KR100860060B1 - ＨＩＦ-１α Ｃ-말단 펩타이드와 ＣＢＰ 또는 ｐ３００단백질과의 결합을 정량분석하는 방법 및 상기 방법을이용한 단백질 복합체 형성을 저해하는 억제제의 스크리닝방법 - Google Patents

ＨＩＦ-１α Ｃ-말단 펩타이드와 ＣＢＰ 또는 ｐ３００단백질과의 결합을 정량분석하는 방법 및 상기 방법을이용한 단백질 복합체 형성을 저해하는 억제제의 스크리닝방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 형광편광을 이용한 HIF-1α(alpha) C-말단 펩타이드와 CBP 또는 p300 단백질간의 결합을 정량적으로 분석하는 방법 및 상기 분석방법을 이용하여 HIF-1α 펩타이드와 CBP 또는 p300 단백질 결합 억제제를 스크리닝하는 방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로 형광물질을 부착한 형광 프로브인 HIF-1α C-말단 펩타이드를 제조한 후, 형광표지된 상기 펩타이드와 CBP 또는 p300 단백질과의 결합양상을 형광편광 값으로 측정함으로써 결합체의 형성을 정량적으로 분석하는 방법에 관한 것이다.　 본 발명에 의한 분석방법은 복합체를 따로 분리하지 않는 단일화 과정 및 웰 플레이트를 이용한 자동화가 가능하여 분석비용을 절감할 수 있기 때문에, HIF-1α 펩타이드와 CBP 또는 p300 단백질의 복합체 형성을 저해하는 억제제를 대량으로 스크리닝하거나 또는 HIF-1α의 단백질합성 후 변형(post-translational modification)의 효능을 분석하는데 유용하게 사용될 수 있다.
형광편광, HIF-1α C-말단 펩타이드, CBP 또는 p300, 단백질합성 후 변형(post-translational modification)

Description

ＨＩＦ-１α Ｃ-말단 펩타이드와 ＣＢＰ 또는 ｐ３００ 단백질과의 결합을 정량분석하는 방법 및 상기 방법을 이용한 단백질 복합체 형성을 저해하는 억제제의 스크리닝 방법{METHOD FOR QUANTITATIVE ANALYSIS OF INTERACTIONS BETWEEN HIF-1ALPHA C-TERMINAL PEPTIDES AND CBP OR p300 PROTEINS AND METHOD OF SCREENING INHIBITORS AGAINST FORMATION OF PROTEIN COMPLEX USING THE SAME}
도 1은 형광표지된 HIF-1α C-말단 펩타이드와 단백질 준비과정 시 Zn2 +의 첨가 유무에 따른 CBP(도 1a) 또는 p300(도 1b) 단백질과의 결합양상을 형광편광 측정으로 분석하여 나타낸 그래프이고,
도 2는 4개의 형광표지된 HIF-1α C-말단 펩타이드와 CBP 단백질과의 결합을 CBP 단백질 농도를 증가시키면서 형광편광 측정으로 분석하여 나타낸 그래프로서, 도 2a는 형광편광 측정 결과이고, 도 2b는 도 2a의 값에서 CBP 단백질을 첨가하지 않은 펩타이드의 형광편광 값을 뺀 형광편광 값을 나타낸 그래프이고, 도 2c 및 도 2d는 각각 HIF-1α(776-826) 및 HIF-1α(786-826) 펩타이드와 CBP 단백질과의 결합상수를 칼레이다그래프(Kaleidagraph) 프로그램으로 분석하여 나타낸 그래프이고,
도 3은 4개의 형광표지된 HIF-1α C-말단 펩타이드와 p300 단백질과의 결합을 p300 단백질 농도를 증가시키면서 형광편광 측정으로 분석하여 나타낸 그래프로 서, 도 3a는 형광편광 측정 결과이고, 도 2b는 도 3a의 값에서 p300 단백질을 첨가하지 않은 펩타이드의 형광편광 값을 뺀 형광편광 값을 나타낸 그래프이고, 도 3c 및 도 3d는 각각 HIF-1α(776-826) 및 HIF-1α(786-826) 펩타이드와 p300 단백질과의 결합상수를 칼레이다그래프 프로그램으로 분석하여 나타낸 그래프이고,
도 4는 FIH(Factor-inhibiting HIF) 효소의 첨가 유무에 따른 HIF-1α(786-826) 펩타이드의 수산화(hydroxylation) 여부를 MALDI-TOF 질량분석기로 측정하여 나타낸 그래프(도 4a) 및 상기 펩타이드와 FIH 효소와의 반응이 p300 또는 CBP 단백질과의 결합에 어떠한 영향을 미치는지 형광편광 측정으로 분석하여 나타낸 그래프(도 4b)이고,
도 5는 HIF-1α(786-826) 펩타이드에 SNAP을 처리하여 에스-니트로소화(S-nitrosylation) 시킨 후, 니트로소티올(nitrosothiol) 결합의 형성 여부를 흡광도로 측정하여 나타낸 그래프(도 5a) 및 SNAP 첨가 유무에 따른 상기 펩타이드의 에스-니트로소화가 p300 단백질과의 복합체 형성에 어떠한 영향을 미치는지 형광편광 측정으로 분석하여 나타낸 그래프(도 5b)이고,
도 6은 HIF-1α(786-826) 펩타이드와 정상산소 상태(normoxia) 또는 저산소 상태(hypoxia)에서 배양된 세포로부터 분리한 인산화효소 단백질을 반응시킨 후, 상기 인산화효소에 의해 32P-ATP로부터 전이된 방사선동위원소 인산염이 펩타이드에 접합된 것을 scintillation counter로 분석하여 상기 펩타이드의 인산화 여부를 나타낸 그래프(도 6a) 및 상기 펩타이드와 p300 단백질 복합체 형성에 상기 인산 화(phosphorylation)가 어떠한 영향을 미치는지 형광편광 측정으로 분석하여 나타낸 그래프이다.
본 발명은 형광편광을 이용한 HIF-1α(alpha) C-말단 펩타이드와 CBP 또는 p300 단백질간의 결합을 정량적으로 분석하는 방법 및 상기 분석방법을 이용하여 HIF-1α 펩타이드와 CBP 또는 p300 단백질 결합 억제제를 스크리닝하는 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 형광물질을 부착한 형광 프로브인 HIF-1α C-말단 펩타이드를 제조한 후, 형광표지된 상기 펩타이드와 CBP 또는 p300 단백질과의 결합양상을 형광편광 값으로 측정함으로써 결합체의 형성을 정량적으로 분석하는 방법에 관한 것이다.
동물세포가 산소 수치의 변화를 감지 및 반응하는 능력은 생존에 필수적이며, 발생(development) 과정뿐 아니라 혈관신생(angiogenesis)과 같은 생리적 과정(physiological process), 심근 허혈(myocardial ischemia), 뇌허혈(cerebral ischemia), 폐동맥 고혈압(pulmonary hypertension) 및 암과 같은 인간 질병에 관여한다고 알려져 있다.　 이러한 산소 수치와 관련된 많은 질병에서 중요한 역할을 하는 단백질 중 하나가 HIF-1(hypoxia inducible factor-1: 저산소 유도인자)이다.
HIF-1은 α와 β 서브유닛으로 구성되어 있으며, 이때 β 서브유닛은 항상 안정적으로 발현되나, HIF-1α는 저산소 상태(hypoxia)에서는 안정화되고, 정상산 소 상태(normoxia)에서는 프로테오솜(proteosome)에 의해 분해되는 특징을 가지고 있다.　 저산소 상태에서 안정화된 HIF-1α는 핵내에 있는 전사보조단백질인 CBP(cAMP-response element-binding protein) 또는 p300 단백질과 결합하여 복합체를 형성한 후, 표적 유전자의 프로모터상에 존재하는 저산소 반응인자(hypoxia-response element, HRE)와 결합하여 표적 유전자들의 전사를 활성화시킨다(Lando, D., et al., Genes. Dev., 16: 1466-14, 2002).　 이때, 상기 CBP 및 p300 전사보조단백질은 각종 신호전달경로의 종결점에서 작용하여 세포의 성장, 분화 및 항상성 유지와 관련된 특정 유전자의 발현을 조절하기 때문에, HIF-1α와 CBP 또는 p300 단백질간의 결합을 조절하게 되면 관상동맥부전, 뇌부전 및 혈관부전과 같은 허혈성 질환을 치료하거나 혈관형성 억제를 통한 암 치료 연구에 매우 유용하게 사용될 수 있다.
CBP 또는 p300 단백질은 Zn2 + 결합 인자를 포함하는 시스테인-/히스티딘-풍부(cysteine-/histidine-rich) CH1 도메인을 가지고 있으며, 이 CH1 도메인은 HIF-1α의 C-말단 부위와 결합하는데, 이러한 결합에는 HIF-1α의 C-말단 부위에 있는 TAD-C(C-terminal transactivation domain)로도 알려져 있는 HIF-1α의 C-말단 부위가 필요하다(Kung, A.L., et al., Nature Medicine, 6: 1335-1340, 2000).　 또한, NMR 연구를 통해 p300 단백질의 331-418번째 아미노산 부위와 HIF-1α의 792-824번째 아미노산 펩타이드의 복합체 구조(Freedman, S. J., et al., PNAS, 99: 5367-5372, 2002) 및 마우스 CBP 단백질의 345-439번째 아미노산 부위와 HIF-1α의 776-826번째 아미노산 펩타이드의 복합체 구조가 밝혀지게 되었다(Dames, S. A., et al., PNAS, 99: 5271-5276, 2002).　 상기 복합체 구조들에 따르면, CH1은 HIF-1α의 C-말단 도메인의 접힘(folding)을 위한 지지대(scaffold)로서 작용하여 다양한 소수성 및 극성 상호작용에 의해 안정화됨을 알 수 있다.　 또한, 본 발명에서는 펩타이드를 수 mM의 높은 농도로 사용하는 NMR 분석과는 달리, μM 단위의 낮은 농도에서도 충분히 결합할 수 있는 HIF-1α의 아미노산 부위를 사용하는 결합 분석법을 개발하였다.
HIF-1 의존성 목표 유전자의 발현은 2가지 다른 산소-의존성 기작(oxygen-dependent mechanism)에 의해 조절되며, 이러한 2가지 기작은 프롤린 수산화반응(proline hydroxylation)과 아스파라긴 수산화반응(asparagine hydroxylation)이다.　 프로릴 수산화효소(prolyl hydroxylase)에 의한 HIF-1α의 ODD(oxygen-dependent domain, 산소-의존성 도메인)에 있는 프롤린 잔기의 수산화반응은 HIF-1α의 분해를 유도하는 반면, 아스파라긴 수산화반응은 HIF-1α의 C-말단을 불활성화시켜 HIF-1α의 분해를 유도하는 것으로 알려져 있다.　 처음에 HIF-1을 저해하는 인자로 발견된 FIH(factor-inhibiting HIF; Mahon, P.C., et al., Genes Dev., 15: 2675-2686, 2001) 단백질은 이후 HIF-1α의 조절에 관여하는 산소 센서의 특징을 가지고 있음이 밝혀지게 되었다(Lando, D., et al., Genes Dev., 16: 1466-14, 2002).　 즉, FIH는 2-옥소글루타레이트(oxoglutarate) 및 금속-의존성 디옥시제나제(iron-dependent dioxygenase) 단백질(Safran, M., et al., J. Clin. Invest., 111: 779-783, 2003)로서 정상산소 상태에서 HIF-1α의 아스파라긴 803을 수산화시 켜 HIF-1α의 C-말단 부위와 CBP 또는 p300 단백질과의 결합을 방해한다고 알려져 있다.
HIF-1α와 CBP 또는 p300 단백질과의 결합에 따른 전사적 활성은 수산화반응 이외에도 다양한 단백질합성 후 변형(post-translational modification)에 의해서 조절된다.　 대표적인 전사적 활성조절 기작으로는 전사인자의 인산화(phosphorylation; Holmberg, C. I., et al., Trends Biochem. Sci., 27: 619-627, 2002) 즉, 정상산소 상태 및 저산소 상태에서 HIF-1α의 직접적인 인산화가 보고되고 있으나(Brahimi-Horn, C., et al., Cellular Signalling, 17: 1-9, 2005), 그 효능에 있어서는 논쟁의 여지가 있다.　 또한, 세포 종류 및 NO 농도에 따라 NO가 HIF-1α의 안정성을 증가시키거나 감소시키는 것으로 알려져 있으며(Bilton, R. L., et al., Eur. J. Biochem., 270: 791-798, 2003), HIF-1α 시스테인 800 잔기의 에스-니트로소화(S-nitrosation)가 p300 단백질과의 상호작용을 증가시켜서 전사적 활성을 증가시킨다는 보고도 있다(Yasinska, I.M., et al., FEBS Lett., 549: 105-109, 2003).
현재까지, HIF-1α와 CBP 또는 p300 단백질과의 상호작용을 관찰하기 위한 다양한 생화학적 또는 면역학적 방법들이 사용되고 있다.　 우선, 상기 단백질간의 상호작용을 분석하는데 널리 사용되고 있는 2종-혼성화 분석(two-hybrid assay)은 효모 GAL4 전사인자의 DNA 결합 도메인(DNA binding domain, DBD)을 CBP 또는 p300 단백질에, 전사 활성화 도메인(transcriptional activation domain, TAD)을 HIF-1α에 각각 융합시켜 두 단백질의 결합에 의한 전사활성을 측정하는 방법이다.　 이 때, GFP(green fluorescent protein), 루시퍼라제(luciferase), β-갈락토시다제(β-galactosidase) 등과 같은 리포터(reporter) 유전자를 이용하면 상기 두 단백질의 결합에 따른 전사활성을 보다 손쉽게 측정할 수 있다.　 또한, CBP 또는 p300 단백질과 HIF-1α의 결합을 리포터 유전자의 활성화로 측정하여 두 단백질간의 상호작용 유무를 측정할 수 있다(Yoshida, E., et al., Genes, 208: 307-314, 1998).
다른 방법으로는, HIF-1α와 CBP 또는 p300 단백질 중 한 단백질은 검출가능한 물질로 표지하고, 나머지 단백질은 고체 담체에 고정시켜 두 단백질의 상호작용을 측정하는 방법이 있다.　 이때, 검출가능한 표지로는 재조합 단백질에 도입할 수 있는 35S-메치오닌(35S-methionine), HA 표지(tag), GST 표지 및 히스티딘 표지 등이 있다(UY 6,787,326 B1).　 이 중, p300 단백질의 CH1 도메인에는 GST를, HIF-1α에는 35S를 각각 표지시켜 전기영동 (SDS-PAGE) 및 자기방사법(autoradiography)을 이용하여 두 단백질간의 상호작용을 측정하는 방법이 보편적으로 사용되고 있다(Kung, A. L., et al., Nature Medicine, 6: 1335-1340, 2000).　 또 다른 방법으로는, CBP 또는 p300 단백질과 HIF-1α의 결합을 HIF-1α의 특정 부위를 인식하는 항체를 이용하여 면역침강(coimmunoprecipitation)시켜서 전기영동으로 분석하여 상호작용 여부를 측정하는 방법이 이용되고 있다.　 그러나, 상기 3가지 방법들은 대량의 시료를 요구하고, 과정이 복잡하며, 실험 소요시간이 길고, 방사성 동위원소를 사용해야 하는 단점을 가지고 있다.
한편, 단백질간의 직접적인 결합을 분석하는 대신 간접적인 방법 즉, HIF-1 α가 CBP 또는 p300 단백질과 결합한 후 저산소-반응 인자(HRE)에 결합함으로써 전사적 활성을 나타낸다는 것에 착안한 리포터 분석도 있다.　 예를 들면, 루시퍼라제를 포함하는 저산소-반응 리포터인 Epo-Luciferase를 세포에 형질도입시켜 발현되는 루시퍼라제의 활성을 측정함으로써 세포내 HIF-1α의 전사활성을 측정하는 방법이 있다(Kung, A. L., et al., Nature Medicine, 6: 1335-1340, 2000).　
상기와 같은 생화학적 또는 면역학적 방법이나 방사능을 표지하는 방법들은 과정이 복잡하고 비용이 많이 드는 단점이 있기 때문에, HIF-1α와 CBP 또는 p300 단백질과의 상호작용을 관찰하기 위한 보다 간단한 분석법이 요구되고 있다.　 이러한 연구의 일환으로, 방사선 원소를 사용하지 않고 단시간에 HIF-1α와 p300 단백질간의 결합을 관찰할 수 있는 96-웰 플레이트를 이용한 분석법이 개발되었다(Kung, A. L., et al, Cancer Cell, 6: 33-43, 2004).　 이 방법은 HIF-1α의 최소 p300 결합 도메인(minimal p300 binding domain)에 해당하는 부위에 바이오틴(biotin)을 붙여서 스트렙토아비딘(streptoavidin)이 코팅된 다중 웰 플레이트(multiwell plate)에 고정시킨 후, 박테리아에서 생산한 GST-CH1(p300) 단백질을 처리하고, 유로피움(europium)-접합된 항-GST 항체를 처리하여 결합된 단백질의 양을 시분해형광분광기(time-resolved fluorescence sepectrometer)로 측정하는 방법이다.　 이러한 측정법은 HIF-1α와 p300 단백질의 상호작용을 저해하는 화합물을 스크리닝하는데 이용가능하나, 고가의 아비딘이 코팅된 플레이트, 항체 및 시분해형광을 측정할 수 있는 분광기를 사용해야 하는 단점을 가지고 있다.
이에, 본 발명자들은 형광표지된 HIF-1α의 C-말단 펩타이드와 CBP 또는 p300 단백질과의 결합 여부를 형광편광 측정 및 분석하여 그 변화를 관찰함으로써 결합체의 형성을 정량적으로 분석할 수 있는 방법을 개발하였고, 이러한 방법을 이용하여 HIF-1α-CBP 또는 HIF-1α-p300 단백질 복합체 형성을 저해할 수 있는 억제제를 대량으로 스크리닝하거나 또는 HIF-1α의 단백질합성 후 변형(post-translational modification; hydroxylation, nitrosation, phosphorylation)의 영향을 분석하는데 유용하게 사용될 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 HIF-1α C-말단 펩타이드와 CBP 또는 p300 단백질과의 상호작용을 간단하게 정량분석할 수 있는 방법 및 상기 방법을 이용한 HIF-1α 펩타이드와 CBP 또는 p300 단백질 결합 억제제의 스크리닝 방법에 관한 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 형광물질을 부착한 형광 프로브인 HIF-1α C-말단 펩타이드와 CBP 또는 p300 단백질의 결합을 정량분석할 수 있는 형광편광 측정방법을 제공한다.
아울러, 본 발명은 상기 형광편광 측정방법을 이용하여 HIF-1α 펩타이드와 CBP 또는 p300 단백질 결합 억제제의 스크리닝 방법을 제공한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 형광물질을 부착한 형광 프로브인 HIF-1α C-말단 펩타이드와 CBP 또는 p300 단백질의 결합을 정량분석할 수 있는 형광편광 측정방법을 제공한다.
구체적으로, 형광편광 측정방법은 하기 1) 내지 3) 단계를 포함하고 있다:
1) HIF-1α C-말단 펩타이드에 형광물질을 부착하여 형광 프로브를 제조하는 단계;
2) 형광표지된 상기 HIF-1α C-말단 펩타이드를 CBP 또는 p300 단백질과 접촉시켜 상기 HIF-1α C-말단 펩타이드에 부착된 형광물질과 CBP 또는 p300 단백질을 반응시키는 단계 및
3) 상기 반응물의 형광편광을 측정한 후, 형광 프로브 자체의 형광편광 값과 비교하여 형광편광 값의 변화를 분석하는 단계.
상기 형광편광 측정방법에 있어서, 단계 1)의 형광 프로브에 포함된 HIF-1α C-말단 펩타이드는 HIF-1α 전장 아미노산 서열(GenBank 등재번호: U22431) 중 적어도 CBP 단백질에 결합하는 HIF-1α C-말단의 776 내지 826번째 아미노산 서열 또는 p300 단백질에 결합하는 HIF-1α C-말단의 786 내지 826번째 아미노산 서열을 포함하는 41 내지 51개의 아미노산을 포함하는 것일 수 있다. 상기 HIF-1α C-말단 펩타이드에 포함된 상기 776 내지 826번째 아미노산 서열 또는 786 내지 826번째 아미노산 서열 이외의 서열은 상기 펩타이드의 CBP 단백질 또는 p300 단백질과의 결합 능력에 영향을 주지 않는 한 어떠한 아미노산 서열도 포함할 수 있다.
또한, 단계 1)의 형광 프로브는 상기 아미노산 서열 외에 추가적으로 N-말단에는 아미노카프로산 링커(aminocaproic acid linker)를 연결시키는 것이 바람직하며, 그 끝에는 형광물질인 FITC(fluorescein isothiocyanate)를 표지한 서열번호 3 또는 서열번호 4인 것이 바람직하다(표 1 참조).　 이때, 상기 링커는 특별히 제한되는 것은 아니며, 형광물질이 부착된 펩타이드 프로브가 대상 단백질과 결합시에 유발될 수 있는 형광세기 변화를 최소화하여 형광편광 측정을 용이하게 할 수 있는 어떠한 링커도 사용 가능하며, 링커가 없어도 무방하다.　 또한, 상기 형광물질은 특별히 제한되는 것은 아니며, 피코에리스린(phycoerythrin, PE), 텍사스 레드(Texas Red, TR) 및 로다민(tetrame-thylrhodamine isothiocyanate, TRITC), 플루오레신카복실산(fluorescein carboxylic acid, FCA), 플루오레신 티오우레아(fluorescein thiourea, FTH), 7-아세톡시쿠마린(acethocycoumarin)-3-1, 플루오레신-5-1, 플루오레신-6-1, 2',7'-디클로로플루오레신(dichlorofluorescein)-5-1, 2',7'-디클로로플루오레신-6-1, 디하이드로테트라메틸로사민(dehydrotetramethylosamine)-4-1, 테트라메틸로다민(tetramethylrhodamine)-5-1, 테트라메틸로다민-6-1로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.
상기 형광편광 측정방법에 있어서, 단계 2)의 CBP 단백질은 특별히 제한되는 것은 아니나, 서열번호 1로 기재되는 1 내지 450번째 아미노산 서열을 갖는 것이 바람직하며, p300 단백질은 특별히 제한되는 것은 아니나, 서열번호 2로 기재되는 300 내지 528번째 아미노산 서열을 갖는 것이 바람직하다.　 이때, 상기 CBP 또는 p300 단백질은 각각 Genebank 등재번호 U85962 및 U01877에 기재된 유전자의 염기서열 중 HIF-1α와 결합하는 부위를 포함하는 CBP 또는 p300 단백질의 일부 또는 전체 아미노산을 포함하는 것일 수 있다.　 본 발명의 바람직한 실시예에서는 CBP 또는 p300 단백질을 발현하는 발현벡터를 제조하였고, 이를 각각 적합한 숙주세포에 형질전환시켜 발현시킨 후 배양 세포 또는 배양액으로부터 추출하여 분리 및 정제하였다.　 이때, 상기 CBP 또는 p300 단백질의 분리 및 정제는 특별히 제한되는 것은 아니나, 투석, 한외여과, 겔여과 및 SDS-PAGE와 같은 분자량의 차이를 이용한 방법, 이온-교환 컬럼 크로마토그래피와 같은 전하의 차이를 이용한 방법 및 역상 고성능 액체 크로마토그래피와 같은 친수성의 차이를 이용한 방법을 사용하는 것이 바람직하다.
또한, 단계 2)의 반응은 완충용액에 형광표지된 HIF-1α C-말단 펩타이드와 CBP 또는 p300 단백질의 함량을 1:1 내지 1:30의 비율로 혼합하여 HIF-1α C-말단 펩타이드와 CBP 또는 p300 단백질의 결합을 유도하는 것이 바람직하며, 보다 바람직하게는 1:2 내지 1:10의 비율로 혼합하여 유도할 수 있다.
상기 형광편광 측정방법에 있어서, 단계 3)의 형광편광 측정은 특별히 제한되는 것은 아니나, 형광분석기(fluorescence spectrometer)나 웰 플레이트(well plate) 기반의 형광 측정기(Victor plate reader)를 이용하는 것이 바람직하며, 형광편광 값의 변화는 측정된 반응물의 형광편광 값에서 형광 프로브 자체의 형광편광 값을 뺀 값으로 나타낼 수 있다.　 이때, 상기 형광물질이 부착된 HIF-1α C-말단 펩타이드는 분자량이 매우 작아 상대적으로 작은 형광편광 값을 갖지만, 분자량이 큰 CBP 또는 p300 단백질과 결합하여 복합체를 형성하게 되면 형광편광 값이 현저히 증가하므로, 형광물질을 부착한 형광 프로브와 CBP 또는 p300 단백질간의 반응 전후의 형광편광 값의 변화를 이용하여 두 단백질간의 상호작용을 분석할 수 있다.　 보다 구체적으로, 상기 형광편광 값의 변화는 예컨대, 값의 차이가 (+)일 때 복합체가 형성되었다고 판정할 수 있다.
상기와 같은 방법으로, 형광물질을 부착한 형광 프로브인 HIF-1α C-말단 펩 타이드와 CBP 또는 p300 단백질의 결합 유무 및 특징을 분석한 결과, 도 1과 같이 Zn2 + 결합 단백질인 CBP 또는 p300 단백질 준비 시 Zn2 +를 첨가하지 않아도 HIF-1α C-말단 펩타이드와 결합할 수 있음을 확인하였고, 형광표지된 4개의 HIF-1α C-말단 펩타이드(서열번호 3 내지 6)를 각각 CBP 또는 p300 단백질과 반응시켜 형광편광 측정으로 분석한 결과, HIF-1α(776-826, 서열번호 3) 및 HIF-1α(786-826, 서열번호 4)의 경우 CBP 또는 p300 단백질의 농도가 증가함에 따라 형광편광 값이 증가하는 반면, HIF-1α(788-822, 서열번호 6) 및 HIF-1α(776-814, 서열번호 5)의 경우 CBP 또는 p300 단백질의 농도 증가에 따른 형광편광 값의 증가가 미약하거나 또는 단백질의 농도가 증가해도 형광편광 값이 거의 변하지 않음을 확인할 수 있었다(도 2a-b 및 도 3a-b 참조).　 이는, HIF-1α C-말단 펩타이드에 있는 적어도 786 내지 826번째 아미노산 서열이 CBP 또는 p300 단백질과의 결합에 중요한 부위임을 의미한다.　 이때, 상기 HIF-1α(776-826, 서열번호 3) 및 HIF-1α(786-826, 서열번호 4)와 CBP 또는 p300 단백질간의 결합상수는 각각 195 nM과 175 nM 및 157 nM과 180 nM이었다(도 2c-d 및 도 3c-d 참조).
아울러, 본 발명은 상기 형광편광 측정방법을 이용하여 HIF-1α 펩타이드와 CBP 또는 p300 단백질 결합 억제제의 스크리닝 방법을 제공한다.
구체적으로, 상기 두 단백질간의 결합을 저해하는 억제제의 스크리닝 방법은 하기 1) 내지 3) 단계를 포함하고 있다:
1) 상기 형광물질이 부착된 형광 프로브인 HIF-1α C-말단 펩타이드와 CBP 또는 p300 단백질을 혼합하여 반응시킨 후, 형광편광 값을 측정하는 단계;
2) 상기 혼합물에 저해제 후보물질을 첨가시킨 후, 형광편광 값을 측정하는 단계 및
3) 상기 단계 1) 및 2)에서 측정된 형광편광 값을 비교하여 단계 2)의 형광편광 값이 작을 경우, 상기 후보물질을 HIF-1α-CBP 또는 HIF-1α-p300 복합체 형성 저해제로 판정하는 단계.
상기 스크리닝 방법에 있어서, 단계 1)의 형광 프로브에 포함된 HIF-1α C-말단 펩타이드는 HIF-1α 전장 아미노산 서열(GenBank 등재번호: U22431) 중 적어도 CBP 단백질에 결합하는 HIF-1α C-말단의 776 내지 826번째 아미노산 서열 또는 p300 단백질에 결합하는 HIF-1α C-말단의 786 내지 826번째 아미노산 서열을 포함하는 41 내지 51개의 아미노산을 포함하는 것일 수 있다. 상기 HIF-1α C-말단 펩타이드에 포함된 상기 776 내지 826번째 아미노산 서열 또는 786 내지 826번째 아미노산 서열 이외의 서열은 상기 펩타이드의 CBP 단백질 또는 p300 단백질과의 결합 능력에 영향을 주지 않는 한 어떠한 아미노산 서열도 포함할 수 있다.
또한, 단계 1)의 형광 프로브는 상기 아미노산 서열 외에 추가적으로 N-말단에는 아미노카프로산 링커(aminocaproic acid linker)를 연결시키는 것이 바람직하며, 그 끝에는 형광물질인 FITC(fluorescein isothiocyanate)를 표지한 서열번호 3 또는 서열번호 4인 것이 바람직하다(표 1 참조).　 이때, 상기 링커는 특별히 제한되는 것은 아니며, 형광물질이 부착된 펩타이드 프로브가 대상 단백질과 결합시에 유발될 수 있는 형광세기 변화를 최소화하여 형광편광 측정을 용이하게 할 수 있는 어떠한 링커도 사용 가능하며, 링커가 없어도 무방하다.　 또한, 상기 형광물질은 특별히 제한되는 것은 아니며, 피코에리스린(phycoerythrin, PE), 텍사스 레드(Texas Red, TR) 및 로다민(tetrame-thylrhodamine isothiocyanate, TRITC), 플루오레신카복실산(fluorescein carboxylic acid, FCA), 플루오레신 티오우레아(fluorescein thiourea, FTH), 7-아세톡시쿠마린(acethocycoumarin)-3-1, 플루오레신-5-1, 플루오레신-6-1, 2',7'-디클로로플루오레신(dichlorofluorescein)-5-1, 2',7'-디클로로플루오레신-6-1, 디하이드로테트라메틸로사민(dehydrotetramethylosamine)-4-1, 테트라메틸로다민(tetramethylrhodamine)-5-1, 테트라메틸로다민-6-1로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.
상기 스크리닝 방법에 있어서, 단계 1)의 CBP 단백질은 특별히 제한되는 것은 아니나, 서열번호 1로 기재되는 1 내지 450번째 아미노산 서열을 갖는 것이 바람직하며, p300 단백질은 특별히 제한되는 것은 아니나, 서열번호 2로 기재되는 300 내지 528번째 아미노산 서열을 갖는 것이 바람직하다.　 이때, 상기 CBP 또는 p300 단백질은 각각 Genebank 등재번호 U85962 및 U01877에 기재된 유전자의 염기서열 중 HIF-1α와 결합하는 부위를 포함하는 CBP 또는 p300 단백질의 일부 또는 전체 아미노산을 포함하는 것일 수 있다.
또한, 단계 2) 저해제 후보물질로는 특별히 제한되는 것은 아니나, 형광물질이 부착된 HIF-1α와 서로 경쟁적으로 작용하여 CBP 또는 p300 단백질과의 결합을 억제할 수 있는 항체, 펩타이드, 올리고뉴클레오티드 및 합성 화합물을 사용하는 것이 바람직하다.
본 발명의 바람직한 실시예에서는 종래에 알려진 HIF-1α의 억제제인 FIH(factor-inhibiting HIF), 니트로소티올 유도체(nitrosothiol derivative)인 SNAP(S-nitroso-N-acetylpenicillamine) 및 저산소 상태 또는 정상산소 상태에서 배양한 세포의 인산화효소 단백질을 각각 처리했을 때, 상기 HIF-1α C-말단 펩타이드의 단백질합성 후 변형(post-translational modification)이 CBP 또는 p300 단백질 결합체 형성에 어떠한 영향을 미치는지 조사하였다.　 그 결과, FIH에 의해 HIF-1α(786-826, 서열번호 4)가 수산화되었고(도 4a 참조), 효소 반응 후 펩타이드-단백질 결합체의 형광편광 값이 현저하게 감소됨을 알 수 있었다(도 4b 참조).　 또한, SNAP에 의해 HIF-1α(786-826, 서열번호 4) 펩타이드가 니트로소화(nitrosation)되었고(도 5a 참조), 효소 반응 후 펩타이드-단백질 결합체의 형광편광 값이 현저하게 감소됨을 확인할 수 있었다(도 5b 참조).　 또한, 정상산소 상태 또는 저산소 상태에서 배양된 세포로부터 분리한 인산화효소 단백질을 처리했을 때, HIF-1α(786-826, 서열번호 4) 펩타이드가 인산화되었고(도 6a 참조), 효소 반응 후 펩타이드-단백질 결합체의 형광편광 값이 현저하게 감소됨을 확인하였다(도 6b 참조).　 이는, 본 발명의 스크리닝 방법에 의해 선정된 저해제 후보물질을 이용할 경우, 상기 저해제 후보물질과 HIF-1α 펩타이드와의 반응이 CBP 또는 p300 단백질 결합체 형성에 어떠한 영향을 미치는지 정량적으로 측정할 수 있음을 의미한다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.　
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
< 실시예 1> 재조합 CBP 및 p300 단백질 분리 및 정제
CBP 및 p300 재조합 단백질을 제조하기 위하여, 본 실시예에서는 서열번호 1로 기재되는 Human CBP(1-450번째의 아미노산) 및 서열번호 2로 기재되는 Human p300(300-528번째의 아미노산) 단백질을 코딩하는 아미노산 서열을 pGEX-KG(GE Healthcare Life Sciences, USA) 및 pGEX-4T-1(GE Healthcare Life Sciences, USA) 발현벡터에 각각 클로닝한 후, BL21(DE3)(Novagen) 균주에 형질전환시켰다.　 상기 형질전환된 세포를 50 μg/ml의 앰피실린이 첨가된 LB 배지에 접종하여 흡광도가 0.6 정도가 될 때까지 37℃에서 배양한 후, 단백질의 발현을 유도하기 위해 0.5 mM의 IPTG(isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside)를 첨가하여 18℃에서 15시간 동안 배양하였다.　 원심분리하여 수득한 세포에　 PMSF(phenylmethylsulfonyl fluoride) 및 리소자임(lysozyme)을 최종 농도가 각각 0.2 mM 및 1 mg/ml이 되도록 첨가한 10 mM의 인산염완충용액(PBS, pH 7.4; 110 mM NaCl, 1 mM DTT)에 현탁시켜 4℃에서 분쇄하였다.　 세포 추출물에 2% Triton X-100을 첨가하여 잘 섞어준 후 10분간 얼음에 두었다가 13,000 rpm에서 30분간 원심분리하였다.　 분리된 상등액에 1 mM의 DTT를 첨가하여 글루타치온-세파로스[glutathione(GSH)-sepharose] 4B 수지(Bio-Rad)와 혼합한 후 4℃에서 2시간 동안 교반하였고, 반응된 수지 혼합액에 10배 부피의 인산염완충용액을 첨가하여 2,100 rpm에서 5분간 원심분리한 다음 상등액을 제거하였다.　 상기 과정을 3회 연속으로 반복하여 상등액을 제거한 후, 반응 수지 혼합물 을 Bio-Spin® Disposable Chromatography 컬럼(Bio-Rad)에 넣어서 5 ml의 인산염완충용액으로 여과시키고, 2 ml의 1 M NaCl 용액으로 여과시킴으로써 불필요한 반응물들을 제거하였다.　 상기 컬럼을 10 mM의 글루타치온(GSH)으로 용출시켜 GST-CBP 단백질 및 GST-p300 단백질을 각각 수득하였다.　 이때, 수득된 단백질은 SDS-PAGE를 이용하여 그 순도를 확인하였고, BCA 단백질 분석법(Pierce)으로 정량하였다.
< 실시예 2> 형광표지된 HIF -1α C-말단 펩타이드와 CBP 또는 p300 단백질과의 결합력 분석
<2-1> 형광표지된 4개의 HIF -1α C-말단 펩타이드 합성
HIF(hypoxia-inducible factor)-1α의 C-말단 부위로 구성된 펩타이드에 형광물질을 부착하기 위하여, HIF-1α 단백질 중 CBP 또는 p300 단백질과 결합할 수 있는 아미노산 서열 중 776-826번째와 786-826번째 아미노산 부위, CBP 단백질과 결합하는 alphaA 및 alphaB 도메인에 해당하는 776-814번째 아미노산 부위 및 FIH(factor-inhibiting HIF)에 의한 수산화반응에 필요한 최소 부위인 788-822번째 아미노산 부위를 대상으로 선정하였고, 상기 HIF-1α 펩타이드의 N-말단에는 아미노카프로산 링커(aminocaproic acid linker)를 붙였으며, 그 끝에는 FITC(fluorescein isothiocyanate)를 표지한 4개의 펩타이드를 애니젠(Anygen, Korea)으로부터 합성하였다(표 1).
형광물질을 부착한 HIF-1α C-말단 펩타이드의 합성 및 형태
합성 펩타이드 형태
F-HIF-1α(776-826, 서열번호 3) FITC-ACA-SDLACRLLGQSMDESGLPQLTSYDCEVNAPIQGSRNLLQGEELLRALDQVN
F-HIF-1α(776-814, 서열번호 5) FITC-ACA- SDLACRLLGQSMDESGLPQLTSYDCEVNAPIQGSRNLLQ
F-HIF-1α(786-826, 서열번호 4) FITC-ACA- SMDESGLPQLLTSYDCEVNAPIQGSRNLLQGEELLRALDQVN
F-HIF-1α(788-822, 서열번호 6) FITC-ACA- DESGLPQLTSYDCEVNAPIQGSRNLLQGEELLRAL
상기 < 실시예 1>에서 제조된 재조합 CBP 또는 p300 단백질과 상기 합성된 펩타이드를 이용하여 단백질-리간드의 복합체 형성시 변화하는 형광편광도를 측정함으로써, 상기 HIF-1α 펩타이드와 CBP 또는 p300 단백질과의 결합 유무 및 특징을 분석하였다.　 이때, 형광편광 값은 형광분석기(fluorescence spectrometer, Perkin-Elmer)를 이용하여 측정하였고, 폭(slit width)은 5 nm, 총 측정시간(integration time)은 5초로 설정하였다.　 완충용액(50 mM Tris, 120 mM NaCl; pH 8.0)은 NP-40(Nonidet P-40)을 최종 2.5%가 되도록 첨가한 후 결합반응에 사용하였다.
<2-2> 형광표지된 HIF -1α C-말단 펩타이드와 Zn 2 + 유무에 따른 CBP 또는 p300 단백질과의 결합력 분석
CBP 또는 p300 단백질은 Zn2 + 결합 단백질이기 때문에, 단백질 준비과정 즉, 세포분쇄 및 단백질 용출 시 Zn2 +의 첨가 유무에 따른 상기 실시예 <2-1>에서 합성된 펩타이드와 CBP 또는 p300 단백질과의 결합양상을 현광편광 값으로 측정하였다.　 이때, 상기 CBP 또는 p300 단백질은 단백질 준비과정 시 세포 분쇄 또는 단백질 용출 과정에서 Zn2+를 첨가 및 첨가하지 않고 준비하였다.　 이어, 상기 실시예 <2-1>에서 준비한 완충용액에 800 nM의 CBP 또는 p300 단백질을 첨가한 후, 100 nM의 F-HIF-1α(776-826, 서열번호 3) 펩타이드 및 F-HIF-1α(786-826, 서열번호 4) 펩타이드를 각각 처리하여 25℃에서 혼합하여 형광편광을 측정하였다.
그 결과, F-HIF-1α(776-826, 서열번호 3) 펩타이드를 CBP 단백질과 혼합하지 않은 경우에는 형광편광 값이 0.144인 반면, 세포분쇄 또는 단백질 용출 시 Zn2 +를 처리하여 준비한 CBP 단백질과 Zn2 +를 처리하여 준비한 CBP 단백질 경우에는 모두 F-HIF-1α(776-826, 서열번호 3) 펩타이드와 결합하여 형광편광 값이 0.222 내지 0.229로 거의 비슷하게 증가함을 관찰하였다(도 1a).　 또한, F-HIF-1α(786-826, 서열번호 4) 펩타이드를 p300 단백질과 혼합하지 않은 경우에는 형광편광 값이 0.062인 반면, 세포분쇄 또는 단백질 용출 시 Zn2 +를 처리하여 준비한 p300 단백질과 Zn2 +를 처리하여 준비한 p300 단백질 경우에는 모두 F-HIF-1α(786-826, 서열번호 3) 펩타이드와 결합하여 형광편광 값이 0.202 내지 0.206으로 증가하였다(도 1b).　 이는, CBP 또는 p300 단백질 준비과정 시 Zn2 +를 첨가하지 않더라도 세포배양 시 발현되는 CBP 또는 p300 단백질과 결합하는 Zn2 +의 양이 충분히 존재하기 때문에, 추가적인 Zn2 +의 첨가 없이도 상기 CBP 또는 p300 단백질과 형광표지된 HIF-1α C-말단 펩타이드가 서로 결합할 수 있음을 의미한다.
<2-3> 형광표지된 HIF -1α C-말단 펩타이드와 CBP 또는 p300 단백질의 농도에 따른 결합력 분석
상기 실시예 <2-1>과 같이 합성된 4개의 HIF-1α C-말단 펩타이드와 CBP 또는 p300 단백질과의 결합을 정량적으로 분석하기 위하여, 우선 형광표지된 HIF-1α 펩타이드 프로브와 단백질 농도를 0-3000 nM로 증가시킨 CBP 단백질을 상기 실시예 <2-2>와 동일한 조건에서 반응시켜 형광편광 변화를 측정하였다(도 2a).　 이때, 각각의 펩타이드 프로브는 그 크기가 달라서 특징적인 형광편광 값의 차이를 보일 수 있으므로, 펩티드 프로브 자체의 형광편광 값을 측정한 후 상기 CBP 또는 p300 단백질과 결합 시 나타나는 형광편광 값에서 이 값을 빼주었다.
그 결과,　F-HIF-1α(776-826, 서열번호 3) 및 F-HIF-1α(786-826, 서열번호 4) 펩타이드의 경우, 용액상의 CBP 단백질의 농도가 증가함에 따라 비례적으로 형광편광 값이 증가하여 펩타이드-단백질의 결합체 형성이 CBP 단백질의 농도에 따라 증가함을 알 수 있었다(도 2b).　 반면, F-HIF-1α(788-822 아미노산, 서열번호 6) 펩타이드는 CBP 단백질의 농도가 증가함에 따라 약간의 형광편광이 증가함을 관찰할 수 있었고, F-HIF-1α(776-814 아미노산, 서열번호 5) 펩타이드는 CBP 단백질의 농도가 증가하더라도 형광편광 값의 증가가 거의 나타나지 않았다(도 2b).　 또한, F-HIF-1α(776-826, 서열번호 3) 또는 F-HIF-1α(786-826, 서열번호 4) 펩타이드와 CBP 단백질간의 결합상수를 구하기 위해 칼레이다그래프(KaleidaGraph) 프로그램으로 계산한 결과, 결합상수는 각각 195 nM 및 175 nM이었다(도 2c 및 2d).
상기와 같은 방법으로, 4개의 HIF-1α 펩타이드 프로브와 단백질 농도를 0-3000 nM로 증가시킨 p300 단백질의 형광편광 변화를 측정하였다(도 3a).　 그 결과, F-HIF-1α(776-826, 서열번호 3) 및 F-HIF-1α(786-826, 서열번호 4) 펩타이드의 경우는 용액상의 p300 단백질의 농도가 증가함에 따라 비례적으로 형광편광 값이 증가하여 펩타이드-단백질의 결합체 형성이 p300 단백질의 농도에 따라 증가함을 알 수 있었다(도 3b).　 반면, F-HIF-1α(788-822 아미노산, 서열번호 6) 펩타이드는 p300 단백질의 농도가 증가함에 따라 약간의 형광편광 값이 증가하였고, F-HIF-1α(776-814 아미노산, 서열번호 5) 펩타이드는 p300 단백질의 농도가 증가하더라도 형광편광 값의 증가가 거의 나타나지 않았다(도 3b).　 또한, F-HIF-1α(776-826, 서열번호 3) 또는 F-HIF-1α(786-826, 서열번호 4) 펩타이드와 CBP 단백질간의 결합상수를 칼레이다그래프 프로그램으로 계산한 결과, 결합상수는 각각 157 nM 및 180 nM이었다(도 3c 및 3d).
상기 결과로부터, 본 발명자들은 형광표지된 HIF-1α 펩타이드와 CBP 또는 p300 단백질과의 결합양상을 형광편광 값의 변화로 간편하게 정량분석할 수 있음을 확인하였다.　
< 실시예 3> 형광편광 측정을 통한 HIF -1α의 단백질합성 후 변형( post -translational modification ; hydroxylaton , nitrosation 및 phosphorylation )이 CBP 또는 p300 단백질과의 결합체 형성에 미치는 효능 분석
<3-1> 수산화( hydroxylation ) 효능 분석
상기 < 실시예 2>에서 검증된 형광편광 측정법을 이용하여 HIF-1α C-말단 펩타이드의 단백질합성 후 변형(post-translational modification)이 CBP 또는 p300 단백질과의 결합에 어떠한 영향을 미치는지 조사하였다.　 우선, HIF-1α C-말단 펩타이드의 특정 아스파라긴(asparagine) 잔기를 수산화시키는 효소로 알려진 FIH(factor-inhibiting HIF)를 형광표지된 펩타이드에 처리한 후, 상기 펩타이드가 CBP 또는 p300 단백질과 결합하는지를 형광편광으로 측정하였다.　 이때, 상기 FIH 단백질은 하기와 같은 방법으로 분리 및 정제하였다.　 즉, human FIH 유전자 단편(1-349번째 아미노산; GenBank 등재번호: AF395830)을 pET28a(+) 발현벡터(Novagen)에 클로닝한 후 BL21(DE3)(Novagen) 균주에 형질전환시켰다.　 상기 형질전환체로부터 대량으로 발현시킨 FIH 단백질을 상기 CBP 또는 p300 단백질 분리 및 정제 과정과 유사하게 세포 분쇄물을 얻은 후, 히스티딘-태그(Histidine-tag)를 이용하여 정제하기 위해서 니켈-친화성 아가로즈(Ni-NTA agarose, Qiagen)와 혼합하여 4℃에서 1시간 동안 교반하였다.　 세척용액(50 mM NaH2PO4, 500 mM NaCl, 20 mM Imidazole)으로 2번 세척한 후, 반응된 수지 혼합물을 Bio-Spin® Disposable Chromatography 컬럼(Bio-Rad)에 넣어서 300 mM의 이미다졸(Imidazole) 용액으로 용출시켜 His-FIH 단백질을 수득하였다.　 이때, 수득된 단백질은 SDS-PAGE를 이용하여 그 순도를 확인하였고, BCA 단백질 분석법(Pierce)으로 정량하였다.
또한, 아스파라긴 잔기의 수산화 반응을 위해, 완충용액(50 mM Tris, 5 mM KCl, 1.5 mM MgCl2, pH 8.0)에 1 mM의 ascrobic acid, 0.5 mM의 알파-케토글루타레이트 및 50 μM의 iron(Ⅱ) chloride hydrate를 첨가한 후, 5 μM의 F-HIF-1α(786-826, 서열번호 4) 펩타이드와 상기 정제된 0.58 μg/μl의 His-FIH 효소를 혼합하여 25℃에서 120분간 반응시켰다.　 반응 후, 효소 반응물을 ZipTipC18(Millipore, MA, USA)에 통과시켜 초과 염을 제거하고, 반응시키지 않은 펩타이드와 함께 MALDI-TOF 질량분석기(mass spectrometry)로 분석한 결과, F-HIF-1α(786-826, 서열번호 4) 펩타이드가 수산화됨을 확인할 수 있었다(도 4a).
상기 < 실시예 2>와 동일한 완충액 및 결합조건에서 FIH 효소와 반응시킨 F-HIF-1α(786-826, 서열번호 4) 펩타이드 및 상기 효소와 반응시키지 않은 F-HIF-1α(786-826, 서열번호 4) 펩타이드 100 nM를 각각 1000 nM의 CBP 또는 p300 단백질과 25℃에서 혼합한 후 형광편광을 측정하였다.　
그 결과, FIH로 효소반응시키지 않은 F-HIF-1α(786-826, 서열번호 4) 펩타이드의 형광편광 값은 0.069이며, 여기에 p300 또는 CBP를 첨가하면 형광편광 값은 각각 0.18 및 0.146으로 증가하였다.　 반면, FIH로 효소반응시킨 F-HIF-1α(786-826, 서열번호 4) 펩타이드와 p300 또는 CBP를 반응시킨 결과, 형광편광 값은 각각 0.125 및 0.099로 FIH로 효소반응시키지 않은 F-HIF-1α(786-826, 서열번호 4) 펩타이드에 비해 형광편광이 감소되었다(도 4b).　
이로부터, 본 발명자들은 HIF-1α C-말단 펩타이드의 특정 아스파라긴이 FIH에 의해 수산화되어 CBP 또는 p300 단백질과의 결합이 저해됨을 형광편광 값의 변화로 간단하게 확인할 수 있었고, 이를 이용하여 FIH의 활성 또한 분석할 수 있었다.
<3-2> 니트로소화 (S- nitrosation ) 효능 분석
F-HIF-1α(786-826, 서열번호 4) 펩타이드가 에스-니트로소화될 경우, CBP 또는 p300 단백질과의 상호작용에 어떠한 영향을 미치는지 조사하였다.　 구체적으로, 니트로소티올(nitrosothiol) 유도체인 SNAP(S-nitroso-N-acetylpenicillamine)은 생리적 환경에서 NO(nitric oxide)를 방출하여 단백질의 시스테인 잔기를 에스-니트로소화시키는 화합물로 알려져 있기 때문에, 본 실시예에서는 F-HIF-1α(786-826, 서열번호 4) 펩타이드에 1 mM의 SNAP을 처리하여 1시간 동안 반응시켰고, 반응하지 않은 SNAP을 스핀 컬럼(spin column)으로 제거한 후 흡광도를 측정하였다.　 320 nm에서 나타난 흡광도와 SNAP을 처리하지 않은 펩타이드의 흡광도를 비교한 결과, SNAP을 처리한 펩타이드가 니트로소화됨을 확인하였다(도 5a).　 이때, 상기 흡광도는 펩타이드에 표지된 FITC의 480 nm에서 나타난 흡광도로 표준화시켰다.
이어, 상기 < 실시예 2>와 동일한 완충액 및 결합조건에서 SNAP을 처리한 F-HIF-1α(786-826, 서열번호 4) 펩타이드 및 처리하지 않은 F-HIF-1α(786-826, 서열번호 4) 펩타이드 100 nM를 각각 200 nM의 p300 단백질과 25℃에서 혼합하여 형광편광을 측정한 결과, SNAP을 처리하지 않은 F-HIF-1α(786-826, 서열번호 4) 펩타이드의 형광편광 값은 0.064이고, SNAP을 처리한 F-HIF-1α(786-826, 서열번호 4) 펩타이드의 형광편광 값은 0.072로 거의 비슷하였다(도 5b).　 p300 단백질을 첨가할 경우, SNAP을 처리하지 않은 F-HIF-1α(786-826, 서열번호 4) 펩타이드의 형광편광 값은 0.164이며, SNAP을 처리한 F-HIF-1α(786-826, 서열번호 4) 펩타이드의 형광편광 값은0.110으로 감소하였는데(도 5b), 이는 HIF-1α 펩타이드가 에스-니트로소화되면 p300 단백질과의 결합이 상당히 감소된다는 것을 의미한다.　
<3-3> 인산화( phosphorylation ) 효능 분석
F-HIF-1α(786-826, 서열번호 4) 펩타이드가 인산화될 경우, CBP 또는 p300 단백질과의 상호작용에 어떤 영향을 미치는지 조사하였다.　 구체적으로, HeLa 세포를 정상산소 상태(normoxia) 또는 저산소 상태(hypoxia)에서 배양한 후, 분쇄용액 처리 및 고속 원심분리하여 세포 분쇄물을 수득하였다.　 상기 분쇄물로부터 인산화효소 단백질(protein kinase-enriched fraction)을 얻기 위해 셀룰로오스 인산염(cellulose phosphate)을 사용하였다.　 0.5 g의 셀룰로오스 인산염(P11, Whatman)을 15 ml의 0.5 M NaOH에서 부풀게 한 다음, open column에 넣어서 pH가 10 이하가 될 때까지 증류수로 세척하였고, column 안의 현탁액을 비이커에 옮긴 다음 15 ml의 0.5 M HCl를 첨가하여 천천히 흔들어 섞어 주었다.　 이어, 상기 반응액 중 일부(약 5분의 1)를 open column에 넣어서 pH가 3 이상이 될 때까지 증류수로 세척한 후, 0.5 M HEPES(pH 7.5)로 충분히 세척하였다.　 상기 open column을 4℃ 상태로 만든 다음, 세척용액(0.1 M NaCl, 0.5 M HEPES)으로 다시 세척하였다.　 저산소 상태 또는 정상산소 상태에서 배양된 상기 세포의 분쇄물을 column에 적재한 후, 3 ml의 세척용액을 처리하여 셀룰로오스 인산염에 붙지 않은 물질들을 제거하였다.　 0.5 ml의 용출용액(0.45 M NaCl, 0.5 M HEPES)으로 인산화효소 단백질을 용출한 후, Bradford 방법으로 단백질을 정량하였다(정상산소 상태에서의 인산화효소: 0.43 mg/ml; 저산소 상태에서의 인산화효소: 0.14 mg/ml).
32P-ATP를 이용한 방사선동위원소 인산화효소 반응(radioisotope kinase reaction)을 수행하여 상기 인산화효소 단백질에 의해 F-HIF-1α(786-826, 서열번호 4) 펩타이드가 인산화되는지 확인하였다.　 구체적으로, 200 μl의 5X 반응용액(125 mM HEPES, 100 mM MgCl2, 0.5 mM Na3VO4, 10 mM DTT, pH 7.6)에 50 μl의 1 mM ATP, 10 μl의 32P-ATP (10 mCi/ml), 450 μl의 증류수를 첨가하여 최종반응용액(master solution)을 준비하였다.　 35 μl의 최종반응용액에 10 μl의 인산화효소 단백질 및 5 μl의 펩타이드를 혼합하여 25℃에서 30분간 반응시킨 후, 30% phosphoric acid 10 μl을 첨가하여 반응을 중화시킨 다음, 양이온 교환 크로마토그래피 수지(cation exchanger chromatography paper, P81, Whatman)에 40 μl의 상기 반응용액을 첨가하였다.　 상기 수지를 1 %의 phosphoric acid 용액에 적셔 여러 번 세척한 다음 건조시켜 scintillation counter로 측정한 결과, 정상산소 상태 및 저산소 상태에서 배양된 세포 분쇄물에서 추출한 인산화효소 단백질은 F-HIF-1α(786-826, 서열번호 4) 펩타이드를 인산화시켰다(도 6a).
또한, 정상산소 상태 및 저산소 상태에서 배양된 세포 분쇄물에서 추출한 인산화효소 단백질에 의해 인산화된 F-HIF-1α(786-826, 서열번호 4) 펩타이드를 HPLC로 분리한 후, 분리된 상기 펩타이드 및 인산화시키지 않은 F-HIF-1α(786-826, 서열번호 4) 펩타이드 100 nM과 상기 < 실시예 2>와 동일한 완충액 및 결합조건에서 p300 단백질의 농도를 증가시켜 혼합한 후, 25℃에서 각각 형광편광을 측정한 결과, 인산화시키지 않은 F-HIF-1α(786-826, 서열번호 4) 펩타이드에 비해 인산화효소 단백질에 의해 인산화된 F-HIF-1α(786-826, 서열번호 4) 펩타이드가 p300 단백질의 농도에 따라 형광편광 증가가 적게 일어남을 확인할 수 있었다(도 6b).　 이는, F-HIF-1α C-말단 부위가 인산화될 경우, p300 단백질과의 결합이 억제됨을 의미한다.
상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 형광편광 측정 분석방법은 형광표지된 HIF-1α C-말단 펩타이드와 CBP 또는 p300 단백질 복합체를 따로 분리하지 않는 단일화 과정 및 웰 플레이트를 이용한 자동화가 가능하여 분석비용을 절감할 수 있기 때문에, HIF-1α 펩타이드와 CBP 또는 p300 단백질의 복합체 형성을 저해하는 억제제를 대량으로 스크리닝하거나 또는 HIF-1α의 단백질합성 후 변형(post-translational modification)의 효능을 분석하는데 유용하게 사용될 수 있다.
<110> Korea Institute of Science and Technology <120> METHOD FOR QUANTITATIVE ANALYSIS OF INTERACTIONS BETWEEN HIF-1ALPHA C-TERMINAL PEPTIDES AND CBP OR p300 PROTEINS AND METHOD OF SCREENING INHIBITORS AGAINST FORMATION OF PROTEIN COMPLEX USING THE SAME <130> DPP20063112KR <160> 6 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 450 <212> PRT <213> Amino acid sequence for CBP <400> 1 Met Ala Glu Asn Leu Leu Asp Gly Pro Pro Asn Pro Lys Arg Ala Lys 1 5 10 15 Leu Ser Ser Pro Gly Phe Ser Ala Asn Asp Ser Thr Asp Phe Gly Ser 20 25 30 Leu Phe Asp Leu Glu Asn Asp Leu Pro Asp Glu Leu Ile Pro Asn Gly 35 40 45 Gly Glu Leu Gly Leu Leu Asn Ser Gly Asn Leu Val Pro Asp Ala Ala 50 55 60 Ser Lys His Lys Gln Leu Ser Glu Leu Leu Arg Gly Gly Ser Gly Ser 65 70 75 80 Ser Ile Asn Pro Gly Ile Gly Asn Val Ser Ala Ser Ser Pro Val Gln 85 90 95 Gln Gly Leu Gly Gly Gln Ala Gln Gly Gln Pro Asn Ser Ala Asn Met 100 105 110 Ala Ser Leu Ser Ala Met Gly Lys Ser Pro Leu Ser Gln Gly Asp Ser 115 120 125 Ser Ala Pro Ser Leu Pro Lys Gln Ala Ala Ser Thr Ser Gly Pro Thr 130 135 140 Pro Ala Ala Ser Gln Ala Leu Asn Pro Gln Ala Gln Lys Gln Val Gly 145 150 155 160 Leu Ala Thr Ser Ser Pro Ala Thr Ser Gln Thr Gly Pro Gly Ile Cys 165 170 175 Met Asn Ala Asn Phe Asn Gln Thr His Pro Gly Leu Leu Asn Ser Asn 180 185 190 Ser Gly His Ser Leu Ile Asn Gln Ala Ser Gln Gly Gln Ala Gln Val 195 200 205 Met Asn Gly Ser Leu Gly Ala Ala Gly Arg Gly Arg Gly Ala Gly Met 210 215 220 Pro Tyr Pro Thr Pro Ala Met Gln Gly Ala Ser Ser Ser Val Leu Ala 225 230 235 240 Glu Thr Leu Thr Gln Val Ser Pro Gln Met Thr Gly His Ala Gly Leu 245 250 255 Asn Thr Ala Gln Ala Gly Gly Met Ala Lys Met Gly Ile Thr Gly Asn 260 265 270 Thr Ser Pro Phe Gly Gln Pro Phe Ser Gln Ala Gly Gly Gln Pro Met 275 280 285 Gly Ala Thr Gly Val Asn Pro Gln Leu Ala Ser Lys Gln Ser Met Val 290 295 300 Asn Ser Leu Pro Thr Phe Pro Thr Asp Ile Lys Asn Thr Ser Val Thr 305 310 315 320 Asn Val Pro Asn Met Ser Gln Met Gln Thr Ser Val Gly Ile Val Pro 325 330 335 Thr Gln Ala Ile Ala Thr Gly Pro Thr Ala Asp Pro Glu Lys Arg Lys 340 345 350 Leu Ile Gln Gln Gln Leu Val Leu Leu Leu His Ala His Lys Cys Gln 355 360 365 Arg Arg Glu Gln Ala Asn Gly Glu Val Arg Ala Cys Ser Leu Pro His 370 375 380 Cys Arg Thr Met Lys Asn Val Leu Asn His Met Thr His Cys Gln Ala 385 390 395 400 Gly Lys Ala Cys Gln Val Ala His Cys Ala Ser Ser Arg Gln Ile Ile 405 410 415 Ser His Trp Lys Asn Cys Thr Arg His Asp Cys Pro Val Cys Leu Pro 420 425 430 Leu Lys Asn Ala Ser Asp Lys Arg Asn Gln Gln Thr Ile Leu Gly Ser 435 440 445 Pro Ala 450 <210> 2 <211> 229 <212> PRT <213> Amino acid sequence for p300 <400> 2 Pro Asn Met Gly Gln Gln Pro Ala Pro Gln Val Gln Gln Pro Gly Leu 1 5 10 15 Val Thr Pro Val Ala Gln Gly Met Gly Ser Gly Ala His Thr Ala Asp 20 25 30 Pro Glu Lys Arg Lys Leu Ile Gln Gln Gln Leu Val Leu Leu Leu His 35 40 45 Ala His Lys Cys Gln Arg Arg Glu Gln Ala Asn Gly Glu Val Arg Gln 50 55 60 Cys Asn Leu Pro His Cys Arg Thr Met Lys Asn Val Leu Asn His Met 65 70 75 80 Thr His Cys Gln Ser Gly Lys Ser Cys Gln Val Ala His Cys Ala Ser 85 90 95 Ser Arg Gln Ile Ile Ser His Trp Lys Asn Cys Thr Arg His Asp Cys 100 105 110 Pro Val Cys Leu Pro Leu Lys Asn Ala Gly Asp Lys Arg Asn Gln Gln 115 120 125 Pro Ile Leu Thr Gly Ala Pro Val Gly Leu Gly Asn Pro Ser Ser Leu 130 135 140 Gly Val Gly Gln Gln Ser Ala Pro Asn Leu Ser Thr Val Ser Gln Ile 145 150 155 160 Asp Pro Ser Ser Ile Glu Arg Ala Tyr Ala Ala Leu Gly Leu Pro Tyr 165 170 175 Gln Val Asn Gln Met Pro Thr Gln Pro Gln Val Gln Ala Lys Asn Gln 180 185 190 Gln Asn Gln Gln Pro Gly Gln Ser Pro Gln Gly Met Arg Pro Met Ser 195 200 205 Asn Met Ser Ala Ser Pro Met Gly Val Asn Gly Gly Val Gly Val Gln 210 215 220 Thr Pro Ser Leu Leu 225 <210> 3 <211> 51 <212> PRT <213> F-HIF-1a(776-826) peptide <400> 3 Ser Asp Leu Ala Cys Arg Leu Leu Gly Gln Ser Met Asp Glu Ser Gly 1 5 10 15 Leu Pro Gln Leu Thr Ser Tyr Asp Cys Glu Val Asn Ala Pro Ile Gln 20 25 30 Gly Ser Arg Asn Leu Leu Gln Gly Glu Glu Leu Leu Arg Ala Leu Asp 35 40 45 Gln Val Asn 50 <210> 4 <211> 42 <212> PRT <213> F-HIF-1a(786-826) peptide <400> 4 Ser Met Asp Glu Ser Gly Leu Pro Gln Leu Leu Thr Ser Tyr Asp Cys 1 5 10 15 Glu Val Asn Ala Pro Ile Gln Gly Ser Arg Asn Leu Leu Gln Gly Glu 20 25 30 Glu Leu Leu Arg Ala Leu Asp Gln Val Asn 35 40 <210> 5 <211> 39 <212> PRT <213> F-HIF-1a(776-814) peptide <400> 5 Ser Asp Leu Ala Cys Arg Leu Leu Gly Gln Ser Met Asp Glu Ser Gly 1 5 10 15 Leu Pro Gln Leu Thr Ser Tyr Asp Cys Glu Val Asn Ala Pro Ile Gln 20 25 30 Gly Ser Arg Asn Leu Leu Gln 35 <210> 6 <211> 35 <212> PRT <213> F-HIF-1a(788-822) peptide <400> 6 Asp Glu Ser Gly Leu Pro Gln Leu Thr Ser Tyr Asp Cys Glu Val Asn 1 5 10 15 Ala Pro Ile Gln Gly Ser Arg Asn Leu Leu Gln Gly Glu Glu Leu Leu 20 25 30 Arg Ala Leu 35

Claims (11)

  1. 삭제
  2. 1) HIF-1 (hypoxia inducible factor-1) α C-말단 펩타이드에 형광물질을 부착하여 형광 프로브를 제조하는 단계;
    2) 형광표지된 상기 HIF-1α C-말단 펩타이드를 CBP (cAMP-response element-binding protein) 또는 p300 단백질과 접촉시켜 상기 HIF-1α C-말단 펩타이드에 부착된 형광물질과 CBP 또는 p300 단백질을 반응시키는 단계 및
    3) 상기 반응물의 형광편광을 측정한 후, 형광 프로브 자체의 형광편광 값과 비교하여 형광편광 값의 변화를 분석하는 단계를 포함하는 HIF-1α C-말단 펩타이드와 CBP 또는 p300 단백질의 결합을 정량분석하는 방법으로서,
    상기 단계 1)의 형광 프로브는 서열번호 3 또는 서열번호 4인 아미노산 서열을 가지고; 상기 아미노산 서열의 N-말단에는 아미노카프로산 링커(aminocaproic acid linker)가 연결되며; 그 끝에는 FITC (fluorescein isothiocyanate)가 표지된 것인, 정량분석 방법.
  3. 삭제
  4. 제2항에 있어서, 단계 2)의 CBP 단백질은 서열번호 1인 아미노산 서열을 갖는 것인, 방법.
  5. 제2항에 있어서, 단계 2)의 p300 단백질은 서열번호 2인 아미노산 서열을 갖는 것인, 방법.
  6. 제2항에 있어서, 단계 2)의 반응은 형광표지된 HIF-1α C-말단 펩타이드와 CBP 또는 p300 단백질의 함량을 1:2 내지 1:10의 비율로 혼합하여 유도하는 것인, 방법.
  7. 삭제
  8. 1) 형광물질이 부착된 형광 프로브인 HIF-1 (hypoxia inducible factor-1) α C-말단 펩타이드와 CBP (cAMP-response element-binding protein) 또는 p300 단백질을 혼합하여 반응시킨 후, 형광편광 값을 측정하는 단계;
    2) 상기 혼합물에 저해제 후보물질을 첨가시킨 후, 형광편광 값을 측정하는 단계 및
    3) 상기 단계 1) 및 2)에서 측정된 형광편광 값을 비교하여 단계 2)의 값이 작을 경우, 상기 후보물질을 HIF-1α-CBP 또는 HIF-1α-p300 복합체 형성 저해제로 판정하는 단계를 포함하는 HIF-1α C-말단 펩타이드와 CBP 또는 p300 단백질 결합 억제제의 스크리닝 방법으로서,
    상기 단계 1)의 형광 프로브는 서열번호 3 또는 서열번호 4인 아미노산 서열을 가지고; 상기 아미노산 서열의 N-말단에는 아미노카프로산 링커(aminocaproic acid linker)가 연결되며; 그 끝에는 FITC (fluorescein isothiocyanate)가 표지된 것인, 결합 억제제의 스크리닝 방법.
  9. 삭제
  10. 제8항에 있어서, 단계 1)의 CBP 단백질은 서열번호 1인 아미노산 서열을 갖는 것인, 결합 억제제의 스크리닝 방법.
  11. 제8항에 있어서, 단계 1)의 p300 단백질은 서열번호 2인 아미노산 서열을 갖는 것인, 결합 억제제의 스크리닝 방법.
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