KR100846672B1 - 알지네이트/메틸-셀룰로우즈 캡슐을 이용한 바실러스폴리퍼멘티쿠스 ｓｃｄ의 생산성과 생존율 향상방법 및 그용도 - Google Patents

알지네이트/메틸-셀룰로우즈 캡슐을 이용한 바실러스폴리퍼멘티쿠스 ｓｃｄ의 생산성과 생존율 향상방법 및 그용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 알지네이트/메틸-셀룰로우즈 캡슐을 이용한 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 SCD의 생산성과 생존율의 향상방법 및 그 용도에 관한 것으로, 본 발명은 캡슐화과정을 응용한 세포 고정화 기술로서 알지네이트/메틸-셀룰로우즈 캡슐로 균체 자체를 바로 피막하여 포자를 만드는데 필요한 시간을 단축하여 비스판균의 생산성을 획기적으로 증가시킬 뿐만 아니라 피막된 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 SCD를 장에 도달할 때까지 외부의 물리적 및 화학적 영향으로부터 보호해줌으로써 간 질환 치료를 위한 의약품, 기능성 식품 및 건강보조식품에 응용하여 생존기간을 연장하는데 뛰어난 효과가 있다.
바실러스 폴리퍼멘티쿠스 SCD, 알지네이트 캡슐, 프로바이오틱, 비스판균, 비스루트, 메틸-셀룰로우즈, 내산성, 내담즙성

Description

알지네이트/메틸-셀룰로우즈 캡슐을 이용한 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 ＳＣＤ의 생산성과 생존율 향상방법 및 그 용도{IMPROVED PRODUCTIVITY AND SURVIVAL OF BACILLUS POLYFERMENTICUS SCD BY ALGINATE/METHYL-CELLULOSE ENCAPSULELATION AND USE THEREOF}
도 1은 거대 캡슐 형성 장치의 모식도를 나타낸 것이다.
도 2는 주사전자현미경(SEM)하에서 알지네이트 캡슐을 관찰한 사진도이다.
도 3은 주사전자현미경하에서 알지네이트 격자공에 포획된 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 SCD를 관찰한 사진도이다.
도 4는 알지네이트 캡슐의 단면을 나타낸 것으로 (A)는 인공 위액에 노출되기전의 표면 형태 사진도이며, (B)는 인공 위액에 3시간동안 노출된 후의 표면 형태를 나타낸 사진도이다.
도 5는 인공 위액에 노출된 후 다른 농도의 알지네이트로 피막된 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 SCD의 생존율을 나타낸 그래프로서 (A)는 2% 알지네이트 캡슐, (B)는 3% 알지네이트 캡슐, (C)는 4% 알지네이트 캡슐로 피막한 경우의 생존율을 나타낸 것이다(◆: pH 1.5, □: pH 2.5, ◇: pH 7.0).
도 6은 인공 위액(pH 1.5)에 노출된 후 다양한 직경을 갖는 3% 알지네이트 캡슐에서 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 SCD의 생존율을 나타낸 그래프이다(◇: 소캡슐(850㎛), ◆: 거대캡슐(2.8mm)).
도 7은 주사전자현미경하에서 알지네이트 매트릭스의 공동속에 있는 메틸-셀룰로우즈 알갱이를 보여주는 알지네이트/메틸-셀룰로우즈 캡슐을 나타낸 사진도이다.
도 8은 주사전자현미경하에서, 동결 건조한 후 캡슐을 관찰한 사진도이다.
도 9는 주사전자현미경하에서, 인공 위액에 3시간동안 노출된 후 동결 건조된 알지네이트/메틸-셀룰로우즈 격자에 포획된 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 SCD를 관찰한 사진도이다((A) 10,000배로 저배율 확대, (B) 20,000배로 고배율 확대한 것을 나타냄).
도 10은 동결 건조된 알지네이트/메틸-셀룰로우즈 캡슐의 단면을 나타낸 사진도이다 ((A) 노출전의 표면 형태, (B) 인공 위액에서 3시간동안 노출 후의 표면 형태).
본 발명은 알지네이트 캡슐을 이용한 비스판균의 생산성과 생존율의 향상방법 및 그 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는 본 발명은 비스판균인 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 SCD를 배양한 후 원심분리하고 상기에서 얻은 세포 현탁액을 농도를 달리한 소디움-알지네이트에 넣고 혼합한 다음 캡슐-형성 장치에 옮겨 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 SCD가 캡슐에 의해 피막되도록 하여 내산성 및 내담즙성을 갖도록 하 는 상기 비스판균의 생산성과 생존율을 향상시키는 방법 및 그 용도에 관한 것이다.
프로바이오틱(probiotics)이란 일반적으로 인간 혹은 동물에 사용될 때, 토착 미생물의 밸런스를 개선함으로써 숙주의 건강에 유리하게 영향을 미치는 생육미생물을 말한다. 최근에는, 프로바이오틱이란 '어느 정도로 섭취할 경우 타고난 기초 영양 이외에 건강에 유익한 살아있는 생물'로 정의하고 있다. 이는 장내에서 살아있는 미생물을 충분한 수로 유지하는 것이 중요함을 강조하는 것이며, 아울러 이러한 이점들은 면역조절과 같은 다른 건강상의 효과와 연관이 있는 미생물의 밸런스 개선을 포함하고 있다.
대부분의 프로바이오틱은 일반적으로 인간 위장관의 중요한 구성요소이며 또한 무해한 시판용 생물로써 존재하는 락트균(Lactobacillus, Bifidobacterium, Streptococcus, Enterococcus, 및 Lactobacillus sporogenes)에 속한다. 또한 신규한 프로바이오틱은 효모(예: Saccharomyces boulardii)와 같은 다른 미생물 및 그외의 상당히 다른 세균타입(예) Clostridium butyricum, Bacillus subtilis, Bacillus polyfermenticus, 등등)들을 포함하고 있다. 바실러스속은 일반적으로 생물산업에서 숙주로써 이용되는 다양한 산업적으로 중요한 종들을 포함하고 있다. 오늘날 바실러스 발효에 의해 생산되는 시판용 산물로는 효소, 항생제 및 살충제가 있다. 다른 산물로는 주로 식품 감미료로 사용되는 핵산과 뉴클레오사이드 및 아미노산이 잘 알려져 있다.
일반적으로 비스판균 이라 불리는 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 SCD(B. polyfermenticus SCD)는 20여종의 효소를 분비하여 영양소를 재활용하게 하며, 비타민 B1, B2 및 K를 합성하여 영양을 보급시키는 것으로 알려져 있다. 또한, 이 균주를 섭취할 경우 비경구적 감염방어작용과 경구적 면역능이 증강된다는 사실이 밝혀져 있으며, 숙주의 면역기능을 강화하고 발암물질과 발암촉진물질을 생성하는 장내 미생물의 생육을 억제하며 대장의 항종양 물질이나 항돌연변이물질을 생성함으로서 종양발생을 억제한다고 알려져 있다. 아울러, 상기 비스판균은 아포를 형성하는 균이므로 장에 도달할 때까지 위산이나 여러 효소에 대한 저항성이 강해 활성을 거의 잃지 않으므로 장기간의 장내 질환 치료에 탁월한 효과를 보이고 있는 유용한 프로바이오틱 생균제이다. 본 발명의 균주는 본 발명자가 (주)바이넥스로부터 비스판균을 입수하여 동정한 후 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 SCD(B. polyfermenticus SCD)로 명명하고 한국종균협회부설 미생물보존센터에 기탁하여 KCCM 10104의 수탁번호를 받은 바 있다. 본 발명자는 비스판균(바실러스 폴리퍼멘티쿠스 SCD)의 생산성을 항상시키기 위한 많은 연구를 수행하여 왔으며 특허로서 등록된 주요기술은 다음과 같다.
1. Liquid cultivation if strains of Bacillus polyfermenticus (미국특허번호 6,010,898호)
2. 액체발효에 의한 비스판균의 제조방법(대한민국 특허등록번호 제 233615호)
3. 비스판균 배양액으로부터 비스판균을 회수하는 방법(대한민국 특허등록번호 제 233616호)
4. 생산성이 향상된 비스루트 변이주(대한민국 특허등록번호 제 290005호)
5. 박테리오신 생산성이 증가된 비스판 변이균주 및 이로부터 박티리오신 생산방법(대한민국 특허등록번호 제 320031호)
현재 시판되고 있는 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 SCD는 주로 포자형태로 의약품에 이용되고 있지만, 포자를 만들기 위해 필요한 배양시간이나 낮은 생산성이 문제점으로 대두되었다. 종래의 제조방법들은 비스판균이 위산에 견디어 장에 무사히 도달하도록 하기위해 비스판균의 포자를 형성하여(약 48시간 정도 소요) 생균제로 활용하며 그 생산성을 높이기 위한 방법들이었다. 세균의 생존을 개선하기 위해서 녹말, 단당류, 유장 단백질과 요거트 혼합물의 완충액과 같은 성장촉진인자 혹은 프리바이오틱(prebiotics)의 첨가 및 포장 조건의 조절 등의 기술들이 사용되었지만, 이러한 기술들을 사용하는데에는 한계가 있다. 따라서, 환경적 생리적 분해로부터 미생물, 세포 또는 조직을 보호하기위해 캡슐 기술이 널리 이용되어 왔으며, 세균 배양의 생존 및 전달을 향상시키는 데 사용되었다.
Rao 등(1989)은 셀룰로우즈 아세테이트 프탈레이트(cellulose acetate phthalate, CAP)로 이루어진 비피도박테리움 슈도롱검(Bifidobacterium pseudolongum)의 캡슐은 피막되지않은 세균과 비교하여 인공 위산조건하에서 세균의 생존을 증가시킴을 발견하였다. 일반적으로 생존능력을 향상시키기위해서는, 에멀젼화/계면 중합화하여 제조한 교차결합된 키토산막내에 젖산균을 미세피막화 시키고, 겔란검, 식용해초(carrageenan)/구주콩 아교와 같은 몇몇 생중합체와 알지네이트(alginate)로 세균을 고정시킨다.
특히, 다당류인 소디움 알지네이트는 온화하고 간단한 고정 조건 때문에 고 정체로써 가장 널리 이용되며, 칼슘 및 다가의 양이온과 접촉한 경우 젤을 형성한다. 알지네이트 캡슐(또는 미세입자)은 낮은 pH에서도 안정적이지만, 약염기상태에서는 팽창하여 붕괴되거나 짓물러지는 특징을 가지고 있다.
따라서, 본 발명의 목적은 비스판균을 포자를 형성하지 않고 영양세포(vegetative cell)을 얻어 상기 균주를 미세캡슐화하여 많은 비스판균들이 장에 도달할 수 있도록 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 SCD의 생산성과 생존율을 향상시키는 방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 SCD의 생존율 향상을 위한 최적 조건의 캡슐을 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 내산성과 내담즙성을 획득한 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 SCD을 유효성분으로 하는 의약품 및 기능성 건강보조식품을 제공하는 것이다.
본 발명의 상기 목적은 비스판균인 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 SCD를 배양한 후 원심분리하고 상기에서 얻은 세포 현탁액을 농도를 달리한 소디움-알지네이트와 메틸-셀룰로우즈에 넣고 혼합한 다음 캡슐-형성 장치에 옮겨 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 SCD를 캡슐로 피막하여 상기 비스판균의 생존율을 향상시킴과 동시에 비스판균의 생산성을 획기적으로 증가시킴으로써 달성하였다.
이하, 본 발명의 구성 및 작용을 설명한다.
본 발명은 비스판균인 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 SCD를 배양하는 단계; 상기 균주를 원심분리하고 그 결과로 얻은 세포 현탁액을 농도를 달리한 소디움-알지네이트와 메틸-셀룰로우즈 혼합용액에 넣고 혼합하는 단계; 상기의 혼합액을 캡슐-형성 장치에 옮겨 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 SCD를 캡슐로 피막하는 단계; 인공위액과 인공 담즙염액에서 상기 피막된 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 SCD의 생존율을 조사하는 단계로 이루어진다.
본 발명에서 사용하는 세포벽의 주(主)물질은 소디움 알지네이트(시그마사 제품)이다. 디하이드레이트 칼슘 클로라이드(CaCl2·2H2O)는 준세이(Junsei)사로부터 구입하였고, 소디움 시트레이트는 시그마사로부터 구입하였다. 옥스빌(Oxbile)과 펩신은 디프코 실험실과 시그마사로부터 얻었다.
알지네이트 캡슐로 피막된 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 SCD의 생육세포를 측정하기위해, Sheu와 Marshall(1993)의 방법에 따라 피막세균을 캡슐로부터 분리하였다. 분리한 알지네이트 캡슐(0.1g)을 살균한 식염수 용액으로 세척하고 0.1M 소디움 시트레이트 용액 1ml에서 30분동안 녹인 후, 보텍스(vortex)로 파쇄하였다. 상기 파쇄액을 TSA 플레이트에 도말하고 37℃에서 12시간동안 항온처리하여 콜로니 형성 단위(colony forming units, CFU/g)를 측정하였다. 그 후에, 상기 배양결과 생장한 콜로니수를 세었다.
본 발명은 비스판균을 포자를 형성하지 않고 영양세포(vegetative cell)을 얻어(배양시간 약 4∼12시간 정도) 미세캡슐화하여 위산과 담즙산에 생존률이 높아 장에 많은 비스판균이 도달할 수 있는 있다는 것을 특징으로 하고 있다. 상기의 경우 배양시간이 많이 단축되어 생산성이 3∼4배 이상 증가되고 또한 비스판 포자가 장에서 발아(germination)이 되어야 생균제로서 역할을 할 수 있는 종래의 방법과는 달리, 발아를 걱정할 필요가 없는 장점이 있다.
상기의 방법에 의해 알지네이트/메틸-셀룰로우즈 캡슐로 피막된 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 SCD를 분말화하기위해서는 동결건조법 등을 사용할 수 있으며, 이는 가장 일반적으로 생균제제를 분말화 할 수 있는 건조법으로서 이와같이 얻어진 비스판균분말은 제제, 예를들어 정제, 과립제등으로 제제화된다.
이하, 본 발명의 구체적인 방법을 실시예를 통하여 상세히 설명하고자 하지만 본 발명의 권리범위는 이들 실시예에만 한정되는 것은 아니다.
[실시예]
실시예 1: 균주의 배양
바실러스 폴리퍼멘티쿠스 SCD(Bacillus polypermenticus SCD)는 대한민국 부산광역시 바이넥스 주식회사 연구개발실로부터 얻었고, -70℃에서 10% 글리세롤(v/v)을 포함한 바이알병(vial-bottle)에 넣고 보존하였다. 캡슐화하기전에, 상기의 조건에서 보존된 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 SCD를 TSB 배지(Trypic Soy Broth, 디프코사)로 옮겨 37℃에서 12시간동안 배양하였다. 모든 배양은 500ml 배플 플라스크(baffle flask, 실사용부피: 100ml)에 넣고 37℃에서 12시간동안 TSB 배지에서 실시하였다. 상기 배양에 사용된 배양액은 121℃에서 15분간 가압증기멸 균 하였다.
실시예 2: 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 SCD의 캡슐화
실험예 1: 거대캡슐의 제조 (Extrusion법 사용)
본원 발명의 실시예에서 사용되는 모든 유리제품 및 용액들은 121℃에서 15분간 멸균하였다. 실시예 1의 방법으로 배양한 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 SCD는 지수증식기 후반에서 얻은 후, 상기 균주를 10,000rpm으로 15분간 원심분리하였다. 상기 원심분리 결과, 균주세포를 포함한 펠렛을 상기 원심분리와 같은 조건하에서 살균한 정상 식염수 20ml로 두 번 세척하고, 대략 1.0x108∼1.0x109 cells/ml이 되도록 10ml의 살균한 식염수로 현탁하였다. 무균 비닐 백(시워드사 제품)에다 상기 10ml의 세포 현탁액과 80ml의 2%, 3%, 4%의 소디움-알지네이트 용액을 첨가하였다. 상기 혼합용액을 스토마춰 400 래보레이토리 블렌더(stomacher 400 laboratory blender, 시워드사)를 사용하여 완전히 혼합하였다. 그 후, 상기 혼합물을 캡슐-형성 장치에다 옮기고, 무균실험대(clean bench)에서 파스테르 피펫과 타이곤 튜브를 통하여 멸균한 0.1M CaCl2 용액에다 점적시켰다. 상기 혼합용액을 1시간 이상 굳힌 후, 알지네이트 캡슐을 얻었다. 도 1은 거대 캡슐 형성 장치의 모식도를 나타낸 것이다.
실험예 2: 소캡슐의 제조(에멀젼화/내부의 겔형성법을 사용)
소캡슐의 제조는 Sheu와 Marshall(1993)의 방법을 변형한 제조방법을 사용하 였다. 미세수정질의 탄산칼슘(5% CaCO3, w/v)을 배양액을 포함하는 3% 알지네이트와 혼합하고, 상기 혼합물을 4분동안 고속 파쇄로 분산하였다. 고속 파쇄한 상기 혼합물을 오일에 점적시켰다. 점적이 끝나면, 상기 혼합물이 에멀젼화되어 크림상태를 보일때까지 격렬하게 저었다. 에멀젼화가 일어나면 5분후에 빙초산(glacial acetic acid)을 넣고 탄산칼슘이 용해될때까지 5분동안 계속 저었다. 0.1M 염화칼슘 용액을 비이커의 벽면을 따라 재빨리 넣고 나서 오일/물 유제의 상분리가 일어남을 관찰하였다. 상기의 혼합물중 칼슘-알지네이트 캡슐이 염화칼슘층의 바닥에 분리되어 가라않도록 30분동안 놓아두었다. 상기의 분리된 오일층을 배출시키고 저속 원심분리하여 캡슐을 얻고 0.85% 식염수로 한번 세척하고 4℃에서 저장하였다. 캡슐의 크기는 850㎛와 1.18mm 강철체를 사용하여 실시하였다.
동결건조된 피막세포의 미세구조적 특징들은 주사전자현미경(FEG-SEM, Hitachi S-4200; 조엘사)으로 조사하였다. 상기의 캡슐 제조방법으로 피막된 피막세포를 4℃에서 냉동하였고, 진공트레이동결건조기(Vacuum Tray Freeze Dryer, I1 신 공업사 제품)를 사용하여 -45℃에서 12시간동안 동결건조하였다. 양쪽면에 접착테이프가 부착된 표본 스터브에다 상기 피막세포의 표본을 올려두었다. 상기 피막세포의 표본을 이온 스푸터(ion sputter, ε-1030, 히타치사 제품)에서 Pt-Pb로 코팅하였다.
도 2와 3에 나타난 바와 같이, 상기 실험예 1과 2에 따라 제조된 캡슐은 평균 직경이 2.8mm이며, 일반적으로 구형의 형태를 가지며 다수의 소공(micropore)이 발견되었다. 고배율로 확대한 현미경사진상으로 관찰할 경우, 알지네이트 캡슐내에 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 SCD 세포가 무작위로 분산 분포되어 있었다. 알지네이트 및 알지네이트/메틸-셀룰로우즈 캡슐의 구조는 면도칼로 동결건조된 캡슐을 자른 후 주사전자현미경(SEM)하에서 조사하였다. 그 결과, 건조된 알지네이트-캡슐은 크기는 약 2.0mm이고, 거친 구형의 형태를 띠고 있고(도 2), 탈수과정동안 수분 함량의 소실로 인해 주름진 표면을 갖고 있다(도4A). 메틸-셀룰로우즈는 공동들(cavity)에 나타났으며(도 7), 반면에 세균은 알지네이트 매트릭스에서 무작위로 분포되어 있었다(도 3).
실시예 3: 캡슐로 피막된 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 SCD의 생존 실험
실험예 1: 인공 위액 조건하에서 피막된 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 SCD의 생존
알칼리성 세균인 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 SCD는 pH 조건에 매우 민감하며 알지네이트 캡슐은 위액에 안정하며 보다 높은 pH 조건에서 분해된다고 알려져 있다. 비록 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 SCD가 알지네이트를 이용한 캡슐에 의해 보호될 수 있다고 해도, 바실러스 균주의 생존은 노출 배지의 pH에 따라 다른 결과가 나타날 수 있다. 따라서, 알지네이트 캡슐로 피막된 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 SCD의 인공 위액에 대한 내성을 조사하기 위하여, 염산이 주성분으로 구성된 용액에 노출시킨 후 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 SCD의 생존능력을 측정하였다. 펩신(0.85% NaCl을 포함한 0.1M HCl)을 포함한 인공 위액은 Rao 등의 방법을 변형하여 제조하였다. 실험예 1의 방법에 따라 제조된 직경이 2.8mm인 알지네이트 캡슐로 피막된 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 SCD를 다음과 같은 pH로 조정한 인공 위액에 넣었다: 대략 pH 1.5, 2.5, 4.0 및 7.0(대조군). 알지네이트 캡슐로 피막된 바실러스 균주 샘플을 37℃에서 3시간동안 항온처리하였다. 상기의 항온처리동안 30분간격으로 캡슐에 적재된 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 SCD 샘플(0.1g)을 모아 생리 식염수로 세척하고나서, 보텍스를 이용하여 멸균한 0.1M 소디움 시트레이트 용액 1ml에서 1시간동안 녹였다. 총 생육세포수는 CFU로 표현하며 평판계수법으로 측정하였다. 희석된 샘플을 37℃에서 12시간동안 TSA 배양하였다. 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 SCD의 평균 생존은 각각 세 번이상 희석하고 도말한 샘플로부터 측정되었다.
도 5에 나타난 바와 같이, 알지네이트의 농도를 달리하여 제조한 소디움 알지네이트 캡슐로 피막된 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 SCD의 생존을 조사한 결과, 생육세포의 수는 중성의 pH에서는 알지네이트의 농도에 관계없이 유사하였으나, 낮은 pH에서는 빠르게 감소되었다. 2% 농도의 알지네이트 캡슐로 피막된 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 SCD의 생육 세포수는 인공위액에 노출되기 전에는 7.0x106 cfu/ml이었으나, 인공위액에 노출된 후에는 1.7x103 cfu/ml이었다. 3% 농도의 알지네이트 캡슐로 피막된 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 SCD의 생육 세포수는 인공위액에 노출되고 3시간후에는 1.4x107 cfu/ml 에서 2.5x104 cfu/ml로 감소하였다. 4% 농도의 알지네이트 캡슐로 피막된 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 SCD의 생육 세포수는 인공위액에 노출되기 전에는 1.1x107 cfu/ml 이었으며, 노출되고 3시간 후에는 2.2x104 cfu/ml이었다. 따 라서, 인공위액에 노출된 후, 3시간이 지나면, 2%, 3%, 4% 농도의 알지네이트 캡슐로 피막된 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 SCD의 생존은 각각 0.02, 0.18 및 0.19%이었다. 한편, 강산에 노출시킨 후 피막되지 않은 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 SCD와 캡슐로 피막된 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 SCD의 생존 실험결과, 피막되지 않은 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 SCD는 강산조건하에서 효과적으로 생존하지 못하였다(미도시됨).
한편, Betty 와 Stephanopoulos는 보다 높은 농도의 알지네이트를 포함하는 캡슐을 통한 물질의 확산은 캡슐의 크기보다는 오히려 소공의 수 및 크기와 연관이 있다고 보고하고 있다. 따라서, 인공위액하에서 캡슐로 피막된 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 SCD의 생존에 대한 캡슐 크기의 효과를 실험하기 위해, 실시예 2의 실험예 1과 2의 캡슐 제조방법에 따라 3% 농도의 알지네이트 혼합물을 이용하여 캡슐을 제조하였다.
도 6에 나타난 바와 같이, 850㎛ 직경의 캡슐(소캡슐)로 피막된 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 SCD의 생육세포수는 초기에는 4.6x107 cfu/ml이었으며, 인공위액에 노출되고 3시간후에는 1.0x104 cfu/ml이었다(0.02%의 생존율). 기대했던 것처럼, 보다 큰 캡슐(2.8mm)로 피막된 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 SCD의 치사율은 소캡슐로 피막된 균주보다 낮았다.
실험예 2: 생중합체를 첨가하여 캡슐물질 선택
Betty 와 Stephanopoulos의 보고에도 나타난 바와 같이 알지네이트 캡슐을 통한 물질의 확산은 캡슐의 크기보다는 오히려 소공의 수 및 크기와 연관이 있으므로, 해로운 물질에 대한 피막된 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 SCD의 생존을 개선하기 위해서는 알지네이트 매트릭스에서 소공의 수와 크기를 감소시키거나 혹은 이들 해로운 물질들의 캡슐내부로의 확산을 감소시키는 다른 방법을 고안하는 것이 중요하다.
따라서, 산성(acid)하에서 피막된 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 SCD의 생존에 대한 캡슐 소공의 수와 크기의 효과를 조사하기위해, 상기 실시예 2의 실험예 1과 2의 캡슐 제조방법에 따른 캡슐 제조시 다양한 생중합체를 세포 현탁액에 첨가하여 최종농도가 0.5%(w/v)가 되도록 하여 함께 혼합하였다. 상기에서 사용된 캡슐물질 및 사용농도는 표 1에 나타내었다.
표 1에 나타난 바와 같이, 인공 위액 하에서 모든 첨가물을 알지네이트에 넣고 제조한 캡슐로 피막된 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 SCD의 생존이 3% 농도의 알지네이트만을 포함하는 캡슐로 피막된 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 SCD 보다 높았다. 생중합체를 첨가하여 제조된 캡슐들중, 3% 농도의 알지네이트와 0.5% 메틸-셀룰로우즈를혼합한 캡슐로 피막된 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 SCD가 특히 인공 위액에 대해 가장 높은 생존율을 나타냈다(표 2). pH 1.5에서, 알지네이트 캡슐로 피막된 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 SCD는 80-90% 감소된 반면, 알지네이트/메틸-셀룰로우즈 캡슐로 피막된 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 SCD는 15-20% 감소하였다(80% 생존율). 0.5% 메틸-셀룰로우즈가 혼합된 알지네이트 캡슐로 피막된 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 SCD 는 인공 위액에 대한 세균의 생존을 개선시키는데 매우 효과적이었다.
Figure 112002002462011-pat00001
따라서, 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 SCD의 생존에 가장 효과가 큰 메틸-세룰로 우즈를 농도를 달리하여 3% 농도의 알지네이트와 혼합하여 제조한 캡슐로 피막된 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 SCD과 3% 농도의 알지네이트만으로 제조된 캡슐로 피막된 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 SCD의 생존을 비교하였다. 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 SCD의 높은 생존율을 얻기 위해, 0.1, 0.3, 0.5 및 0.7%의 메틸-셀룰로우즈의 농도에 따라, 인공 위액에 노출하고 2시간후에 생육세포수를 측정하였다.
표 2에 나타난 바와 같이, 알지네이트/메틸-셀룰로우즈로 피막된 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 SCD의 생존율은 알지네이트만으로 피막된 세포와 비교하여 보다 증가하였다. 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 SCD의 생존은 메틸-셀룰로우즈의 농도가 높을수록 매우 증가하였지만, 인공 위액하에서 0.7% 농도의 알지네이트/메틸-셀룰로우즈로 피막된 세포의 생육세포수는 0.5% 농도의 알지네이트/메틸-셀룰로우즈보다 현저하게 낮았다(표 2). 0.7%의 알지네이트/메틸-셀룰로우즈로 피막된 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 SCD의 낮은 생존율은 알지네이트 매트릭스에서 고분자의 메틸-셀룰로우즈의 농도가 증가함으로 인해 제한되기때문인 것 같다. 상기의 결과, 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 SCD의 생존을 개선하기 위한 최적 피막 물질은 0.5%의 메틸-셀룰로우즈로 혼합된 3%의 알지네이트임을 알 수 있었다.
Figure 112002002462011-pat00002
실험예 3: 인공 담즙염액 조건하에서 피막된 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 SCD의 생존
미생물은 위를 통과한 후, 담즙이 분비되는 상부의 장관으로 들어간다. Gilliland 등은 프로바이오틱의 담즙염 내성은 인간 장관의 조건이 고무되는 최소 한 0.3% 옥스갈을 포함한 배지에서 배양될 때 관찰되어야 한다고 보고했다. 인간의 위장관계에서 담즙의 농도는 다양하지만 보통 0.6% 정도라고 알려져 있다. 알지네이트 캡슐로 피막된 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 SCD의 담즙염 내성을 측정하기위해 인공 담즙염 용액(pH 7.2)을 사용하였다. 멸균된 필터에 옥스갈(Oxgall)을 최종농도가 0.6, 0.8 및 1%가 되도록 첨가하고 샘플을 37℃에서 6시간동안 항온처리하였다. 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 SCD의 생존은 상기 실시예 3의 실험예 1과 같은 방법으로 적절한 희석액을 도말하여 세 번 측정하였다. 생존은 최대 6시간까지 노출하여 2시간 간격으로 기록하였다. 담즙염 용액에 노출된 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 SCD의 생존에 대한 캡슐 매개변수의 영향은 인공 위액에서와 같은 방법으로 실험하였다.
Figure 112002002462011-pat00003
표 3에 나타난 바와 같이, 담즙염액에 노출된 후 2시간째에 비록 침투 시간이 다르다고 해도 알지네이트 캡슐만으로 피막된 것과 알지네이트/메틸-셀룰로우즈 캡슐로 피막된 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 SCD의 생존율은 둘다 감소하였다. 그러나, 피막된 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 SCD의 생육세포수는 4시간후에는 증가하였다. 결과적으로, 알지네이트 캡슐과 알지네이트/메틸-셀룰로우즈 캡슐로 피막된 바실러 스 폴리퍼멘티쿠스 SCD는 둘다 인공 담즙염하에서 대조군보다 높은 생장율을 나타내었다.
실험예 4: 건조하지 않은 캡슐과 동결건조한 알지네이트-셀룰로우즈 캡슐로 피막된 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 SCD의 생존 비교
동결건조후 알지네이트 캡슐의 형태적 관찰
상기 실시예에 따라 제조된 캡슐을 초기에 주사전자현미경(SEM)으로 조사할 때 건조 및 코팅단계에서 인위적으로 생성되는 주름 등의 특징들을 구별하기 위해 광학현미경하에서 선별하였다. 광학현미경하에서 선별된 캡슐(메틸-셀룰로우즈 변형 알지네이트)의 표면 및 내부의 형태를 알기 위해서 주사전자현미경(SEM)하에서 관찰하였다. SEM 하에서 관찰하기 위해 준비하는 표본은 등급별 에탄올로 탈수되었고, 임계점에서 건조되고 스푸터에서 금으로 코팅되었고 주사전자현미경(SEM)에서 실험하였다.
도 2와 8에 나타난 바와 같이, 알지네이트/메틸-셀룰로우즈 캡슐과 동결건조된 알지네이트/메틸-셀룰로우즈 캡슐을 주사전자현미경하에서 관찰한 결과, 알지네이트/메틸-셀룰로우즈 캡슐의 표면 형태는 비록 전반적인 형태와 크기는 바뀌지 않았지만, 메틸-셀룰로우즈 분자로 인해 변형된 모습을 띠고 있다(도 8). 도 9에 나타난 바와 같이, 인공위액에서 3시간동안 노출후 동결건조한 알지네이트/메틸-셀룰로우즈 격자에 포획된 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 SCD의 주사전자현미경 사진도를 보 면,결과적으로 메틸-셀룰로우즈가 알지네이트 캡슐의 내부 구조와 표면을 변형시킴을 알 수 있다. 또한, 도 10B에서 볼 수 있듯이, 3시간동안 인공 위액에 노출되면 알지네이트/메틸-셀룰로우즈 캡슐의 표면은 매끄러워지는 것 같다.
동결건조후 피막된 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 SCD의 인공 위액과 담즙염에 대한 내성 실험
바실러스 폴리퍼멘티쿠스 SCD의 위산 내성을 비교하기위해, 0.5%의 메틸-셀룰로우즈를 3% 알지네이트 캡슐에 첨가한 후, 멸균한 0.85% 식염수로 다시 두 번 세척한 다음, -75℃에서 2시간동안 냉동시켰다. 알지네이트/메틸-셀룰로우즈 캡슐로 피막된 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 SCD의 최종 생성물은 -45℃에서 24시간동안 15mmtorr 압력하에서 동결건조기(I1 Shin Engineering Co., Korea)를 사용하여 동결건조하여 얻었다. 건조되지 않은 캡슐과 상기의 방법으로 동결건조된 알지네이트/메틸-셀룰로우즈 캡슐 0.1g을 100ml의 인공 위액(pH1.5, 펩신첨가)에 넣었다. 상기 각 캡슐과 인공위액 혼합물을 37℃에서 3시간동안 항온처리한 후, 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 SCD의 생존을 상기 실시예 3의 실험예 1과 동일한 방법으로 측정하고나서 통계적으로 비교하였다. 또한, 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 SCD의 담즙염에 대한 생존 비교를 위해, 건조되지않은 캡슐과 동결건조된 알지네이트/메틸-셀룰로우즈 캡슐의 샘플을 0.6%의 옥스갈을 포함한 인공 담즙염 용액에 넣고 37℃에서 6시간동안 항온처리하였다. 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 SCD의 생존은 상기 실시예 3의 실험예 1과 동일한 방법으로 적절한 희석액을 도말하여 세 번 측정하였다.
Figure 112002002462011-pat00004
표 4에 나타난 바와 같이, 37℃의 인공 위액(pH 1.5, 펩신첨가)하에서 시간당 동결 건조된 알지네이트/메틸-셀룰로우즈 캡슐내 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 SCD의 생존을 조사한 결과, 인공 위액에서 3시간동안 처리후 바실러스 균주의 생존은 1.2x105 cfu/g으로 유지되었다(생존율 60%). 상기의 결과로 부터, 위액은 표면 바늘구멍으로 미세입자를 넣어 결과적으로 생존능력을 상실케하는 것으로 보인다.
Figure 112002002462011-pat00005
또한, 표 5에 나타난 바와 같이, 37℃의 인공 담즙염 용액하에서 시간당 동결건조된 알지네이트/메틸-셀룰로우즈 캡슐내 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 SCD의 생존을 조사한 결과, 동결건조된 알지네이트/메틸-셀룰로우즈 캡슐내 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 SCD의 생육세포수는 0.6% 옥스갈 용액에 6시간동안 노출한 후 2.6x105에서 2.3x105 cfu/ml으로 감소하였다(90%의 생존율).
그러나, 표 4와 5에 나타난 바와 같이, 인공위액과 담즙염 용액에서 건조되지않은 알지네이트 캡슐내 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 SCD의 생존은 동결건조된 알지네이트/메틸-셀룰로우즈 캡슐로 피막된 균주의 생존과 비교하여 보다 높은 생존율을 나타내었다.
이상, 상기 실시예 및 실험예를 통하여 설명한 바와 같이, 본 발명은 비스판균을 포자를 형성하지 않고 영양세포(vegetative cell)을 얻어(배양시간 약 4∼12시간 정도) 미세캡슐로 피막하여 위산과 담즙산에 대한 내성을 획득함으로써 생존률이 높아져 장에 많은 비스판균이 도달할 수 있도록 하는데 뛰어난 효과가 있다. 또한, 본 발명은 배양시간을 많이 단축시키므로 생산성이 3∼4배 이상 증가되는 효과가 있으며 비스판균의 포자가 장에서 발아(germination)이 되어야 생균제로서 역할을 할 수 있는 종래의 방법과는 달리, 상기 균주의 발아를 걱정할 필요가 없는 장점이 있다. 아울러, 본 발명은 상기의 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 SCD가 안전하게 표적장기에 도달케 함으로써 캡슐로 피막된 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 SCD를 유효성분으로 하는 간 질환 치료를 위한 의약품, 기능성 식품 및 건강보조식품 제조에 뛰어난 효과가 있으므로 의약품 및 건강식품산업상 매우 유용한 발명인 것이다.

Claims (5)

  1. 배양된 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 SCD(Bacillus polyfermenticus SCD; KCCM 10104)를 원심분리하고, 상기에서 얻은 펠렛을 식염수로 세척 및 현탁하고, 상기의 세포 현탁액을 2-4%의 소디움-알지네이트와 0.1-0.7%의 메틸-셀룰로우즈 혼합용액에 넣고 혼합한 다음 캡슐-형성 장치에 옮기고 0.1M의 염화칼슘용액에 점적시켜 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 SCD가 캡슐에 의해 피막되도록 하여 내산성 및 내담즙산성을 갖도록 하는 것을 특징으로 하는 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 SCD(KCCM 10104)의 생산성 및 생존율을 향상시키는 방법.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 소디움-알지네이트/메틸 셀룰로오즈 캡슐은 직경이 0.85∼2.8mm이고 다수의 소공을 가진 거친 구형의 형태를 갖는 것을 특징으로 하는 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 SCD(KCCM 10104)의 생산성 및 생존율을 향상시키는 방법.
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 제 1항 기재의 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 SCD(KCCM 10104)의 소디움-알지네이트/메틸-셀룰로우즈 캡슐을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 건강보조식품 조성물.
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