KR100781053B1 - 고역가 글루코아밀라제를 생산하는 신규한 리조푸스 속 균주 k s d-815 - Google Patents

Abstract

본 발명은 기존의 글루코아밀라제 생산 리조푸스 속 균주를 돌연변이원 처리하여 당화력이 극도로 향상된 변이주를 분리선별하고, 이를 알콜 발효에 사용하는 방법에 관한 것으로 무증자 당화력을 가진 글루코아밀라제 역가가 월등히 향상된 본 발명 변이주는 전통주의 생산성 및 풍미를 향상시키는 매우 뛰어난 효과가 있다.

리조푸스 속 균주, 글루코아밀라제, 전통주, 술

Description

고역가 글루코아밀라제를 생산하는 신규한 리조푸스 속 균주 K S D-815{Novel Rhizopus sp. KSD-815 producing glucoamylase with high activity}

본 발명은 돌연변이원 처리에 의해 선별된 고역가 글루코아밀라제 활성을 갖는 변이주 리조푸스속 균주 KSD-815에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 기존의 글루코아밀라제 생산균에 UV, NTG, EMS 등의 다양한 돌연변이원을 처리하여 생존한 균주들 중에서 친주에 비해 글루코아밀라제 활성이 매우 우수한 균주를 선별하고 이를 전통주의 제조에 이용하는 방법에 관한 것이다.

약주, 청주, 탁주 등의 전분질 기타 곡류를 원료로 하는 양조 시의 품질 향상을 위해 사용하는 쌀의 품종이나 누룩균의 선택, 누룩의 제조방법, 담금수의 수질이나 주모용 효모의 개선 등에 관한 연구가 많이 행하여져 오고 있다. 이 중 누룩 또는 누룩균의 특성은 발효주의 풍미 및 생산성에 많은 영향을 미친다.

이러한 누룩 제조에 일반적으로 사용되는 아스퍼질러스 오리자에는 비교적 엿당 생성능이 강한 α -아밀라제, 미약한 글루코아밀라제 및 α -글루코시다제 활성을 가지는데 주효소인 α -아밀라제는 생쌀에는 작용못하고 찐 쌀에 작용하여 그 호화전분으로부터 덱스트린, 올리고당, 그리고 발효성의 엿당과 포도당을 생성하는 것으로 알려져 있으며, 생성되는 당의 대부분이 엿당이라 주정의 발효속도가 포도당의 것보다 매우 늦은 특징이 있다. 그렇기 때문에 상기 균주는 생쌀에는 작용이 약한 한계가 있으며 또한 찐쌀과 상기 균을 사용하여 누룩을 담글 경우에도 발효성당의 생성 및 축적에 많은 시간이 걸릴뿐만 아니라, 시간 지연에 따라 오염균의 증식을 방지하는 것이 힘든 문제점이 있었다.

이에 따라, 당화에 원료를 찔 것없이 물을 흡수시키고 리조푸스 속 사상균을 접종하여 여기에 생산되는 글루코아밀라제에 의해 당화시키는 기법이 채용되어 왔다. 리조푸스속 사상균 유래의 글루코아밀라제는 전분으로부터 직접 포도당을 생성할 수 있기 때문에 찌지 않은 전분이나 기타 곡류원료도 쉽게 포도당으로 당화시킬 수 있는 장점이 있다. 그러나, 찌지 않은 원료를 사용하여 발효시키는 경우 사용효소의 순도 및 역가가 낮아 효소제를 원료인 쌀에 많은 양 사용해야 하는 문제점이 있었다. 특히, 전통 약주 및 탁주는 제조 과정상 불가피하게 사용되는 누룩 또는 조효소제에 의해 특이한 풍미가 나는데, 이는 누룩의 제조나 보존상에 따라 상당히 변화가 심하여 최종 제품의 균일한 품질을 유지하는데 어려움이 따른다. 특히나 누룩 또는 조효소의 역가가 낮아 그 사용량이 많아질 경우 특유한 이취가 강하게 남으로써 제품의 질적 저하를 가져오게 된다. 따라서, 특히 누룩 또는 조효소제의 역가를 상승시키는 것은 생산성 개선 효과뿐만 아니라 특유의 이취를 감소시켜 풍미를 개선효과를 가져온다.

본 발명자들은 이러한 이취의 원인이 되는 누룩의 사용량을 줄이기 위해 무 엇보다 무증자 당화력이 우수한 균주를 선별하기 위하여 기존의 글루코아밀라제 생산 리조푸스 속 균주에 NTG 및 기타 다양한 돌연변이원 처리를 하고 이중 당화력이 극도로 개량된 변이주를 선별한 결과 기존의 발표된 균주들과 친주에 비해 당화력이 월등히 향상되고 아직까지 공지사실로 발표된 바 없는 신규 균주를 확보하고, 이를 실제 전통주 제조에 활용한 결과 생산성을 향상시키고 이취를 줄여 풍미가 매우 향상된 술을 제조할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 기존의 곰팡이들이 갖는 글루코아밀라제의 활성보다 획기적으로 향상된 활성을 갖는 신규한 리조푸스 변이주를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 균주를 배양하여 수득되는 고역가 글루코아밀라제 함유 균주배양물이나 배양액을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 균주를 이용하여 술의 제조에 사용될 수 있는 국 또는 조효소제의 제조방법 및 이로부터 제조되는 국 또는 조효소제를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 본 발명 변이주를 사용하여 알콜 발효의 생산성 향상 및 곰팡이 특유의 이취를 감소시켜 기호도를 증진시킨 약주, 탁주 등의 술의 제조방법을 제공하는 것이다.

이하, 본 발명의 구성을 보다 상세히 설명한다.

본 발명은 고역가의 글루코아밀라제를 생산하는 신규한 리조푸스 속 균주 및 이러한 신규의 균주를 이용하여 발효주를 제조하는 방법에 관한 것으로, 보다 상세 하게는 자연으로부터 분리한 리조푸스속 균주를 공지의 인위적 돌연변이방법을 이용하여 친주에 비해 글루코아밀라제 활성을 월등히 증가시킨 신규한 리조푸스 속균주 KSD-815(한국미생물보존센터 기탁번호 KFCC-11279)를 제조하고, 이를 전분질 기타 곡류를 원료로 하는 발효주의 제조에 이용하는 방법에 관한 것이다.

돌연변이 방법은 당업계에 공지된 방법을 이용할 수 있는데, 본 발명자들은 공시균주의 포자 현탁액을 제조하고 이를 NTG를 포함한 다양한 돌원변이원 처리를 하고 생존한 변이주들의 조효소액을 제조한 후, 고역가의 당화력을 갖는 변이주를 선별하였으며, 그 결과 최종적으로 선별된 균주를 Rhizopus sp. KSD-815라 명명하였다. 상기 균주는 현재 2001년 8월 20일 기탁번호 KFCC-11279로 한국미생물보존센터에 기탁되어 있다. 본 발명 균주는 완전배지에서 생육시켜 보면, 25-30℃에서 생육이 왕성하며 포자의 크기가 친주에 비해 약간 작고 포자의 색이 더욱 백색이며, 자낭과 중축이 있는 많은 구형의 포자낭을 형성하며 긴 포자낭병은 포복지의 기근 부위에 분기하지 않고 직립하며, 생육은 특히 30℃에서 빠르고 콜로니의 앞면은 회색 또는 백색으로 전형적인 Rhizopus 속의 특징을 나타낸다.

당화력 측정에 사용된 조효소액의 조제는 국세청의 발효제 분석규정에 따라 수행하였다. 먼저 조효소제 10g에 1% NaCl 용액 20ml를 가하고 가끔 흔들면서 실온에서 3시간 침출한 후 여과하여 5%의 침출액을 얻어 적당히 희석하여 조효소액으로 수득하고 다음의 실험에 사용하였다. 상기 방법에 의해 준비한 조효소액의 당화효소력 측정은 국세청의 발효제 분석규정에 따라 수행하였다. 즉, 조효소제 10g에 1% NaCl 용액 200ml를 가하고 가끔 흔들면서 실온에서 3시간 침출하여 5%의 침출액을 얻는다. 초산 완충액으로 pH를 5.0으로 조정한 2% 가용성 전분맥을 기질로, 조효소제 침출액을 효소액으로 하여(희석배수를 적당히 하여) 55℃에서 60분간 효소반응을 시킨 후 생성된 환원당의 양을 lane-Eynon법으로 측정하여 당화율을 산출하고 이에 효소의 희석배수를 곱하여 조효소제의 당화력으로 하였다. 또한, 무증자 당화력의 측정은 문헌에 기재된 방법(Korean J. Appl. Microbiol. Bioeng. 15, 1987)에 따라 20mg의 옥수수가루와 0.1M 아세테이트 완충액(pH 4.5) 0.2ml 그리고 1.6 ml 증류수로 구성된 반응물로 측정하였다.

일반적으로 전통 누룩에서 분리된 무증자 당화력이 약한 아스퍼질러스 속 곰팡이 균주들의 당화력은 5,000-8,000SP 정도로 알려져 있고(Korean J. Food ＆ Nutrition Vol.6, No2., 89-95, 1993; Korean J. Food ＆ Nutrition Vol.8, No.1, 6-12, 1995), 무증자 당화력이 강한 리조푸스 속 곰팡이들은 5,000-6,000SP로 알려져 있는데(Korean J. Food ＆ Nutrition Vol. 6, No.2, 96-102, 1993), 본 발명자들이 분리 선별한 리조푸스 속 균주 KSD-815(KFCC-11279)의 당화력은 보통 사용되는 존통누룩의 역가(2,000-3,000SP)보다는 4-5배 정도 높을 뿐만 아니라, 돌연변이 전의 기존 친주인 리조푸스 속 균주와 상기 공지된 발표 균주들보다는 무려 약 2배정도 높은 역가를 나타낸다.

무증자 당화력이 뛰어난 본 발명 균주를 전분질 기타 곡류를 원료로 하여 알콜 발효를 통해 약주, 탁주, 청주 등의 술의 제조에 사용할 경우 원료로 가급적 미량의 누룩을 종래의 양보다 절반으로 줄일 수 있는 특징이 있다. 즉, 찌지 않은 정백미 및 기타 전분질 원료, 물 또는 산을 첨가한 물, 및 본 발명 균주를 고체배양 하여 제조한 글루코아밀라제 함유 누룩을 원료로 하고 여기에 효모를 가하여 담그고 발효시킴으로써 약주, 탁주 등의 발효주를 제조할 수 있다. 이와 같이 글루코아밀라제 활성이 매우 높은 잇점으로 인해 종래의 누룩 첨가량을 최대한 제한하여 이취발생을 억제하고 풍미를 향상시키며, 자원절약을 꾀할 수 있고 원료의 이용성을 높여 생산성을 향상시킬 수도 있다.

한편, 본 발명 리조푸스속 사상균 유래의 글루코아밀라제를 배양물이나 배양액 형태 또는 조효소제나 고도로 정제된 형태로 술의 제조에 사용할 수 있다. 글루코아밀라제 생산균인 본 발명 변이주를 배양하고 그의 배양물로부터 추출, 정제함으로써 글루코아밀라제를 수득하는 것은 당업계에 공지되어 있다. 예컨대, 본 발명 변이주로부터 글루코아밀라제를 추출하는 방법으로는 사상균 균체 추출물 또는 리조푸스 사상균 배양액을 산성으로 완충시킨 강음이온 교환수지의 칼럼을 통과시킴으로써 색소와 프로테아제를 흡착 제거시키고 글루코아밀라제의 활성은 손실없이 무색의 유출액 중에서 회수할 수 있는데, 상기 유출액을 탈염한 후 적절히 농축시킨 후에 동결건조 또는 분무건조시키면 정제된 글루코아밀라제를 수득할 수 있다.

약주의 기호성에 맞게 가급적 미량의 누룩을 첨가하여 양조를 실시하거나 또는 정백미를 직접 원료로 사용하여 양조에 허용되고 있는 범위 내의 정제 글루코아밀라제(또는 조효소액이나 배양물/배양액)를 첨가하여 당화할 수 있음으로 인해 종래의 이취 등의 문제점을 해결할 수도 있다. 본 발명균주에서 유도된 글루코아밀라제가 생곡류 전분의 당화분해력이 강력하고 분해한도가 높은 것은 하기 실시예에 입증된 바와 같다.

본 발명의 한 바람직한 실시예에 있어서, 본 발명 리조푸스 변이주를 이용하여 제조한 전통주의 풍미 및 기호도가 매우 우수한 것으로 나타났다. 탁주, 약주, 청주 등의 전분질이나 곡류를 원료로 알콜 발효를 통해 제조되는 전통주의 특성과 기호도에 대한 시험결과는 다음과 같은 방법으로 평가하였다. 산도측정은 발주 10ml를 취해 0.1N NaOH로 pH 7.0이 될 때까지 적정할 때 첨가된 NaOH의 ml 수로 표시하였으며, 단백질분해 효소력의 측정은 Anson 개량법에 따라 pH 7.0으로 조정한 0.6% 카제인 용액을 기질로, 조효소제 침출액을 효소액으로 하여 40℃에서 10분간 효소반응을 시킨 후 생성된 Folin 발색성 비단백성 물질의 양을 Folin 비색법으로 측정하여 조효소제 1g이 1분간에 생성하는 티로신의 mg 수로 나타내었다 또한, 기호도 검사는 관능검사 인원을 15명으로 하여 발효주의 색감, 향취 및 미감을 5점 평점법을 사용하여 관능평가하였다(참조 : 장건형, 식품의 기호성 관능검사, 개문사, 1975).

이하, 실시예에 의해 본 발명의 구성 및 작용효과를 보다 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 목적일 뿐 본 발명의 권리범위가 하기 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.

실시예 1 : 고역가 변이주의 선별

실험예 1 : 포자현탁액의 조제

포자현탁액은 공시균주를 Czapeck solution agar 배지의 시험관에 접종하여 28℃에서 사면배양하여 포자를 충분히 형성시켜, 살균된 0.1% Tween 80용액을 3-5ml 넣어 백금이로 포자를 서서히 교반시켜 유리시킨다. 같은 방법으로 2회 포자를 유리시킨 후 약간의 균사가 함유된 포자현탁액을 격렬하게 진탕하여 균사와 포자를 완전히 유리시켜 살균된 탈지면으로 여과하여 균사를 제거시킨다. 포자현탁액을 10,000 X g에서 10-15분간 원심분리하여 포자를 침전시킨다. 침전된 포자를 멸균수로 씻은 다음 20% 글리세롤 용액으로 포자수가 1.0 × 10⁹ 포자/ml 되게 포자현탁액을 조제하였다. 포자현탁액은 -70℃에서 보관하면서 사용하였다.

실험예 2 : 변이주의 분리

친주의 포자 현탁액을 멸균수로 세척한 후, 0.5M Tris-HCl 완충액(pH 9.0)으로 현탁하고 변이원인 NTG를 1-3mg/ml 첨가하였다. 이 현탁액을 30℃에서 15분간처리(1-10% 생존율)한 후, 멸균수로 2회 세척하였다. 세척된 균주를 완전배지(2% glucose, 0.1% K₂HPO₄, 0.05% MgSO₄·7H₂O, 0.05% KCl, 0.2% NaNO₃, 0.01% FeSO₄· 7H₂O, 0.5% yeast extract, 0.5% casamino acid, 1.5% agar, pH 5.6)에 도말하여 28℃에서 3일간 생육시킨 후 육안으로 보았을 때 친주와 다른 포자색과 생육양상을 보이거나 생육속도가 빠른 균주 5종을 선별하였다.

실험예 3 : 변이주의 효소활성

분리된 변이주를 밀기울 배지에서 생육시킨 후, 생성된 글루코아밀라제의 활성을 측정한 결과 표 1과 같이 친주보다 약 2배 정도의 활성이 나타나는 Mutant-3를 분리하였고 이를 리조푸스 속 균주 KSD-815라 명명하였다. 이러한 결과는 일반적으로 사용되는 존통누룩의 역가인 2,000-3,000SP보다는 4-5배 높은 역가이고 기존의 친주보다는 약 2배가 높은 역가이다. 따라서, 변이원 처리에 의한 리조푸스속 균주 KSD-815의 산업적가치는 충분할 것으로 생각된다.

[표 1]

친주와 변이주의 당화력

실험예 4 : 변이주의 형태적 특징

친주인 리조푸스 속 균주 KSD-4와 이로부터 얻어진 변이주 리조푸스 속 균주 KSD-815를 완전배지에서 30℃, 3일간 생육시켜 자란 콜로니의 형태적 특성을 살펴본 결과(표 2), 친주보다 25-30℃에서 생육이 더욱 왕성하며 포자의 크기가 약간 작고 포자의 색이 더욱 백색인 것을 제외하고는 동일하였다. 즉, 자낭과 중축이 있는 많은 구형의 포자낭을 형성하며 긴 포자낭병은 포복지의 기근 부위에 분기하지 않고 직립하며, 생육은 특히 30℃에서 빠르고 콜로리의 앞면은 회색 또는 백색으로 전형적인 Rhizopus 속의 특징을 나타내었다(Compendium of soil fungi, Voll. 703-709, 1993./Atlas of the geneus Rhizopus and its allies, CCRC, Taiwan, ROC).

[표 2]

친주와 변이주의 형태학적 특징

실시예 2 : 변이주를 이용한 전통약주의 제조

본 실시예에서는 본 발명 변이주의 전통주에 대한 풍미개선 효과 및 생산성 행상에 대한 검증실험을 위하여 다음과 같이 전통주를 제조하여 상품화 가능성을 타진하였다.

실험예 1 : 변이주 리조푸스 속 균주 KSD-815를 이용한 조효소제의 제조

수분을 가하지 않은 밀기울을 증자하고 밀기울 중량 60%의 0.1% 염산수와 40%의 Rhizopus sp. KSD-815 배양액을 고르게 섞은 다음 스테인레스 바트에 2cm 정도의 두께로 고르게 깐 다음 28-30℃에서 3일간 배양하였다. 배양 후 수분 10% 내외로 건조하여 분쇄하였다.

밀기을 증자 + 0.1% 염산수 + Rhizopus sp. KSD-815 배양액

↓

배양(28-30℃ , 3일)

↓

건조

↓

분쇄

실험예 2 : 변이주 Rhizopus sp. KSD-815를 이용한 전통주의 제조

친주 Rhizopus sp. KSD-4와변이주 Rhizopus sp. KSD-815 균주를 이용하여 상기의 방법대로 조효소제를 제조한 다음 각각의 역가를 측정한 결과 각각 5,880SP 및 11,000SP가 나왔다. 전통주 제조를 위한 원료의 구성은 하기 표 3과 같았다. 열처리를 하지 않은 찹쌀을 약 1시간 가량 침지후 분쇄하여 조효소제 및 효모 그리고 물을 첨가하여 25℃ 전후에서 7일간 발효시켰다.

[표 3]

전통주 제조를 위한 원료 구성

상기의 표와 같이 조효소제의 양을 절반으로 줄일 수 있어 생산성 개선에 효과가 있고 발효경과는 하기 표 4와 같이 두 실험구 모두 유의적인 차이는 없었으나, 실험구 2의 경우 직당의 함량이 오히려 높아 원주의 주질이 향상되었다. 풍미 역시 실시예에서와 같이 조효소제의 사용량이 상대적으로 적은 실험구 2가 우수하였다.

[표 4]

친주 및 변이주의 조효소제를 이용한 전통약주의 발효경과

실험예 3 : 변이주 Rhizopus sp. KSD-815를 전통주의 관능검사

변이주 리조푸스 속 균주 KSD-815를 이용하여 상기의 방법에 준하여 조효소제를 제조한 후, 실험예 2과 같이 전통주를 제조하여 기호도를 조사한 결과 표 5와같이 색감 및 향취의 경우 조효소제의 사용량이 적은 변이주 Rhizopus sp. KSD-815의 경우가 우수했고, 마찬가지로 미감 역시 우수한 것으로 판명되었다.

[표 5]

변이주 Rhizopus sp. KSD-815를 이용한 전통주의 관능검사 결과

이상에서 설명하고 입증하였듯이 본 발명에 의한 고역가의 변이주 Rhizopus sp. KSD-815를 이용하여 전통주를 제조할 때 기존보다 훨씬 양호해진 풍미의 전통주 제조 및 생산성 향상에 기여할 수 있다.

무증자 당화력을 가지면서 글루코아밀라제 활성이 획기적으로 향상된 리조푸스 속 균주를 이용하여 전통주를 제조할 때 기존보다 100% 이상의 생산성 향상 및 곰팡이 특유의 이취를 효과적으로 제거함으로써 전통주를 고급화하는 효과가 있다.

Claims (4)

1. 글루코아밀라제 활성을 갖는 변이주 리조푸스 속 균주 KSD-815(KFCC-11279)
2. 제1항의 균주를 배양하는 것을 포함하여 글루코아밀라제를 제조하는 방법.
3. 제2항의 방법에 의해 제조된 글루코아밀라제를 함유하는 조효소제나 배양물 또는 배양액.
4. 제1항의 균주 또는 제3항의 조효소제나 배양물 또는 배양액을 이용하여 술을 제조하는 방법.