KR100826342B1 - Ｅｐｉ-ｈｎｅ 단백질의 현탁액, 그의 제조 방법,그로부터 유도된 건조 분말 에어로졸, 상기 현탁액 또는에어로졸을 함유하는 제약학적 조성물 및 그의 용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 EPI-hNE 단백질의 결정화 입자의 현탁액, 상기 현탁액의 제조 방법, 상기 현탁액으로부터의 건조 분말 에어로졸, 상기 현탁액 또는 상기 건조 분말 에어로졸을 포함하는 흡입가능한 제약학적 제제, 및 각종 병리학적 상태의 치료에서 상기 흡입가능한 제약학적 제제의 용도에 관한 것이다.
Description
본 발명은 EPI-hNE 단백질의 결정화 입자의 현탁액, 상기 현탁액의 제조 방법, 상기 현탁액으로부터 유도된 건조 분말 에어로졸, 상기 현탁액 또는 상기 건조 분말 에어로졸을 포함하는 흡입가능한 제약학적 제제, 및 각종 병리학적 상태의 치료에서 상기 흡입가능한 제약학적 제제의 용도에 관한 것이다.
국제 특허 출원 WO96/20278호 (Ley 등)는 인간 호중구 엘라스타제(hNE)를 억제하는 다수의 유전자 조작 신규 단백질을 기재하고 있다. 상기 특허 출원에서 나타난 바와 같이, 인간 호중구 엘라스타제(또한 인간 백혈구 엘라스타제라 공지됨)는 다형핵 백혈구의 아주르호성 과립의 주요 중성 프로테아제 중 하나이다. 이 효소는 병원균의 제거 및 연결 조직 재구성에 관련되어 있다.
hNE의 주요 전신 억제제는 이전에 α1 안티트립신이라 알려진 α-1-프로테아제 억제제이다. 다수의 병리학적 상황 (유전적 질병, 만성 기관지염, 기종, 낭성 섬유증)에서, 이러한 억제제는 혈류에 충분한 양으로 존재하지 않거나 불활성되어 hNE의 엘라스틴용해 활성을 조절할 수 없게 되고, 이것은 폐 조직의 과다한 파괴를 일으킨다.
따라서, WO96/20278호는 hNE의 안정하고 비독성의 고효능 억제제인 신규 단백질을 제안한다. 이러한 억제제는 염기성 췌장 트립신 억제제(BPTI)에서 발견되는 쿠니쯔(Kunitz)형 억제 도메인 또는 인간 유래 단백질, 즉 인간 인터-α-트립신 억제제(ITI)의 경쇄로부터 유래된 억제제 군의 일부를 형성한다. 이들은 특히 EPI-hNE-1, EPI-hNE-2, EPI-hNE-3 및 EPI-hNE-4이다. WO 96/20278호의 억제제는 생물공학적 방법에 의해 생성되고, 생물학적 쿠니쯔 도메인에 대해 변형된 DNA 서열을 포함한다. 이러한 사실은 위 억제제를 매우 강력하게 만든다. 이러한 억제제의 하나인 EPI-hNE-4가 특히 중요하다.
WO96/20278호는 hNE 억제제 EPI-hNE-1, EPI-hNE-2, EPI-hNE-3 및 EPI-hNE-4를 위한 피치아 파스토리스(Pichia pastoris) 생산 체계의 제조, 단백질의 생성 및 정제를 설명하고 있다 (특히 실시예 10 - 15 참조).
비작용성 히스티디놀 탈수소효소 유전자(his4)를 함유하는 효모 피치아 파스토리스 변이 균주 GS115는, 상류 유도성 피.파스토리스 aox1 유전자 프로모터와 하류 aox1 전사 종료 및 폴리아데닐화 서열의 제어하에 원하는 hNE 억제제의 아미노 말단에 직접 융합된 에스.세레비지애(S.cerevisiae) 교배 인자 알파 프리프로 펩티드를 암호화하는 서열을 포함한 발현 플라스미드에 의해 형질전환되었다. 발현 플라스미드를 SacI 소화에 의해 선형화하고, 스페로플라스트 형질전환에 의해 선형 DNA를 동종 재조합에 의해 피.파스토리스 균주 GS115의 게놈 내로 혼입하고,첨가된 히스티딘의 부재하에서의 생육에 대해 선택하고, 메탄올 이용 표현형, 분비 수준 및 유전자량 (서던 블롯트에 의해 판정됨)에 대해 선별하였다. 이렇게하여, aox1 유전자 자리 내에 탠덤 배열(tandom array)로서 통합된 대략 4개 카피의 발현 플라스미드를 갖는 것으로 추측되는 균주가 선택되었다.
선택된 균주의 배양액을 먼저 탄소원으로서 글리세롤을 사용하여 회분 방식으로 생육시킨 다음, 글리세롤을 소모시키고, 글리세롤-제한 공급 방식으로 생육시켜 세포량을 더욱 증가시키고 aox1 프로모터를 활성화시키고 마지막으로 메탄올-제한 공급 방식으로 생육시켰다. 마지막 단계 동안에, aox1 프로모터가 충분히 활성화되고 단백질이 배양 매질내로 분비된다.
이어서, EPI-hNE 단백질을 정제한다. 특정한 정제 절차는 각각의 단백질의 특정 성질에 따라 변한다. 간략하게, 배양 배지를 원심분리하고, 상층액을 미세여과하고 이어서 한외여과하고 임의로 정용여과(diafiltration)한 다음, 암모늄 설페이트 침전 및 이온 교환 크로마토그래피에 의해 단백질을 회수한다.
유럽 특허 출원번호 00203049.2호 및 그의 우선권 주장 서류인 국제 특허 출원 PCT/FR01/02699호 (본 출원인 회사에 의해 출원됨)는 상기 단백질의 발현을 위한 숙주 균주의 배양 배지로부터 제약으로 사용가능한 품질의 EPI-HNE 단백질을 정제하기 위한 개선된 방법을 기재하고 있으며, 이 방법은
-(a) 용출액을 회수하기 위하여 양이온 교환 흡착제의 유동층(expandable bed) 위로 배양 배지로부터 얻은 부분을 통과시키고,
-(b) 단백질의 소수성에 따라, 얻어지는 용출액에서 단백질을 분리시키고,
-(c) 얻어진 용출액을 양이온 교환 컬럼 위로 통과시키고,
-(d) 임의로, 얻어진 배지를 살균 조건하에서 여과하고,
-(e) 임의로, EPI-HNE 단백질을 회수하기 위해 얻어진 여액을 동결건조시키는 단계를 포함한다.
본 발명에 따른 현탁액을 제조하기 위하여, 단계(d)의 마지막에 수득되는 용액 또는 그로부터 얻어진 동결 건조 분말을 사용할 수 있고, 상기 현탁액은 본 발명에 따른 흡입가능한 제약학적 제제에 혼입될 수 있다.
EPI-hNE 단백질, 특히 EPI-hNE-4의 정제 방법을 개선시킨 본 출원인 회사는, 계속해서 정제된 EPI-hNE 단백질을 함유하는 제약학적 조성물을 개발하기 위해 상당한 연구와 노력을 기울였다.
사실상, 본 출원인 회사는, EPI-hNE-4의 용액을 함유하는 구강 흡입가능한 제약학적 조성물의 개발에 집중하여 왔다. 그러나, 제품 개발 과정에서, 일단 분무기 안에서의 EPI-hNE-4 용액은 불안정하고 침전되는 경향이 있어서 용액이 혼탁해지는 것을 발견하였다.
처음에 단백질의 침전된 형태는 치료적으로 불활성인 것으로 생각되었다. 그러나, 놀랍고도 뜻밖에, 침전된 형태가 EPI-HNE4의 결정화 형태이고 이러한 결정화가 단백질의 활성에 역효과를 미치지 않는다는 것을 알아내었다. 여기에서, 용어 "EPI-hNE4의 결정화 형태"란 막대형 구조 및 주로 10㎛ 미만의 입자 크기를 갖는 단백질의 불용성 형태임을 의미한다.
본 출원인 회사는, 단백질이 결정 형태로 있는 EPI-hNE 단백질의 현탁액을 개발하는 쪽으로 노력을 기울였다. 이 현탁액은 제약학적 조성물, 특히 흡입가능한 제약학적 제제내에 혼입될 수 있다.
놀랍게도, 특정한 농도 및 pH 조건하에 실온에서 안정한 현탁액을 제조할 수 있음을 알아내었고, 이에 의해 실온에서 안정한 현탁액을 함유한 제약학적 조성물을 제조할 수 있다. 이러한 실온 안정성은 통원 치료를 위해 특히 중요하다.
용액 대신에 EPI-hNE 단백질의 현탁액을 사용하게 되면, 활성 물질이 더욱 농축되어진 제제를 개발하여 단 시간내에 약물을 투여할 수 있기 때문에 흡입가능한 제약학적 조성물의 제조에 있어서 유리하다.
이것은 흡입가능한 약물의 투여에 있어서 중요한 인자이다. 왜냐하면 필요한 흡입 기간이 종종 길어질 수 있는데, 이것은 주된 제약 요인이 되어 환자 순응성을 불량하게 만들 수 있기 때문이다.
즉, 본 발명은, EPI-hNE 단백질이 대부분 1 내지 6㎛, 특히 3 내지 6㎛ (레이저 입자측정법(granulometry)에 의해 결정됨)의 입자 크기를 가진 결정성 입자의 형태로 존재하고, pH 3 내지 8, 바람직하게는 pH 4 내지 6, 가장 바람직하게는 pH 4.0 내지 5.0에서 수성 부형제 중 EPI-hNE 단백질의 현탁액 농도가 1 내지 80 mg/ml, 바람직하게는 2 내지 50 mg/ml, 가장 바람직하게는 치료 조건에 필요한 EPI-hNE의 양에 적절한 농도임을 특징으로 하는, EPI-hNE 단백질의 현탁액에 관한 것이다.
상기 현탁액은 실온에서 2개월 이상의 기간 동안 그의 생물학적 활성 및 입자 크기 분포의 측면에서 안정하다.
수성 부형제는 바람직하게는 등삼투압을 가진 염류 용액(saline solution)이다.
상기 염류 용액은 아세트산나트륨 및 염화나트륨 또는 시트르산나트륨을 포함할 수도 있다.
EPI-hNE 단백질은 EPI-hNE-1, EPI-hNE-2, EPI-hNE-3 및 EPI-hNE-4로 구성되는 군에서, 바람직하게는 EPI-hNE-3 또는 EPI-hNE-4에서 적절히 선택된다. 가장 바람직한 것은 EPI-hNE4이다.
상기 현탁액은 레이저 입자측정법으로 측정하였을 때 입자 크기가 3 내지 6㎛인 EPI-hNE-4 결정성 입자를 65% 이상 포함한다.
파리 LC-스타(Pari LC-Star) 분무기로 측정한 이 현탁액의 흡입된 양은 약 40 내지 50%이고, 이것은 흡입가능한 제약학적 제제를 위해 양호한 값이다.
EPI-hNE4 결정화 입자를 함유하는 분무 소적의 MMAD (중간 질량 공력 직경)는 충격 입자측정법(impactor granulometry)으로 측정하였을 때 약 2㎛이다. 이 MMAD값은 높은 호흡 비율과 폐 안으로의 효과적인 침투를 달성하기에 적합하다.
예를들어, 바람직하게는 pH를 3.5 내지 4.5로 조절한 후에 현탁액을 원심분리하고 상층액을 분리해내고 펠릿을 서서히 진공 건조시킨 다음 균질화하여 응집물로부터 입자를 개별화함으로써, 상기 현탁액으로부터 건조 분말을 만들 수 있다.이러한 조건 하에서, 대부분 1 내지 6㎛의 입자 크기 또는 직경(직접적 현미경검사에 의해 측정)을 가진 회전타원체형 입자가 수득된다. 건조 분말은 레이저 입자측정법에 의해 용액중에서 측정하였을 때 현탁액의 크기 분포와 거의 비슷한 크기 분포 를 갖는다.
또한, 건조 분말은 EPI-hNE 단백질의 용액 또는 EPI-hNE 단백질의 동결 건조 분말로부터 만들어 질 수도 있다.
본 발명은 또한, 직접적 현미경검사에 의해 측정하였을 때 대부분 1 내지 6㎛의 입자 크기 또는 직경을 갖고, 바람직하게는 입자의 75% 이상이 1 내지 3㎛의 입자 크기 또는 직경을 가지며, 레이저 입자측정법에 의해 측정하였을 때 대부분 1 내지 6㎛의 입자 크기 또는 직경을 갖고, 바람직하게는 입자의 60% 이상이 1 내지 3㎛의 입자 크기 또는 직경을 갖는, EPI-hNE-4의 회전타원체형 입자를 포함하는 건조 분말에 관한 것이다. 이 건조 분말은 앞에서 설명한 EPI-hNE 단백질의 현탁액에서 액체상으로부터 결정을 분리하고, 잔류수를 없애고, 수득된 무른 압축 케이크를 균질화하는 단계를 포함한 방법에 의해 적절히 얻을 수 있다.
또한, 본 발명은 레이저 입자측정법으로 측정하였을 때 입자의 90% 이상이 0.5 내지 4.0㎛의 입자 크기 또는 직경을 갖고 MMAD가 약 2.1㎛인, EPI-hNE-4의 회전타원체형 입자를 포함하는 건조 분말에 관한 것이다. 이러한 MMAD 값은, 분말이 적절한 추진 부형제에 분산될 때, 높은 호흡 비율과 폐 안으로의 효과적인 침투를 달성하기에 적합하다. 이러한 건조 분말은 EPI-hNE 단백질의 용액을 분무 건조하는 단계를 포함하는 방법에 의해 편리하게 수득될 수 있다.
본 발명은 또한, 적절한 추진 부형제 중의 상기 정의된 건조 분말을 포함하는 건조 분말 에어로졸 또는 상기 정의된 EPI-hNE-4 단백질의 현탁액을 포함하는 흡입가능한 제약학적 제제에 관한 것이다.
본 발명은 또한, EPI-hNE 단백질의 용액으로부터 또는 동결 건조된 분말로부터 출발하여, EPI-hNE 단백질의 현탁액을 제조하는 방법에 관한 것이다.
EPI-hNE 단백질의 용액으로부터 출발할 때, 현탁액을 제조하기 위한 적절한 방법은
(a) EPI-hNE 단백질의 결정화를 위하여, 용액의 pH를 3.5 내지 4.5의 값으로 조절하고,
(b) pH를 3.0 내지 8.0의 값으로 조절하는 단계를 포함한다.
상기 단계 (a) 및 (b)는 1 내지 40℃, 바람직하게는 4 내지 30℃의 온도에서 적절하게 수행될 수 있다.
동결 건조된 분말로부터 출발할 때, 현탁액의 적절한 제조 방법은
(a) 3.0 미만의 pH를 가진 완충액중에 EPI-hNE 단백질을 용해시키고,
(b) EPI-hNE 단백질의 결정화를 위하여 용액의 pH를 3.5 내지 4.5의 값으로 조절하고,
(c) pH를 3.0 내지 8.0의 값으로 조절하는 단계를 포함한다.
상기 단계 (a), (b) 및 (c)는 1 내지 40℃, 바람직하게는 4 내지 30℃의 온도에서 적절하게 수행될 수 있다.
본 발명은 EPI-hNE 단백질의 상기 현탁액, 그의 용액 또는 동결 건조된 분말로부터 출발하여 상기 정의된 건조 분말을 제조하는 방법에 관한 것이다.
EPI-hNE 단백질의 현탁액으로부터 출발할 때, 건조 분말을 제조하는 방법은, 상기 현탁액에서 예를들어 원심분리 또는 서브미크론 필터 상에서의 여과에 의해 액체 상으로부터 결정을 분리하고, 적절하게는 고체상 케이크의 과다한 압축을 일으키지 않는 방법, 예를들어 40℃ 미만의 온도 및 대기압보다 약간 낮은 압력에서의 약한 증발에 의해 잔류수를 없애고, 적절하게는 당 기술분야에 공지된 분쇄 기술, 예를들어 프리트쉬(Fritsch)로부터의 펄버리세트(Pulverisette)5를 사용하거나 프랑스 파리의 래보러토리 모던(Laboratoire Moderne)으로부터의 전기 분쇄 장치인 몰랭(Moulin) JK를 사용하여 수득된 고체 케이크를 균질화하여 응집된 입자들을 개별화하는 단계를 포함한다.
EPI-hNE 단백질의 용액으로부터 출발할 때, 건조 분말을 제조하기 위해 적절한 방법은
(a) EPI-hNE 단백질의 결정화가 가능하도록, 용액의 pH를 3.5 내지 4.5의 값으로 조절하고,
(b) 상기 현탁액에서, 예를들어 원심분리 또는 서브미크론 필터 상의 여과에 의해, 액체 상으로부터 결정을 분리하고,
(c) 적절하게는, 고체상 케이크의 과다한 압축을 일으키지 않는 방법을 사용하여, 바람직하게는 40℃ 미만의 온도 및 대기압보다 약간 낮은 압력에서 약한 증발에 의해 잔류수를 없애고,
(d) 적절하게는, 당 기술분야에 공지된 분쇄 기술에 의해, 수득된 고체 케이크를 균질화하여 응집된 입자들을 개별화시키는 단계를 포함한다.
상기 단계 (a) 및 (b)는 1 내지 40℃, 바람직하게는 4 내지 30℃의 온도에서 적절하게 수행될 수 있다.
EPI-hNE 단백질의 용액으로부터 출발할 때, 바람직한 방법은 이 용액의 분무-건조 단계를 포함한다. 이 단계의 파라미터는, 분말이 적절한 추진 부형제에 분산될 때 높은 호흡 비율 및 폐 안으로의 효과적인 침투가 달성되도록 하는 입자 크기 분포를 얻기 위해 편리하게 조절될 수 있다.
EPI-hNE 단백질의 동결 건조 분말로부터 출발할 때, 건조 분말의 제조를 위한 적절한 방법은
(a) 3.0 미만의 pH를 가진 완충액 내에서 EPI-hNE 단백질을 용해시키고
(b) EPI-hNE 단백질의 결정화가 가능하도록 용액의 pH를 3.5 내지 4.5의 값으로 조절하고,
(c) 상기 현탁액에서, 바람직하게는 원심분리 또는 서브미크론 필터 위에서의 여과에 의해, 액체상으로부터 결정을 분리하고,
(d) 적절하게는, 고체상 케이크의 과다한 압축을 일으키지 않는 방법을 사용하여, 바람직하게는 40℃ 미만의 온도 및 대기압보다 약간 낮은 압력에서 약한 증발에 의해 잔류수를 없애고,
(e) 적절하게는, 당 기술분야에 공지된 분쇄 기술에 의해, 수득된 고체 케이크를 균질화하여 응집된 입자들을 개별화시키는 단계를 포함한다.
상기 단계 (a) 및 (b)는 1 내지 40℃, 바람직하게는 4 내지 30℃의 온도에서 적절하게 수행될 수 있다.
또한, 본 발명은 hNE의 과다한 활성에 기인한 질병 상태를 치료하기 위한 약제의 제조에 있어서 EPI-hNE 단백질의 상기 현탁액 또는 건조 분말 에어로졸의 용 도에 관한 것이다.
질병 상태는 특히 호흡기 질환일 수도 있거나 또는 낭포성 섬유증, 폐기종, ARDS (급성 호흡 곤란 증후군) 및 COPD (만성 폐쇄성 폐 질환)로 구성된 군에서 선택될 수도 있다.
하기 실시예는 본 발명을 더욱 설명하기 위한 것이지만, 어떠한 방식으로도 본 발명을 제한하는 것으로 간주되지 않는다.
하기 설명은 도 1 내지 3B를 참고로 하여 더욱 잘 이해될 것이다.
도 1은 물의 존재하에 EPI-hNE-4 결정의 막대형 구조를 나타내는, EPI-HNE4 현탁액의 원심분리 후에 수득된 펠릿의 현미경사진이다.
도 2는 약 2.5㎛의 직경을 갖고 막대형 EPI-HNE4 결정 입자를 함유하는 분무 소적의 현미경사진이다.
도 3A 및 3B는 건조 형태에서 EPI-hNE4 입자의 회전타원체형 구조를 나타내는 건조 분말의 현미경사진이다.
실시예 1
EPI-HNE4의 정제
효모 생성 체계
높은 세포 밀도 피치아 파스토리스 균주 GS115 발효액의 배양 상층액에서 hNE 억제제를 분비된 단백질로서 생성하였다.
원하는 hNE 억제제를 암호화하는 합성 DNA의 5'-말단에, 사카로마이세스 세레비지애 교배 인자 α프리프로펩티드를 암호화하는 합성 DNA 서열을 직접적으로 결찰시킴으로써 발현 플라스미드를 구축하였다. 이러한 융합 유전자를, 에스.세레비지애 his4 유전자를 암호화하는 플라스미드 상에서 운반된 상류 유도성 피.파스토리스 aox1 유전자 프로모터와 하류 aox1 유전자 전사 종료 및 폴리아데닐화 서열 사이에 끼워넣었다.
스페로플라스트 형질전환에 의해 피.파스토리스 균주 GS115의 게놈 내에 동종 재조합에 의해 선형화된 발현-플라스미드 DNA를 혼입하였다. 첨가된 히스티딘의 부재하에서의 생육을 위해 재생된 스페로플라스트를 선택하였다. 각각의 단리물을 메탄올 이용 표현형 (mut+), 분비 수준 및 유전자 카피 수에 대해 선별하였다. 이렇게하여 다량의 EPI-HNE-4를 분비하는 균주 PEY-53을 선택하였다. aox1 유전자 자리 내에 통합된 4개 카피의 발현 플라스미드 DNA를 함유하는지에 대하여, 이러한 균주를 게놈 DNA의 서던 분석에 의해 평가하였다.
단백질 생성
정제된 산소 대신에 압축 공기를 사용하는 차이점 이외에는 WO 96/20278호에 기재된 절차와 유사한 혼합-공급 발효액에서 피.파스토리스 균주 PEY-53을 생육시켰다. 간단히 설명하면, 탄소원으로서 글리세롤을 사용하여 회분 방식으로 배양액을 먼저 생육시켰다. 글리세롤의 소모 후에, 배양액을 글리세롤-제한 공급 방식으로 약 4 시간동안 생육시켜 세포량을 더욱 증가시키고 aox1 프로모터를 활성화시켰다. 최종 생성 단계에서, 배양액을 메탄올-제한 공급 방식으로 생육시켰다. 이 단계 동안에, aox1 프로모터가 충분히 활성을 갖고 hNE 억제제가 조절 배지(C.M.)내로 분비되었다. PEY-53 발효액 C.M.에서 EPI-hNE4의 최종 농도는 SDS-PAGE 분석 및 RP-HPLC로 측정하였을 때 약 1000 mg/l 였다. PEY-53 배양액에 의해 생성된 주요 분자 종은 적절히 가공된 EPI-hNE-4 단백질이다. 그러나, 이러한 균주는 또한 약간 더 높은 분자량을 가진 단백질을 약 5 내지 20% 분비한다. 이것은 아마도 다르게 가공된 EPI-hNE-4 단백질이 있음을 나타내는 것이다. 바르게 가공된 EPI-hNE-4는 하기 기재된 바와 같이 이러한 오염물을 실질적으로 함유하지 않도록 정제될 수 있다.
실시예 1에 기재된 바와 같이 수득된 PEY-53 CM 100리터를 모으고, 다음과 같이 유동층 위로 통과시켰다: 10리터의 크로마토그래피 매트릭스 (아머샴-파마시아(Amersham-Pharmacia)의 스트림라인 SP(Streamline SP))을 50mM 아세트산암모늄 pH 3.5에서 평형화시키고, 300cm/h로 동일한 완충액에서 30리터까지 유동화시켰다. 로딩 후에, 컬럼을 10mM 아세트산암모늄 pH 3.5로 세척하여 280nm에서 0.05 미만의 흡광도를 수득하였다. 비이드를 10리터까지 채우고, 1M 아세트산암모늄 pH 4.5 완충액에서 컬럼을 세척함으로써 EPI-hNE-4를 회수하였다.
따라서, 약 100g의 EPI-hNE4를 함유하는 10리터 용액을 수득하였다 (280nm에서의 분광분석법, RP-HPLC, 쿠마시(Coomassie) 단백질 분석 및 생물학적 활성 분석으로 측정).
RP-HPLC (파마시아(Pharmacia)의 실리카 컬럼 리크로스피어(Licrosphere) 100RP/ 물 + 1% TFA 및 아세토니트릴 + 1% TFA의 구배)는, 다르게 가공된 형태가 바르게 가공된 형태로부터 분리되지 않았다는 것을 나타내었다. 녹색 오염물(green contaminant)에 의한 오염을 또한 검출할 수 있다.
용액을 더욱 정제하기 전에 22㎛ 필터(밀리포어로의 밀리팩(Millipack) 200) 위에서 멸균-여과하였다.
15리터 BPTG 컬럼(파마시아(Pharmacia))에서 페닐-세파로스 고속 유동 매트릭스(파마시아)을 사용하여, 바이오프로세스(BioProcess) (파마시아) 시스템에 상기 10리터 용액을 통과시킴으로써, 소수성 상호작용 크로마토그래피를 수행하였다. 사용된 완충액은 A: 아세트산나트륨 50mM pH 4.5 + 1M NaCl 및 B:아세트산나트륨 50mM pH 4.5였다. 용출을 100% B로 1단계로 수행하였으며, 유속은 300cm/h이었다.
용출액은 약 50g의 정제 EPI-hNE4를 함유하였다 (280nm에서의 분광분석법, 쿠마시 단백질 분석 및 생물학적 활성 분석으로 측정).
RP-HPLC는, 다르게 가공된 형태가 분리되지 않았음을 나타내었다. 녹색 안료는 검출되지 않았다.
이어서, 바이오프로세스 크로마토그래피 시스템(파마시아)을 사용하여 양이온 교환 크로마토그래피를 수행하였다. 사용된 매트릭스는 15리터 BPG200 컬럼(파마시아) 내에 있는 바이오래드(BioRad)의 마크로프레프 하이(Macroprep High) S 매트릭스 (술포네이트 표면 기를 보유한 가교 메타크릴레이트를 기재로 하는 경질 매트릭스)이었다. 사용된 완충액은 A: 아세트산암모늄 10mM pH3.5, B 아세트산나트륨 50mM pH6.2 및 C: 10 mM 중탄산암모늄 pH 7.8이었다. 완충액 B에서의 첫번째 용출을 사용하여 잘못가공된 형태를 분리하였다. 이어서, 300cm/h의 유속에서 100%B로 1단계에 의해 용출을 수행하였다.
용출액은 약 40g의 정제된 EPI-hNE4 (280nm에서의 분광분석법, 쿠마시 단백 질 분석 및 생물학적 활성 분석으로 측정)를 함유하였으며, 이는 약40%의 정제 공정의 전체 수율에 상응한다.
RP-HPLC는 1.5% 미만의 다르게 가공된 형태를 나타내었다. 녹색 안료는 검출되지 않았다.
용출액을 동결 건조하고 -20℃에서 보관하였다.
실시예 2
EPI-hNE4 제제의 제조
실시예 1에서 수득된 EPI-hNE4 동결 건조된 분말로부터 출발하여, 하기 기재된 방법을 사용하여 하기 EPI-HNE4 현탁액의 12개 회분을 제조하였다.
제형 10/4: pH 4.0의 아세트산나트륨 및 염화나트륨 용액 중의 10mg/l EPI-hNE4의 현탁액
제형 10/5: pH 5.0의 아세트산나트륨 및 염화나트륨 용액 중의 10mg/l EPI-hNE4의 현탁액
제형 5/4: pH 4.0의 아세트산나트륨 및 염화나트륨 용액 중의 5mg/l EPI-hNE4의 현탁액
제형 5/5: pH 5.0의 아세트산나트륨 및 염화나트륨 용액 중의 5mg/l EPI-hNE4의 현탁액
제형 2.5/4: pH 4.0의 아세트산나트륨 및 염화나트륨 용액 중의 2.5mg/l EPI-hNE4의 현탁액
제형 2.5/5: pH 5.0의 아세트산나트륨 및 염화나트륨 용액 중의 2.5mg/l EPI-hNE4의 현탁액
제형 20/4 (4℃): 4℃의 온도에서 제조된, pH 4.0의 아세트산나트륨 및 염화나트륨 용액 중의 20mg/l EPI-hNE4의 현탁액
제형 20/4 (30℃): 30℃의 온도에서 제조된, pH 4.0의 아세트산나트륨 및 염화나트륨 용액 중의 20mg/l EPI-hNE4의 현탁액
제형 30/4 (4℃): 4℃의 온도에서 제조된, pH 4.0의 아세트산나트륨 및 염화나트륨 용액 중의 30mg/l EPI-hNE4의 현탁액
제형 30/4 (30℃): 30℃의 온도에서 제조된, pH 4.0의 아세트산나트륨 및 염화나트륨 용액 중의 30mg/l EPI-hNE4의 현탁액
제형 50/4 (4℃): 4℃의 온도에서 제조된, pH 4.0의 아세트산나트륨 및 염화나트륨 용액 중의 50mg/l EPI-hNE4의 현탁액
제형 50/4 (30℃): 30℃의 온도에서 제조된, pH 4.0의 아세트산나트륨 및 염화나트륨 용액 중의 50mg/l EPI-hNE4의 현탁액
결정성 입자 EPI-HNE 단백질의 현탁액의 제조를 위한 일반적 방법
2.5, 5 및 10 mg/l EPI-hNE4의 현탁액의 제조
pH 3.0에서 EPI-hNE-4의 15mg/ml 용액을 다음과 같이 제조하였다: 분말 형태의 140mg의 EPI-hNE-4를 7ml의 10mM 아세트산나트륨 완충액 pH 3.0에 용해시켰다. 1M 염산(HCl)으로 pH를 2.0으로 만들었다. 용해 후에, 용액을 메디아캡(MediaKap) 5 필터 상에서 여과하고, 1M 수산화나트륨(NaOH)을 사용하여 pH를 pH 3.0으로 만들었다.
단백질 농도를 UV 분광광도법에 의해 검사하고, 용액을 15mg/ml의 농도까지 10mM 아세트산나트륨으로 희석하였다.
10mM 아세트산나트륨, 2.4% 염화나트륨 pH12의 1/2 부피를 첨가하여, 10mg/ml EPI-hNE-4, pH 4.0의 용액을 수득하였다. 필요에 따라, 1M HCl 또는 1M 수산화나트륨으로 pH를 4±0.1로 조절할 수 있다.
용액을 유리 용기로 옮기고, 실온에서 밤새 결정화시켰다.
50㎕의 샘플을 원심분리하고, 위상차 현미경 분석을 위해 펠릿을 취하였다.
도 1은 EPI-hNE-4 결정의 막대형 구조를 나타내는 펠릿의 현미경사진이다.
현탁액을 균질화한 다음, 1/2 부피를 다른 유리 용기에 옮기고 1M NaOH를 사용하여 pH 5.0으로 만들었다. 이 시점에서, pH 4.0 및 5.0의 현탁액을 필요에 따라 반복적으로 희석하여 5mg/ml 및 2.5mg/ml의 농도를 수득하였다.
20, 30 및 50mg/l EPI-HNE4의 현탁액의 제조
각각 EPI-hNE4의 30, 45 및 75 mg/l 용액으로부터 출발하여, 제형 20/4 (4℃), 20/4 (30℃), 30/4 (4℃), 30/4 (30℃), 50/4 (4℃) 및 50/4 (30℃)을 실질적으로 상기 기재된 바와 같이 제조하였으며, 모든 단계들은 4℃의 온도 또는 30℃의 온도에서 수행하고, 용액을 72시간동안 결정화를 위해 방치하였다. 2개의 온도 사이에서 결정화 속도에서의 상당한 차이는 관찰되지 않았다.
실시예 3
레이저 입자측정법에 의한 EPI-HNE4 현탁액의 분석
실시예 2에서 제조된 현탁액에서 EPI-HNE4 입자의 입도를 코울터 멀티사이저(Coulter Multisizer) II 상에서 분석하였다. 일부 결과를 하기 표 1에 나타낸다.
| [EPI-HNE-4] mg/ml | pH | 3 내지 6㎛의 입자 크기 또는 직경을 가진 입자의 퍼센트 |
| 10 | 4.0 | 67.25 |
| 10 | 5.0 | 65.65 |
| 5 | 4.0 | 69.27 |
| 5 | 5.0 | 68.55 |
| 2.5 | 4.0 | 71.13 |
| 20 (4℃) | 4.0 | 87.3 |
| 20 (30℃) | 4.0 | 84.2 |
| 30 (4℃) | 4.0 | 85.1 |
| 30 (30℃) | 4.0 | 89.0 |
| 50 (4℃) | 4.0 | 85.6 |
| 50 (30℃) | 4.0 | 87.8 |
상기 표는, 각각의 현탁액에서 65% 이상의 입자가 3 내지 6㎛의 직경을 갖고 있음을 나타낸다.
실시예 4
EPI-hNE4 현탁액의 생물학적 활성의 측정 방법
비색 시험을 사용하여 인간 호중구 엘라스타제의 억제 수준을 측정함으로써 EPI-hNE-4 현탁액의 생물학적 활성을 확인하였다.
인간 엘라스타제는 합성 기질 N-메톡시숙시닐-ala-ala-pro-val-p-니트로아닐리드를 가수분해한다.
가수분해 동안에, 생성물 p-니트로아닐리드 (황색)이 방출된다. 따라서 EPI-hNE-4의 생물학적 활성은 p-니트로아닐리드의 방출이 감소되는 것을 추적하여 인간 엘라스타제의 억제 수준으로 계산하였다.
희석 용액으로서 트리스 100mM, NaCl 50mM, 트리톤 X100 0.25%, BSA 0.1%, pH 8.0을 사용하여 EPI-hNE-4의 현탁액의 여러 희석액을 제조하였다. UV 분광광도법에 의해 특정한 단백질 농도를 나타낸다. 100㎕의 희석된 100nM EPI-hNE-4를 5ml 시험관에 첨가하였다. 동일한 완충액 중의 100nM hNE 100㎕를 첨가하고, 희석된 샘플을 실온에서 15분동안 배양하였다 (교반은 필요하지 않았다). 100㎕의 4.2mM 기질 (상기 기재된 바와 같음)을 첨가하고, 혼합물을 37℃에서 15분간 배양하였다. 50㎕의 빙초산을 첨가함으로써 반응을 정지시켰다. 완충액 단독 및 대조군으로서 EPI-hNE-4 샘플을 갖지 않은 hNE를 사용하여 410nm 파장에서의 흡광도를 측정하였다.
실시예 5
EPI-hNE4 현탁액의 안정성
pH 5.0에서 2.5, 5 및 10mg/ml의 EPI-hNE-4 농도를 가진 3개 현탁액 및 pH 4.0에서 20, 30 및 50mg/ml의 EPI-hNE-4 농도를 가진 3개 현탁액의 EPI-hNE4의 크기 분포 및 억제 활성을 2개월간 분석하여, 그들의 안정성을 입증하였다.
실시예 2에 기재된 방법에 따라 현탁액을 제조하였다. pH 4.0 및 4℃에서 2.5, 5 및 10mg/ml의 EPI-hNE-4 농도를 가진 3개 현탁액 및 pH 4.0에서 20, 30 및 50mg/ml의 EPI-hNE-4 농도를 가진 3개 현탁액에 대하여, 각각의 현탁액의 3개 바이알을 실온에서 2개월간 보관하였다.
상기 실시예 4에 기재된 것과 같이 비색 인간 호중구 엘라스타제 억제 분석을 사용하여, 2개월 기간의 처음과 마지막에서 현탁액의 생물학적 활성을 측정하였다. 2개월 기간의 처음과 마지막 사이에 현저한 차이는 발견되지 않았다.
2-개월 기간의 처음과 마지막에서 코울터 멀티사이저 II를 사용하여 레이저 입자측정법에 의해 입자의 크기 분포를 측정하였다. 실온에서 2개월 보관 기간 후에, EPI-HNE4 10mg/ml, pH 5.0의 현탁액의 크기 분포에서 현저한 변화는 존재하지 않았다.
pH 5.0에서 EPI-hNE-4 농도 10mg/ml를 가진 현탁액의 EPI-HNE4의 크기 분포 및 억제 활성은, 실온에서 10개월 보관 후에 현저한 변화를 나타내지 않았다.
실시예 6
EPI-HNE4 현탁액의 분무. 분무 소적의 크기 분포 분석 및 현미경 관찰
실시예 2에서 제조된 현탁액을 파리 LC-스타 제트 분무기에서 분무하였다.
당 기술분야에 공지된 절차에 따라 측정된 흡입가능한 양은 약 40 내지 50%이었고, 이는 흡입가능한 제약학적 제제를 위해 양호한 값이다.
분무 입자 크기 분포를 코울터 멀티사이저 II 상에서 레이저 입도분석계에 의해 분석하였다. MMAD는 3 내지 4㎛이었다.
당 기술분야에 공지된 절차에 따라서, 8.0㎛, 6.0㎛, 4.0㎛, 3.0㎛, 2.0㎛, 1.5㎛, 1.0㎛, 0.75㎛, 0.5㎛ 및 0.25㎛의 연속 필터 상에서 충격 입자측정법에 의해 분무 입자 크기 분포를 분석하였다. 시험된 각각의 현탁액에 대하여, 약 2㎛의 MMAD가 관찰되었다.
도 2는 약 2.5㎛의 직경을 갖고 막대 형태 EPI-hNE4 결정성 입자를 함유하는 분무 소적의 현미경사진이다.
실시예 7
건조 분말의 제조, 현미경 관찰 및 생물학적 활성 측정에 의한 상기 분말의 분석
pH 3.0인 EPI-hNE-4의 15mg/ml 용액을 다음과 같이 제조하였다: 분말 형태의 140mg의 EPI-hNE-4를 7ml의 10mM 아세트산나트륨 완충액 pH 3.0중에 용해시켰다. 1M 염산(HCl)으로 pH를 2.0으로 만들었다. 용해 후에, 용액을 메디아캡(MediaKap) 5 필터 위에서 여과하고, 1M 수산화나트륨(NaOH)을 사용하여 pH를 pH 3.0으로 만들었다.
UV 분광광도법에 의해 단백질 농도를 검사하고, 10mM 아세트산나트륨으로 용액을 15mg/ml 농도까지 희석하였다.
10mM 아세트산나트륨, 2.4% 염화나트륨 pH 12의 1/2 부피를 첨가하여, 10mg/ml EPI-hNE-4 용액, pH 4.0을 수득하였다. 필요에 따라서, 1M HCl 또는 1M 수산화나트륨으로 pH를 4±0.1로 조절할 수도 있다.
용액을 유리 용기에 옮기고, 실온에서 72시간동안 결정화를 위해 방치하였다.
0.22㎛ 필터 상에서 현탁액을 여과하였다. 필터를 회수하고, 블루 실리카겔을 함유하는 데시케이터(물을 서서히 증발시킬 수 있는 시스템)에서 밤새 건조시켰다. 필터로부터 무른 압축 분말을 회수하였다. 모르타르를 사용하여 간단한 수동 기계적 균질화를 수행하였으며, 이에 의해 매우 미세하고 시각적으로 균일한 분말이 수득되었다.
이 분말을 토마스(Thomas) 플레이트 상에서 직접적 현미경에 의해 관찰하였다. 도 3A는 분말의 현미경사진이고, 건조 형태의 EPI-HNE4의 불규칙한 회전타원 형 구조를 나타내며, 각각의 입자의 대부분은 1 내지 6㎛의 직경 또는 입자 크기를 갖는다. 현미경사진에서 어두운 부분은 아마도 개개의 입자들이 겹쳐지거나 수동으로 불충분하게 균질화된 샘플의 응집물이 남아있음을 나타낸다.
직접적 현미경검사 토마스 플레이트 현미경사진 위에서 측정된 개개 입자들의 직경 (회전타원체형 입자의 가장 큰 직경과 가장 작은 직경의 평균)을 통계적으로 분석하면, 입자의 대부분(80% 이상)이 1 내지 6㎛의 직경 (또는 입자 크기)를 갖고, 입자의 적어도 75%가 1 내지 3㎛의 직경 (또는 입자 크기)를 갖고 있음을 나타낸다. 중간 직경 (또는 입자 크기)은 약 2.1㎛이고, 평균 직경(또는 입자 크기)은 2.33± 0.18㎛이다.
1% NaCl 용액에 분말을 분산시키고, 코울터 멀티사이저 II 위에서 레이저 입자측정법에 의해 분석하였다. 레이저 입자측정법 데이타의 완전 통계 분석은 실시예 3에서 수득된 것과 매우 유사한 입자 크기 분포를 나타내었으며, 입자의 65% 이상이 1 내지 6㎛의 직경(또는 입자 크기)을 가졌다.
실시예 2에 기재된 것과 매우 유사한 절차에 의해, 이 분말로부터 pH 5.0의 10mg/ml EPI-hNE4의 현탁액을 제조하였다. 상기 실시예 4에 기재된 비색 인간 호중구 엘라스타제 억제 분석을 사용하여 현탁액의 생물학적 활성을 측정하였다. 이러한 생물학적 활성은 실시예 5에서 pH 5.0에서의 10mg/ml EPI-hNE4의 현탁액에 대해 결정된 활성과 현저하게 상이하지 않았다.
실시예 8
건조 분말의 제조 및 레이저 입자측정법에 의한 그의 분석
앞서 EPI-hNE-4의 회분을 제조하는 동안에 수득되어진 2리터의 현탁액으로부터 건조 분말을 제조하였다.
10000g에서 30분동안 현탁액을 원심분리하였다. 상층액을 버리고, 얻어진 펠릿을 100ml의 10mM 중탄산암모늄 완충액에서 균질화하였다. 현탁액을 0.22㎛ 필터 위에서 여과하였다. 필터를 회수하고, 블루 실리카겔을 함유하는 데시케이터(물을 서서히 증발시킬 수 있는 시스템)에서 밤새 건조시켰다. 4g의 무른 압축 분말을 필터에서 회수하였다. 프랑스 파리의 래보러토리 모던의 전기 분쇄 장치인 몰랭(Moulin) JK를 사용하여 균질화를 수행하였으며, 이에 의해 매우 미세하고 시각적으로 균질한 분말을 수득하였다.
말번(Malvern) 장치 (영국 말번의 말번 마스터사이저(Malvern Mastersizer) 2000, 건조 샘플러<쉬로코(Scirocco 2000> 장착됨) 상에서 이 분말의 입자측정법을 분석하였다.
결과는, 대부분의 입자 (80% 이상)가 1 내지 6㎛의 직경(또는 입자 크기)을 갖고, 입자의 적어도 60%가 1 내지 3㎛의 직경(또는 입자 크기)을 가짐을 나타내었다. 중간 직경(또는 입자 크기)은 약 2.66㎛이었다.
실시예 9
분무-건조에 의한 건조 분말의 제조 및 레이저 입자측정법 및 생물학적 검사에 의한 분석
분말 형태 또는 결정 형태의 1g의 EPI-hNE4 (실시예 8 참조)를 1% 염산 pH 2.5를 함유하는 물에 용해시켰다. 하기 조건하에서 미니-스프레이 건조기 부쉬( Buchi) B191.A를 사용하여 이 용액을 분무-건조(미립화)하였다:
- 분무기의 내부 직경: 0.7mm
- 분무 유속: 3.4 g/l
- 공기 압력: 600 l/h
- 건조 공기 유속: 35 m3/h
- 건조 공기 유입 온도: 120℃
- 건조 공기 배출 온도: 74 ∼ 75℃
토마스 플레이트 상에서 직접적 현미경검사에 의해 분말을 관찰하였다. 도 3B는 건조 형태의 EPI-HNE4의 불규칙한 회전타원체형 구조를 나타내는 분말의 현미경사진이며, 대부분의 개개 입자들이 1 내지 3㎛의 직경 또는 입자 크기를 갖는다. 도 3A에 비해 어두운 부분이 없다는 것은 분말의 양호한 균일성을 나타낸다.
건조 샘플러 쉬로코 2000이 장착된 말번 멀티사이저 2000을 사용하여, 레이저 입자측정법에 의해 분말 입자의 크기 분포를 분석하였다.
결과는, 입자의 90%가 0.5 내지 4.0㎛의 직경 또는 입자 크기를 갖고, 입자의 75%가 0.5 내지 2.8㎛의 직경 또는 입자 크기를 갖고, 입자의 60%가 0.5 내지 2.2㎛의 직경 또는 입자 크기를 가지며, MMAD가 2.16㎛임을 나타내었다.
실시예 4에서 기재된 바와 같이 분말의 특정한 생물학적 활성을 측정하여 단백질이 충분한 활성을 가짐을 알 수 있었다.
Claims (19)
- EPI-hNE-4가 레이저 입자측정법으로 측정하였을 때 65% 내지 100%가 1 내지 6㎛의 직경 또는 입자 크기를 갖는 결정성 입자의 형태로 존재하고, pH 3 내지 8에서 수성 부형제 중의 EPI-hNE-4의 현탁액 농도가 1 내지 80 mg/ml임을 특징으로 하는, EPI-hNE-4의 현탁액.
- 제1항에 있어서, 상기 수성 부형제가 등삼투압을 갖는 염류 용액인 현탁액.
- 제2항에 있어서, 상기 염류 용액이 아세트산나트륨 및 염화나트륨을 포함하는 것인 현탁액.
- 삭제
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, EPI-hNE-4 결정성 입자의 65% 내지 100%가 레이저 입자측정법으로 측정하였을 때 3 내지 6㎛의 입자 크기 또는 직경을 갖는 것인 현탁액.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 분무 후에, 충격 입자측정법으로 측정하였을 때 2㎛의 MMAD를 갖는 EPI-HNE-4 결정화 입자를 함유하는 분무 소적을 제공하는 현탁액.
- 직접적 현미경검사로 측정하였을 때 입자의 75% 내지 100%가 1 내지 3㎛의 직경 또는 입자 크기를 갖는, EPI-hNE-4의 회전타원체형 입자를 포함하는 건조 분말.
- 레이저 입자측정법으로 측정하였을 때 입자의 60% 내지 100%가 1 내지 3㎛의 직경 또는 입자 크기를 갖는, EPI-hNE-4의 회전타원체형 입자를 포함하는 건조 분말.
- 레이저 입자측정법으로 측정하였을 때 입자의 90% 내지 100%가 0.5 내지 4.0㎛의 직경 또는 입자 크기를 갖고 MMAD가 2.1㎛인, EPI-hNE-4의 회전타원체형 입자를 포함하는 건조 분말.
- 적절한 추진 부형제 중의 제7항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 건조 분말을 포함하는 건조 분말 에어로졸 또는 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 EPI-hNE-4의 현탁액을 포함하는, 흡입가능한 제약학적 제제.
- EPI-hNE-4를 함유하는 용액으로부터 출발하여,(a) 용액의 pH를 3.5 내지 4.5의 값으로 조절하여 EPI-hNE-4가 결정화되도록 하고,(b) pH를 3.0 내지 8.0의 값으로 조절하는 단계를 포함하는, 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 EPI-hNE-4의 현탁액의 제조 방법.
- EPI-hNE-4의 동결 건조 분말로부터 출발하여,(a) 3.0 미만의 pH를 가진 완충액 중에 EPI-hNE-4를 용해시키고,(a) 용액의 pH를 3.5 내지 4.5의 값으로 조절하여 EPI-hNE-4가 결정화되도록 하고,(b) pH를 3.0 내지 8.0의 값으로 조절하는 단계를 포함하는, 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 EPI-hNE-4의 현탁액의 제조 방법.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 현탁액에서 액체상으로부터 결정을 분리하고, 잔류수를 없애고, 수득된 무른 압축 케이크를 균질화하는 단계를 포함하는, 제7항 또는 제8항에 정의된 건조 분말의 제조 방법.
- EPI-hNE-4의 용액을 분무-건조하는 단계를 포함하는, 제9항에 정의된 건조 분말의 제조 방법.
- 제10항에 있어서, hNE의 과다 활성에 기인한 질병 상태를 치료하기 위한 흡입가능한 제약학적 제제.
- 제15항에 있어서, 상기 질병 상태가 호흡기 질환 또는 낭포성 섬유증, 폐기종, ARDS (급성 호흡 곤란 증후군) 및 COPD (만성 폐쇄성 폐 질환)로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 흡입가능한 제약학적 제제.
- 제1항에 있어서, pH 4 내지 6에서 수성 부형제 중의 EPI-hNE-4의 현탁액 농도가 1 내지 80 mg/ml임을 특징으로 하는, EPI-hNE-4의 현탁액.
- 제17항에 있어서, pH 4.0 내지 5.0에서 수성 부형제 중의 EPI-hNE-4의 현탁액 농도가 1 내지 80 mg/ml임을 특징으로 하는, EPI-hNE-4의 현탁액.
- 제1항에 있어서, pH 3 내지 8에서 수성 부형제 중의 EPI-hNE-4의 현탁액 농도가 2 내지 50 mg/ml임을 특징으로 하는, EPI-hNE-4의 현탁액.
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