCTAGCCTTAGATAAAACTGAGACCCTAGCCTTAGATAAAACTGAG 147147 2424 56.656.6 41.741.7 1313 PC23-R3PC23-R3 CTGTTTAATTGTGTGGAAGATCCCTGTTTAATTGTGTGGAAGATCC 266266 2323 57.757.7 47.147.1 1414

MMxMMx 엑손exons 프로브probe 명칭 designation 서열order 시작start
지점Point 길이length
(bp)(bp) TMTM GC%GC% 서열번호SEQ ID NO: 1One 99
(E542X)(E542X) PP8-5PP8-5 GAGATCCTCTCTCTAAAATCACTGAGCGAGATCCTCTCTCTAAAATCACTGAGC 147147 2727 61.4761.47 44.4444.44 FAM(zen)FAM(zen) 1515 PP9-1PP9-1 AGATCCTCTCTCTGGAATCACTGAAGATCCTCTCTCTGGAATCACTGA 148148 2424 60.7560.75 45.8345.83 FAM(zen)FAM(zen) 1616 PP10PP10 GAGATCCTCTCTCTGTAATCACTGAGCGAGATCCTCTCTCTGTAATCACTGAGC 147147 2727 62.3362.33 48.1548.15 FAM(zen)FAM(zen) 1717 BlockerBlocker 5x P-ex9-B55x P-ex9-B5 TCTCTCTGAAATCACTGAGCAGGAGTCTCTCTGAAATCACTGAGCAGGAG 154154 2525 63.663.6 4848 BlockerBlocker 1818 4(N345)4 (N345) 2x PP4-22x PP4-2 GTGCAACCTACGTGAAAGTAAATATTCGGTGCAACCTACGTGAAAGTAAATATTCG 196196 2828 63.9463.94 39.2939.29 HEX(zen)HEX(zen) 1919 BlockerBlocker 2x P-ex4-B12x P-ex4-B1 GTGCAACCTACGTGAATGTAAATATTCGGTGCAACCTACGTGAATGTAAATATTCG 196196 2828 64.5764.57 39.2939.29 BlockerBlocker 2020 22 99
(E545X)(E545X) PP11-3PP11-3 TCTCTGAAATCACTAAGCAGGAGATCTCTGAAATCACTAAGCAGGAGA 156156 2424 59.759.7 41.741.7 FAM(zen)FAM(zen) 2121 PP12PP12 TCTGAAATCACTGGGCAGGAGATCTGAAATCACTGGGCAGGAGA 159159 2222 64.464.4 5050 FAM(zen)FAM(zen) 2222 PP13PP13 CTCTGAAATCACTGATCAGGAGAAACTCTGAAATCACTGATCAGGAGAAA 157157 2525 61.161.1 4040 FAM(zen)FAM(zen) 2323 PP15PP15 TCTCTGAAATCACTCAGCAGGAGATCTCTGAAATCACTCAGCAGGAGA 156156 2424 62.862.8 45.8345.83 FAM(zen)FAM(zen) 2424 PP16PP16 TCTGAAATCACTGTGCAGGAGATCTGAAATCACTGTGCAGGAGA 158158 2222 60.9860.98 45.4545.45 FAM(zen)FAM(zen) 2525 BlockerBlocker 5x P-ex9-B55x P-ex9-B5 TCTCTCTGAAATCACTGAGCAGGAGTCTCTCTGAAATCACTGAGCAGGAG 154154 2525 63.663.6 4848 BlockerBlocker 2626 6(C420R)6 (C420R) 2x PP6-12x PP6-1 GTTTTTTAAGGAACACCGTCCATTGGGTTTTTTAAGGAACACCGTCCATTGG 114114 2626 66.3566.35 42.3142.31 HEX(zen)HEX(zen) 2727 33 99
(Q546X)(Q546X) PP17PP17 TCTCTGAAATCACTGAGAAGGAGAAATCTCTGAAATCACTGAGAAGGAGAAA 157157 2626 6262 38.538.5 FAM(zen)FAM(zen) 2828 PP18PP18 TCTCTGAAATCACTGAGGAGGAGAAATCTCTGAAATCACTGAGGAGGAGAAA 156156 2626 63.963.9 42.3142.31 FAM(zen)FAM(zen) 2929 PP20-1PP20-1 TCTCTGAAATCACTGAGCGGGAGAAATCTCTGAAATCACTGAGCGGGAGAAA 156156 2626 68.3568.35 46.1546.15 FAM(zen)FAM(zen) 3030 PP21PP21 TCTCTGAAATCACTGAGCCGGAGAAATCTCTGAAATCACTGAGCCGGAGAAA 156156 2626 68.3568.35 FAM(zen)FAM(zen) 3131 BlockerBlocker 5x P-ex9-B55x P-ex9-B5 TCTCTCTGAAATCACTGAGCAGGAGTCTCTCTGAAATCACTGAGCAGGAG 154154 2525 63.663.6 4848 BlockerBlocker 3232 1(R108H)1 (R108H) 2x PP22x PP2 CCAGTAGGCAACCATGAAGAAAAGCCAGTAGGCAACCATGAAGAAAAG 202202 2424 63.2263.22 45.8345.83 HEX(zen)HEX(zen) 3333 44 2020
(H1047X)(H1047X) PP25-1PP25-1 AAATGAATGATGCACGTCATGGAAATGAATGATGCACGTCATGG 199199 2222 62.962.9 40.940.9 FAM(zen)FAM(zen) 3434 PP26-1PP26-1 ACAAATGAATGATGCACTTCATGGACAAATGAATGATGCACTTCATGG 196196 2424 63.263.2 37.537.5 FAM(zen)FAM(zen) 3535 2x PP272x PP27 TGAATGATGCATATCATGGTGGCTGAATGATGCATATCATGGTGGC 203203 2323 64.964.9 43.543.5 FAM(zen)FAM(zen) 3636 BlockerBlocker 4x P-ex20-B34x P-ex20-B3 AATGAATGATGCACATCATGGTGAATGAATGATGCACATCATGGTG 200200 2323 62.862.8 39.139.1 BlockerBlocker 3737 4(IC)4 (IC) 2x PP3(IC)2x PP3(IC) CAATGCCATCTTATTCCAGACGCCAATGCCATCTTATTCCAGACGC 9595 2323 64.964.9 5050 HEX(zen)HEX(zen) 3838 55 20(M1043I)20 (M1043I) 2xPP242xPP24 CATGAAACAAATTAATGATGCACATCCATGAAACAAATTAATGATGCACATC 192192 2626 61.661.6 30.830.8 FAM(zen)FAM(zen) 3939 20(G049R)20 (G049R) PP28PP28 CACATCATCGTGGCTGGACACACATCATCGTGGCTGGACA 211211 2020 64.2364.23 5555 FAM(zen)FAM(zen) 4040 9(D549N)9 (D549N) 2xPP222xPP22 CTGAGCAGGAGAAAAATTTTCTATGCTGAGCAGGAGAAAAATTTTCTATG 168168 2525 59.8259.82 3636 HEX(zen)HEX(zen) 4141 66 9(E545A)9 (E545A) PP14-2PP14-2 TCTCTCTGAAATCACTGCGCAGGAGATCTCTCTGAAATCACTGCGCAGGAGA 154154 2626 69.6269.62 5050 FAM(zen)FAM(zen) 4242 1(R88Q)1 (R88Q) 2xPP292xPP29 TGATGAAACAAGACAACTTTGTGACTGATGAAACAAGACAACTTTGTGAC 141141 2525 60.560.5 3636 HEX(zen)HEX(zen) 4343

<실시예 8><Example 8>

PIK3CA 돌연변이 검출 키트의 위양성(feasibility) 평가Evaluation of feasibility of the PIK3CA mutation detection kit

임상 검체를 이용하여 최종 확정된 본 발명의 PIK3CA 돌연변이 검출용 키트의 위양성 수치를 분석하였다. 상기 임상 검체로 유방암 환자 26명의 FFPE 샘플을 이용하였고, 상기 샘플에 대한 NGS(Next Generation Sequencing) 실험 결과와 비교하여 그 결과를 도 10에 나타내었다. 결과에 있어서 Mutant index (MI)는 각 돌연변이에 상응하는 야생형유전자 대비 존재하는 돌연변이 비율을 뜻한다. False-positive values of the PIK3CA mutation detection kit of the present invention finally confirmed using clinical samples were analyzed. As the clinical specimen, FFPE samples from 26 breast cancer patients were used, and the results are shown in FIG. 10 compared with the NGS (Next Generation Sequencing) test results for the samples. In the results, the mutant index (MI) refers to the ratio of mutations present to the wild-type gene corresponding to each mutation.

그 결과 본 발명의 PIK3CA 돌연변이 검출용 키트를 이용한 결과와 NGS 결과가 100% 일치함을 확인하였다.As a result, it was confirmed that the results using the PIK3CA mutation detection kit of the present invention and the NGS results were 100% consistent.

이상 살펴본 바와 같이 본 발명에 따른 PIK3CA 돌연변이 검출용 조성물 및 키트는 PIK3CA 유전자의 돌연변이를 검출할 수 있을 뿐만 아니라, 이를 통해 암의 예후 평가, 돌연변이 발생 위험도 예측, 특정 치료제에 대한 치료 반응성 예측 또는 암 환자의 표적치료에 필요한 정보를 제공할 수 있으므로 항암치료제 투여 필요성 판단을 비롯하여 향후 치료의 방향에 대한 단서를 제시하는 목적 및 암의 전이 또는 재발에 대한 모니터링 하는 데에 유용하게 이용될 수 있다.As described above, the composition and kit for detecting PIK3CA mutation according to the present invention can not only detect mutations in the PIK3CA gene, but also evaluate the prognosis of cancer, predict the risk of mutation, predict treatment responsiveness to a specific therapeutic agent, or cancer patients Since it can provide information necessary for targeted treatment of cancer, it can be usefully used for the purpose of determining the need for anticancer drug administration, providing clues for future treatment directions, and monitoring metastasis or recurrence of cancer.

Claims (19)

ⅰ) 서열번호 1의 정방향 프라이머, 서열번호 2의 역방향 프라이머, 서열번호 3의 정방향 프라이머, 서열번호 4의 역방향 프라이머 및 서열번호 15 내지 20으로 이루어진 군에서 선택된 프로브의 폴리뉴클레오티드 세트;
ⅱ) 서열번호 3의 정방향 프라이머, 서열번호 4의 역방향 프라이머, 서열번호 5의 정방향 프라이머, 서열번호 6의 역방향 프라이머 및 서열번호 21 내지 27으로 이루어진 군에서 선택된 프로브의 폴리뉴클레오티드 세트;
ⅲ) 서열번호 3의 정방향 프라이머, 서열번호 4의 역방향 프라이머, 서열번호 7의 정방향 프라이머, 서열번호 8의 역방향 프라이머 및 서열번호 28 내지 33으로 이루어진 군에서 선택된 프로브의 폴리뉴클레오티드 세트;
ⅳ) 서열번호 11의 정방향 프라이머, 서열번호 12의 역방향 프라이머, 서열번호 13의 정방향 프라이머, 서열번호 14의 역방향 프라이머 및 서열번호 34 내지 38으로 이루어진 군에서 선택된 프로브의 폴리뉴클레오티드 세트;
ⅴ) 서열번호 3의 정방향 프라이머, 서열번호 4의 역방향 프라이머, 서열번호 13의 정방향 프라이머, 서열번호 14의 역방향 프라이머 및 서열번호 39 내지 41로 이루어진 군에서 선택된 프로브의 폴리뉴클레오티드 세트; 및
ⅵ) 서열번호 3의 정방향 프라이머, 서열번호 4의 역방향 프라이머, 서열 번호 9의 정방향 프라이머, 서열번호 10의 역방향 프라이머 및 서열번호 42 내지 43으로 이루어진 프로브의 폴리뉴클레오티드 세트; 로 이루어진 군에서 선택된 세트를 유효성분으로 포함하는 PIK3CA 돌연변이 검출용 프라이머 및 프로브 세트 조성물.
i) a polynucleotide set of a probe selected from the group consisting of a forward primer of SEQ ID NO: 1, a reverse primer of SEQ ID NO: 2, a forward primer of SEQ ID NO: 3, a reverse primer of SEQ ID NO: 4, and SEQ ID NOs: 15 to 20;
ii) a polynucleotide set of a probe selected from the group consisting of a forward primer of SEQ ID NO: 3, a reverse primer of SEQ ID NO: 4, a forward primer of SEQ ID NO: 5, a reverse primer of SEQ ID NO: 6 and SEQ ID NOs: 21 to 27;
iii) a polynucleotide set of a probe selected from the group consisting of a forward primer of SEQ ID NO: 3, a reverse primer of SEQ ID NO: 4, a forward primer of SEQ ID NO: 7, a reverse primer of SEQ ID NO: 8, and SEQ ID NOs: 28 to 33;
iv) a polynucleotide set of a probe selected from the group consisting of a forward primer of SEQ ID NO: 11, a reverse primer of SEQ ID NO: 12, a forward primer of SEQ ID NO: 13, a reverse primer of SEQ ID NO: 14 and SEQ ID NOs: 34 to 38;
v) a polynucleotide set of a probe selected from the group consisting of a forward primer of SEQ ID NO: 3, a reverse primer of SEQ ID NO: 4, a forward primer of SEQ ID NO: 13, a reverse primer of SEQ ID NO: 14 and SEQ ID NOs: 39 to 41; and
vi) a polynucleotide set of a probe consisting of the forward primer of SEQ ID NO: 3, the reverse primer of SEQ ID NO: 4, the forward primer of SEQ ID NO: 9, the reverse primer of SEQ ID NO: 10 and SEQ ID NOs: 42 to 43; A primer and probe set composition for detecting PIK3CA mutation comprising a set selected from the group consisting of as an active ingredient.
제1항에 있어서,
상기 PIK3CA 돌연변이 검출은 암의 예후 평가 또는 암 돌연변이 발생 위험도를 예측하기 위한 것임을 특징으로 하는 프라이머 및 프로브 세트 조성물.
According to claim 1,
The primer and probe set composition, characterized in that the detection of the PIK3CA mutation is for predicting the prognosis of cancer or the risk of cancer mutation.
제1항에 있어서,
상기 PIK3CA 돌연변이 검출은 암의 표적 치료에 필요한 정보를 제공하기 위한 것임을 특징으로 하는 프라이머 및 프로브 세트 조성물.
According to claim 1,
The primer and probe set composition, characterized in that the detection of the PIK3CA mutation is for providing information necessary for the targeted treatment of cancer.
제1항에 있어서,
상기 PIK3CA 돌연변이 검출은 PIK3CA (Phosphatidylinositol-4,5-Bisphosphate 3-Kinase Catalytic Subunit Alpha) 저해제 또는 HER2 (Human Epidermal Growth Factor Receptor 2) 저해제에 대한 치료 반응성 (responsiveness) 예측을 위한 것임을 특징으로 하는 프라이머 및 프로브 세트 조성물.
According to claim 1,
The PIK3CA mutation detection is PIK3CA (Phosphatidylinositol-4,5-Bisphosphate 3-Kinase Catalytic Subunit Alpha) inhibitors or HER2 (Human Epidermal Growth Factor Receptor 2) inhibitors, primers and probes, characterized in that for predicting therapeutic responsiveness (responsiveness) set composition.
제4항에 있어서,
상기 PIK3CA 저해제는 피크레이 (Piqray, alpelisib), 자이델릭 (Zydelig, idelalisib), 알리코파 (Aliqopa, copanlisib) 및 코픽트라 (Copiktra, duvelisib)으로 이뤄진 군에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 프라이머 및 프로브 세트 조성물.
5. The method of claim 4,
The PIK3CA inhibitor is a primer, characterized in that any one selected from the group consisting of Piqray (Piqray, alpelisib), Zydelig (Zydelig, idelalisib), Aliqopa (Copanlisib) and Copiktra (Copiktra, duvelisib) and Probe set composition.
제4항에 있어서,
상기 HER2 저해제는 허셉틴(Herceptin), 페르투주맙(Pertuzumab), MM-111, 네라티닙(Neratinib), 라파티닙(Lapatinib) 및 라파티닙 디토실레이트(lapatinib ditosylate)/타이커브(Tykerb)^®로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 프라이머 및 프로브 세트 조성물.
5. The method of claim 4,
The HER2 inhibitor is Herceptin (Herceptin), Peer-to-jumap (Pertuzumab), MM-111, four Lahti nip (Neratinib), lapatinib (Lapatinib) and lapatinib Ditto salicylate from the group consisting of (lapatinib ditosylate) / tayikeobeu (Tykerb) ^® Primer and probe set composition, characterized in that any one selected.
제2항 또는 제3항에 있어서,
상기 암은 대장암, 간암, 위암, 폐암, 췌장암, 두부 편평상피세포암, 교모세포종, 자궁내막암, 난소암 및 유방암으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는 프라이머 및 프로브 세트 조성물.
4. The method of claim 2 or 3,
The cancer is colon cancer, liver cancer, stomach cancer, lung cancer, pancreatic cancer, head squamous cell carcinoma, glioblastoma, endometrial cancer, ovarian cancer, and a primer and probe set composition, characterized in that at least one selected from the group consisting of breast cancer.
제1항에 있어서,
상기 프로브는 형광물질과 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 프라이머 및 프로브 세트 조성물.
According to claim 1,
Primer and probe set composition, characterized in that the probe is bound to a fluorescent material.
제8항에 있어서,
상기 형광물질은 VIC, HEX, FAM, EverGreen dye로 이루어진 군에서 선택된 하나이상인 것임을 특징으로 하는 프라이머 및 프로브 세트 조성물.
9. The method of claim 8,
The primer and probe set composition, characterized in that the fluorescent material is at least one selected from the group consisting of VIC, HEX, FAM, and EverGreen dye.
제1항에 따른 프라이머 및 프로브 세트 조성물을 유효성분으로 포함하는 PIK3CA 돌연변이 검출용 키트.
A kit for detecting PIK3CA mutations comprising the primer and probe set composition according to claim 1 as an active ingredient.
제10항에 있어서,
상기 키트는 RUO (research use only) 또는 IVD (in vitro diagnostic) 키트인 것을 특징으로 하는 키트.
11. The method of claim 10,
The kit is a kit, characterized in that the RUO (research use only) or IVD (in vitro diagnostic) kit.
ⅰ) 서열번호 1의 정방향 프라이머, 서열번호 2의 역방향 프라이머, 서열번호 3의 정방향 프라이머, 서열번호 4의 역방향 프라이머 및 서열번호 15 내지 20으로 이루어진 군에서 선택된 프로브의 폴리뉴클레오티드 세트;
ⅱ) 서열번호 3의 정방향 프라이머, 서열번호 4의 역방향 프라이머, 서열번호 5의 정방향 프라이머, 서열번호 6의 역방향 프라이머 및 서열번호 21 내지 27로 이루어진 군에서 선택된 프로브의 폴리뉴클레오티드 세트;
ⅲ) 서열번호 3의 정방향 프라이머, 서열번호 4의 역방향 프라이머, 서열번호 7의 정방향 프라이머, 서열번호 8의 역방향 프라이머 및 서열번호 28 내지 33으로 이루어진 군에서 선택된 프로브의 폴리뉴클레오티드 세트;
ⅳ) 서열번호 11의 정방향 프라이머, 서열번호 12의 역방향 프라이머, 서열번호 13의 정방향 프라이머, 서열번호 14의 역방향 프라이머 및 서열번호 34 내지 38으로 이루어진 군에서 선택된 프로브의 폴리뉴클레오티드 세트;
ⅴ) 서열번호 3의 정방향 프라이머, 서열번호 4의 역방향 프라이머, 서열번호 13의 정방향 프라이머, 서열번호 14의 역방향 프라이머 및 서열번호 39 내지 41로 이루어진 군에서 선택된 프로브의 폴리뉴클레오티드 세트; 및
ⅵ) 서열번호 3의 정방향 프라이머, 서열번호 4의 역방향 프라이머, 서열 번호 9의 정방향 프라이머, 서열번호 10의 역방향 프라이머 및 서열번호 42 내지 43으로 이루어진 프로브의 폴리뉴클레오티드 세트; 로 이루어진 군에서 선택된 세트를 유효성분으로 포함하는 PIK3CA 돌연변이 검출용 키트
i) a polynucleotide set of a probe selected from the group consisting of a forward primer of SEQ ID NO: 1, a reverse primer of SEQ ID NO: 2, a forward primer of SEQ ID NO: 3, a reverse primer of SEQ ID NO: 4, and SEQ ID NOs: 15 to 20;
ii) a polynucleotide set of a probe selected from the group consisting of the forward primer of SEQ ID NO: 3, the reverse primer of SEQ ID NO: 4, the forward primer of SEQ ID NO: 5, the reverse primer of SEQ ID NO: 6 and SEQ ID NOs: 21 to 27;
iii) a polynucleotide set of a probe selected from the group consisting of a forward primer of SEQ ID NO: 3, a reverse primer of SEQ ID NO: 4, a forward primer of SEQ ID NO: 7, a reverse primer of SEQ ID NO: 8 and SEQ ID NOs: 28 to 33;
iv) a polynucleotide set of a probe selected from the group consisting of a forward primer of SEQ ID NO: 11, a reverse primer of SEQ ID NO: 12, a forward primer of SEQ ID NO: 13, a reverse primer of SEQ ID NO: 14 and SEQ ID NOs: 34 to 38;
v) a polynucleotide set of a probe selected from the group consisting of a forward primer of SEQ ID NO: 3, a reverse primer of SEQ ID NO: 4, a forward primer of SEQ ID NO: 13, a reverse primer of SEQ ID NO: 14 and SEQ ID NOs: 39 to 41; and
vi) a polynucleotide set of a probe consisting of the forward primer of SEQ ID NO: 3, the reverse primer of SEQ ID NO: 4, the forward primer of SEQ ID NO: 9, the reverse primer of SEQ ID NO: 10 and SEQ ID NOs: 42 to 43; A kit for detecting PIK3CA mutations comprising a set selected from the group consisting of
제10항에 있어서,
상기 키트는 digital PCR 또는 qPCR (quantitative PCR) 방법에 사용되는 것임을 특징으로 하는 키트.
11. The method of claim 10,
The kit is characterized in that it is used for digital PCR or qPCR (quantitative PCR) method.
제13항에 있어서,
상기 digital PCR 방법은 ddPCR(Droplet Digital PCR)인 것을 특징으로 하는 키트.
14. The method of claim 13,
The digital PCR method is a kit, characterized in that ddPCR (Droplet Digital PCR).
제10항에 있어서,
상기 키트는 혈액에서 분리된 cfDNA(cell-free DNA)를 주형으로 하는 것을 특징으로 하는 키트.
11. The method of claim 10,
The kit is a kit, characterized in that the cfDNA (cell-free DNA) isolated from blood as a template.
제10항에 있어서,
상기 키트는 FFPE (formalin fixed parafin embedded) 조직에서 분리된 DNA 또는 상기 조직 유래의 RNA로부터 역전사 반응에 의해 합성된 cDNA (complementary DNA)를 주형으로 하는 것을 특징으로 하는 키트.
11. The method of claim 10,
The kit is a kit, characterized in that the DNA isolated from FFPE (formalin fixed parafin embedded) tissue or cDNA (complementary DNA) synthesized by reverse transcription from the tissue-derived RNA as a template.
제10항에 있어서,
상기 키트는 혈액에서 분리된 CTC (circulating tumor cell)에서 분리된 DNA 또는 상기 CTC 유래의 RNA로부터 역전사 반응에 의해 합성된 cDNA (complementary DNA)를 주형으로 하는 것을 특징으로 하는 키트.
11. The method of claim 10,
The kit is a kit, characterized in that the DNA isolated from CTC (circulating tumor cell) isolated from blood or cDNA (complementary DNA) synthesized by reverse transcription from the CTC-derived RNA as a template.
암의 예후 또는 돌연변이 발생 위험도 예측에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 하기 단계를 포함하는 시료에서 PIK3CA 돌연변이 검출 방법;
(a) 암 시료 또는 암 돌연변이 발생 의심 시료에서 PIK3CA DNA를 분리하는 단계;
(b) 상기 각각의 분리된 PIK3CA DNA를 주형으로 하고 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 프라이머 및 프로브 세트를 이용하여 중합효소연쇄반응(PCR)을 실시하는 단계;
(c) 상기 중합효소연쇄반응으로 증폭된 산물의 PIK3CA 유전자의 특정 부위를 확인하는 단계; 및
(d) 상기 암 돌연변이 발생 의심 시료와 암 시료를 비교하여 PIK3CA 유전자 특정 부위의 돌연변이 발생 여부를 확인하는 단계.
In order to provide information necessary for predicting the prognosis of cancer or the risk of mutation, a method for detecting a PIK3CA mutation in a sample comprising the following steps;
(a) isolating PIK3CA DNA from a cancer sample or a sample suspected of having a cancer mutation;
(b) using each of the isolated PIK3CA DNA as a template and performing a polymerase chain reaction (PCR) using the primer and probe set of any one of claims 1 to 6;
(c) identifying a specific region of the PIK3CA gene of the product amplified by the polymerase chain reaction; and
(d) determining whether a mutation occurs in a specific region of the PIK3CA gene by comparing the sample suspected of having a cancer mutation with the cancer sample.
암의 표적 치료에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 하기 단계를 포함하는 시료에서 PIK3CA 돌연변이 검출 방법;
(a) 시료에서 PIK3CA DNA를 분리하는 단계;
(b) 상기 분리된 PIK3CA DNA를 주형으로 하고 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 프라이머 및 프로브 세트를 이용하여 중합효소연쇄반응(PCR)을 실시하는 단계;
(c) 상기 중합효소연쇄반응으로 증폭된 산물의 PIK3CA 유전자의 특정 부위를 확인하는 단계; 및
(d) 상기 확인된 PIK3CA 유전자의 돌연변이를 분석하여 표적 약물치료 전략을 설계하는 단계.In order to provide information necessary for targeted treatment of cancer, a method for detecting a PIK3CA mutation in a sample comprising the following steps;
(a) isolating the PIK3CA DNA from the sample;
(b) performing a polymerase chain reaction (PCR) using the isolated PIK3CA DNA as a template and using the primer and probe set according to any one of claims 1 to 5;
(c) identifying a specific region of the PIK3CA gene of the product amplified by the polymerase chain reaction; and
(d) designing a target drug treatment strategy by analyzing the mutation of the identified PIK3CA gene.

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