JP6521669B2 - 標的dnaに変異が導入された植物細胞、及びその製造方法 - Google Patents
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Description
(a)前記マーカー遺伝子の5’側に第1のヌクレアーゼ認識部位を介して第1の相同DNAが付加されており、
(b)前記マーカー遺伝子の3’側に第2のヌクレアーゼ認識部位を介して第2の相同DNAが付加されており、
(c)第1の相同DNAの3’末端領域と第2の相同DNAの5’末端領域とが相同な30〜500ヌクレオチドからなるDNA配列(短鎖重複DNA配列)であり、
(d)第1の相同DNA及び第2の相同DNAの少なくとも1のDNAにおいて、前記短鎖重複DNA配列以外の領域に所望の変異が導入されている。
(1) 下記工程(i)〜(iii)を含む、標的DNAに変異が導入された植物細胞の製造方法
(i)標的DNAと相同な第1のDNA及び第2のDNAと、マーカー遺伝子とを含むDNA構築物であって、下記(a)〜(d)の特徴を有するDNA構築物を、植物細胞に導入する工程、
(a)前記マーカー遺伝子の5’側に第1のヌクレアーゼ認識部位を介して第1の相同DNAが付加されており、
(b)前記マーカー遺伝子の3’側に第2のヌクレアーゼ認識部位を介して第2の相同DNAが付加されており、
(c)第1の相同DNAの3’末端領域と第2の相同DNAの5’末端領域とが相同な30〜500ヌクレオチドからなるDNA配列(短鎖重複DNA配列)であり、
(d)第1の相同DNA及び第2の相同DNAの少なくとも1のDNAにおいて、前記短鎖重複DNA配列以外の領域に所望の変異が導入されている
(ii)第1及び第2の相同DNAと前記標的DNAとの相同組換えにより、第1及び第2のヌクレアーゼ認識部位に挟まれた前記マーカー遺伝子と前記変異とが当該標的DNAに導入されている植物細胞を、前記マーカー遺伝子の発現を指標として選択する工程、
(iii)工程(ii)にて選択された細胞に、第1及び第2のヌクレアーゼ認識部位を特異的に認識するヌクレアーゼを発現させ、前記マーカー遺伝子、並びに第1及び第2のヌクレアーゼ認識部位を当該標的DNAから除去する工程。
(2) 前記ヌクレアーゼはI−SceIである、(1)に記載の方法。
(3) (1)又は(2)に記載の方法により製造された、標的DNAに変異が導入された植物細胞。
(4) 標的DNAと相同な第1のDNA及び第2のDNAと、マーカー遺伝子とを含むDNA構築物であって、下記(a)〜(d)の特徴を有するDNA構築物が導入されることにより、第1及び第2のヌクレアーゼ認識部位に挟まれた前記マーカー遺伝子と下記変異とが、第1及び第2の相同DNAとの相同組換えによって標的DNAに導入された植物細胞
(a)前記マーカー遺伝子の5’側に第1のヌクレアーゼ認識部位を介して第1の相同DNAが付加されており、
(b)前記マーカー遺伝子の3’側に第2のヌクレアーゼ認識部位を介して第2の相同DNAが付加されており、
(c)第1の相同DNAの3’末端領域と第2の相同DNAの5’末端領域とが相同な30〜500ヌクレオチドからなるDNA配列(短鎖重複DNA配列)であり、
(d)第1の相同DNA及び第2の相同DNAの少なくとも1のDNAにおいて、前記短鎖重複DNA配列以外の領域に所望の変異が導入されている。
(5) 前記ヌクレアーゼはI−SceIである、(4)に記載の植物細胞。
(6) (3)〜(5)のうちのいずれか一に記載の細胞を含む植物体。
(7) (6)に記載の植物体の子孫又はクローンである植物体。
(8) (6)又は(7)に記載の植物体の繁殖材料。
(9) 標的DNAと相同な第1のDNA及び第2のDNAと、マーカー遺伝子とを含むDNA構築物であって、下記(a)〜(d)の特徴を有するDNA構築物
(a)前記マーカー遺伝子の5’側に第1のヌクレアーゼ認識部位を介して第1の相同DNAが付加されており、
(b)前記マーカー遺伝子の3’側に第2のヌクレアーゼ認識部位を介して第2の相同DNAが付加されており、
(c)第1の相同DNAの3’末端領域と第2の相同DNAの5’末端領域とが、相同な30〜500ヌクレオチドからなるDNA配列(短鎖重複DNA配列)であり、
(d)第1の相同DNA及び第2の相同DNAの少なくとも1のDNAにおいて、前記短鎖重複DNA配列以外の領域に所望の変異が導入されている。
(10) (1)又は(2)に記載の方法に用いるための、下記(a)及び(b)を含むキット
(a)(9)に記載のDNA構築物
(b)第1及び第2のヌクレアーゼ認識部位を特異的に認識するヌクレアーゼを、植物細胞内に発現させるためのDNA構築物。
(i)標的DNAと相同な第1のDNA及び第2のDNAと、マーカー遺伝子とを含むDNA構築物であって、下記(a)〜(d)の特徴を有するDNA構築物を、植物細胞に導入する工程、
(a)前記マーカー遺伝子の5’側に第1のヌクレアーゼ認識部位を介して第1の相同DNAが付加されており、
(b)前記マーカー遺伝子の3’側に第2のヌクレアーゼ認識部位を介して第2の相同DNAが付加されており、
(c)第1の相同DNAの3’末端領域と第2の相同DNAの5’末端領域とが相同な30〜500ヌクレオチドからなるDNA配列(短鎖重複DNA配列)であり、
(d)第1の相同DNA及び第2の相同DNAの少なくとも1のDNAにおいて、前記短鎖重複DNA配列以外の領域に所望の変異が導入されている
(ii)第1及び第2の相同DNAと前記標的DNAとの相同組換えにより、第1及び第2のヌクレアーゼ認識部位に挟まれた前記マーカー遺伝子と前記変異とが当該標的DNAに導入されている植物細胞を、前記マーカー遺伝子の発現を指標として選択する工程、
(iii)工程(ii)にて選択された細胞に、第1及び第2のヌクレアーゼ認識部位を特異的に認識するヌクレアーゼを発現させ、前記マーカー遺伝子、並びに第1及び第2のヌクレアーゼ認識部位を当該標的DNAから除去する工程。
前述の通り、本発明の製造方法によれば、標的DNAに所望の変異のみが導入されている植物細胞を得ることができる。したがって、本発明は、前記製造方法により製造された、標的DNAに変異が導入された植物細胞を提供するものである。
本発明の植物細胞は、再生させることにより植物体を得ることができる。特に、本発明の製造方法により製造された植物細胞は、標的DNAに所望の変異のみを有しているため、このような植物細胞から再生させた植物体は、当該変異に伴い、表現型が変化しうる。したがって、本発明の方法を利用すれば、植物の育種を効率的に行うことが可能であり、また標的DNAの機能を効率よく分析することが可能となる。
前述の通り、本発明のDNA構築物は、本発明の製造方法において有用であり、その有効性も本発明において初めて示されたものである。したがって、本発明は、標的DNAと相同な第1のDNA及び第2のDNAと、マーカー遺伝子とを含むDNA構築物であって、上記(a)〜(d)の特徴を有するDNA構築物をも提供するものである。
(A)標的DNAと相同な第1のDNA及び第2のDNAと、マーカー遺伝子とを含むDNA構築物であって、上記(a)〜(d)の特徴を有するDNA構築物
(B)第1及び第2のヌクレアーゼ認識部位を特異的に認識するヌクレアーゼを植物細胞内に発現させるためのDNA構築物。
(a)前記マーカー遺伝子の5’側に第1のヌクレアーゼ認識部位を介して第1の相同DNAが付加されており、
(b)前記マーカー遺伝子の3’側に第2のヌクレアーゼ認識部位を介して第2の相同DNAが付加されており、
(c)第1の相同DNAの3’末端領域と第2の相同DNAの5’末端領域とが、相同な30〜500ヌクレオチドからなるDNA配列(短鎖重複DNA配列)であり、
(d)第1の相同DNA及び第2の相同DNAの少なくとも1のDNAにおいて、前記短鎖重複DNA配列以外の領域に所望の変異が導入されている。
<ジーンターゲッティング(GT)ベクターの構築>
PDS遺伝子座を標的としたGTベクター(ポジティブ・ネガティブ選抜ベクター)を以下のようにして構築した。
<1st PCR>
AscPDS 4.7kF 5’−ttctggcgcgccTGCATGAGGAGGCAAACGAGGTCCT−3’(配列番号:1)
I−SceI PDS 7.3kR 5’−ACCCTGTTATCCCTAGCTTAAACCTGTGCAAAAGGATCTGGGCA−3’(配列番号:2)
<2nd PCR >
AscPDS4.7kF 5’−ttctggcgcgccTGCATGAGGAGGCAAACGAGGTCCT−3’(配列番号:3)
Pac I−SceI PDS 7.3kR 5’−GAAGTTAATTAATTACCCTGTTATCCCTAGCTTAAACCT−3’(配列番号:4)。
<1st PCR>
I−SceI PDS 7.3kF 5’−ACCCTGTTATCCCTATGCCCAGATCCTTTTGCACAGGTTTAAGCT−3’(配列番号:5)
Pac PDS 10kR 5’−ATTGTTAATTAAagtgagtgcaaagggagaTAAGGTCTCT−3’(配列番号:6)
<2nd PCR>
Asc I−SceI PDS 7.3kF 5’−AATTGGCGCGCCATTACCCTGTTATCCCTATGCCCAGATCCT−3’(配列番号:7)
Pac PDS 10kR 5’−ATTGTTAATTAAagtgagtgcaaagggagaTAAGGTCTCT−3’(配列番号:6)。
次に、前記GTベクターを用い、以下に示す方法にて、標的DNAに所望の変異のみを有する植物体の作製を試みた。
Thsp17.3F 5’−ACATACCCATCCAACAATGTTCAATCCCTT−3’(配列番号:11)
PDS−10.15kR 5’−TGGATTTGTAGAGTTAGAAATACCTGACTT−3’(配列番号:12)
PDS−4.2kF 5’−TGATGGACTGATTGGCTGATGGTGGT−3’(配列番号:13)
TactP35S 554R 5’−CTGACGATGAGAATATATCTGATGCTGTGA−3’(配列番号:14)。
nptII+23Fw 5’−TTGAACAAGATGGATTGCAC−3’(配列番号:15)
nptII+527Rv 5’−GGCATCGCCATGTGTCACGA−3’(配列番号:16)。
PDS−6.2kF 5’−AGGTAGAAATGCCATGCGGGAAGT−3’(配列番号:17)
PDS−8.33kR 5’−TCCGACTTGGAACCAAATAATTCA−3’(配列番号:18)。
PDS−7.2kF 5’−TCACATTGGGAAGAACTGGCAGT(配列番号:19)。
さらに、痕跡無くポジティブ選抜マーカーが除去されていることが明らかとなった植物体のDNAを用いて、図9に示すサザンブロット解析を行った。GT後に痕跡無くマーカーが除去された場合、PDS遺伝子座に残るのは点変異のみである。すなわち、当該植物体からゲノムDNAを抽出し、SacIにて処理した。次いで、それら処理産物を電気泳動にて分画し、PDS遺伝子をプローブとしたサザンブロット解析を行い、野生型のそれと同一のバンドパターンになることを確認した。得られた結果を図10に示す。なお、検出に用いたDIGプローブの作製に用いたプライマーは以下の通りである。
PDS−8.7kF 5’−TGCAAGGTACTAACTAGGAGACATT−3’(配列番号:20)
PDS−9.33kR 5’−TTGTAAACAGATCTGTAACAGTGA−3’(配列番号:21)。
非特許文献2においては、マーカー遺伝子と、その両端に配置したヌクレアーゼI−SceIの認識部位とが挿入されているレポーター遺伝子を有するT−DNAを、植物細胞に導入し、レポーター遺伝子がゲノムDNAにランダムに挿入された植物細胞においてI−SceIを発現させることにより、レポーター遺伝子からマーカー遺伝子を除去できることが示されている。さらに前記T−DNAにおいて、該認識部位の外側600bpの配列を一致(重複)させることにより、マーカー遺伝子の切り出し後に、切断末端の当該重複DNA配列間にて相同組換えが生じ、I−SceI認識部位も除去することができることが示されている。
<223> 人工的に合成されたプライマーの配列
配列番号:8
<223> PDS 7311−7340
配列番号:9
<223> I−SceIフォワード
配列番号:10
<223> I−SceIリバース
Claims (6)
- 下記工程(i)〜(iii)を含む、標的DNAに変異が導入された植物細胞の製造方法
(i)標的DNAと相同な第1のDNA及び第2のDNAと、マーカー遺伝子とを含むDNA構築物であって、下記(a)〜(e)の特徴を有するDNA構築物を、植物細胞に導入する工程、
(a)前記マーカー遺伝子の5’側に第1のヌクレアーゼ認識部位を介して第1の相同DNAが付加されており、
(b)前記マーカー遺伝子の3’側に第2のヌクレアーゼ認識部位を介して第2の相同DNAが付加されており、
(c)第1の相同DNAの3’末端領域と第2の相同DNAの5’末端領域とが、相同な30〜500ヌクレオチドからなるDNA配列(短鎖重複DNA配列)であり、
(d)第1の相同DNA及び第2の相同DNAの少なくとも1のDNAにおいて、前記短鎖重複DNA配列以外の領域に所望の変異が導入されている
(e)第1及び第2のヌクレオチド認識配列が同一のヌクレアーゼに特異的に認識される非対称配列であり、前記DNA構築物において、第1のヌクレオチド認識配列の向きと第2のヌクレオチド認識配列の向きとが逆になっている
(ii)第1及び第2の相同DNAと前記標的DNAとの相同組換えにより、第1及び第2のヌクレアーゼ認識部位に挟まれた前記マーカー遺伝子と前記変異とが当該標的DNAに導入されている植物細胞を、前記マーカー遺伝子の発現を指標として選択する工程、
(iii)工程(ii)にて選択された細胞に、第1及び第2のヌクレアーゼ認識部位を特異的に認識するヌクレアーゼを発現させ、前記マーカー遺伝子、並びに第1及び第2のヌクレアーゼ認識部位を当該標的DNAから除去する工程。 - 前記ヌクレアーゼはI−SceIである、請求項1に記載の方法。
- 標的DNAと相同な第1のDNA及び第2のDNAと、マーカー遺伝子とを含むDNA構築物であって、下記(a)〜(e)の特徴を有するDNA構築物が導入されることにより、第1及び第2のヌクレアーゼ認識部位に挟まれた前記マーカー遺伝子と下記変異とが、第1及び第2の相同DNAとの相同組換えによって標的DNAに導入された植物細胞
(a)前記マーカー遺伝子の5’側に第1のヌクレアーゼ認識部位を介して第1の相同DNAが付加されており、
(b)前記マーカー遺伝子の3’側に第2のヌクレアーゼ認識部位を介して第2の相同DNAが付加されており、
(c)第1の相同DNAの3’末端領域と第2の相同DNAの5’末端領域とが、相同な30〜500ヌクレオチドからなるDNA配列(短鎖重複DNA配列)であり、
(d)第1の相同DNA及び第2の相同DNAの少なくとも1のDNAにおいて、前記短鎖重複DNA配列以外の領域に所望の変異が導入されている
(e)第1及び第2のヌクレオチド認識配列が同一のヌクレアーゼに特異的に認識される非対称配列であり、前記DNA構築物において、第1のヌクレオチド認識配列の向きと第2のヌクレオチド認識配列の向きとが逆になっている。 - 前記ヌクレアーゼはI−SceIである、請求項3に記載の植物細胞。
- 標的DNAと相同な第1のDNA及び第2のDNAと、マーカー遺伝子とを含むDNA構築物であって、下記(a)〜(e)の特徴を有するDNA構築物
(a)前記マーカー遺伝子の5’側に第1のヌクレアーゼ認識部位を介して第1の相同DNAが付加されており、
(b)前記マーカー遺伝子の3’側に第2のヌクレアーゼ認識部位を介して第2の相同DNAが付加されており、
(c)第1の相同DNAの3’末端領域と第2の相同DNAの5’末端領域とが、相同な30〜500ヌクレオチドからなるDNA配列(短鎖重複DNA配列)であり、
(d)第1の相同DNA及び第2の相同DNAの少なくとも1のDNAにおいて、前記短鎖重複DNA配列以外の領域に所望の変異が導入されている
(e)第1及び第2のヌクレオチド認識配列が同一のヌクレアーゼに特異的に認識される非対称配列であり、前記DNA構築物において、第1のヌクレオチド認識配列の向きと第2のヌクレオチド認識配列の向きとが逆になっている。 - 請求項1又は2に記載の方法に用いるための、下記(a)及び(b)を含むキット
(a)請求項5に記載のDNA構築物
(b)第1及び第2のヌクレアーゼ認識部位を特異的に認識するヌクレアーゼを、植物細胞内に発現させるためのDNA構築物。
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