FI104405B

FI104405B - Mikro-organismeja sisältävät tärkkelyskapselit ja niiden valmistusmenetelmä

Info

Publication number: FI104405B
Application number: FI980707A
Authority: FI
Inventors: Kaisa Poutanen; Tiina Mattila-Sandholm; Paeivi Myllaerinen; Pirkko Forssell; Atte Von Wright; Minna Alander
Original assignee: Valtion Teknillinen
Priority date: 1998-03-27
Filing date: 1998-03-27
Publication date: 2000-01-31
Also published as: EP1063976A1; FI980707A; FI980707A0; WO1999052511A1; CA2324364A1; AU3038699A; JP2002511403A; BR9909133A

Description

104405

Mikro-organismeja sisältävät tärkkelyskapselit ja niiden valmistusmenetelmä

Esillä oleva keksintö liittyy tärkkelyskapseleihin. Etenkin keksintö koskee patentti-5 vaatimuksen 1 mukaista menetelmää tärkkelyskapselien valmistamiseksi.

Keksintö koskee myös patenttivaatimuksen 26 mukaista tärkkelyskapselia.

Elintarvikkeiseen lisättyjä mikrobeja, jotka edesauttavat ihmisen terveyttä parantamalla 10 suoliston mikrobitasapainoa, kutsutaan probiooteiksi. Maitohappobakteerien, kuten esimerkiksi Lactobacillus, Streptococcus, Pediococcus, Lactococcus, Leuconostoc,

Corynebacterium, Enterococcus ja Bifidobacterium probioottinen vaikutus ihmisen ravitsemuksessa on tunnettua. Ihmisen suolistossa luonnostaan olevien mikrobien tehtävänä on estää haittamikrobien lisääntyminen ja erilaisten tulehdustilojen syntyminen. Probioottien : 15 on havaittu estävän myös suolistoperäisten syöpien syntyä. Ruoka-aineiden, joissa on probiootteja, on todettu lisäävän maitosokerin sietokykyä ihmisillä, jotka eivät voi - käyttää maitotuotteita. Erilaisten sairaustilojen tai esimerkiksi antibioottihoitojen yhteydessä suoliston hyödyllinen mikrobikanta voi tuhoutua. Nopea palautuminen voidaan saada aikaan nauttimalla tuotteita, joissa on maitohappobakteereita. Tällaisia tuotteita ,· 20 ovat esimerkiksi erilaiset hapatetut maitotuotteet tai maitohappobakteereiden avulla hapatetut kasvis- tai viljatuotteet. Kaupallisesti on saatavissa suun kautta nautittavia maitohappobakteerivalmisteita kapseleina, tabletteina tai jauheina. Probiootit kuitenkin tuhoutuvat herkästi happamissa olosuhteissa. Nautituista probiooteista suuri osa tuhoutuu jo ruoansulatuskanavan yläosassa alhaisen pH:n (pH 2) tai sappihappojen vaikutuksesta.

• 25 Vaikka maitohappobakteerivalmisteet siis sinänsä sisältäisivät oikeanlaisia maitohappo- t bakteerikantoja, jotka kykenisivät tehokkaasti palauttamaan suoliston mikrobitasapainon, .

suurin osa maitohappobakteereista kuolee jo ennen kuin ne ovat kunnolla päässeet Ϊ suolistoon. Suoliston tasapainoisen toiminnan kannalta olisi tärkeätä, että maitohappo-bakteerit selviäisivät suoliston läpi paksuun suoleen asti. Maitohappobakteereja sisältäviä ·: 30 ruoka-aineita tai maitohappobakteerivalmisteita pitää siis nauttia pitkiä aikoja ja suuria 2 104405 määriä ennen kuin ne saavat aikaan halutun vaikutuksen.

Maitohappobakteerien säilyvyys apteekin tai kaupan hyllyllä on myös ongelma. Mikrobit pitäisi suojata hapen vaikutukselta ja kosteuden ja lämpötilan vaihteluilta. Muuten maito-5 happobakteerivalmisteiden maitohappobakteeripitoisuus on jo ostohetkellä niin alhaisella tasolla, ettei tuotteen nauttimisella ole toivottua vaikutusta.

Probiootteja voitaisiin lisätä myös erilaisiin - lähinnä kuiviin - elintarvikkeisiin kuten viljatuotteet, mysli ja makeiset, mikäli probioottien säilyvyys tuotteessa ja kaupan 10 hyllyllä ei olisi ongelma.

Eläviä mikrobeja on pyritty suojaamaan erilaisilla pakkaustavoilla, pakkaamalla mikrobit kapseleihin tai tabletteihin, joiden pinta sulaa kosteuden vaikutuksesta tai tietyssä pH:ssa. Muita tapoja on esimerkiksi pakkaskuivaus. Jokaista mikrobiryhmää varten pitää kuiten-15 kin etsiä sopivat olosuhteet ennen pakkaskuivausta, kuten kasvatusalusta, solujen kon-sentraatio, suoja-aine, pH, kosteus, jäähdytysnopeus, pääkuivaus-ja jälkikuivausaika, astioiden sulkemistapa jne. Pakkaskuivauksella suojattujen solujen säilyvyyttä lisää säilytys vakuumissa tai kaasuatmosfaärissä. Optimaaliset olosuhteet varastointikestävyy-den kannalta tarkoittavat suojausta valolta ja kosteuden vaihteluilta sekä alhaista varas-20 tointilämpötilaa. Varastointilämpötilan nosto lisää solujen inhiboitumista. Esimerkiksi pakkaskuivattuja startteriviljelmiä tulisi säilyttää -40 .. -20°C:een lämpötilassa. Pakkas-kuivattujen solujen rehydratointiolosuhteilla, kuten lämpötilalla ja liuoksen koostumuksella on todettu olevan ratkaiseva vaikutus viljelmien toimintakyvyn palautumiseen.

: 25 Esillä olevan keksinnön tarkoituksena on saada aikaan menetelmä, jolla elävät mikrobit i voidaan suojata ympäristön vaikutuksilta siten, että olennainen osa mikrobeista säilyy elävinä.

Esillä olevan keksinnön tarkoituksena on saada aikaan tietynlainen suojapakkaus, joka 30 suojaa eläviä mikrobeita siten, että mikrobit säilyvät huoneenlämmössä pitkiäkin aikoja .104405 3 sellaisenaan tai esimerkiksi sekoitettuina elintarvikkeisiin. Suojapakkauksen tarkoituksena on lisäksi antaa suojaa mahalaukun happamuutta ja sappihappoja ym suoliston olosuhteita vastaan siten, että mikrobien elävyys suolistossa säilyy niin pitkälle kuin mikrobien vaikutuksen kannalta on tarkoituksenmukaista.

5

Esillä oleva keksintö perustuu siihen yllättävään havaintoon, että tärkkelyksestä voidaan muodostaa kapseleita, jotka antavat juuri halutunlaisen suojan eläville mikrobeille.

Keksinnön erään toisen suoritusmuodon mukaisesti tärkkelyksestä muodostettavien 10 kapseleiden avulla voidaan suojata myös erilaisia polypeptidejä ja proteiineja, etenkin entsyymejä, joiden halutaan säilyttävän aktiivisuutensa varastoinnin ja säilytyksen aikana r tai suolistossa.

Tärkkelys on kasvien varastopolysakkaridi. Se koostuu kahdesta glukoosin polymeeristä, 15 lineaarisesta amyloosista ja runsaasti haaroittuneesta amylopektiinistä. Tärkkelysjyväset 1 voidaan hydrolysoida amylolyyttisillä entsyymeillä kuten α-amylaaseilla. Tällöin tärkke-lysjyväsen amorfiset osat hydrolysoituvat ja kiteiset alueet jäävät jäljelle. Eri alkuperää olevat tärkkelykset poikkeavat kooltaan ja koostumukseltaan.

.· 20 EP-patenttijuIkaisussa 0 539 910 AI on kuvattu tärkkelysjyvästen käsittely amylaasilla. I

Pyrkimyksenä on ollut muuttaa tärkkelysjyvästen keittoviskositeettia. Amylaasilla Γ käsiteltyjä tärkkelysjyväsiä on ehdotettu käytettäväksi esimerkiksi nestemäisissä pika- ; ruoissa tai sekoitettuna käsittelemättömien tärkkelysjyvästen kanssa, jolloin saadaan ' viskositeetiltaan erilaisia tärkkelysjyvässeoksia. Julkaisun mukaan amylaasilla käsitellyt , 25 tärkkelysjyväset saattavat adsorboida hydrofobisia aineita kuten aromaattisia yhdisteitä.

Glukoamylaasilla käsiteltyjen tärkkelysjyvästen on arveltu kykenevän adsorboimaan ~ öljyjä.

Kansainvälisessä patenttijulkaisussa WO 89/04842 on kuvattu tärkkelysjyvästen käyttö 30 absorboituneiden toiminnallisten yhdisteiden kantajana. Tärkkelysjyväsiä on käsitelty a- ” 4 104405 amylaasilla tai glukoamylaasilla. Tärkkelysjyväsiä on ehdotettu käytettäväksi anti-perspiranttien apuaineena tai ruokien ja juomien täyteaineena. Nestemäisiä aineita on ehdotettu formuloitavaksi käsiteltyjen tärkkelysjyvästen avulla jauheiksi, tahnoiksi tai voiteiksi, jotka ovat helpommin pakattavia tai muuten käytännöllisempiä. Hydrolysoi-5 tujen tärkkelysjyvästen rakenteen vahvistamiseksi on ehdotettu tärkkelyksen käsittelyä kemiallisesti ristiinreagoivien aineiden kuten natriumtrimetafosfaatin kanssa. Jos tärkkelysjyväsiin absorboitava aine on luonteeltaan lipidi, tärkkelysmatriisi voidaan julkaisun mukaan käsitellä aineilla, jotka tekevät huokosten pinnan lipofiilisemmäksi. Tällaisia aineita ovat esimerkiksi synteettiset polymeerit kuten metyyliselluloosa.

10 Julkaisussa on mainittu, että absorboitavat aineet voivat olla esimerkiksi salaattiöljyjä, aromeita, hyönteiskarkotteita, insektisidejä, herbisidejä, parfyymejä, kosteusaineita, saippuoita, vahoja, ihovoiteita ja -lotioneita, vitamiineja ja terapeuttisia lääkeaineita.

US-patenttijulkaisussa 4,551,177 on kuvattu kokoonpuristuva tärkkelys, jota voidaan 15 käyttää sitomisaineena tableteissa. Kylmään veteen liukenemattomat tärkkelysjyväset käsiteltiin hapolla, emäksellä tai α-amylaasilla, jolloin saatiin muuttuneita, heikentyneitä jyväsiä, joiden sitomiskyky oli hyvä, kun niitä puristettiin kokoon.

: US-patenttijulkaisussa 5,670,490 on kuvattu tärkkelysjyväsistä sitovien aineiden avulla 20 muodostettuja huokoisia aggregaatteja, joiden sisään jäävää tyhjää tilaa on käytetty hyväksi erilaisten toiminnallisten aineiden kantajana. Aineet vapautuvat aggregaatista mekaanisen paineen/hajottamisen, sitovien tai muiden aineiden hajoamisen tai liuotuksen tai diffuusion avulla huokoiselta pinnalta. Pyöreiden aggregaattien halkaisija oli 15 -150 μπι. Sitova aine oli tyypillisesti polymeeri. Patentissa on ehdotettu aggregaattien käyttä-25 mistä mm. suun kautta annosteltavien farmaseuttisten yhdisteiden formuloinnissa siten, että formulaatio suojaisi aktiivisia aineita mahalaukun happamilta ja sulattavilta olosuh-I: teiltä ja siten, että aktiiviset aineet vapautuisivat vasta ohutsuolessa. Aggregaatit valmis- !! tettiin suspendoimalla tärkkelysjyväset sopivaan sitovia aineita sisältävään liuokseen ja il spray- kuivaamalla suspensio. Julkaisun mukaan aggregaatit voitaisiin päällystää poly- „ 30 meerillä sen jälkeen kun toiminnalliset yhdisteet olisi viety aggregaattien sisään. Sitovat tl ia ia 5 104405 aineet voisivat olla biohajoavia polymeerejä kuten polysakkarideja (levistä tai kasveista peräisin olevia kumeja, pektiineitä, agaria, alginaattia, gelatiinia, dekstriiniä, tärkkelys-johdannaisia) ja selluloosapitoisia aineita kuten karboksimetyyliselluloosa, hydroksi-metyyliselluloosa, hydroksipropyyliselluloosa jne. proteiineja, erityisesti sellaisia, joita ei 5 ole luonnostaan tärkkelysjyväsissä, ja polyestereitä. Polymeerit voisivat olla myös ei-biohajoavia, synteettisiä tai semisynteettisiä kuten polyvinyylialkoholi poly-N-vinyyli-2-pyrrolidoni tai akryyli- tai metakryylihapon polymeerejä tai kopolymeereja tai näiden amidijohdannaisia kuten polyakrylamidi. Päällystysaineet voisivat olla samoja tai eri polymeerejä kuin sitovat aineet. Toiminnallisia aineita, jotka voitaisiin absorboida 10 aggregaattien sisään olisivat samat aineet, jotka on lueteltu hakemuksessa WO 89/04842.

Patenttijulkaisussa WO 89/04803 ehdotetun menetelmän epäkohta on se, että hydrolysoidut tärkkelysjyväset voivat kyllä ottaa erilaisia aineita huokosrakenteittensa sisään, mutta mikään ei estä aineita vapautumasta ulos tärkkelysjyväsistä, eivätkä aineet toisaalta 15 ole suojassa ympäristön vaikutukselta (valo, pH, kosteus, happi, lämpötila). US-patentti-julkaisussa 5,670,490 tärkkelysjyväset sidotaan toisiinsa siten, että ne muodostavat aggregaatin, jonka sisään jää kotelomainen tila, jonka sisään on ehdotettu suljettavaksi 1 erilaisia aineita. Aggregaattien muodostamisessa käytetään erilaisia sitovia aineita, esimerkiksi erilaisia polymeerejä, joista voi olla haittaa elimistöön vietynä tai valmis-20 tusprosessin aikana.

Esillä olevan keksinnön tarkoituksena on poistaa tunnettuun tekniikkaan liittyvät epäkohdat ja saada aikaan aivan uudenlainen menetelmä, jossa käytetään luonnon polymeerejä. Menetelmän avulla erilaisia aineita voidaan suojaata ympäristön vaikutukselta . : 25 säilytyksen aikana tai ihmisten tai eläinten suolistossa.

Keksinnön mukaisessa menetelmässä tärkkelysjyväset hydrolysoidaan siten, että niiden rakenne muuttuu pinnalta reiälliseksi ja sisältä huokoiseksi, jolloin jyväsen sisätila muodostaa onton kotelomaisen tilan. Kotelomainen tila voidaan täyttää halutuilla aineilla 30 ja jyväsen pinta peittää haluttaessa ohuella kerroksella kalvonmuodostukseen kykenevää 6 104405 biopolymeeriä kuten selluloosaa, pektiiniä, proteiinia, edullisesti tärkkelystä. Tärkke-lyspinta voidaan muodostaa kuumaan veteen liuotetusta tärkkelyksestä tai tärkkelyksen komponentista, amyloosista, tai sulkemalla tärkkelysjyväsen pinnassa olevat huokoset sopivan kokoisilla, pienemmillä tärkkelysjyväsillä.

5

Keksintö perustuu siihen havaintoon, että tärkkelys hydrolysoituu amylolyyttisilla entsyymeillä kuten a-amylaaseilla, β-amylaaseilla tai glukoamylaaseilla. Jyväsen amorfiset osat hydrolysoituvat ja kiteiset alueet jäävät jäljelle. Nämä kiteiset osat ovat melko stabiileja myöskin ihmisen ruoansulatuskanavassa. Hydrolysoinnin jälkeen tärkke-10 lysjyvänen täytetään halutuilla aineilla kuten elävillä mikrobeilla tai entsyymeillä tai näiden seoksella. Mikrobiviljelmissä voi luonnostaankin olla tiettyjä mikrobien tuottamia entsyymejä. Mikrobit voivat myös tuottaa tärkkelysjyväsen hydrolysoinnissa tarvittavat hydrolyyttiset entsyymit, kun niiden annetaan kasvaa sopivissa olosuhteissa tärkkelys-jyvästen sisään.

15

Haluttaessa tärkkelys voidaan päällystää luonnon biopolymeereillä, kuten selluloosalla, pektiineillä, proteiineilla, edullisesti tärkkelyksellä. Tärkkelys, erityisesti toinen sen komponenteista, lineaarinen amyloosi, kykenee muodostamaan kalvoja. Tärkkelystä voidaan modifioida fysikaalisin keinoin (esimerkiksi lämpötilan avulla) siten, että se : .· 20 muuttuu stabiilimmaksi ja resitentimmäksi mahan ja ohutsuolen nesteille. Erilaisia ] tekniikoita päällystää tärkkelysjyväsiä ovat esimerkiksi päällystäminen sumuttamalla j tärkkelys/amyloosiliuoksella tai sekoittamalla jyväset tärkkelys/amyloosiliuokseen ja antamalla tärkkelyksen kiteytyä jyväsen pintaan. Tärkkelys/amyloosiliuos voidaan saostaa jyvästen pintaan myös etanolilla. Keksinnön erään sovellusmuodon mukaan tärkkelys-25 jyväsen pinnalla olevat reiät voidaan sulkea myös sopivan pienikokoisilla tärkkelys-jyväsillä. Tärkkelysjyvästen päällystämisessä voidaan tärkkelyksen/amyloosin sijasta käyttää muitakin biopolymeerejä, mikäli niiden kalvonmuodostusominaisuudet ja liukenemisominaisuudet ovat yhtä hyvät kuin tärkkelyksen ja amyloosin.

m 30 Tärkkelysjyväset voidaan täyttää elävillä mikrobeilla kuten maitohappobakteereilla tai 7 104405 elintarviketeollisuuden käyttämillä starttereilla tai polypeptideillä tai proteiineilla, kuten entsyymeillä.

Tärkkelyskapselit on valmistettu edullisesti natiivitärkkelyksestä. Eri alkuperää olevat 5 tärkkelykset poikkeavat kooltaan ja koostumukseltaan. Näitä eroja voidaan käyttää hyväksi erilaisissa sovelluksissa.

Esillä olevan menetelmän mukaan tärkkelyskapseli valmistetaan seuraavasti: - valitaan käyttötarkoituksen mukaan sopivaa kokoluokkaa edustavat tärkkelysjyväset ja 10 - täytetään jyväset mikro-organismeilla j a/tai polypeptideillä tai proteiineilla, kuten entsyymeillä.

Tärkkelysjyvästen huokoisuutta parannetaan hydrolysoimalla tärkkelysjyväset kemiallisesti tai entsymaattisesti.

15

Haluttaessa jyväset päällystetään biopolymeerillä, edullisesti tärkkelyksellä.

Täsmällisemmin sanottuna keksinnön mukaiselle menetelmälle on tunnusomaista se, mikä on esitetty patenttivaatimuksen 1 tunnusmerkkiosassa.

20 : • = : Keksinnön kohteena ovat myös tärkkelyskapselit, jotka koostuvat tärkkelysjyväsestä, joka ” on rakenteeltaan huokoinen ja täytetty halutulla aineella, edullisesti mikrobeilla ja/ tai polypeptideillä, tai proteiineilla kuten entsyymeillä. Haluttaessa tärkkelyskapselit on päällystetty biopolymeerillä, edullisesti tärkkelyksellä.

25 ‘ Täsmällisemmin sanottuna keksinnön kohteena on patenttivaatimuksen 26 tunnusmerkkiosan mukainen tärkkelyskapseli.

Keksinnön avulla saavutetaan huomattavia etuja. Niinpä keksinnön mukaiset tärkkelys-30 jyväset säilyvät hyvin huoneenlämmössä useita kuukausia.

Ψ 9 m 8 104405

Keksinnön mukaisiin tärkkelyskapseleihin säilöttyjä maitohappobakteereja tai elintarviketeollisuuden käyttämiä starttereita, probiootteja sisältäviä elintarvikkeita tai entsyymejä voidaan säilyttää huoneenlämmössä pitkähköjä aikoja. Eläviä mikrobeita sisältävien valmisteiden kuten maitohappobakteerivalmisteiden tai probiootteja sisältävien 5 elintarvikkeiden laatu paranee, kun mikrobipitoisuus tuotteessa saadaan jo alunperin korkealle tasolle. Entsyymien aktiivisuus ja teho paranee, kun entsyymi ei ole alttiina ympäristön kosteusvaihteluiden, lämpötilan, hapen tai happamuuden vaikutukselle.

Keksinnön mukaisiin tärkkelyskapseleihin säilöttyjen eläviä mikrobeita sisältävien 10 valmisteiden teho paranee, koska mikrobit eivät vapaudu tärkkelyskapseleista liian aikaisin suolistossa. Samoin entsyymien vaikutus paranee ja vaikutusaika pitenee, kun entsyymipreparaatin aktiivisuus ei pääse laskemaan ennen käyttökohteeseen pääsyä.

Esillä olevaa keksintöä ryhdytään seuraavassa lähemmin tarkastelemaan yksityiskohtaisen 15 selityksen ja sovellusesimerkkien avulla.

Kuvio 1. Eroteltujen tärkkelysjyvästen kokojakauma Coulterilla.

Kuvio 2. Tärkkelysjyvänen, joka on hydrolysoitu a-amylaasilla.

Kuvio 3. Amyloosilla päällystetty tärkkelysjyvänen.

20 Kuvio 4. Maitohappobakteereilla täytetty tärkkelysjyvänen (leikepaksuus 4pm)

Kuvio 5. Maitohappobakteerien kasvukäyrä.

Tärkkelyskapseleiden valmistuksessa käytetty tärkkelys on edullisimmin natiivia tärkkelystä. Se voi olla peräisin ohrasta, perunasta, vehnästä, kaurasta, herneestä, j '·] 25 maissista, tapiokasta, sagos ta, riisistä tai sentapaisesta mukula- tai viljakasvista, j edullisimmin se on peräisin perunasta, ohrasta, vehnästä tai maissista.

t |

Esillä olevassa keksinnössä käytetään tärkkelysjyväsiä, jotka ovat kooltaan 10 -100 pm , edullisesti 30-100 pm suuruisia, edullisimmin 50-100 pm suuruisia. Koska joidenkin 30 kasvien tärkkelysjyväset ovat luonnostaan sopivan kokoisia, jyvästen fraktiointia ei tarvita.

9 104405

Muussa tapauksessa tärkkelysjyväset fraktioidaan eri kokoluokkia edustaviin fraktioihin ja valitaan käyttötarkoituksen kannalta sopiva tärkkelysjyväsfraktio.

Jyväset hydrolysoidaan kemiallisesti tai entsymaattisesti. Entsyymeinä käytetään a-5 amylaaseja tai glukoamylaaseja, jotka ovat tyypillisesti peräisin Rhizopus, Aspergillus tai Bacillus-suvuista. Esimerkkejä sopivista α-amylaaseista ja β-amylaaseista ovat esimerkiksi MEGAZYME® (Australia).

Hydrolysointia varten tärkkelysjyväset suspendoidaan veteen noin 5-15 % liuokseksi.

10 Amylaasiliuosta lisätään 1000-10 000 U/g jyväsiä riippuen entsyymituotteesta.

Hydrolysointi tehdään lämpötilassa, joka sopii entsyymin toiminnalle, mutta joka ei muuta tärkkelyksen rakennetta, esimerkiksi 30-40 °C:ssa tai vaihtoehtoisesti korkean paineen alaisena, jolloin lämpötilan ei tarvitse olla näin korkea. Hydrolyysin tavoitteena on saada valituista tärkkelysjyväsistä 3-60%, edullisesti 30 - 50 %, edullisimmin 40% kuiva-aineesta 15 hydrolysoitua.

Tärkkelysjyväsiä sekoitetaan sopiva määrä, esimerkiksi 1 paino-osa 10 -100 paino-osaan

elävien bakteerien liuosta (PFU 10* -109) tai 1 paino-osa 10-100 paino-osaan sopivan T

konsentraatioista entsyymiliuosta tai muuta ainetta, jolla tärkkelysjyväset halutaan täyttää.

20

Keksinnön yhden edullisen suoritusmuodon mukaisesti hydrolysoidut tärkkelysjyväset kylmäkuivataan, täytetään halutulla aineella ja jälleen kylmäkuivataan.

Keksinnön toisen edullisen sovellusmuodon mukaisesti hydrolysoidut tärkkelysjyväset • · *— 25 täytetään halutulla aineella ja kylmäkuivataan ne samanaikaisesti tai täytön jälkeen.

Keksinnön kolmannen edullisen sovellusmuodon mukaisesti tärkkelysjyväset sekoitetaan amylolyyttisiä entsyymejä sisältävään mikrobiliuokseen, edullisesti maitohappobakteerien ^ kasvuliuokseen, sopivissa olosuhteissa siten, että mikrobit lisääntyvät ja kasvavat 30 tärkkelysjyvästen pintaan ja onttoon sisätilaan käyttäen tärkkelysjyväsistä vapautuvia _ 10 104405 hydrolyysituotteita ravintonaan tuottaen samalla omia aineenvaihduntatuotteitaan kuten maito- ja etikkahappoa, jotka laskevat pH:n mikrobien kasvun kannalta edulliselle tasolle, polysakkarideja, jotka stabiloivat lisää tärkkelysjyväsen rakennetta ja entsyymejä, jotka hydrolysoivat tärkkelysjyväsiä. Liuokseen on edullista lisätä myös maitohappo/etikka-5 happoliuosta ja säätää liuoksen pH mikrobien kasvulle edulliseksi.

Voidaan ajatella myös sovellusta, jossa tärkkelysjyvästen ja mikrobien seokseen ei lisätä lainkaan hydrolysoivia entsyymejä tai kemikaaleja, vaan annetaan mikrobien tuottaa hydrolyysissä tarvittavat entsyymit.

10

Sekoitettaessa tärkkelysjyväset mikrobiliuokseen lämpötila voidaan valita siten, että se on edullinen mikrobien kasvulle, alle 40 °C , edullisesti 30 - 37 °C ja sekoitusaika voi olla niin pitkä, että mikrobit ehtivät lisääntyä ja kasvaa tärkkelysjyvästen huokoiseen ja onttoon sisätilaan.

15

Hydrolysoinnin ja täytön jälkeen tärkkelysjyväset voidaan erilaisia sovelluksia varten , erottaa käsittelyliuoksesta ja kylmäkuivata, jäähdyttää pakastimessa tai nestetypessä.

Tuloksena on helposti käsiteltävä jauhe, jossa tärkkelysjyvästen muodostamat kapselit ovat oleellisesti erillisinä, eivätkä muodosta aggregaatteja.

!· 20 Täytetyt tärkkelysjyväset voidaan haluttaessa päällystää siten, etteivät tärkkelysjyväsen sisään suljetut aineet pääse vapautumaan ennenaikaisesti tai ettei ympäristö vaikuta niihin I haitallisesti. Tämä on edullista varsinkin kun tärkkelysjyväset on täytetty mikrobeilla.

i ‘ 9 25 Päällystys voidaan tehdä jollain kalvonmuodostukseen kykenevällä biopolymeerillä, edullisesti tärkkelyksellä ja edullisimmin amyloosilla. Tärkkelyksestä tai amyloosista | ’ voidaan valmistaa 0,1 - 70 % tai 0,1-2 % liuos tärkkelyksen suhteen. Tärkkelys- tai amyloosiliuos voidaan sumuttaa jyvästen pintaan siten että tärkkelys- tai amyloosipitoisuus ' on 1 -6% jyvästen painosta ja antaa jäähtyä siten, että tärkkelys/amyloosi muodostaa geelin ä 30 jyvästen pintaan. Tällöin on edullista käyttää 0,1 - 2 % tärkkelysliuosta. Vaihtoehtoisesti 104405 π jyväset voidaan sekoittaa tärkkelys- tai amyloosiliuoksen kanssa ja antaa kiteytyä viileässä (4-10 °C). Tällöin on edullista käyttää 0,1 - 70 % tärkkelysliuosta. Tärkkelys- tai amyloosi-liuos voidaan myös saostaa jyvästen pintaan etanolilla. Erään vaihtoehdon mukaan tärkkelysjyväset voidaan päällystää itseään pienemmillä tärkkelysjyväsillä, jotka ovat 5 kooltaan esimerkiksi 1 -10 pm suuruisia. ! Tärkkelyskalvopäällystys voidaan toteuttaa vesipohjaisena, mikä on selkeä etu orgaanisia liuottimia käyttävään kalvopäällystykseen nähden (työturvallisuus, Iiuotinjäämät, ympäristönäkökohdat).

10

Voidaan myös ajatella, että kapselin päällystyksessä käytettävää biopolymeeriä, edullisesti ' tärkkelystä tai amyloosia kombinoidaan erilaisten farmasiassa käytettävien kalvopäällystys-materiaalien kanssa. Tällä tavoin tärkkelyskalvojen hajoamisnopeutta ruoansulatuskanavassa voitaisiin säädellä. Päällystysmateriaali on edullisesti 50- 100 %, edullisimmin 15 90 - 100 % biopolymeerejä, kuten tärkkelystä/amyloosia, loppuosa 0 - 50 %, edullisesti 0 - = 10 % farmasiassa käytettäviä kalvomateriaaleja.

Keksinnön mukaisesti jyväset voidaan täyttää mikro-organismeilla kuten erilaisilla bakteereilla, hiivoilla tai homeilla.

'· - 20

Bakteerit voivat olla maitohappobakteereita ja kuulua sukuihin Lactobacillus,

Streptococcus, Pediococcus, Lactococcus, Leuconostoc, Corynebacterium, Enterococcus ~~ tai kuulua Bifidobacterium-sukuun tai ne voivat olla hiivoja ja kuulua sukuun -

Saccharomyces. .

' · 25

Keksinnön mukaisesti jyväset voidaan täyttää erilaisilla polypeptideilla tai proteiineilla - kuten entsyymeillä. Entsyymit ovat esimerkiksi leivontaentsyymejä, joiden toimiminen liian ” aikaisin halutaan estää.

30 Seuraavat ei-rajoittavat esimerkit havainnollistavat keksintöä.

12 104405

Esimerkki 1 1. Tärkkelysjyvästen erottelu 5 Perunatärkkelys suspendoidaan veteen (5%:nen liuos). Kaadetaan liuos lasiputkeen (halk. 4 cm ja korkeus 15 cm). Sekoitetaan ja annetaan jyvästen sedimentoitua 8 min ajan. Isot jyväset (30 - lOOpm) laskeutuvat putken pohjaan. Sakan päältä kaadetaan liuos (pienet jyväset) pois toiseen astiaan. Sedimentointi toistetaan 3 kertaa. Sakka (isot jyväset) pakkaskuivataan. Sedimentti sentrifugoidaanjapakkaskuivataan. Erotellun tärkkelysjakeen 10 kokojakauma (määritetty Coulterilla) on esitetty kuviossa 1.

2. Tärkkelyksen hydrolyysi a-amylaasilla Tärkkelysjyväset suspendoitiin veteen (10 % liuos). Lisättiin oc-amylaasiliuosta 15 (MEGAZYME®, Australia) 1000 - 10 000 U/g jyväsiä. Hydrolysoitiin yön yli 30°C:n lämpötilassa magneettisekoittimella varustetussa vesihauteessa. Sentrifugoitiin liuos ja pakkaskuivattiin sakka. Perunatärkkelyksestä hydrolysoitui n. 3 % ja erotelluista isoista perunatärkkelysjyväsistä hydrolysoitui n. 40 % kuiva-aineesta. Kuviossa 2 on esitetty ; hydrolysoitu tärkkelysjyvänen.

1 20 ! 3. Hydrolysoitujen tärkkelysjyvästen täyttö maitohappobakteereilla Tärkkelysjyväset (10 g) ja 100 ml MRS-liuosta (deMan-Rogose-Sharpe-elatusaine, Oxoid, Unipath Ltd, Basingstoke, Hampshire, England), jossa oli kasvatettu Lactobacillus / 25 rhamnosus (ATCC 53109) (10® -109 CFU/ml) tai Lactococcus lactis (VTT E-90414) (108 - 109 CFU/ml) maitohappobakteereita yhdistettiin. Seoksia pidettiin magneettisekoittajalla vesihauteessa (30°C) yön yli. Liuos sentrifugoitiin pois. Pestiin sakka vedellä ja pesuvesi sentrifugoitiin pois. Täytetyt tärkkelysjyväset pakkaskuivattiin. Maitohappobakteereilla täytetty tärkkelysjyvänen on esitetty kuviossa 4.

.. 30 11 13 104405 4. Bakteerien elävyys 5 Bakteerien elävyys oli tuoreena huoneenlämpötilassa (20°C) 3x107 CFU/g ja 2 kk:n ! varastoinnin (eksikaattorissa 20°C:n lämpötilassa) jälkeen 3x105 CFU/g. Pakastimessa i (-18°C) 2 kk:n ajan säilytetyn näytteen elävyys oli 2xl07 CFU/g.

Esimerkki 2 10

Hydrolysoidut tärkkelysjyväset täytettiin maitohappobakteereilla kuten esimerkissä 1 kohdissa 1-3 on kuvattu. Pakkaskuivatut tärkkelysmaitohappobakteeripartikkelit päällystettiin amyloosilla. Valmistettiin amyloosista 0,1 -2% vesiliuos kuumentamalla se 170°C:n lämpötilaan. Liuos jäähdytettiin 60 °C:seksi tai 30°C:seksi. Liuosta sumutettiin 15 partikkeleihin siten, että amyloosipitoisuus oli n. 1 - 6 % partikkelien painosta tai partikkelit sekoitettiin liuokseen ja annettiin kiteytyä yön yli + 4°C:n lämpötilassa.

Amyloosilla päällystetty tärkkelysjyvänen on esitetty kuviossa 3.

Esimerkki 3 20 : Tärkkelysjyvästen hydrolyysi ja täyttö tehtiin samanaikaisesti. Erotellut isot tärkkelys- jyväset (lOg), maitohappobakteeri MRS-liuoksessa (108 - 109 CFU/ml/100 ml), entsyymi (α-amylaasi, MEG ΑΖΥΜΕ® 1000U) ja maitohappo/etikkahappoliuos (0,1 ml/liuoksen pH 4,5) sekoitettiin. Hydrolysoitiin yön yli 30 °C:n lämpötilassa magneettisekoittajalla. Maito-25 happobakteeripitoisuuden todettiin lisääntyvän paremmin kun MRS-liuokseen lisättiin • a-amylaasia (1=10 IU/ml, 2=50 IU/ml, 3=100 IU/ml, 4=200 IU/ml, 5=300 IU/ml, PS=kontrolli; kuvio 5,). Seos sentrifugoitiin ja sakka pakkaskuivattiin. Täytetyt partikkelit päällystettiin esimerkin 2 mukaisesti. Bakteerien elävyys oli tuoreena 7x109 CFU/g, 1 kk I.

säilytyksen jälkeen 4x108 CFU/g ja 2 kk säilytyksen jälkeen lxlO9 CFU/g.

30

Claims

104405

1, Menetelmä täytettyjen tärkkelyskapseleiden valmistamiseksi, tunnettu siitä, että 5 menetelmä käsittää seuraavat vaiheet: - valitaan käyttötarkoituksen mukaan sopivaa kokoluokkaa edustavat tärkkelysjyväset, - hydrolysoidaan tärkkelysjyväset siten, että jyvästen rakenne tulee huokoiseksi ja - täytetään jyväset mikro-organismeilla ja/tai polypeptideillä tai proteiineilla.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että tärkkelysjyväset hydrolysoidaan entsymaattisesti.

3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että tärkkelysjyväset hydrolysoidaan a-amylaasilla, β-amylaasilla tai glukoamylaasilla. 15

4. Menetelmä täytettyjen tärkkelyskapseleiden valmistamiseksi, tunnettu siitä, että menetelmä käsittää seuraavat vaiheet: - valitaan käyttötarkoituksen mukaan sopivaa kokoluokkaa edustavat tärkkelysjyväset ja - annetaan elävien mikro-organismien kasvaa tärkkelysjyvästen sisään ja tuottaa 20 hydrolyysissä tarvittavat entsyymit.

5. Jonkin edellisen patenttivaatimuksen mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että hydrolyysin annetaan tapahtua siten, että tärkkelysjyväsistä 3 -60%, edullisesti 30 - 50% kuiva-aineesta hydrolysoituu. | : 25 w

6. Jonkin edellisen patenttivaatimuksen mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että l tärkkelysjyväset päällystetään biopolymeerillä.

7. Jonkin edellisen patenttivaatimuksen mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että 30 tärkkelysjyväset päällystetään selluloosalla, pektiinillä, proteiinilla, tärkkelyksellä ja/tai ia 104405 amyloosilla.

8. Jonkin edellisen patenttivaatimuksen mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että tärkkelysjyväset päällystetään selluloosan, pektiinin, proteiinin, tärkkelyksen ja/tai 5 amyloosin ja jonkin farmasiassa käytetyn kalvopäällystysmateriaalin seoksella.

9. Jonkin edellisen patenttivaatimuksen mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että tärkkelysjyväset fraktioidaan eri kokoluokkia edustaviin fraktioihin ennen hydrolysointia.

10 Streptococcus, Pediococcus, Lactococcus, Leuconostoc, Corynebacterium, Enterococcus kuuluvilla bakteereilla, tai Bifidobacterium- sukuun kuuluvilla bakteereilla

10. Jonkin edellisen patenttivaatimuksen mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että tärkkelysjyväset hydrolysoidaan ja täytetään samanaikaisesti.

11. Jonkin edellisen patenttivaatimuksen mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että tärkkelysjyväset kylmäkuivataan hydrolysoinnin jälkeen ja/ tai täytön jälkeen. '

12. Jonkin edellisen patenttivaatimuksen mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että hydrolysoidut tärkkelysjyväset täytetään ja kylmäkuivataan ne samanaikaisesti tai täytön jälkeen. . 20

13. Jonkin edellisen patenttivaatimuksen mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että « elävien mikro-organismien annetaan kasvaa tärkkelysjyvästen sisään hydrolyyttisten I entsyymien läsnäollessa.

14. Jonkin edellisen patenttivaatimuksen mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että r : 25 tärkkelysjyväset ovat peräisin ohrasta, perunasta, vehnästä, kaurasta, herneestä, maissista, tapiokasta, sagosta, riisistä tai sentapaisesta mukula- tai viljakasvista, edullisesti perunasta, ^ ohrasta, vehnästä tai maissista.

15. Jonkin edellisen patenttivaatimuksen mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että ^ 30 tärkkelysjyväset ovat kooltaan 10 - 100 pm, edullisesti 50-100 pm suuruisia. i • i 104405

16. Jonkin edellisen patenttivaatimuksen mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että tärkkelysjyväset täytetään mikro-organismeilla, kuten bakteereilla, hiivoilla tai homeilla.

17. Patenttivaatimuksen 16 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että tärkkelysjyväset 5 täytetään maitohappobakteereilla, kuten sukuihin Lactobacillus, Streptococcus, Pediococcus, Lactococcus, Leuconostoc, Corynebacterium, Enterococcus kuuluvilla bakteereilla, tai Bifidobacterium- sukuun kuuluvilla bakteereilla

18. Patenttivaatimuksen 16 mukainen menetelmä, tunnettu siitä että mikro-organismit 10 ovat hiivoja ja kuuluvat sukuun Saccharomyces.

19. Jonkin patenttivaatimuksen 1-15 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että tärkkelysjyväset täytetään entsyymeillä.

20. Jonkin edellisen patenttivaatimuksen mukainen menetelmä, tunnettu siitä että tärkkelysjyväset päällystetään kiteyttämällä tai sumuttamalla tärkkelysliuos jyvästen pintaan.

21. Patenttivaatimuksen 20 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kiteytyksessä käytettävä tärkkelysliuos on 0,1 - 70 % tärkkelyksen suhteen. 20

22. Patenttivaatimuksen 20 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että sumutuksessa käytettävä tärkkelysliuos on 0,1 - 2 % tärkkelyksen suhteen.

23. Jonkin patenttivaatimuksen 1-20 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että 25 tärkkelysjyväset päällystetään sekoittamalla jyväset 0,1 - 70 % tärkkelysliuoksen kanssa, joka jäähdytettäessä muodostaa geelin jyvästen pintaan. «

24. Jonkin patenttivaatimuksen 1 - 20 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että tärkkelysjyväset päällystetään sekoittamalla jyväset tärkkelysliuoksen kanssa, joka etanolin 30 avulla saostettaessa muodostaa geelin jyvästen pintaan. i " 104405

25. Jonkin patenttivaatimuksen 1-19 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että tärkkelysjyvästen reiällinen pinta täytetään tärkkelyspartikkeleilla, jotka ovat kooltaan 1 -10 pm suuruisia. 5

26. Tärkkelyskapseli, tunnettu siitä, että se koostuu tärkkelysjyväsestä, joka on rakenteeltaan huokoinen hydrolysoinnin seurauksena ja täytetty mikro-organismeilla ja/tai j polypeptideillä tai proteiineilla.

27. Patenttivaatimuksen 26 mukainen tärkkelyskapseli, tunnettu siitä, että 10 tärkkelysjyvänen on hydrolysoitu entsymaattisesti.

28. Patenttivaatimuksen 26 tai 27 mukainen tärkkelyskapseli, tunnettu siitä, että tärkkelysjyvänen on hydrolysoitu a-amylaasilla, β-amylaasilla tai glukoamylaasilla.

29. Jonkin patenttivaatimuksen 26 - 28 mukainen tärkkelyskapseli, tunnettu siitä, että tärkkelysjyvänen on päällystetty biopolymeerillä.

30. Jonkin patenttivaatimuksen 26 - 29 mukainen tärkkelyskapseli, tunnettu siitä, että T tärkkelysjyvänen on päällystetty selluloosalla, pektiinillä, proteiinilla, tärkkelyksellä ja/tai T 20 amyloosilla. • * - ;_

31. Jonkin patenttivaatimuksen 26 - 30 mukainen tärkkelyskapseli, tunnettu siitä, että tärkkelysjyvänen on päällystetty selluloosan, pektiinin, proteiinin, tärkkelyksen ja/tai amyloosin ja jonkin farmasiassa käytetyn kalvopäällystysmateriaalin seoksella. 25

32. Jonkin patenttivaatimuksen 26-31 mukainen tärkkelyskapseli, tunnettu siitä, että tärkkelysjyvänen on peräisin ohrasta, perunasta, vehnästä, kaurasta, herneestä, maissista, ta-piokasta, sagosta, riisistä tai sentapaisesta mukula- tai viljakasvista, edullisesti perunasta, ohrasta, vehnästä tai maissista. * 9 30 104405

33. Jonkin patenttivaatimuksen 26 - 32 mukainen tärkkelyskapseli, tunnettu siitä, että tärkkelysjyvänen on kooltaan 10-100 pm suuruinen, edullisesti 50-100 pm.

34. Jonkin patenttivaatimuksen 26 - 33 mukainen tärkkelyskapseli, tunnettu siitä, että jyvänen on täytetty mikro-organismeilla, kuten bakteereilla, hiivoilla tai homeilla.

35. Patenttivaatimuksen 34 mukainen tärkkelyskapseli, tunnettu siitä, että tärkkelysjyvänen on täytetty maitohappobakteereilla, kuten sukuihin Lactobacillus,

36. Patenttivaatimuksen 34 mukainen tärkkelyskapseli, tunnettu siitä, että mikro-organismit ovat hiivoja ja kuuluvat sukuun Saccharomyces. 15

37. Jonkin patenttivaatimuksen 26 - 33 mukainen tärkkelyskapseli, tunnettu siitä, että jyvänen on täytetty entsyymeillä.

38. Jonkin patenttivaatimuksen 26 - 37 mukainen tärkkelyskapseli, tunnettu siitä, että 20 tärkkelyskapseli on päällystetty tärkkelysliuoksella, jonka pitoisuus on 0,1 - 70 % ; : tärkkelyksen suhteen.

| , 39. Jonkin patenttivaatimuksen 26 - 38 mukainen tärkkelyskapseli, tunnettu siitä, että ! tärkkelyskapseli on päällystetty tärkkelysliuoksella, jonka pitoisuus on 0,1 - 2 % 25 tärkkelyksen suhteen. 1 *5 Jonkin patenttivaatimuksen 26 - 37 mukainen tärkkelyskapseli, tunnettu siitä, että tärkkelysjyvästen reiällinen pinta on täytetty tärkkelyspartikkeleilla, jotka ovat kooltaan 1 -I 10 pm suuruisia. 30 104405