KR100833793B1 - 골수 유래 골 생성용 유핵 세포 분리 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 골수 유래 골 생성용 유핵 세포 분리 방법에 관한 것이다.

본 발명은 이를 위해 골수의 세척공정; 적혈구의 용혈공정; 골수용액의 중화공정; 유핵 세포의 정제공정 및 유핵 세포와 골 생성용 이식 용액과 혼합하는 공정;이 포함되어 구성된다.

상기와 같이 구성된 본 발명은 골 결손 치료 시 혹은 골 생성이 필요한 부위에 대해 골 생성을 목적으로 이식할 수 있는 골수 유래 골 생성용 유핵 세포를 빠르고 간편하게 분리할 수 있도록 한 것이며, 이는 결과적으로 시술 장소에서 간편하고 빠르게 골 생성용 유핵 세포를 분리하여 주입함으로 응급환자나 반복된 재수술 환자에게 골 생성을 이루는데 효과적이도록 한 것이다.

골수, 골 생성용 유핵 세포, 골 생성, 적혈구 용혈, 중화, 원심분리.

Description

골수 유래 골 생성용 유핵 세포 분리 방법{Separation method of nucleated cells derived from bone marrow for bone formation}

본 발명은 골수 유래 골 생성용 유핵 세포 분리 방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 골 결손 치료 시 혹은 골 생성이 필요한 부위에 대해 골 생성을 목적으로 이식할 수 있는 골수 유래 골 생성용 유핵 세포를 빠르고 간편하게 분리할 수 있도록 한 것이며, 이는 결과적으로 시술 장소에서 간편하고 빠르게 골 생성용 유핵 세포를 분리하여 주입함으로 응급환자나 반복된 재수술 환자에게 골 생성을 이루는데 효과적 이도록 한 것이다.

주지하다시피 WHO에 의하면 65세 이상의 노인인구의 50% 이상이 고질적인 골 질환에 고통받고 있으며 지난 10여 년간 골다공증을 원인으로 한 골절의 비율이 2배 이상 증가하였다. 50세 이상 여성인구의 거의 40% 이상에 해당된다. 미국의 경우 매년 약 560만 명이 골절상을 당하고, 이중 310만 명이 수술을 받는데 1995년 medical data international(MDI)의 통계에 따르면 약 426,000 예의 골 이식술이 시행되었다. 골 이식에 대한 비용은 전 세계적으로 매년 8억 달러 정도가 사용되고, 1995년 한해 동안 58% 정도가 자가 골 이식, 동종 골 이식은 34%, 합성물 이식은 8%가 시행되었다.

보통 단순 골절의 경우 몇 주간의 석고 고정으로도 충분한 치유가 이루어지지만 골절이 심한 경우나 골 결손이 있는 경우에는 골 이식술을 시행하였다. 그러나 자가 골이식(autograft)의 경우 채취 부위에 통증이 심하고, 회복기간도 오래 걸리며, 골 이식 공여부의 확보에 어려움이 따른다. 동종 골 이식(allograft)의 경우, 멸균에 따른 골 강도의 약화, 면역 거부반응, 흡수, 재 골절 등으로 하여 그 사용이 매우 제한적이며 간염이나 AIDS와 같은 감염의 가능성이 있다는 치명적인 단점을 가지고 있다. 따라서 이식은 Food & Drug Administration에서 감염에 대한 골 조직 은행에 규제를 강화한 이후인 1993년 후반부터는 그 사용이 감소 되고 있다.

또 다른 골 이식 방법으로 생물 활성이나 생물 비활성 세라믹으로 도포된 금속 등이 정형외과 수술에 지지체로 사용되나 금속의 부식, 세라믹-금속의 표면 마모, 뼈와 이식물 표면의 심한 fibrous tissue 형성 등의 문제점 등을 가지고 있어 금속을 골 이식제로 사용하는 데는 많은 어려움이 있다.

골 형성 인자에 대해서는 Urist와 Mclean(1952)의 골형성 단백의 골 형성에 대한 발표 후 여러 가지 인자들이 연구되고는 있지만, 그 생산 과정이 복잡하고 고가의 과정에 소량을 얻는 비효율성으로 인하여 일반 임상에의(삭제) 적용에는 한계가 있다.

골수 주입술(bone marrow injection)은 Huggins(1931), Friedenstein(1973), Ashton(1980)등이 골수 내의 골 생성 전구 세포(osteoprogenitor cell)가 골 형성을 유도하고 촉진한다고 한 주장에 근거를 둔다. 이는 주로 골절 치유를 위해 단독으로 주입되기도 하지만, 골 이식과 병행하여 주입되기도 한다. 다른 골 이식술과는 달리 공여 부위를 피부 절개를 통한 수술이 아니므로 공 여부의 문제점이 없고, 합병증이나 부작용이 없다는 것이 큰 장점이다.

그 후 많은 임상 적용의 발표를 통해 좋은 결과도 발표되고는 있지만, 많은 결과들이 일정하지 않고, 먼저 한 곳에서 뽑을 수 있는 골수의 양이 제한되어 있고 또한 골수에 포함된 골 생성 전구 세포의 수는 매우 제한되는 이론적 근거가 불명확한 단점이 있다.

그리하여 충분한 수의 골모 세포로 증폭 배양한 후, 골 생성 부위에 주입하는 새로운 골 생성 이식 방법이 매우 효과적인 방법으로 기존의 자가 골 이식이나 동종골 이식 및 골수 주입에 비해 많은 장점과 효과를 내포하고 있으나, 골모 세포 증식을 위한 3~4주간의 배양기간이 필요해 응급을 요하는 환자 또는 여러 차례의 재수술을 요구하는 환자의 경우 적용하기 어려운 문제점이 있다.

본 발명은 상기와 같은 종래 기술의 제반 문제점을 해소하기 위하여 안출한 것으로, 인플란트, 골 이식, 배양된 골모 세포 이식 등의 문제점을 개선하고자 함을 제1목적으로 한 것이고, 제2목적은 골 생성을 위해 골수를 소량 채취한 뒤 골 생성용 유핵 세포만을 분리하여 주입함으로써 임상적으로 거부반응이 없도록 한 것 이며, 제3목적은 시술 장소에서 간편하고 빠르게 골 생성용 유핵 세포를 분리하여 주입함으로 응급환자나 반복된 재수술 환자에게 효과적인 골 생성을 이루도록 한 것이고, 제4목적은 본 발명에 따라 채취된 골수의 유핵 세포를 분리하여 골 생성을 목적으로 하는 부위에 적용하면 빠르고 간편하게 준비하여 골 생성 유핵 세포를 주입하므로 효과적인 골 생성 유도가 가능하도록 한 것이며, 제5목적은 이로 인해 세포 분리 방법의 신뢰성을 대폭 향상시켜 소비자로 하여금 좋은 이미지를 심어줄 수 있도록 한 골수 유래 골 생성용 유핵 세포 분리 방법을 제공한다.

이러한 목적 달성을 위하여 본 발명은 골수의 세척공정; 적혈구의 용혈공정; 골수용액의 중화공정; 유핵 세포의 정제공정 및 유핵 세포와 골 생성용 이식 용액과 혼합하는 공정;이 포함됨을 특징으로 하는 골수 유래 골 생성용 유핵 세포 분리 방법을 제공한다.

이하에서는 이러한 목적 달성을 위한 본 발명의 바람직한 실시예를 보다 상세히 설명하면 다음과 같다.

본 발명에 적용된 골수 유래 골 생성용 유핵 세포 분리 방법은 다음과 같이 구성되는 것이다.

하기에서 본 발명을 설명함에 있어, 관련된 공지 기능 또는 구성에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우에는 그 상세한 설명은 생략할 것이다.

그리고 후술 되는 용어들은 본 발명에서의 기능을 고려하여 설정된 용어들로서 이는 생산자의 의도 또는 관례에 따라 달라질 수 있으므로 그 정의는 본 명세서 전반에 걸친 내용을 토대로 내려져야 할 것이다.

먼저, 본 발명은 골수의 세척공정; 적혈구의 용혈공정; 골수용액의 중화공정; 유핵 세포의 정제공정 및 유핵 세포와 골 생성용 이식 용액과 혼합하는 공정;이 구비되는 것으로 이의 보다 상세한 기술적 구성은 다음과 같다.

즉, 상기 골수의 세척공정은, 인체에서 기 분리된 2~5ml의 골수를 세척용액에 저장하는 단계와, 이후 상기 골수가 담긴 세척용액을 골수 내 불순물이나 지방성분이 충분히 제거될 정도로 흔들어주고 1,600rpm으로 4~5분간 원심 분리하는 단계와, 상기 원심분리 단계 이후 상층 용액을 제거한 뒤 바닥에 남은 골수 성분을 다른 세척용기에 옮긴 뒤 반복하여 골수가 담긴 세척용기를 다시 충분히 혼합될 때까지 흔들고 1,600rpm으로 4~5분간 원심 분리하는 단계와, 이후 상기 상층 용액을 제거하는 단계가 구비된다.

또한 상기 적혈구 용혈공정은 골수 양의 10배에 해당하는 적혈구 용혈용액(Lysis buffer)을 투입하는 단계 및 이후 상기 용액을 혼합시켜주기 위해 주사기를 이용하여 수회 혼합한 뒤 수십초(10~20초)간 정치하는 단계가 구비된다.

또한 상기 골수용액의 중화공정은, 적혈구 용혈공정 이후 중화용액을 골수량과 동일하게 첨가한 후 혼합하는 단계 및 상기 용액을 1,600rpm으로 4~5분간 원심 분리한 뒤 침전된 골 생성용 유핵 세포를 제외한 나머지 상층 용액을 제거하는 단계가 구비된다.

또한 본 발명에 적용된 상기 유핵 세포의 정제공정은, 골수용액의 중화공정 이후 용기에 골 생성용 이식용액을 4~5ml 첨가한 뒤 혼합하는 단계 및 이후 상기 용액을 1,600rpm으로 4~5분간 원심분리한 후 상층 용액을 제거하는 단계가 구비된다.

아울러 상기 유핵 세포와 골 생성용 이식 용액과 혼합하는 공정은, 유핵 세포의 정제공정 이후 골 생성용 이식용액을 병변의 크기를 고려하여 2~3ml 첨가한 후 주사기를 이용하여 용기 바닥면의 세포를 부유시키는 단계가 포함되어 구성된다.

상기 본 발명은 골 결손 치료 시 혹은 골 생성이 필요한 부위에 대해 골 생성을 목적으로 이식할 수 있는 골수 유래 골 생성용 유핵 세포를 시술장소에서 빠르고 간편하게 분리하는 방법의 실시 예는 다음과 같다.

(실시예)

먼저, 골수유래 골 생성용 유핵 세포 분리를 위한 구성 키트는 다음과 같이 준비한다.

1) 채취된 골수의 보관 및 세척용 용액(Washing solution) 2개

2) 적혈구 용혈 용액(Lysis buffer)

3) 중화 용액(neutralization buffer)

4) 골 생성용 이식용액(Maintence buffer)

5) 이식용 주사기

상기와 같이 구성된 구성물에 의해 본 발명 골수 유래 골 생성용 유핵 세포 분리 방법을 도출할 수 있게 된다. 먼저,

1) 인체에서 기 분리된 2~5ml의 골수를 세척용액(Washing solution)에 담는다. 이때 장 골능에서 채취하는 골수는 2~5ml 정도의 양이 순수 골수(hole bone marrow)이고, 그 이상으로 채취되는 것은 혈액(peripheral blood) 성분이다. 그러므로 골수 채취시 정량을 지켜 채취하는 것이 순수한 골수를 채취하는 효과적인 방법이다.

2) 세척용액에 골수가 담긴 용기를 골수 내 불순물이나 지방성분이 충분히 제거될 정도로 흔든 뒤 1,600rpm, 5분 원심 분리한다. 이때 원심분리기의 회전력(rpm)과 시간은 세포가 손상되지 않고 침전되는 최소 조건이다.

3) 상층 용액을 제거한 뒤 바닥에 남은 골수 성분을 2번 세척용액에 옮긴 뒤 반복하여 골수가 담긴 용기를 충분히 혼합될 때까지 흔든 뒤 1,600rpm, 5분 원심 분리한다.

4) 상층 용액을 제거한 뒤 골수 양의 10배에 해당하는 적혈구 용혈용액(Lysis buffer)을 넣는다. 골수의 10배에 해당하는 용혈용액은 저장액에서 적혈구를 삼투압을 이용하여 용혈 시키고 유핵 세포의 손상을 최소화하여 lysis 시키는 조건이다.

5) 주사기를 이용하여 수회 혼합해 준 뒤 적혈구 용혈반응을 완성 시키기 위해서 수십 초(10~20초)간 정치한다.

6) 중화용액을 골수 량과 동일하게 첨가한 후 조심스럽게 흔들어 잘 섞어준 다. 이때 중화용액은 10배 농축용액을 사용하였다.

7) 위 용액을 1,600rpm, 5분 원심 분리한 뒤 침전된 골 생성용 유핵 세포를 제외한 나머지 상층 용액을 제거한다.

8) 용기에 골 생성용 이식용액을 일정량 첨가한 뒤 수회 흔들어 준다.

9) 위 용액을 1,600rpm, 5분 원심분리 후 상층 용액을 제거한다.

10) 골 생성용 이식용액을 병변의 크기를 고려하여 일정량 첨가한 뒤 주사기 이용하여 용기의 바닥면의 세포를 부유시킨다.

삭제

상기와 같은 방법에 의해 인체에서 기 분리된 골수에서 골 생성용 유핵세포를 분리하여 골 생성을 목적으로 하는 부위에 주입함으로 임상적으로는 거부 반응이 없으며 골수 채취 후 단시간에 골 생성용 유핵 세포를 분리하여 이식함으로 효과적이고 빠르게 골 생성을 유도할 수 있게 된다.

한편 본 발명은 상기의 구성부를 적용함에 있어 다양하게 변형될 수 있고 여러 가지 형태를 취할 수 있다.

그리고 본 발명은 상기의 상세한 설명에서 언급되는 특별한 형태로 한정되는 것이 아닌 것으로 이해되어야 하며, 오히려 첨부된 청구범위에 의해 정의되는 본 발명의 정신과 범위 내에 있는 모든 변형물과 균등물 및 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.

상기에서 상세히 살펴본 바와 같이 본 발명은 인플란트, 골 이식, 배양된 골모 세포 이식 등의 문제점을 개선하고자 한 것으로, 특히 골 생성을 위해 골수를 소량 채취한 뒤 골 생성용 유핵 세포만을 분리하여 주입함으로써 임상적으로 거부반응이 없도록 한 것이다.

또한 시술 장소에서 간편하고 빠르게 골 생성용 유핵 세포를 분리하여 주입함으로 응급환자나 반복된 재수술 환자에게 효과적인 골 생성을 이루도록 한 것이다.

더하여 본 발명에 따라 채취된 골수의 유핵 세포를 분리하여 골 생성을 목적으로 하는 부위에 적용하면 빠르고 간편하게 준비하여 골 생성용 유핵 세포를 주입하므로 효과적인 골 생성 유도가 가능하도록 한 것이다.

본원발명은 결과적으로 세포 분리 방법의 신뢰성을 대폭 향상시켜 소비자로 하여금 좋은 이미지를 심어줄 수 있도록 한 매우 유용한 발명인 것이다.

Claims (5)

1. 삭제
2. 골수의 세척공정; 적혈구의 용혈공정; 골수용액의 중화공정; 유핵 세포의 정제공정 및 유핵 세포와 골 생성용 이식 용액과 혼합하는 공정;에 의해 골수 유래 골 생성용 유핵 세포를 분리하는 방법에 있어서,

   상기 적혈구 용혈공정은,

   인체에서 기 분리된 2~5ml의 골수를 세척용액에 저장하는 단계;

   이후 상기 골수가 담긴 세척용액을 골수 내 불순물이나 지방성분이 충분히 제거될 정도로 40~50회 흔들고 1,600rpm으로 4~5분간 원심 분리하는 단계;

   상기 원심분리 단계 이후 상층 용액을 제거한 뒤 바닥에 남은 골수 성분을 다른 세척용기에 옮긴 뒤 반복하여 골수가 담긴 세척용기를 다시 40~50회 흔들고 1,600rpm으로 4~5분간 원심 분리하는 단계;

   이후 상기 상층 용액을 제거한 뒤 골수 양의 10배에 해당하는 적혈구 용혈용액(Lysis buffer)을 투입하는 단계; 및

   이후 상기 용액을 혼합시켜주기 위해 주사기를 이용하여 수회 혼합한 뒤 수십초(10~20초)간 정치하는 단계;가 포함됨을 특징으로 하는 골수 유래 골 생성용 유핵 세포 분리 방법.
3. 제 2 청구항에 있어서,

   상기 골수용액의 중화공정은,

   적혈구 용혈공정 이후 중화용액을 골수량과 동일하게 첨가한 후 혼합하는 단계; 및

   상기 용액을 1,600rpm으로 4~5분간 원심 분리한 뒤 침전된 골 생성용 유핵 세포를 제외한 나머지 상층 용액을 제거하는 단계;가 포함됨을 특징으로 하는 골수 유래 골 생성용 유핵 세포 분리 방법.
4. 제 2 청구항에 있어서,

   상기 유핵 세포의 정제공정은,

   골수용액의 중화공정 이후 용기에 골 생성용 이식용액을 4~5ml 첨가한 뒤 혼합하는 단계; 및

   이후 상기 용액을 1,600rpm으로 4~5분간 원심분리한 후 상층 용액을 제거하는 단계;가 포함됨을 특징으로 하는 골수 유래 골 생성용 유핵 세포 분리 방법.
5. 제 2 청구항에 있어서,

   상기 유핵 세포와 골 생성용 이식 용액과 혼합하는 공정은,

   유핵 세포의 정제공정 이후 골 생성용 이식용액을 병변의 크기를 고려하여 2~3ml 첨가한 후 주사기를 이용하여 용기 바닥면의 세포를 부유시키는 단계;가 포함됨을 특징으로 하는 골수 유래 골 생성용 유핵 세포 분리 방법.