KR100794458B1 - ｐ23을 이용한 세포사멸 억제와 형질전환 동물의 제조 - Google Patents

ｐ23을 이용한 세포사멸 억제와 형질전환 동물의 제조 Download PDF

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Abstract

본 발명은 p23 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산을 포함하는 세포사멸을 억제하기 위한 조성물 및 p23을 과발현시켜 세포사멸을 억제시키는 방법에 관한 것이다. 또한, p23 단백질이 과발현되는 형질전환 동물 및 상기 형질전환 동물의 제조 방법에 관한 것이다. 또한 본 발명은 p23을 과발현하고 종양이 형성된 동물 또는 세포를 이용하여 항종양제를 탐색하는 방법에 관한 것이다.
p23, 세포사멸, 항암제

Description

ｐ23을 이용한 세포사멸 억제와 형질전환 동물의 제조{Inhibition of apoptosis and preparation of transgenic-animal using p23}
도 1a는 p23의 cDNA를 클로닝하여 제작된 재조합 발현 벡터를 나타낸다.
도 1b는 p23 형질전환 마우스의 게놈 DNA를 이용하여 RT-PCR을 실시한 결과이다.
도 2a는 p23 형질전환 마우스의 각 조직에서 발현된 p23 단백질을 웨스턴 블랏으로 확인한 결과이다.
도 2b는 형질전환 마우스의 조직에서 p23 유전자의 발현을 RT-PCR로 살펴본 결과이다.
도 3a는 p23 형질전환 마우스에서 암이 발생하였음을 나타내는 사진이다; (1), (3) 및 (5)는 간, (2)는 자궁, (4)는 미분화 간암세포, (6)은 간의 전이육종
도 3b는 p23 형질전환 마우스 라인의 pedigree을 보여준다.
도 4는 누드마우스에 대조군과 p23 형질전환 간암세포를 피하이식한 뒤, 시간의 지남에 부양부피, 종양무게, 종양크기를 나타낸 결과이다; (1)은 종양부피를 비교한 그래프, (2)는 종양무게를 비교한 그래프, (3)는 종양크기를 비교한 사진.
도 5는 세포사멸 유도물질인 H2O2를 처리한 후 FACS, MTT assay 및 웨스턴 블랏을 실시한 결과이다; a는 FACS 결과, b는 MTT assay, c는 웨스턴 블랏 결과, d는 ROS의 양을 측정 결과.
도 6은 p23 과발현 세포에서 세포 사멸 및 증식에 관련된 단백질 또는 인자의 세포내 수준을 확인한 결과이다; a는 세포 사멸 및 노화관련 단백질인 Bcl-2의 증가, b는 Rb의 증가를 나타낸 사진, c는 노화관련 인자인 베타 갈락토시다제의 분석 결과.
도 7은 p23 형질전환 세포에서 발현된 Bcl-2 단백질 및 mRNA 수준을 측정한 결과이다; a는 RT-PCR, b는 사이클로헥사마이드를 처리한 후 웨스턴 블랏, c는 MG 132를 처리한 후 웨스턴 블랏을 실시한 결과, d는 hsp90 억제제인 geldanamycin을 처리한 후 웨스턴 블랏을 실시한 결과.
도 8은 p23의 과발현이 세포의 이동(cell migration)을 증가시키고 접촉저해(contact inhibition)를 극복한 다는 것을 보여준 결과이다; a는 세포의 성장 곡선을 나타낸 것이고, b는 Tbx3의 RT-PCR 결과이고, c는 Tbx3의 타겟인 E-cadherin의 웨스턴 블럿 사진, d는 세포가 이동하는 사진.
도 9는 p23 과발현 세포에서 ER-α가 증가한다는 것을 보여주는 웨스턴 블럿 결과이다.
도 10은 p23 형질전환 세포에서 RT-PCR을 실시하였을 때 여러 열 충격 단백질의 발현을 비교한 결과이다.
도 11은 p23에 의한 MMR 유전자의 변화를 나타낸 사진이다.
본 발명은 p23 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산을 포함하는 세포사멸을 억제하기 위한 조성물 및 세포내에서 p23을 과발현시켜 세포사멸을 억제하는 방법에 관한 것이다. 또한, p23 단백질을 과발현한 형질전환 동물 및 상기 형질전환 동물의 제조 방법에 관한 것이다. 또한 본 발명은 p23을 과발현하고 종양이 형성된 동물 또는 세포를 이용하여 항종양제를 탐색하는 방법에 관한 것이다.
p23 단백질은 처음 프로게스테론 수용체(progesterone receptor)의 소단위(subunit)로 알려졌고, 열 충격 단백질인 Hsp90의 샤페론 경로(chaperoning pathway)에서의 코-샤페론(co-chaperone)으로서 Hsp90이 대상 단백질(client protein)에 안정적으로 결합하고 분리되는데 있어서 중요한 역할을 한다고 알려져 있다. 특히, 스테로이드 수용체(steroid receptors)의 어셈블리(assembly)와 활성화 과정에서 hsp90과 p23은 서로 의존적인 기능을 가지는 것으로 밝혀졌다. 또한, p23은 염색체 말단에 있는 텔로미어(telomere)의 길이를 유지하는 효소인 텔로머라제(telomerase)의 활성단위로 기능하여 그들이 활성을 갖도록 한다(Shawn et al., Genes and Development 13:817-826, 1999).
Hsp90의 조효소, 텔로머라제 활성 조절자로서의 기능 외에 독립적인 p23의 기능에 대해서는 거의 알려져 있지 않다. 국제특허출원 WO2004/038045호에는 위암(diffuse-type gastric cancers)에서 발현이 증가하는 유전자 중의 하나로 p23을 개시하고 이를 이용하여 위암을 진단하는 방법에 대하여 기재하고 있으나, p23의 종양 유발능 등 암화과정에서 역할에 대해서는 알려진 바가 없다.
이런 배경하에 본 발명자는 p23의 역할을 규명하기 위하여, p23이 과발현되는 형질전환 마우스를 제조한 결과, 마우스의 간, 비장, 자궁 등의 여러 장기에서 종양이 유발되며, 이 때, p23의 과발현에 의하여 세포사멸 억제 단백질로 알려진 Bcl-2와 ER-α, 세포 증식과 노화에 관련된 Rb, p21의 세포 내 단백질 수준이 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 즉, p23은 세포사멸을 억제시키면서 종양을 유발하며 특히, 이의 과발현만으로 종양 동물 모델로 사용될 수 있는 형질전환 동물을 효과적으로 제조할 수 있다는 것을 밝히고 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 p23 단백질 또는 p23 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 갖는 핵산을 포함하는, 세포사멸을 억제하기 위한 조성물을 제공하기 위함이다.
본 발명의 또 다른 목적은 세포내에서 p23 단백질을 과발현시켜 세포사멸을 억제하는 방법을 제공하기 위함이다.
본 발명의 또 다른 목적은 p23 단백질이 과발현된 형질전환 동물을 제공하기 위함이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 형질전환 동물의 종양에서 유래한 세포를 제공하기 위함이다.
본 발명의 또 다른 목적은 p23 단백질 발현 벡터를 제조하는 단계; 상기 발현 벡터를 수정란의 핵으로 삽입하는 단계; 상기 수정란을 대리모로 이식시키는 단계를 포함하는 형질전환 동물을 제조하는 방법을 제공하기 위함이다.
본 발명의 또 다른 목적은 p23 단백질 발현 벡터를 제조하는 단계; 상기 발현 벡터 또는 상기 발현 벡터로 형질전환된 세포를 동물내로 주입하는 단계를 포함하는 암 발생된 형질전환 동물을 제조하는 방법을 제공하기 위함이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기의 형질전환 동물 및 이로부터 유래한 세포를 준비하는 단계; 상기 동물 또는 세포로 항종양제 후보물질을 처리하는 단계; 및 상기 동물 또는 세포에서의 종양 발생이 감소한 정도를 측정하고 후보 억제제를 처리하지 않은 대조구와 비교하는 단계를 포함하는, 항종양제를 탐색하는 방법을 제공하기 위함이다
본 발명자는 p23 (unactive progesteron receptor complex, p23: telomerase binding protein, hsp90 co-chaperone)이 암 유발능을 가지는 유전자로, 마우스 등의 동물에서 p23의 과발현만으로 간, 비장, 자궁 등의 여러 장기에서 종양을 유발 시킬 수 있음을 밝혔다. p23 과발현에 의한 종양의 유발은, p23 과발현에 의해 유발되는 세포사멸에 대한 저항성 부여와 관련 있음을 FACS 분석, MTT assay, PARP의 절단 분석 결과 알 수 있었으며 p23의 과발현에 의하여 세포사멸(apoptosis) 억제 단백질로 알려진 Bcl-2와 ER-α, 세포 증식에 관련된 Rb 및 p21의 세포 내 단백질 수준이 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 즉, p23은 과발현시 세포사멸을 억제시키면서 종양을 유발 활성을 가지는 유전자이다.
따라서, 하나의 양태로서, 본 발명은 p23 단백질 또는 p23 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 갖는 핵산을 포함하는, 세포사멸을 억제하기 위한 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 조성물에 사용되는 p23 단백질은 인간과 말, 양, 돼지, 염소, 낙타, 영양, 개, 래빗, 마우스, 래트, 기니피그, 햄스터 등의 동물 유래의 모든 p23 단백질을 포함한다. 서열번호 2의 마우스 유래의 p23을 예시할 수 있다.
또한, 본 발명의 p23 단백질은 이의 정상형(wild type)의 아미노산 서열을 갖는 단백질뿐만 아니라 p23 단백질의 변이체를 포함한다. p23 단백질의 변이체란 야생형의 아미노산 서열과 하나 이상의 아미노산 잔기가 상이한 서열을 가지는 단백질을 의미한다. p23 단백질의 변이체란 p23의 정상 아미노산 서열과 하나 이상의 아미노산 잔기가 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합에 의하여 상이한 서열을 가지는 단백질을 의미한다. 분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질 및 펩티드에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다 (H. Neurath, R. L. Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979).
또한, p23 단백질은 경우에 따라서는 인산화(phosphorylation), 황화(sulfation), 아크릴화(acrylation), 당화(glycosylation), 메틸화(methylation), 파네실화(farnesylation) 등으로 수식(modification) 될 수도 있다.
상기 변이체 또는 수식체는 천연 단백질과 동일한 생물학적 활성을 나타내는 기능적 등가물이나, 필요에 따라서는 이의 단백질의 특성을 변형시킨 변이체 또는 수식체일 수 있다. 바람직하게는 아미노산 서열상의 변이와 수식에 의해서 단백질의 열, pH등에 대한 구조적 안정성이 증가하거나 단백질 활성이 증가한 단백질이다.
p23 단백질 또는 이의 변이체는 당 분야에 널리 공지된 방법으로 천연에서 추출 및 정제하여 얻을 수 있다. 달리는, p23 단백질의 서열이 밝혀져 있으므로 화학적으로 합성(Merrifleld, J. Amer. Chem. Soc. 85:2149-2156, 1963)하거나 유전자 재조합 기술을 이용하여 얻을 수 있다.
화학적으로 합성하여 제조하는 경우, 당 분야에 널리 공지된 폴리펩타이드 합성법을 이용하여 얻을 수 있다. 유전자 재조합 기술을 이용할 경우, p23 단백질을 코딩하는 핵산을 적절한 발현 벡터에 삽입하고, 벡터를 숙주세포로 형질전환하여 p23이 발현되도록 숙주 세포를 배양한 뒤, 숙주세포로부터 p23을 회수하는 과정으로 수득할 수 있다. 단백질은 선택된 숙주 세포에서 발현시킨 후, 분리 및 정제를 위해 통상적인 생화학 분리 기술, 예를 들어 단백질 침전제에 의한 처리(염석법), 원심분리, 초음파파쇄, 한외여과, 투석법, 분자체 크로마토그래피(겔여과), 흡착크로마토그래피, 이온교환 크로마토그래피, 친화도 크로마토그래피 등의 각종 크로마토그래피 등을 이용할 수 있으며, 통상적으로 순도가 높은 단백질을 분리하기 위하여 이들을 조합하여 이용한다.
본 발명의 조성물에서 p23 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 야생형 또는 상기한 바와 같은 변이체 형태의 p23 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열로서, 하나 이상의 염기가 치환, 결실, 삽입 또는 이들의 조합에 의해 변이될 수 있으며, 천연에서 분리되거나 화학적 합성법을 이용하여 제조할 수 있다.
상기한 뉴클레오타이드 서열을 갖는 핵산은 단쇄 또는 이중쇄일 수 있으며, DNA 분자(게놈, cDNA) 또는 RNA 분자일 수 있다.
p23 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 화학적으로 합성하여 제조하는 경우, 당업계에 널리 공지된 합성법, 예를 들어 문헌(Engels and Uhlmann, Angew Chem Int Ed Engl. 37:73-127, 1988)에 기술된 방법을 이용할 수 있으며, 트리에스테르, 포스페이트, 포스포르아미다이트 및 H-포스페이트 방법, PCR 및 기타 오토프라이머 방법, 고체 지지체상의 올리고뉴클레오타이드 합성법 등을 들 수 있다.
보다 바람직하게는, p23 단백질을 코딩하는 핵산서열은 서열번호 2의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열이다. 서열번호 1의 뉴클레오타이드 서열을 서열번호 2의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열로서 예시할 수 있다.
보다 바람직한 양태로서, p23 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 갖는 핵산은 재조합 벡터에 삽입되어 발현된다.
본 발명에서 “벡터”란 목적 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 숙주 세포로 도입되기 위한 수단을 의미한다. 본 발명의 벡터는 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 바이러스 벡터 등을 포함한다. 적합한 발현벡터는 프로모터, 오퍼레이터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널, 인핸서 같은 발현 조절 요소 외에도 막 표적화 또는 분비를 위한 신호 서열 또는 리더 서열을 포함하며 목적에 따라 다양하게 제조될 수 있다. 개시 코돈 및 종결 코돈은 일반적으로 목적 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 일부로 간주되며, 유전자 작제물이 투여되었을 때 개체에서 반드시 작용을 나타내야 하며 코딩 서열과 인프레임(in frame)에 있어야 한다. 벡터의 프로모터는 구성적 또는 유도성일 수 있다. 또한 발현벡터는 벡터를 함유하는 숙주 세포를 선택하기 위한 선택성 마커를 포함하고, 복제 가능한 발현벡터인 경우 복제 기원을 포함한다. 벡터는 자가 복제하거나 숙주 게놈 DNA에 통합될 수 있다.
바람직하게는 벡터내로 삽입되어 전달된 유전자가 숙주세포의 게놈내로 비가역적으로 융합되어 세포내에서 유전자 발현이 장기간 안정적으로 지속되도록 하는 벡터이다. 구체적으로, 본 발명의 형질전환 마우스 제조에 사용된 벡터는, 사이토메갈로 바이러스 게놈 유래의 인핸서의 조절을 받는 강력한 베타-액틴 프로모터로부터 목적 단백질이 높은 수준으로 발현되는 pCAGGS 벡터이며, 숙주 게놈으로 벡터가 삽입되어(integrate) 안정하게 유지됨을 특징으로 한다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 세포내에서 p23 단백질을 과발현시켜 세포사멸을 억제하는 방법에 관한 것이다.
상기 방법에서 세포사멸의 억제는 종양의 유발을 예시할 있으며, 이러한 p23 단백질의 과발현은 p23 단백질 또는 p23 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 갖는 핵산을 세포내로 도입시켜 수행할 수 있다. p23 단백질 또는 p23 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 세포사멸을 억제하기에 충분한 양으로 도입되며 동물 또는 세포의 종류, 동물의 체중, 투여형태 및 경로 등 다양한 요인에 도입되는 양은 결정되며 단일 또는 다중 도입될 수 있다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 p23 단백질이 과발현된 형질전환 동물에 관한 것이다.
본 발명에서 용어, “형질전환 동물(transgenic animal)"이란 세포내 p23 단백질 수준이 정상 세포 수준에 비하여 증가되도록 형질의 변형이 유도된 동물을 의미하고, p23 단백질을 발현하는 벡터를 세포내 유입함으로써 형질전환을 유도할 수 있다. 종양이 발생된 상기 형질전환 동물은 종양 동물 모델로 효과적으로 사용될 수 있다.
본 발명에서 “동물 모델(animal model)” 또는 “질환 모델(disease model)"은 사람의 질병과 유사한 특정 질환을 가지고 있어서 병인을 규명하고, 병태를 확인할 수 있는 연구 대상이 될 수 있는 모델이 되는 동물을 의미한다. 동물 모델로서 사용하기 위한 동물은, 인간에서와 같은 효과를 예측할 수 있으며, 쉽게 만들 수 있고, 재현성이 있다. 또한, 인간질병의 병인과 같거나 유사하게 진행되어야 한다. 따라서, 인간과 같은 포유류 척추동물이면서, 장기 등의 체내 구조, 면역체계, 체온 등이 유사하고, 고혈압, 암, 면역결핍 등의 질환을 앓는 동물이 동물 모델로서 적합하다. 이런 동물은 바람직하게는 말, 양, 돼지, 염소, 낙타, 영양, 개, 래빗, 마우스, 래트, 기니피그, 햄스터 등의 포유류이고, 보다 바람직하게는 마우스, 래트, 기니피그, 햄스터 등의 설치류이다. 특히, 마우스는 소형동물로 번식력이 우세하고, 사양관리가 쉽고, 질병에 강하며, 유전적으로 균일하며, 다양한 종류가 개발되었고, 사람에서 발생하는 질병과 같거나 유사한 증상을 보이는 동물의 생산이 가능하여, 인간의 질병을 연구하는데 가장 많이 이용되고 있다.
본 발명의 동물 모델은 종양 질환 모델로, p23이 과발현되도록 유전자 조작하여 제조된 모델이다. 유전자 조작을 통한 동물 모델 제조의 효율성을 결정짓는 결정적 요소는 조작될 유전자의 선별이다. 단순히 암유전자(oncogene)의 과발현, 암억제 유전자(tumor suppressor gene)의 발현 억제만으로 종양이 발생되지 않으므로, 암유전자, 암억제 유전자로서의 성질 규명만으로는 유전자를 이용하여 종양 동물 모델 제작 가능 여부를 예측할 수 없다는 점에서, 유전자 선별의 어려움이 있다. 본 발명자는 p23이 암 유도능을 가지며 실제, 이를 세포내에서 과발현시키면 별도의 조작 없이 p23 단일 유전자 과발현만으로 동물의 여러 장기에서 종양이 효과적으로 발생되는 것을 알 수 있었다. 특히, 기존의 종양 동물 모델에서 단일 유전자의 과발현으로 종양을 발생시키기가 쉽지 않았으나, 본 발명자는 p23의 경우 유도제 등의 별도 처리 없이 단일 유전자 과발현만으로 효과적으로 암을 유발할 수 있음을 밝혔다. 유전자 조작으로 제조된 종양 질환 모델은, UV 조사나 화학물질 투여 등의 방법을 통하여 무작위적인 기작으로 종양을 유발시킨 모델이 동일한 재현성을 제공할 수 없고 제조시 통제가 어렵다는 단점을 가지는데 비하여, 조절이 가능하고 동일한 재현성을 가지므로 보다 바람직하다.
상기의 p23 과발현으로 제조된 동물 모델은 유전자 기능에 대한 연구, 암의 분자적 기작 및 신규 항종양제 탐색 등의 연구에 효과적으로 사용할 수 있다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 형질전환 동물의 종양에서 유래한 세포에 관한 것이다.
형질전환 동물의 종양이 발생한 조직으로부터 세포주(cell line)를 획득할 수 있다. 동물 조직으로부터 세포를 얻는 방법은 특별히 제한되지 않는다. 예를 들어, 동물로부터 종양이 발생한 부위의 조직을 떼어내고 조직을 잘게 부순 다음 단백질 분해효소를 이용하여 세포와 세포를 연결해주는 결합단백질을 파괴하여 서로 잘 분리된 세포 현탁액을 준비한 뒤 세포 현탁액을 적절한 배지에 넣어 주는 일반적인 방법으로 획득할 수 있다. p23을 과발현시키면 동물의 간, 비장, 장, 자궁 등의 다양한 조직에서 종양이 발생되므로 간, 비장, 장, 자궁 등의 조직 유래의 종양 세포를 효과적으로 획득할 수 있다.
종양 질환 모델로 사용되는 형질전환 동물의 제조 방법은 특별히 제한되지 않지만, 수정란에 p23 단백질을 발현하는 재조합 발현 벡터를 유입시켜 p23의 과발현을 유도하는 방법으로 제조할 수 있다.
따라서, 또 다른 양태로서, 본 발명은 p23 단백질 발현 벡터를 제조하는 단계; 상기 발현 벡터를 수정란의 핵으로 삽입하는 단계; 상기 수정란을 대리모로 이식시키는 단계를 포함하는 형질전환 동물을 제조하는 방법에 관한 것이다.
정상적으로 교배시켜 얻은 동물 수정란에 p23 단백질 발현 벡터를 주입한 뒤 p23이 삽입된 수정란을 암컷에 착상시켜 얻은 새끼를 동물 모델로 사용하는 방법이다. 수정란에 발현 벡터를 주입하는 방법은 특별히 한정되지 않는다. 구체적으로 본 발명에서는 수정란의 전핵에 벡터를 미세 주사 바늘을 이용하여 직접 주입하는 미세주입법(miroinjection)을 사용하였다. 성선자극 호르몬을 투여하여 과배란을 유도하고 얻은 수정란을 난구세포를 제거하여 수정란으로 핵으로 발현벡터를 미세주사바늘로 직접 주입하였다. p23 유전자가 주입된 수정란을 국제기탁기관인 대전시 유성구 어은동 52번지 소재의 KCTC(Korean Collection for Type Cultures)에에 2005 년 9월 5일자로 제KCTC10841BP호로 기탁하였다.
수정란을 대리모로 이식시키는 방법은, 난관에 이식시키거나 자궁에 착상시키는 방법이 있다.
또한, 정상적인 성체에 p23 단백질 발현 벡터 또는 p23 단백질 발현 벡터로 형질전환된 세포를 주입함으로써, 성체로부터 암이 발생된 형질전환 동물을 제조할 수 있다.
따라서, 또 다른 양태로서, 본 발명은 p23 단백질 발현 벡터를 제조하는 단계; 상기 발현 벡터 또는 상기 발현 벡터로 형질전환된 세포를 동물내로 주입하는 단계를 포함하는 암 발생된 형질전환 동물을 제조하는 방법에 관한 것이다.
성체의 p23 단백질 발현 벡터 또는 상기 발현 벡터로 형질전환된 세포를 동물내로 주입함으로써 정상 동물의 조직에서 암을 유발할 수 있다. 구체적으로, 성체 마우스에 p23 과발현 간암세포를 이식하면, 간암세포 이식군에 비해서 종양크기가 각각 86.3배, 93.7배 증가하고 종양의 무게는 35.5배, 38.1배 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 이는, p23 과발현 세포 이식만으로 성체에서 암을 효과적으로 유발할 수 있다는 것을 의미하고, 간암 세포 이식군에 비하여 p23의 과발현 간암세포 이식군에서 종양 발생이 효율이 현저하게 높다는 사실은 p23이 암 발생에 결정적인 역할을 한다는 것을 의미한다.
발현 벡터 또는 발현 벡터로 형질전환된 세포를 동물내로 주입하는 경로는 복강내, 정맥내, 근육내, 피하, 피내, 경구, 국소, 비내, 폐내, 직장내 투여 될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
상기 방법으로 제조된 형질전환 동물은 종양 동물 모델로 제공되고, 이를 이용하여 유전자 기능에 대한 연구, 암의 분자적 기작 및 신규 항종양제 탐색 등의 연구에 효과적으로 사용할 수 있다.
따라서, 또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 형질전환 동물 또는 이에서 유래한 세포를 준비하는 단계; 상기 동물 또는 세포로 항종양제 후보물질을 처리하는 단계; 및 상기 동물 또는 세포에서의 종양 발생이 감소한 정도를 측정하고 후보 억제제를 처리하지 않은 대조구와 비교하는 단계를 포함하는, 항종양제를 탐색하는 방법에 관한 것이다.
본 발명에서 용어, “항종양제(anti-tumor agent)”란 암세포의 증식을 억제하거나 사멸하는 경향 또는 능력을 가지는 제제를 의미한다.
본 발명에서 항종양제로서의 후보물질은 유기 또는 무기 화합물과 같은 단일 화합물, 단백질, 탄수화물, 핵산분자(RNA, DNA 등) 및 지질과 같은 고분자 화합물 및 복수의 화합물의 복합체 등이 포함될 수 있다.
이 때, 후보 물질은 유효량의 범위 내에서 처리하도록 한다. “유효량”이란 반응을 유도하기에 충분한 양을 의미하는 것으로, 유효량 범위 이하에서는, 정확한 결과를 얻을 수 없으므로, 유효량 범위 내에서 항암효과를 조사하도록 한다.
본 발명에서 용어. “처리(treatment)”란 후보 물질이 세포내에서 영향을 미치도록 하는 것을 의미하고, 세포 내로 직접 흡수되는 것뿐만 아니라 물질이 세포막에 영향을 미치고 그 세포막으로부터 발생한 신호가 세포내에 영향을 미치는 모든 경우를 포함한다. 따라서 본 발명에 있어서, 상기 후보 물질은 세포막 투과성인 물질 뿐만 아니라, 세포막에 불투과성인 물질도 포함한다.
종양이 발생한 정도는 대조구에 비하여 형성된 종양의 수와 크기가 감소된 정도, 세포사멸이 감소된 정도를 확인함으로써 유효한 효과를 가지는 치료제를 검출할 수 있다. 세포사멸이 발생된 정도는 FACS, 인 시추(in situ) DNA 결합법, 전기영동에 의한 DNA 단편물 확인법 등이 있으나, 이로 제한되는 것은 아니다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시 예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.
< 실시예 1> p23 과발현 형질전환 마우스의 제작
<1-1> p23 발현 벡터의 제조
본 발명자들은 사람의 p23과 단백질 레벨에서 97.5% 상동성을 지니고 있는 마우스의 p23 cDNA(Genebank Accession #AF153479, 서열번호 1)를 최초로 동정하고 이를 pCAGGS 플라스미드(Niwa H, Yamamura K, Miyazaki J. Gene 108(2):193-9, 1991)에 삽입하여 pCAGGS-p23 플라스미드 재조합 벡터를 제작하였다. 제한효소로 상기 벡터로부터 p23 cDNA를 절단한 후, N-말단에 SR 펩티드를 암호화하는 표지 서열(sequence tag)을 갖는 벡터인 pSRTN 벡터로 서브클로닝하였다. 상기 벡터에서 SR-p23 부분만 절단한 후 pCAGGS 벡터 내 닭의 베타-액틴 프로모터(chicken β-actin promoter)와 토끼의 베타-글로빈 폴리아데닐레이션 사이트(rabbit β-globin poly A) 부위 사이에 삽입함으로써 발현벡터 pCAGGS-SR-p23을 제작하였다(도 1a). 상기 발현벡터는 거의 모든 조직에서 p23 유전자를 발현시켰다. 상기 발현벡터를 미디-프렙 키트(midi-prep kit, QIAGEN)로 정제한 후 제한효소로 프로모터-SR-p23-poly A 부분을 절단하였다. 이를 페놀/클로로포름으로 추출하고 0.2 ㎛ 시린지 필터(MILLIPORE, Millex-GV)를 통해 순수 분리하여 하기와 같이 형질전환 마우스 제작에 사용하였다.
<1-2> 형질전환 마우스의 제작 및 확인
많은 수의 수정란을 얻기 위하여 PMSG (pregnant mare's serum gonadotrophin, 배란유도)와 HCG (human chorionic gonadotropin, 난포자극)와 같은 성선자극 호르몬 5 IU를 FVB/N 마우스(Jackson Laboratory, USA에서 구입)의 복강내에 투여하여 과배란을 유도하였다. 과배란시켜 얻은 수정란은 팽대부를 터뜨려 얻고 여기에 히알루로니다아제(hyaluronidase; 300 ng/㎖)를 2분 정도 처리하여 난구세포들을 제거하였다. 수정란 중에서 핵이 잘 보이는 세포에 미세조작기를 이용하여 상기에서 정제한 p23 발현벡터를 삽입하였다. 이 수정란을 대리모인 ICR (Charles River, USA에서 구입) 암컷 마우스의 난관에 이식하여 임신시켰다. 태어난 새끼들의 꼬리를 1㎝ 가량 자른 후 TESK (Tris-EDTA-SDS-Proteinase K) 용액에 꼬리를 넣어 55℃에서 5시간 정도 배양하여 조직을 모두 녹인 후, 페놀/클로로포름으로 처리하여 DNA를 추출한 후, p23 발현벡터가 염색체내에 삽입되었는지 중합효소연쇄반응(PCR)을 이용하여 확인하였다(도 1b). 각각 서열번호 3과 4로 기재되는 정방향 프라이머와 역방향 프라이머 및 본 실험실에서 박테리아로부터 Taq 유전자를 과발현시켜 제작한 Taq 중합효소를 사용하여 게놈 DNA를 주형으로 94℃에서 5분 동안 변성시키고, 94℃에서 20초, 55℃에서 25초 및 72℃에서 45초를 30회 반복하고, 72℃에서 10분간 연장시켜 반응을 종결하였다.
< 실시예 2> p23 유전자의 발현량 측정
p23 단백질 및 유전자가 형질전환 마우스에서 발현되는지를 알아보기 위하 여, 항-SR 항체(성균관대 의과대학 한명준 교수 연구실에서 제조한 항체를 입수)를 사용하여 웨스턴 블랏(도 2a)을 실시하였고 역전사-중합효소연쇄반응(RT-PCR)(도 2b)을 실시하였다. 각 조직에서 RNA를 뽑은 후 역전사 효소(GIBCO BRL, Superscript Ⅱ RT)를 이용하여 42℃에서 1시간 동안 cDNA를 합성한 후 각각 서열번호 5와 6으로 기재되는 정방향 프라이머와 역방향 프라이머를 이용하여 cDNA를 주형으로 94℃에서 5분 동안 변성시키고, 94℃에서 20초, 55℃에서 25초 및 72℃에서 45초를 25회 반복하고, 72℃에서 10분간 연장시켜 반응을 종결시켰다. 그 결과, 도 2b에 나타난 바와 같이 형질전환 마우스 대부분의 조직에서 정상 마우스의 조직보다 p23 유전자가 약 2 내지 3배 정도 많이 발현되었다. 이로서 p23 유전자가 과발현되는 형질전환 마우스를 제작하였다.
< 실시예 3> p23 과발현 마우스에서의 암 발생
p23 과발현 마우스를 특정 병원성 미생물이 없는 성균관대학교 의과대학의 SPF 배리어 시스템(specific pathogene free barrier system, AAALAC 국제공인 기관)에서 16-20개월 정도 사육한 후(n=20) 마우스를 희생시켜 확인한 결과, 자발적 종양 빈도(spontaneous tumor frequency, 전체 마우스 중 암이 발생된 마우스수를 %로 나타낸 것)가 약 40% 정도로 여러 장기(liver, spleen, intestine, uterus)에서 암이 발생되어 있음을 확인하였고 H&E(haematoxylin-eosin) 염색을 하여 암의 성질을 조사하였다(도 3a). 또한, 이러한 암 발생은 1세대에 한하여 발생한 것이 아니라 다음 세대로 유전된다는 것을 pedigree를 통해 확인할 수 있었다(도 3b).
9세대 형질 전환 마우스 수컷과 야생형 암컷 마우스를 교배한 후 3.5일째 되는 날 암컷의 자궁에서 배반포(blastocyst)를 추출하여 동결시켜서 획득한 p23 형질 전환 마우스의 수정란을 2005년 9월 5일자로 생명공학연구소 유전자은행(Korean Collection for Type Cultures: KCTC)에 기탁하였다(수탁번호: KCTC 10841BP).
< 실시예 4> p23 을 과발현하는 간암세포의 암 유도능( oncogenic activity )
<4-1> p23 과발현 간암세포주 제작
HepG2 (human hepatoma cell line) 세포를 10 ㎝의 플레이트에서 배양한 후 pcDNA3-HA 벡터(Invitrogen사의 pcDNA3 벡터에 HA 펩티드를 N-말단에 갖도록 변형시킨 벡터로 이화여대 배윤수 교수 연구실에서 입수)에 p23 유전자가 삽입되어 있는 pcDNA3-p23 발현벡터와 대조군인 pcDNA3-HA 벡터로 형질전환시켰다. 다음 날 형질전환된 HepG2 세포를 15 ㎝ 플레이트로 옮긴 후, 500 ㎍/㎖의 G418 (GIBCO)을 포함하는 배지를 2-3일에 한 번씩 교환하였다. 10일 후 플레이트에 형성된 콜로니를 팁(tip)으로 피킹(picking)하여 배양한 후 웨스턴 블랏으로 p23 유전자의 발현 여부를 확인하였다. 이로서 형질전환된 p23 과발현 간암세포주를 제작하였다.
<4-2> 누드마우스에 p23 과발현 간암세포 주입
누드 마우스에 p23 과발현 간암 세포주를 주입하여 p23의 암 유도능을 살펴보았다. 7주령에 체중이 17-19 g인 일본 찰스 리버(Charles River) 회사의 암컷 누드마우스를 실험동물로 사용하였으며 1주일 이상 무병원균 동물실에서 적응 기간을 갖게 한 후, 실험에 사용하였다. 동물실의 온도는 21± 2℃, 습도는 55± 5%, 명암은 12시간 주기로 자동 조절하였다. 실험동물용 고형사료는 방사선 멸균제품이었으며, 음수는 고압 증기 멸균기로 멸균하였다. 사료와 음수는 자유 섭취시켰다.
실시예 <4-1>에서 제작한 p23 과발현 간암세포 2종(#3-5, #3-6)과 대조군인 정상 간암세포를 누드마우스에 주입하였다. 간암세포는 3× 107세포/㎖의 농도로 마우스 당 0.3 ㎖씩 피하로 이식하였다. 종양을 이식한 후 4일째부터 종양의 크기를 측정하여 최종일까지 총 6회에 걸쳐 개체별로 측정하였다. 종양의 크기는 버니어 칼리퍼(vernier caliper)를 이용하여 3방향을 측정한 후 수학식 1에 따라 계산하였다.
종양부피 = (길이 X 폭 X 높이)/2
최종일인 16일째에 누드마우스를 희생시켜 종양을 절제하고 무게를 측정하였으며, 디지털 카메라를 사용하여 촬영하였다. 그 결과 도 4에 나타난 바와 같이 최종일에 p23 과발현 간암세포인 3-5 및 3-6 암세포주 이식군은 대조군인 정상 간암세포 이식군에 비해서 종양크기가 각각 86.3배 및 93.7배 증가하였다. 또한 종양을 절제하여 그 무게를 측정한 결과, 3-5 및 3-6 이식군은 정상 간암세포 이식군에 비해 종양무게가 35.5배 및 38.1배 증가하였음을 확인하였다.
< 실시예 5> p23 과발현 세포의 세포사멸에 대한 저항성 확인 및 ROS 조절
p23 유전자가 암 형성능 이외에 또 다른 기능이 있는지 살펴보기 위하여, H2O2와 같은 세포사멸을 유도하는 물질을 처리하였을 때 p23 과발현 세포가 어떠한 변화를 나타내는지 관찰하였다. 구체적으로 p23 과발현 간암세포와 대조군인 정상 간암세포에 H2O2를 처리한 후 아넥신 V(annexin V, BD Biosciences)로 염색한 후 FACS로 분석하였다. 그 결과, 도 5a에 나타난 바와 같이 p23을 과발현하는 세포는 대조군 세포에 비해서 세포사멸이 감소함을 확인하였다. 도 5b에서 mitochondrial activity의 측정으로 세포 사멸의 정도를 알 수 있는 MTT (3-(dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide) assay를 수행하였을 때에도 H2O2 에 의한 세포 사멸이 p23 과발현 간암세포주에서 억제되었다. 또한 PARP 항체(Cell signaling)를 이용한 웨스턴 블랏으로 세포사멸에 대한 마커로 알려진 PARP(poly-ADP-ribose-polymerase)의 절단(cleavage)을 조사한 결과, p23 과발현 세포에서 PARP 절단이 줄어들어 있음을 확인하였다(도 5c). H2O2와 같은 ROS (Reactive Oxygen Species)에 의한 세포사멸이 p23 과발현에 의해 억제되는 메커니즘을 알아보기 위해 우선 p23 과발현 간암세포내에서 ROS의 양을 측정하였다(도 5d). ROS를 검출하는데 사용되어지는 DCF-DA (Dichlorofluorescein diacetate)와 세포 추출액( cell lysate)을 반응시킨 후 sepectrometry를 이용하여 세포내 ROS의 양을 측정하였을 때 p23 과발현 세포에서 ROS의 양이 외부에서 H2O2를 처리하고 안한 것에 관 계없이 줄어들어 있었다. 이것은 p23이 ROS를 제거하는 세포내 방어 메커니즘을 활성화 시킴으로서 ROS를 제거하여 세포 사멸을 억제한다고 볼 수 있다.
< 실시예 6> p23 과발현 세포 내의 Bcl -2, Rb 및 p21 단백질 증가 확인
본 발명자들은 p23 과발현 세포가 암 형성능을 가지고, 세포사멸 저항성을 갖는 메커니즘을 밝히기 위하여 세포성장과 사멸에 관련된 여러 가지 단백질의 발현 정도를 웨스턴 블랏으로 p23 과발현 세포에서 관찰하였다. 그 결과 Bax, cyclins, cdks등은 차이가 없지만 세포사멸 억제 단백질로 알려진 Bcl-2가 p23 과발현 세포에서 증가되어 있을 뿐 아니라 세포의 노화, 증식에 관련된 Rb와 p21 단백질이 증가되어 있음을 확인하였다(도 6a, b). Rb와 p21의 증가는 세포분열을 억제하고 세포사멸에 대한 저항성을 갖게 할 뿐만 아니라 노화를 촉진한다. Rb가 없는 세포에 세포사멸 물질을 처리하였을 때 세포사멸에 대한 감수성이 높아지고, 또한 Rb 녹아웃 마우스(knockout mouse)의 경우 세포사멸이 증가된다는 사실이 잘 알려져 있다(Clarke AR, Maandag ER, van Roon M, van der Lugt NM, van der Valk M, Hooper ML, Berns A, te Riele H, Nature 359; 328-30, 1992). p21은 주로 세포주기 억제제로 알려져 있지만 최근 세포사멸 억제제로서의 기능이 많이 보고 되고 있다(Gartel AL, Tyner AL, Mol Cancer Ther. 1; 639-49, 2002). 그러므로 p23 과발현 세포에서 Rb 및 p21의 증가가 세포사멸에 대한 저항성을 갖게 하는 원인이 될 수도 있다. 또한, Rb와 p21은 노화와 관련되어 있기 때문에 세포의 노화를 간접적 으로 증명할 수 있는 실험인 노화관련(senescence-associated) 베타 갈락토시다제 분석(beta-galactosidase assay)을 수행하여 p23 과발현 세포의 노화 정도를 관찰하였다(도 6c). 상기 방법은 세포 내 리포좀에 존재하며 pH4-5 사이에서 활성을 갖는 베타 갈락토시다제를 분석하는 것으로, 세포가 노화 되면 이 효소의 활성이 변화되어 pH 6에서도 활성을 갖게 되므로 pH 6에서 상기 효소의 활성 측정은 노화의 척도로 많이 사용된다. 분석 결과, 대조군 세포와 달리 p23을 과발현하는 세포에서 노화된 세포가 약 10% 정도 더 관찰(대조군, 0.68%; 3-5, 9.6%; 3-6, 12.4%) 되었다. 이는 노화된 세포가 여러 스트레스에 대해 저항성을 가진다는 이전의 보고들에 따라, p23 과발현에 의한 노화 관련 유전자들의 증가는 세포가 스트레스에 대해 저항성을 갖게 하여 세포사멸을 억제하는 것임을 알 수 있었다.
< 실시예 7> p23 에 의한 Bcl -2의 조절 메커니즘: 전사 촉진, 분해 억제 확인
p23이 과발현된 세포에서 Bcl-2가 어떠한 방법으로 조절되는지 확인하기 위해 우선 RT-PCR을 통하여 Bcl-2의 전사 수준을 확인하였다. 그 결과 Bcl-2의 mRNA가 p23 과발현 세포에서 증가되어 있음을 cDNA를 농도 의존적으로 넣어 RT-PCR을 수행하였을 때 확인하였다(도 7a). 또한, 단백질 합성을 저해하는 사이클로헥사마이드(cyclohexamide)와 단백질 분해를 저해하는 MG132를 처리한 후, 웨스턴 블랏을 통해 Bcl-2의 단백질양을 조사하였다(도 7b). 그 결과 사이클로헥사마이드를 처리하였을 때, 대조군 세포의 Bcl-2 단백질 양이 감소하는 반면 p23의 과발현에 의해 증가된 Bcl-2의 양은 차이가 없었다. 이것은 Bcl-2의 transcripts의 증가뿐만 아니 라 bcl-2 단백질의 분해가 p23 과발현에 의해 억제된다는 것을 의미한다. 또한, 이 사실은 단백질 저해제인 MG132와 LLnL을 처리하였을 때 대조군과의 Bcl-2의 양적차이가 처리하지 않았을 때보다 줄어 들어 있음을 통해 확인하였다(도 7c).
p23은 hsp90의 조효소로서 hsp90에 의존적으로 여러 가지 조절 기능에 관여를 한다고 알려져 있다. p23에 의한 Bcl-2의 증가가 hsp90 의존적인지를 결정하기 위해 hsp90의 억제제인 젤다나마이신(geldanamycin)을 여러 농도로 처리한 후 그 양의 변화를 관찰하였다(도 7d). 그 결과 p23은 hsp90의 유무에 관계없이, Bcl-2의 양을 조절함을 확인하였다.
< 실시예 8> p23 에 의한 cell migration 의 증가와 contact inhibition 극복
p23 과발현 세포의 성장 속도(growth rate)를 측정하였을 때 처음에는 속도에 거의 차이가 없지만 배양 디쉬에 꽉 차게 되었을 때(confluent density), 대조군 세포는 더 이상 증식이 일어나지 않지만 p23 과발현 세포의 경우는 contact inhibition을 극복하고 계속 증식을 하는 것을 관찰하였다(도 8a). 또한, DEG (differentially expressed gene) analysis ((주)씨젠)를 수행하였을 때 Tbx3 유전자가 p23 과발현 세포에서 증가되어 있음을 확인하였다(도 8b). Tbx3 유전자는 contact inhibition에 중요한 단백질인 E-cadherin의 발현을 억제하는 것으로 알려져 있기 때문에 p23 과발현 세포주에서 E-cadherin의 발현 정도를 비교하였다. 그 결과 E-cadherin이 p23 과발현을 통해 감소 되어 있음을 확인하였고 (도 8c), 이런 결과는 p23 과발현 세포가 contact inhibition을 극복하고 계속 자라는 원인을 설 명해준다. 또한, E-cadherin은 세포의 migration에 관여되기 때문에 p23 과발현 세포에서 cell migration을 조사하였다. 그 결과 p23 과발현은 cell migration을 증가시킨다는 것을 알 수 있었다(도 8d). 즉, p23은 Tbx3를 증가시켜 E-cadherin을 억제하여 세포가 contact inhibition을 극복하고 계속 증식 할 수 있는 능력을 갖게 할 뿐만 아니라 cell migration 활성이 증가되므로 암이 형성되었을 때 전이될 가능성을 증가시킨다.
< 실시예 9> p23 과발현 세포에서 ER -α의 증가
p23을 과발현하는 나이 든 쥐에서의 암형성은 암컴 생쥐에서만 관찰이 되었다. p23은 ER-α의 활성을 증가시키는 것으로 알려져 있기 때문에(ref. Mol Cell Biol. 1999 May;19(5):3748-59.) p23 과발현 세포에서 ER-α의 발현을 살펴보았다(도 9). 그 결과 ER-α가 p23 과발현 세포에서 증가되어 있음을 확인하였다. 이것은 male보다 female에서 ER-α의 ligand인 estrogen의 양이 많기 때문에 p23 과발현으로 인한 활성화된 ER-α의 양이 female에서 더 증가되어 있어 male보다 female에서 더욱 자발적인 암이 많이 생기는 것으로 생각할 수 있다.
< 실시예 10> p23 에 의한 열 충격 단백질의 발현 변화 확인
열 충격 단백질(heat shock protein)들은 서로 상호조절을 하고 hsp90을 비롯한 hsp10이나 hsp60이 세포사멸 과정에 관여한다고 알려져 있기 때문에 p23 과발현 세포에서 여러 열 충격 단백질의 발현을 RT-PCR을 통해 조사하였다. 그 결과 hsp27의 경우 발현이 증가됨을 확인하였다. 현재까지 hsp27과 Bcl-2의 직접적인 관계에 대해 알려진 것은 없지만 두 단백질 모두 미토콘드리아 매개된 세포사멸에 관여하기 때문에 p23 과발현 세포가 세포사멸에 대한 저항성을 갖는 이유를 뒷받침한다(도 10).
< 실시예 11> p23 에 의한 미스매치 복구( mismatch repair ; MMR ) 유전자의 변화 확인
최근 발표된 논문에서 노화가 됨에 따라 암 발생률의 증가에 대한 메커니즘을 제시하였는데, 즉 Bcl-2에 의한 MMR 유전자의 과발현으로 돌연변이가 세포에 축적되고 이로 인해 암이 생기게 된다고 주장하였다. p23 과발현 마우스의 경우 노화가 되면서 암 발생이 진행되는 결과를 보였고, 또한 p23 과발현 세포에서 Bcl-2가 증가되었기 때문에 MMR 유전자에 변화가 있는지 살펴보았다. 그 결과 p23 과발현 세포가 Bcl-2를 증가시키기는 하지만 MMR 유전자에 발현 정도에는 차이를 나타내지 않는 다는 것을 알게 되었다(도 11). 이것은 p23에 의한 Bcl-2의 증가가 암을 발생시키는 메커니즘은 mismatch repair gene에 의한 것이라기보다는 세포 내에서 꾸준하게 존재하는 여러 가지 스트레스에 대한 세포사멸에 대해 저항성을 갖게 되고 이로 인해 살아남은 세포들이 암세포로 발전된다는 것을 의미한다.
상기에서 기술된 바와 같이, p23을 이용하여 종양 동물 모델을 제조할 수 있고 제조된 모델을 이용하여 항암제 등의 탐색에 효과적으로 사용할 수 있다.
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Claims (18)

  1. p23 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산을 포함하는, 세포사멸을 억제하기 위한 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 종양을 유발하는 조성물.
  3. 제1항에 있어서, p23 단백질을 코딩하는 핵산이 재조합 벡터인 조성물.
  4. 세포내에서 p23 단백질을 과발현시켜 세포사멸을 억제하는 방법.
  5. 제4항에 있어서, 종양을 유발하는 방법.
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  9. 삭제
  10. 삭제
  11. p23 단백질 발현 벡터를 제조하는 단계; 상기 발현 벡터를 수정란의 핵으로 삽입하는 단계; 상기 수정란을 대리모로 이식시키는 단계를 포함하는, 종양이 유발되는 형질전환 동물을 제조하는 방법.
  12. 제11항에 있어서, 난관에 이식시키거나 자궁에 착상시켜 수정란을 대리모에 이식시키는 형질전환 동물을 제조하는 방법.
  13. p23 단백질 발현 벡터를 제조하는 단계; 상기 발현 벡터 또는 상기 발현 벡터로 형질전환된 세포를 동물내로 주입하는 단계를 포함하는, 종양이 유발되는 형질전환 동물을 제조하는 방법.
  14. 제11항 또는 제13항에 있어서, 동물이 포유류인 방법.
  15. 제14항에 있어서, 포유류가 설치류인 방법.
  16. p23 단백질이 과발현된 형질전환동물 또는 p23 단백질이 과발현된 형질전환동물의 종양에서 유래한 세포를 준비하는 단계; 상기 동물 또는 세포로 항종양제 후보물질을 처리하는 단계; 및 상기 동물 또는 세포에서의 종양 발생을 측정하는 단계를 포함하는, 항종양제를 탐색하는 방법.
  17. 제16항에 있어서, 형성된 종양의 수 및 크기를 측정하여 항종양제를 탐색하 는 방법.
  18. 제16항에 있어서, 세포사멸을 측정하여 항종양제를 탐색하는 방법.
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Oncogene, Vol. 19(22), pp. 3324-3333
PNAS, Vol. 98(11), pp. 6435-6440

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