KR100781058B1

KR100781058B1 - 식물 유래의 바인딩 프로테인 유전자를 이용한 유전자 조작식물체 선별 방법

Info

Publication number: KR100781058B1
Application number: KR1020060107078A
Authority: KR
Inventors: 전재흥; 김현순; 강원진; 김윤식; 정혁; 문제선
Original assignee: 한국생명공학연구원
Priority date: 2006-11-01
Filing date: 2006-11-01
Publication date: 2007-11-30

Abstract

본 발명은 식물 유래의 바인딩 프로테인 유전자를 이용한 유전자 조작 식물체 선별 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 유전자 조작 식물체의 안전성을 높이기 위해 단백질의 접힘에 관여하는 샤페론(chaperone) 중 하나인 바인딩 프로테인(Binding Protein; BiP) 유전자를 표지 유전자로 이용한 유전자 조작 식물체 선별 방법에 관한 것이다. 본 발명의 바인딩 프로테인은 대부분의 동물이나 식물에 모두 존재하는 단백질로 형질전환 작물에 사용된 후에 자연 속으로 퍼져도 생태계를 교란시키는 문제를 해소하여 유전자 조작 식물체의 안전성을 높일 수 있다.

바인딩 프로테인, 유전자 조작 식물체 선별방법

Description

식물 유래의 바인딩 프로테인 유전자를 이용한 유전자 조작 식물체 선별 방법{Methods of use for preparing transgenic plants with binding protein genes of plant origin as a selection marker}

도 1은 감자의 잎 절편을 각기 다른 농도의 투니카마이신(tunicamycin) 재분화 배지에서 조직 배양하여 유도되고 있는 감자의 캘러스 및 재분화 정도를 비교해 나타내는 사진이다.

도 2A는 서열번호 1로 기재되는 콩의 바인딩 프로테인(Binding Protein)유전자를 pCAMBIA1301의 하이그로마이신 저항성 유전자를 제한효소를 이용하여 자르고 CaMV 35S 프로모터에 결합시켜 선별마커로 사용한 식물 발현벡터인 pCAMBIA1301-BiP-GUS 형질전환용 벡터를 나타내는 모식도이며, 도 2B는 형질전환 조건을 비교하기 위하여 GUS 유전자가 있는 pCAMBIA1301 식물 형질전환용 벡터를 나타내는 모식도이다.

도 3은 콩의 바인딩 프로테인 유전자가 도입된 pCAMBIA1301-BiP-GUS 벡터의 제작을 바인딩 프로테인 유전자 내부에 존재하는 EcoR I 제한효소 처리로 XhoⅠ부위에 바인딩 프로테인 유전자가 CaMV 35S 프로모터에 정방향으로 결합된 벡터를 절단 크기 차이에 의해 선별했음을 나타내는 전기영동 사진이다.

도 4는 선별된 감자 식물체로부터 식물체들을 이용하여 gDNA를 추출하고 PCR을 통 하여 식물체 게놈상에 도입된 콩의 바인딩 프로테인 유전자를 증폭시켜서 형질전환 여부를 확인한 전기영동 사진이다.

본 발명은 식물 유래의 바인딩 프로테인 유전자를 이용한 유전자 조작 식물체 선별 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 유전자 조작 식물체의 안전성을 높이기 위해 단백질의 접힘에 관여하는 샤페론(chaperone) 중 하나인 바인딩 프로테인(Binding Protein; BiP) 유전자를 표지 유전자로 이용한 유전자 조작 식물체 선별 방법에 관한 것이다.

유전자 조작이란 한 종으로부터 유전자를 얻은 후에 이를 다른 종에 삽입하는 기술로서, 1953년 왓슨과 크릭에 의해 DNA의 구조가 밝혀지고 1970년대 이후 DNA를 자르는 것이 가능해지면서 이러한 기술도 가능해졌다.

유전자 조작은 원하는 특성을 나타내는 유전자를 인위적으로 떼어내어 다른 생명체에 집어넣기 때문에 그 특성의 발현 가능성이 높고 시간이 적게 걸린다는 장점이 있어 이제는 매우 일반화 되어있다. 이런 방식으로 새롭게 만들어진 생명체를 유전자 조작 생물체(geneticcally modified organisms; GMO)라고 부르며 벼나 감자, 옥 수수, 콩 등의 농작물에 행해지면 유전자 조작 농작물이라 하고, 이를 가공하면 유전자 조작 식품이라고 한다.

유전자 조작 농작물은 해충과 잡초에도 잘 견디는 품종을 단시간 내에 다량 수확할 수 있기 때문에 식량문제를 해결할 수 있을 뿐만 아니라 맛과 영양을 획기적으로 개선하거나 약용 성분을 주입하여 영양 결핍을 해결할 수도 있다. 우리나라에서 1995년부터 두부, 간장, 두유, 메주 제조용으로 수입한 콩의 30% 가량이 유전자 변형 콩으로 추정되고 있으며 우리 국민의 대다수는 이미 유전자 조작 농산물의 맛을 보았고 유전자 조작 농작물의 애용은 계속 증가할 추세이다. 그러나 형질 전환된 식물체만 선별하기 위해 항생제나 제초제 저항성 유전자 등, 표지 유전자를 사용하는데 이 유전자가 외부 자연으로 퍼질 경우 제초제에 강한 수퍼 잡초나 페니실린 등의 항생제에 죽지 않는 수퍼 박테리아 등이 만들어져 생태계를 파괴할 수 있다는 우려가 있어 실용?상업화로 이어지는 걸림돌이 되고 있다. 상기 문제를 극복하면서도 상품성이 우수한 유전자 조작 농작물의 개발을 위해서는, 생태계 교란을 일으킬 수 있는 항생제나 제초제 내성 유전자 대신 사용할 수 있는 환경 친화적인 유전자를 발굴해야 하며 이런 노력은 유전자 조작 식품의 안전성을 위해 필수적이다.

폴리펩티드는 전사가 진행되는 동안 접힘(folding)이 되지 않은 상태로 소포체 막으로 이동한다. 따라서 폴리펩티드는 소포체 내에서 샤페론(chaperone)의 도움을 받아 3차원적인 구조로 접힘이 이뤄진다. 바인딩 프로테인(BiP)은 소포체 내에 존 재하는 주단백질 중의 하나이며, 샤페론의 Hsp70 부류로써 소포체 내에서 접힘이 이뤄지지 않은 폴리펩티드가 소포체 막을 통해 이동하는 동안 단백질의 접힘과 다수 소단위체의 결합을 조절한다(Hammond and Helenius, 1995, Curr Opin Cell Biol, 7:523-529). 또한 Bip은 소포체내의 스트레스 반응에 중요한 단백질이며 최근 BiP의 과발현이 각종 스트레스에 내성을 갖는다는 보고가 있다. 투니카마이신은 N-결합 당 단백질의 당질화를 억제하고 소포체 내에 접힘이 일어나지 않은 단백질의 축적을 촉진시킨다. BiP는 투니카마이신에 의해 발현이 증가하며 콩의 바인딩 프로테인을 과다 발현시킨 담배는 투니카마이신에 내성을 가진다고 보고 되어있다(Alvim et al., 2001, Plant Physiology, 126:1042-1054).

이에, 본 발명자들은 투니카마이신을 선별 마커(selection marker)로, 식물 유래의 바인딩 프로테인 유전자를 선별유전자로 사용하여 유전자 조작 식물체 선별 가능성을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 식물 유래의 바인딩 프로테인 유전자를 표지 유전자로 사용하고 투니카마이신으로 유전자 조작 식물체를 선별하는 방법을 제공함으로써 환경친화적인 유전자 조작 식물체의 안전성을 향상시키는데 그 목적이 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 단백질의 접힘에 관여하는 샤페론(chaperone) 중 하나인 바인딩 프로테인(binding protein: BiP) 유전자를 표지 유전자로 이용한 유전자 조작 식물체 선별 방법을 제공한다.

또한 본 발명은 (1)식물체의 투니카마이신 농도에 따른 내성 정도 확인; (2)BiP 유전자를 발현시키는 식물 발현벡터를 제작하는 단계; (3)상기의 단계 (2)에서 제작된 벡터를 아그로박테리아에 도입시킨 후, 상기 아그로박테리아를 감자와 공동배양하여 형질전환시키는 단계; (4) 상기의 단계 (3)의 형질전환된 식물세포를 재분화시켜 형질전환 된 식물체를 선별하는 단계를 포함하는 바인딩 프로테인 유전자를 이용한 유전자 조작 식물체 선별 방법을 제공한다.

또한 본 발명에서 식물 유래의 바인딩 프로테인 유전자는 서열번호 1의 염기서열을 가지는 콩, 감자, 벼, 고구마, 고추, 토마토, 옥수수, 땅콩, 해바라기, 애호박, 면화를 포함하는 작물의 바인딩 프로테인 유전자인 것을 특징으로 한다.

또한 본 발명은 식물 발현벡터로 플라스미드 벡터 pCAMBIA1301-BiP-GUS를 제공한다. 상기 식물 발현벡터는 기존의 Ti-플라스미드 벡터들에서 선별유전자를 제거하고 바인딩 프로테인 유전자를 발현하도록 고안된 것을 특징으로 한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명하면 다음과 같다.

본 발명에서 투니카마이신 농도에 따른 감자의 내성 정도를 확인한 결과, 0, 0.025, 0.05 ㎎/ℓ의 투니카마이신 PR배지에서는 옮겨준 지 10일 경과 후, 잎 절편의 상처 부위에서 캘러스가 형성되었고, 4주 경과 후부터 소식물체가 출현하였다. 그러나 이 농도보다 높은 투니카마이신 PR배지에서는 캘러스는 생성되나 한 달 후부터 눈에 띄게 갈변현상이 나타났다.

본 발명에서 식물 발현벡터는 바인딩 프로테인 유전자가 CaMV35S 프로모터에 정방향으로 위치하고, 리포터 유전자인 GUS를 포함하고 있다. 상기 식물 발현벡터는 pCAMBIA1301-BiP-GUS로서 콩의 바인딩 프로테인 유전자를 사용하였고 pCAMBIA1301 발현 플라스미드를 이용하였으나, 반드시 이에 한정하지는 아니한다.

이하, 본 발명을 실시예에 의하여 상세히 설명한다.

하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것으로, 본 발명의 범위가 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 투니카마이신 농도에 따른 감자의 내성 정도 확인

감자의 내성 정도를 확인하기위해 보름 정도 배양 용기내에서 배양한 잎을 절단하여 각각 0.01 ㎎/ℓ의 나프탈렌초산(naphthalenacetic acid, NAA), 0.1 ㎎/ℓ의 지 베렐린(gibberelin, GA₃), 2.0 ㎎/ℓ의 제아틴(Zeatin) 및 선별마커로 0, 0.025, 0.05, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5 ㎎/ℓ의 투니카마이신(Tunicamycin)이 들어 있는 식물 재분화배지(PR 배지)에 배양하였다. 0, 0.025, 0.05 ㎎/ℓ의 투니카마이신 PR배지에서는 옮겨준 지 10일 경과 후, 잎 절편의 상처 부위에서 캘러스가 형성되었고, 4주 경과 후부터 소식물체가 출현하였다. 그러나 이 농도보다 높은 투니카마이신 PR배지에서는 캘러스는 생성되나 한 달 후부터 눈에 띄게 갈변현상이 나타났다(도 1).

실시예 2: BiP 유전자를 발현시키는 식물 발현벡터를 제조하는 단계

<2-1> 식물 발현용 플라스미드

감자에 형질전환 시키기 위한 플라스미드 벡터 pCAMBIA1301-BiP-GUS(도 2A)를 제조하였다.

선별마커로 하이그로마이신(Hygromycin)을 사용하는 pCAMBIA1301 벡터(CAMBIA GPO Box3200, 도 2B)에서 XhoⅠ제한효소로 하이그로마이신 저항성 유전자를 제거한 후, 서열번호 1로 기재되는 콩의 바인딩 프로테인 유전자 서열을 기반으로 콩의 cDNA로부터 PCR 합성하여 서열을 확인한 후 이를 CaMV 35S 프로모터에 정방향으로 결합시켜 제조하였다. 이때, 바인딩 프로테인 유전자는 XhoⅠ 제한효소부위를 이용하여 결합하였는데 제한효소부위를 도입하는 방법은 다음의 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)방법에 의하였다. 먼저 CaMV35S 프로모터와 CaMV35S 폴리A 사이에 발현되도록 양 프라이머의 말단 부위에 인위적으로 5??말단과 3’말단의 XhoⅠ제한효소부위를 첨가하였다. 제조된 프라이머로 PCR을 수행하여 클로닝에 이용될 벡터에 도입될 수 있게 바인딩 프로테인 유전자를 증폭시켰다. 이때, PCR은 전반응(precycling reaction)으로 94℃에서 2분간 변성시킨 다음, 94℃에서 1분, 60℃에서 1분 및 72℃에서 1분 30초의 순서로 30회 반응을 반복한 후, 마지막 반응에서 72℃에서 10분간 반응시킴으로서 PCR 반응을 종료시켰다(도 3).

상기와 같이 제조된 각 벡터의 플라스미드 pCAMBIA1301-BiP-GUS를 아그로박테리움 투메파시엔스 LBA 4404(Agrobacterium tumefaciens LBA 4404)로 도입하고 식물의 형질전환에 사용하였다. 또한, 형질전환의 기본조건을 조사하기 위하여 리포터 유전자가 GUS인 pCAMBIA1301 이나 pBI121 플라스미드를 이용하였다.

< 실시예 3> 선별 유전자로써 BiP 유전자의 효용성 확인

<3-1> 아그로박테리아를 이용한 pCAMBIA1301-BiP-GUS의 형질전환

감자의 잎을 pCAMBIA1301-BiP-GUS를 포함한 아그로박테리움 투메파시엔스 LBA4404 와 15분 동안 공동 배양하여 형질전환 하였다. 상기의 형질전환된 잎 절편을 3일 동안 2,4-D(2,4-dichlorophenoxy acetic acid)가 들어있는 캘러스 유도배지(C·C 배지)에서 배양하였다. 이때 캘러스 유도배지는 MS 배지에 3%의 서당, 0.8% 한천 및 2.0 ㎎/ℓ의 2,4-D를 첨가하고, 배지의 수소이온농도를 5.8로 조정한 배지를 사용하였다. 그 후, 0.01 ㎎/ℓ의 나프탈렌초산, 1000 ㎎/ℓ의 카베니실린(Carbenicillin disodium), 2.0 ㎎/ℓ의 제아틴 및 선별마커로 0.3 ㎎/ℓ의 투니카마이신(Tunicamycin)이 들어 있는 식물 재분화배지(PR 배지)로 옮겨주었다. 옮겨준 지 10일 경과 후, 잎 절편의 상처 부위에서 캘러스가 형성되었고, 4주 경과 후부터 소식물체가 출현하였다. 상기 소식물체를 분리가 가능할 정도까지 배양한 다음, MS 기본배지로 옮겨 주어 정상 식물과 동일한 과정으로 증식시켰다.

<3-2> PCR을 통한 형질전환 식물체의 선별

형질전환 후 각각 Km 및 Tm 선별배지에서 선별된 식물체들을 이용하여 게놈 DNA(genomic DNA, gDNA)를 추출하여 PCR을 통하여 형질전환 여부를 확인하였다. PCR을 수행하여 식물체 게놈상에 도입된 바인딩 프로테인 유전자를 증폭시켰다. 이때, PCR은 전반응(precycling reaction)으로 94℃에서 2분간 변성시킨 다음, 94℃에서 1분, 60℃에서 1분 및 72℃에서 1분 30초의 순서로 30회 반응을 반복한 후, 마지막 반응에서 72℃에서 10분간 반응시킴으로서 PCR 반응을 종료시켰다. 식물형질전환에 가장 널리 쓰이고 있는 pBI121 벡터를 사용했을때 약 28.6%의 형질전환율 을 얻었고, pCAMBIA1301-BiP-GUS 와 투니카마이신을 사용했을시에는 16.7%의 형질전환율을 얻었으므로 형질전환율은 낮았으나 충분히 선별마커로 사용가능함을 확인하였다(도 4).

이상에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 바인딩 프로테인 유전자는 유전자 조작 식물체의 선별마커로 사용이 가능하며, 생태계 교란을 일으킬 수 있는 항생제나 제초제 내성 유전자 대신 사용할 수 있어 유전자 조작 식물체의 안정성을 높여 유전자 조작 식품 산업에 유용하게 이용될 것이다.

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Claims

단백질의 접힘에 관여하는 샤페론(chaperone) 중 하나인 식물 유래의 바인딩 프로테인(binding protein: BiP) 유전자를 표지 유전자로 이용한 것을 특징으로 하는 유전자 조작 식물체 선별 방법.
제 1항에 있어서, 유전자 조작 식물체 선별방법은 (1)식물체의 투니카마이신 농도에 따른 내성 정도 확인; (2) 바인딩 프로테인 유전자를 발현시키는 식물 발현벡터를 제작하는 단계; (3) 상기의 단계 (2)에서 제작된 벡터를 아그로박테리아에 도입시킨 후, 상기 아그로박테리아를 감자와 공동배양하여 형질전환시키는 단계; (4) 상기의 단계 (3)의 형질전환된 식물세포를 재분화시켜 형질전환 된 식물체를 선별하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 유전자 조작 식물체 선별 방법.
제 1항 또는 제 2항에 있어서, 식물 유래의 바인딩 프로테인 유전자는 서열번호 1의 염기서열을 가지는 콩, 감자, 벼, 고구마, 고추, 토마토, 옥수수, 땅콩, 해바라기, 애호박, 면화를 포함하는 작물의 바인딩 프로테인 유전자인 것을 특징으로 하는 유전자 조작 식물체 선별 방법.
제 2항에 있어서, 식물 발현벡터는 기존의 Ti-플라스미드 벡터들에서 선별유전자를 제거하고 바인딩 프로테인 유전자를 발현하도록 고안된 것을 특징으로 하는 유전자 조작 식물체 선별 방법.
제 2항에 있어서, 상기 식물 발현벡터는 도 2에 기재된 플라스미드 벡터 pCAMBIA1301-BiP-GUS 인 것을 특징으로 하는 유전자 조작 식물체 선별 방법.