JP2009537215A - 骨形成用に骨髄由来の有核細胞を分離する方法 - Google Patents

Abstract

【課題】本発明は、骨形成用に骨髄由来の有核細胞を分離する方法に関する。
【解決手段】この方法は、骨髄の洗滌工程、骨髄中の赤血球の溶解(lysing)工程、骨髄溶
解産物(lysate)の中和工程、中和した骨髄から有核細胞を精製する工程、及び有核細胞を
骨形成用の保存緩衝液と混合する工程、からなる。本発明によれば、手術場所で迅速かつ
簡易な方法で骨形成用に有核細胞を分離し、分離した細胞を患者に注入することによって
、急患や繰り返しの手術を受けている患者に効果的な骨形成を達成できる。
【選択図】なし

Description

本発明は、骨形成用に骨髄由来の有核細胞を分離する方法に関するものであり、より詳細
には、骨欠損治療、又は骨形成が必要な部位(site)に対して移植することができる骨髄由
来の有核細胞を迅速かつ簡易な方法で分離できる方法に関する。本発明によれば、手術場
所で簡易かつ迅速な方法で骨形成用有核細胞を分離し、分離した有核細胞を患者に注入す
ることで急患や繰り返し手術を受けている患者の骨形成を効果的に達成できる。

世界保健機構（WHO）によれば、６５才以上の老人人口の５０％以上が慢性的な骨疾患に
苦しんでおり、骨粗鬆(多孔)症に起因した骨折の発生率が過去１０年間で倍増した。これ
らの数値は、５０才以上の女性人口の約４０％に該当する。米国の場合、毎年約５６０万
人が骨折傷を負い、このうち３１０万人が手術を受けている。ＭＤＩ（Medical Data Int
ernational）の統計によれば、約４２６，０００例の骨移植術が実施された。骨移植に対
する費用として、全世界的に毎年約８億米ドルが使用されていると推定される。１９９５
年の１年間には、自家骨移植（autografting）が５８％、同種骨移植（allografting）が
３４％、合成物(synthetic material)移植が８％の内訳の骨移植術が実施された。

通常、単純（閉鎖）骨折の場合、何週間かの石膏固定で充分な治癒が可能であるが、骨折
が激しい場合又は骨欠損がある場合は、骨移植術が実施される。しかし、自家骨移植は、
骨の採取部位に激しい痛みを引き起こし、長い回復期間を必要とし、骨移植のための骨を
提供する供与(donor)部位の確保に困難を伴う。同種骨移植は、滅菌による骨強度の弱化
、免疫拒否反応、吸収や再骨折に起因してその使用に大きな制約があり、かつ肝炎やエイ
ズ（AIDS）などの感染のおそれがあるという致命的な短所を有する。この理由により、移
植の利用は米連邦食品医薬品局(ＦＤＡ：Food & Drug Administration)が骨組織銀行に対
して感染についての規制を強化した以後である１９９３年後半からは減少している。

他の骨移植技術において、例えば、生物活性や生物非活性セラミックで塗布された金属が
整形外科手術において支持体として使用される。しかし、骨移植材料としての金属の使用
は、金属の腐食、セラミック―金属の表面摩耗、骨と移植片表面における激しい線維状組
織（fibrous tissue）の形成などの問題に起因する多くの困難が伴う。

骨形成因子に関しては、１９５２年に、アリスト（Urist）とマクリーン（Mclean）が骨
形態形成蛋白の骨形態形成を発表して以来、多様な因子が研究されている。しかしながら
、これらは、複雑で高価なプロセスを用いて少量生産されるので、非効率的であり、これ
らの因子は、一般的な臨床応用には限界がある。

骨髄注入術（bone marrow injection）は、ハギンス（Huggins）（1931）、フリーデンシ
ュタイン（Friedenstein）（1973）、アシュトン（Ashton）（1980）などの、骨髄内の骨
形成前駆細胞（osteoprogenitor cell）が骨形成を誘導して促進する、という報告に基づ
いている。この骨髄注入術は、主に骨折治癒のために単独で行われるか、骨移植と組み合
わせて行われる。他の骨移植術とは異なって、骨髄注入術は、供与部位(donor site)の皮
膚切開を伴わず、従って、供与部位に伴う問題がない。加えるに、これは合併症や副作用
を伴わない。

それ以来、骨髄注入術の臨床応用を通して良好な成果も報告されているが、成果の重要部
分は一定でない。また、成果の理論的根拠が不明確であり、一つの部位から採取されるこ
とができる骨髄の量が限られ、さらに骨髄に含まれた骨形態形成前駆細胞の数がかなり限
られる。

そこで、骨前駆細胞を充分な数の骨芽細胞に増幅し培養し、培養した細胞を骨形成部位に
注入することからなる骨形成のための新規な骨移植方法を使用することは非常に有用であ
る。この方法は、現在の自家骨移植、同種骨移植、及び骨髄注入術に比べて多くの長所及
び効果を有しているが、骨芽細胞増殖のために３〜４週間の培養期間が必要で、急患又は
繰り返して手術を必要とする患者に適用するのが困難であるという問題がある。

本発明は、従来技術に生じる上記の問題を解決するためになされたものであり、本発明の
第１の目的は、骨形成用に骨由来有核細胞を分離する方法を提供して、インプランテーシ
ョン、骨移植、培養した骨芽細胞の移植などの問題を改善することである。
本発明の第２の目的は、骨形成用に骨由来有核細胞を分離する方法を提供して、骨形成用
の少量の骨髄を採取し、骨髄から骨形成用の有核細胞のみを分離し、そして分離した細胞
を注入することによって、臨床的拒否反応を除去することである。
本発明の第３の目的は、骨形成用に骨由来有核細胞を分離する方法を提供して、
手術場所において迅速かつ簡易な方法で骨形成用の有核細胞を分離し、分離した細胞を患
者に注入することによって、急患又は繰り返しの手術を受けている患者に効果的な骨形成
を達成することである。
本発明の第４の目的は、骨形成用に骨由来有核細胞を分離する方法を提供して、
本発明に従って採取された骨髄から有核細胞を分離し、分離した細胞を骨形成部位に注入
することによって効果的な骨形成が誘導されるようにすることである。
加えるに、本発明の第５の目的は、骨形成用に骨由来有核細胞を分離する方法を提供して
、消費者が細胞分離に対して良いイメージをもつことができる程度に細胞分離の信頼性を
大幅に高めることである。

上記の目的を達成するために、本発明は、骨形成用に骨由来有核細胞を分離する方法を提
供する。この方法は、：骨髄の洗浄工程；骨髄内の赤血球細胞の溶解（lysing）工程；骨
髄溶解産物(lysate)の中和工程；中和した骨髄からの有核細胞の精製工程；有核細胞と骨
形成用の緩衝液との混合工程、からなる。

以下では、本発明の望ましい実施例をより詳しく説明する。

本発明に適用される骨形成用の骨髄由来の有核細胞の分離方法は、次のように構成される
。

以降の記載において、ここに組み入れられる公知機能又は構成についての詳細な説明が、
本発明の主題を不明瞭にするかもしれないときは、その詳細な説明は省略するであろう。

さらに、後述される用語は本発明の機能を考慮して規定されている。用語は、生産者の意
図又は慣例によって変わるかもしれないので、用語の意味は、明細書の全内容に基づいて
定義されるべきである。

本発明は、骨髄の洗浄工程；骨髄内の赤血球の溶解（lysing）工程；骨髄溶解産物(lysat
e)の中和工程；中和した骨髄からの有核細胞の精製工程；骨形成のための有核細胞と緩衝
液との混合工程、の各工程からなり、これらの技術的構成は、下記のとおりである。

骨髄の洗滌工程は、患者から２〜５mlの骨髄を採取し、採取した骨髄を洗滌溶液に仕込む
段階と、
骨髄洗滌溶液を骨髄内の不純物や脂肪成分が充分に除去される程度に振盪し、振盪した洗
浄液を１，６００rpmで４〜５分間、遠心分離する段階と、
上澄みを除去し、残った骨髄成分を他の洗滌容器に移し、骨髄を含む容器を充分に混合す
るまで振盪して、次いで、振盪した溶液を１，６００rpmで４〜５分間、遠心分離する段
階と、
遠心分離した溶液から上澄みを除去する段階と、からなる。

また、赤血球の溶解工程は、骨髄に１０倍量の溶解緩衝液(lysis buffer)を添加する段階
と、注射器を用いて溶解緩衝液を骨髄と数回混合し、次いで、数十秒(１０〜２０秒)溶液
を静置をする段階と、からなる。

また、骨髄溶液の中和工程は、骨髄溶液を同量の中和緩衝液と混合する段階と、前記溶液
を１，６００rpmで４〜５分間遠心分離し、次いで、沈殿した骨形成用有核細胞以外の上
澄みを除去する段階と、からなる。

さらに、有核細胞の精製工程は、４〜５mlの保存緩衝液を容器中の有核細胞と混合する段
階と、前記溶液を１，６００rpmで４〜５分間、遠心分離し、次いで、上澄みを除去する
段階と、からなる。

加えるに、有核細胞を保存緩衝液と混合する工程は、病変部を考慮して２〜３mlの保存緩
衝液を有核細胞に添加し、次いで、注射器を用いて容器の底の上の有核細胞を浮遊させる
段階と、有核細胞と保存緩衝液を注射器に入れ、次いで、注射器の内容物を骨欠損部位又
は骨形成が必要な部位に注入する段階と、からなる。

本発明に従い、骨欠損の治療又は骨形成が必要な部位に移植できるところの骨形成用の骨
髄由来の有核細胞は、手術場所で迅速かつ簡易な方法で分離できる。本発明に従う方法の
一実施例は下記のとおりである。

(実施例)

先ず、骨形成用の骨髄由来の有核細胞の分離用のキットを次の構成をもつように準備する
。

１)採取された骨髄の仕込及び洗滌用の二つの溶液

２)赤血球の溶解緩衝液(lysis buffer)

３)中和用緩衝液(neutralization buffer)

４)骨形成用保存緩衝液(maintence buffer)

５)移植用注射器

上記のキット構成を用いて、本発明の骨形成用に骨髄由来の有核細胞を分離する方法を下
記の方法で遂行することができる。

１)患者から２〜５mlの骨髄を採取して洗滌溶液に仕込む。腸骨稜(iliac crest)から骨髄
を採取する際に、純粋な骨髄の量は、約２〜５mであり、この量を超える採取物は周囲の
血液成分に相当する。よって、純粋な骨髄を採取するには骨髄を２〜５ｍｌ採取すること
が効果的である。

２)洗滌溶液中に骨髄を含む容器を振盪して、骨髄から不純物や脂肪成分を充分に除去し
、次いで、溶液を１，６００rpmで５分間、遠心分離する。遠心分離速度(rpm)と時間は細
胞が損傷されないで沈澱する最小の条件である。

３)上澄みを除去した後、容器の底に残った骨髄成分を第２の洗滌溶液に移し、骨髄を含
有する容器を振盪して、骨髄を第２の洗滌溶液と充分に混合し、次いで、溶液を１，６０
０rpmで５分間、遠心分離する。

４)上澄みを除去した後、残っている骨髄溶液に１０倍量の赤血球の溶解緩衝液を添加す
る。１０倍量の溶解緩衝液は、有核細胞の損傷を最小化しつつ浸透圧を利用して骨髄中の
赤血球を溶解する作用をする。

５)溶解緩衝液と骨髄溶液は注射器を利用して互いに数回混合される。次いで、赤血球の
溶解を達成するために数十秒(１０〜２０秒)の間そのまま静置する。

６)同量の中和用緩衝液を骨髄に添加し、次いで、慎重に振盪して中和緩衝液を骨髄と混
合する。ここで使用される中和緩衝液は１０倍濃縮緩衝液である。

７)この溶液を１，６００rpmで５分間、遠心分離し、沈澱した骨形成用有核細胞以外の上
澄みを除去する。

８)骨形成用の保存緩衝液を有核細胞を含有する容器に添加し、次いで、容器を数回振盪
する。

９)この溶液を１，６００rpmで５分間、遠心分離し、上澄みを除去する。

１０)病変の大きさを考慮して選ばれる量で、骨形成用の保存緩衝液を細胞に添加し、次
いで、容器の底の細胞を注射器を利用して浮遊させる。

１１)骨形成用の有核細胞と骨形成用の保存緩衝液を注射器に入れ、次いで、骨欠損部位
や骨形成が必要な部位に注入する。

前記の方法によって、骨形成用の有核細胞は、患者から採取した骨髄から分離され、骨形
成を必要とする部位に注入されるので、臨床的拒否反応は生じない。また、骨形成用有核
細胞は、骨髄の採取後に短時間で分離され、移植されるので、骨形成は、効果的かつ迅速
な方法で誘導できる。

本発明は、種々の改良や代替形態を許容できるが、特定の具体例が、実施例として説明さ
れている。本発明は、開示された特定の形態に限定されるべきであることを意図していな
い。それよりも、本発明は、添付の特許請求の範囲によって規定されたとおりの本発明の
精神と範囲内に収まっている全ての改良物、等価物、代替物をカバーする。

詳しく上記したとおり、本発明は、インプランテーション、骨移植、培養された骨芽細胞
の移植などに生じる諸問題を改善することを狙っている。特に、本発明によれば、骨形成
用に少量の骨髄を採取し、この骨髄から骨形成用の有核細胞のみを分離し、分離した細胞
を注入することによって、臨床的拒絶反応がなくなる。

また、本発明によれば、手術場所で迅速かつ簡易な方法で骨形成用有核細胞を分離し、分
離した細胞を患者に注入することによって、急患や繰り返しの手術を受けている患者に効
果的な骨形成を達成する。

加えるに、本発明によれば、本発明に従って採取された骨髄から有核細胞を分離し、分離
した細胞を骨形成部位に注入することによって、効果的な骨形成を誘導できる。

結果として、本発明によれば、消費者が細胞分離に対する良いイメージを持つことができ
る程度に細胞分離の信頼性を大いに高めることができる。

Claims (5)

1. 骨髄の洗滌工程、骨髄中の赤血球の溶解(lysing)工程、骨髄溶解産物(lysate)の中和工程
   、中和した骨髄から有核細胞を精製する工程、及び有核細胞を骨形成用の保存(maintenan
   ce)緩衝液と混合する工程、が含まれることを特徴とする骨形成用に骨由来の有核細胞を
   分離する方法。
2. 前記骨髄の洗滌工程は、
   患者から２〜５mlの骨髄を採取し、採取した骨髄を洗滌溶液に仕込む段階と、
   骨髄洗滌溶液を骨髄内の不純物や脂肪成分が充分に除去されるように４０〜５０回振盪し
   て、振盪した洗浄液を１，６００rpmで４〜５分間、遠心分離する段階と、
   上澄みを除去し、残った骨髄成分を他の洗滌容器に移し、骨髄を含む容器を４０〜５０回
   振盪して、次いで、振盪した溶液を１，６００rpmで４〜５分間、遠心分離する段階と、
   遠心分離した溶液から上澄みを除去する段階と、
   骨髄に１０倍量の溶解緩衝液(lysis buffer)を添加する段階と、及び
   注射器を用いて溶解緩衝液を骨髄と数回混合し、次いで数十秒(１０〜２０秒)溶液を静置
   をする段階と、
   が含まれることを特徴とする請求項１に記載の方法。
3. 前記骨髄溶液の中和工程は、
   骨髄溶液を同量の中和緩衝液と混合する段階と、
   前記溶液を１，６００rpmで４〜５分間、遠心分離し、次いで、沈殿した骨形成用有核細
   胞以外の上澄みを除去する段階と、
   が含まれることを特徴とする請求項１に記載の方法。
4. 前記有核細胞の精製工程は、
   ４〜５mlの保存緩衝液を容器中の有核細胞と混合する段階と、
   前記溶液を１，６００rpmで４〜５分間、遠心分離し、次いで上澄みを除去する段階と、
   が含まれることを特徴とする請求項１に記載の方法。
5. 前記有核細胞を保存緩衝液と混合する工程は、
   病変部を考慮して、２〜３mlの保存緩衝液を有核細胞に添加し、次いで、注射器を用いて
   容器の底の上の有核細胞を浮遊させる段階と、
   有核細胞と保存緩衝液を注射器に入れ、次いで、注射器の内容物を骨欠損部位又は骨形成
   が必要な部位に注入する段階と、
   が含まれることを特徴とする請求項１に記載の方法。