KR100774925B1 - 표적지향을 위한 나노입자 및 그의 제조방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 히알루론산 또는 그의 염; Cu2 +, Cu3 +, Zn2 +, Zn3 +, Ni2 +, Ni3 +, Mg2 +, Mg3+, Ca2 +, Ca3 +, Co2 +, Co3 +, Ba2 +, Ba3 +, Fe2 +, 및 Fe3 + 등의 2가 또는 3가의 전이금속 이온 또는 알카리 토금속 이온; 및 치료학적으로 유효한 양의 항암제를 포함하는, 10 ∼ 1,000 nm의 평균 입자경을 갖는, 나노입자 및 그의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 나노입자는 히알루론산 또는 그의 염과 다양한 구조의 항암제와의 혼합물을 금속이온을 이용하여 나노입자화시켜 제조된 약물송달시스템으로서, 나노입자에 의한 EPR 효과를 통한 항암제의 수동표적지향 및 히알루론산과 암세포와의 친화력을 통한 항암제의 능동표적지향을 동시에 가능하게 한다. 즉, 본 발명에 따른 나노입자는 암세포에 선택적으로 작용할 수 있는 나노-약물송달시스템으로서, 고형암 뿐만 아니라 전이암에도 선택적으로 작용할 수 있다. 또한, 본 발명의 나노입자는 생체적합성이 우수하고, 암세포에 대하여 높은 친화력을 가지며, 물리화학적인 안정성을 갖는다.
약물송달시스템, 나노입자, 항암제, 표적지향, 히알루론산

Description

표적지향을 위한 나노입자 및 그의 제조방법{Nano-particles for targeting and processes for the preparation thereof}
도 1 및 도 2는 본 발명에 따라 얻어진 나노입자(실시예 1에서 제조된 나노입자)의 주사전자현미경(Scanning Electron Microscope) 측정 사진이다. (도 1: 10,000 배, 도 2: 40,000 배)
도 3a, 3b 및 도 4a, 4b는 본 발명에 따라 얻어진 나노입자의 CD44에 대한 친화도를 측정한 시험 결과이다.
본 발명은 표적지향을 위한 나노입자 및 그의 제조방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 히알루론산 또는 그의 염; 금속이온; 및 치료학적으로 유효한 양의 항암제를 포함하는, 표적지향을 위한 나노입자 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
항암제(또는 항종양제)를 이용한 종래의 암치료는 암세포뿐만 아니라 인체 내의 정상세포에도 영향을 미치므로, 다양한 부작용을 초래하는 것으로 알려져 있다. 이를 개선하기 위해 수동표적지향(passive targeting) 및 능동표적지향(active targeting)을 포함한 다양한 표적지향 방법이 연구되고 있으나, 아직 만족할만한 수준에는 이르지 못하고 있다.
수동표적지향 방법은 미세입자가 몸속에서 지속적인 혈액순환에 의해 비정상적인 혈관을 가진 암세포에만 선택적으로 축적되는 것을 의미한다. 예를 들어, 암세포의 경우 정상세포와는 달리 비정상적인 성장속도로 비대해지기 때문에 정상적인 세포의 일정한 내피세공(aligned endothelial pores)에 비해 크기가 크거나 다양한 크기의 내피세공을 지니고 있다. 종양세포의 혈관 내피세공의 크기는 약 10 nm 에서 1000 nm까지 아주 다양한 크기를 지니고 있다. 따라서, 항암제를 함유한 입자성 전달체를 미세화하여 혈액 속에서 계속적으로 순환시킬 경우, 암세포에만 나노입자들이 축적되고 정상세포의 혈관내피에는 침투하지 못하는데, 이를 투과성/잔류성 향상 효과 (Enhanced permeation and retention effect, "EPR" 효과)라 한다. 수동표적지향 방법의 예로는 소립자 리포좀 에어로졸을 이용하여 항암제를 암세포에 전달하는 방법(국제특허공개 제WO1999/15153, 대한민국 특허공개 제10-2001-0024232호) 및 항암물질에 실리카 나노입자를 결합시킨 주사 제형의 약물송달시스템으로 암세포에 직접 주사하는 방법(대한민국 특허공개 제10-2003-0091678호) 등이 알려져 있다.
능동표적지향 방법은 암세포 표면에 과발현되는 분자를 특이적으로 인식하는 수용체, 예를 들어 렉틴, 성장인자, 사이토카인, 호르몬, 불포화지방산, 저밀도 지질단백질, 엽산 등의 수용체를 이용하여 약물송달시스템을 제작하여, 암세포에 항암제를 수송하는 방법이다(S.P Vyas., et. al., Advanced Drug Delivery Review 43 (2000) 101-164). 생분해성 고분자 또는 리포좀 등에 항암제를 결합 및/또는 봉입 시킨 후, 암세포 표면에 과발현되는 분자를 특이적으로 인식하는 수용체를 부착시킨 다양한 약물송달시스템이 알려져 있다. 예를 들어, 미국특허 제6,593,308호는 리포좀 등의 캡슐화 수송 비히클(encapsulating delivery vehicle) 및 히알루로난(hyaluronan) 리간드를 포함하는 약물송달시스템을 개시하고 있다. 상기 약물송달시스템에서 항암제는 상기 비히클 내에 봉입되게 되며, 비이클에 리간드를 부착시키기 위한 연결제(linking agent) 또는 킬레이트화제로서 금속이온을 사용한다. 기타, 미국특허 제6,699,471호는 히알루론산의 벤질 에스테르 또는 히알루론산의 자가-가교된(auto-cross-linked) 유도체를 포함하는 겔 형태의 주사용 제제를 개시한 바 있다. 기타, 암세포에 친화도가 매우 높다고 알려진 단일클론 항체를 이용한 표적지향 방법(Stanislv J., et al., Bioorg. Medic. chem.(2005) 13, 5043-5054)도 보고되고 있다.
그러나, 상기한 종래의 표적지향 방법은 수동표적지향만을 목적으로 하거나 또는 능동표적지향만을 목적으로 설계된 것으로, 고형암 뿐만 아니라 전이암을 동시에 치료할 수 있는 표적지향 방법 즉, 수동표적지향 및 능동표적지향을 동시에 달성할 수 있는 표적지향 방법이 요구된다. 나아가, 항암제 수송을 위해 리포좀 등의 별도의 비히클을 설계하여야 하는 데에서 비롯되는 제조상의 문제점(예를 들어, 유기용매의 사용, 제조과정의 복잡성 등)을 해결할 수 있는 표적지향 방법이 당업계에 요구된다.
본 발명은 수동표적지향 및 능동표적지향을 동시에 달성할 수 있는 히알루론 산 또는 그의 염을 이용한 표적지향을 위한 약물송달시스템을 제공한다. 즉, 항암제(항종양제)와 히알루론산 또는 그의 염의 혼합물을 금속이온을 사용하여 나노입자를 형성시킴으로써, 투과성/잔류성 향상 효과 (Enhanced permeation and retention effect, "EPR" 효과)에 의한 항암제의 수동표적지향(passive targeting) 및 히알루론산에 의한 항암제의 능동표적지향(active targeting)을 동시에 달성할 수 있는 약물송달시스템을 제공한다.
따라서, 본 발명은 수동표적지향 및 능동표적지향을 동시에 달성할 수 있는, 히알루론산 또는 그의 염; 금속이온; 및 치료학적으로 유효한 양의 항암제를 포함하는 나노입자를 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 나노입자의 제조방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 일 태양에 따라, 히알루론산 또는 그의 염; 2가 또는 3가의 전이금속 이온 또는 알카리 토금속 이온; 및 치료학적으로 유효한 양의 항암제를 포함하는, 10 ∼ 1,000 nm의 평균 입자경을 갖는, 나노입자가 제공된다.
본 발명의 다른 태양에 따라, (a) 히알루론산 또는 그의 염 및 항암제를 물, 유기용매, 또는 물과 유기용매의 혼합용매에 용해시키는 단계; (b) 단계(a)에서 얻어진 용액에 2가 또는 3가의 전이금속 이온 또는 알카리 토금속 이온을 가하여 나노입자가 분산된 분산액을 제조하는 단계; 및 (c) 단계(b)에서 얻어진 분산액을 건조시키는 단계를 포함하는, 10 ∼ 1,000 nm의 평균 입자경을 갖는, 나노입자의 제조방법이 제공된다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명의 나노입자에 있어서, 히알루론산 또는 그의 염과 다양한 구조의 항암제와의 혼합물은 서로 이온적 상호작용(ionic interaction) 또는 소수적 상호작용(hydrophobic interaction) 등의 상호작용을 하게 되며, 이를 2가 또는 3가의 금속이온을 이용하여 나노입자화시킬 경우, 나노입자에 의한 투과성/잔류성 향상 효과 (Enhanced permeation and retention effect, "EPR" 효과)를 통한 항암제의 수동표적지향(passive targeting) 및 히알루론산과 암세포와의 친화력을 통한 항암제의 능동표적지향(active targeting)을 동시에 가능하게 한다. 즉, 본 발명에 따른 나노입자는 암세포에 선택적으로 작용할 수 있는 나노-약물송달시스템으로서, 고형암 뿐만 아니라 전이암에도 선택적으로 작용할 수 있다. 또한, 본 발명의 나노입자는 생체적합성이 우수하고, 암세포에 대하여 높은 친화력을 가지며, 물리화학적인 안정성을 갖는다.
본 명세서에서, "나노입자"라 함은 약 1000 nm 이하의 크기를 갖는 히알루론산(또는 그의 염)-항암제-금속이온으로 이루어진 약물전달체를 말한다. 상기 나노입자의 평균입자경은 EPR 효과(Enhanced permeation and retention effect)를 가능하게 하는 크기, 예를 들어 10 ∼ 1,000 nm, 바람직하게는 50 ∼ 500 nm, 더욱 바람직하게는 50 ∼ 300 nm를 갖는다.
본 발명은 히알루론산 또는 그의 염; 2가 또는 3가의 전이금속 이온 또는 알카리 토금속 이온; 및 치료학적으로 유효한 양의 항암제를 포함하는, 10 ∼ 1,000 nm, 바람직하게는 50 ∼ 500 nm, 더욱 바람직하게는 50 ∼ 300 nm의 평균 입자경을 갖는, 나노입자를 포함한다.
상기 히알루론산은 인체 내에 존재하는 친수성 다당체로서, D-글루코론산(D-glucoronic acid)과 N-글루고스아민(N-glucosamine)의 이당체(Disaccharide, 분자량 379)의 기본 단위(Unit)가 긴 사슬처럼 연결된 고분자(High molecular weight hetero-polysaccharide)의 형태로 존재하며, 세포의 성장, 분화, 및 이동(migration) 등 세포외 간질(extracelluar matrix) 내에서 다양한 기능을 담당한다. 히알루론산의 광범위한 활성은 세포 표면 당단백질인 CD44 등과 같은 다수의 히알루론산-결합 수용체, 히알루론산-매개 운동성 (Receptor for hyaluronic acid-mediated motility, RHAMM)에 대한 수용체 및 기타 히알루론산-결합 요소(motifs)를 갖는 다른 수용체 등에 의해 설명된다 (S. Jaracz et al., Recent advances in tumor-targeting anticancer drug conjugates, Bioorg. Med. Chem. 13 (2005) 5043-5054). 특히, 다양한 종양, 예를 들어 상피(epithelial), 난소(ovarian), 결장(colon), 위장(stomach), 및 급성 백혈병(acute leukemia)은 히알루론산-결합 수용체인 CD44 및 RHAMM 을 과발현하는 것으로 알려져 있으며(Day, A. J.; Prestwich, G. D. J. Biol. Chem. 2002, 277, 4585; 및 Turley, E. A.; Belch, A. J.; Poppema, S.; Pilarski, L. M. Blood 1993, 81, 446), 결과적으로 이들 종양 세포들은 증진된 히알루론산의 결합 및 내재화(internalization)을 나타낸다 (Hua, Q.; Knudson, C. B.; Knudson, W. J. Cell Sci. 1993, 106, 365). 또한, 히알루론산은 종양세포의 전이 과정에도 관여한다 [Sleeman, J. et al., Cancer. Res.(1996) 56, 3134]. 따라서, 본 발명에 따른 나노입자는 히알루론산을 에너지원 으로 사용하거나 종양세포에 특이적인, 즉 능동표적지향이 가능한 약물송달시스템으로서 작용하게 된다.
본 발명의 나노입자에 사용되는 상기 히알루론산은 이당체의 기본 단위체가 연속적으로 결합되어 있는 형태로서, 나노입자를 형성하는데 있어서 이들 기본 단위체가 중요한 역할을 하며, 이들 단위체와 상기 금속이온과의 결합에 의해 나노입자가 형성된다. 본 발명의 나노입자에 사용되는 상기 히알루론산의 분자량은 특별히 제한된 것은 아니며, 예를 들어, 상기 히알루론산의 평균분자량은 1,000 ∼ 10,000,000 달톤일 수 있고, 바람직하게는 1,000 ∼ 4,000,000 달톤, 더욱 바람직하게는 1,000 ∼ 1,500,000 달톤일 수 있다. 또한, 상기 히알루론산의 염은 다양한 염 형태일 수 있으며, 예를 들어, 히알루론산 코발트, 히알루론산 마그네슘, 히알루론산 아연, 히알루론산 칼슘, 히알루론산 칼륨, 히알루론산 나트륨 등의 무기염 및 히알루론산 테트라부틸암모늄 등의 유기염 형태일 수 있다. 바람직하게는 히알루론산 나트륨을 사용할 수 있다. 본 발명의 나노입자는 상기 히알루론산 또는 히알루론산의 염을 각각 포함하거나, 히알루론산과 히알루론산의 염을 혼합하여 포함할 수 있다.
본 발명의 나노입자는 2가 또는 3가의 전이금속 이온 또는 알카리 토금속 이온을 포함한다. 상기 2가 또는 3가의 전이금속 이온 또는 알카리 토금속 이온은 Cu2+, Cu3 +, Zn2 +, Zn3 +, Ni2 +, Ni3 +, Mg2 +, Mg3 +, Ca2 +, Ca3 +, Co2 +, Co3 +, Ba2 +, Ba3 +, Fe2 +, 및 Fe3 +로 이루어진 군으로부터 1 종 이상 선택될 수 있다. 상기 2가 또는 3가의 전 이금속 이온 또는 알카리 토금속 이온은 히알루론산(또는 그의 염)의 이당체의 기본단위(분자량 379) 내의 글루코로닉 모이어티(glucoronic moieties)에 존재하는 카르복실기와 복합체(complex)를 형성한다. 또한, 부수적으로 상기 금속이온은 히알루론산(또는 그의 염)의 당쇄 사이의 히드록시기의 산소(Hydroxylic oxygen) 및/또는 산소(oxygen) 원자와 반응하거나 N-글루코사민 모이어티(N-glucosamine moieties)의 아미드 그룹과도 반응하여 복합체를 형성한다. 즉, 히알루론산의 이당체(Disaccharide)의 기본단위(Unit)와 상기 금속이온과의 반응에 의해 나노입자 복합체가 형성되며, 제조된 나노입자는 히알루론산의 기본단위인 이당체와 전이금속 이온 간의 결합비에 의해 나노입자 형성이 조절된다. 히알루론산(또는 그의 염)-약물-금속이온의 상호작용에 의하여, 얻어지는 입자의 크기가 미세화되어 나노입자가 형성된다.
본 발명의 나노입자에 포함되는 상기 금속이온은 다양한 금속염으로부터 유래될 수 있으며, 예를 들어 염화구리, 염화아연, 염화니켈, 염화마그네슘, 염화칼슘, 염화코발트, 염화바륨, 질산철, 또는 염화철로부터 유래될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 상기 금속이온 중 바람직하게는 인체 내에 존재하는 성분인 Fe2 + 또는 Fe3 + 이온을 바람직하게 사용할 수 있으며, 상기 Fe2 + 또는 Fe3 + 이온은 질산철 또는 염화철로부터 유래될 수도 있다.
상기 금속이온은 나노입자가 형성될 수 있는 함량으로 사용된다. 즉, 사용되는 상기 금속이온의 양은 히알루론산 또는 그의 염 이당체의 기본 단위 당 0.05∼ 0.8의 몰비(molar ratio)로 사용될 수 있으며, 0.1∼0.4의 몰비로 사용하는 것이 더욱 바람직하다. 히알루론산 또는 그의 염 이당체 단위 당 사용되는 금속이온의 몰비가 0.8을 초과하는 경우에는 응집이나 침전이 발생할 수 있으며, 0.05보다 낮은 경우에는 나노입자의 형성이 곤란해질 수 있다. 상기 금속이온의 함량을 조절함으로써, 얻어지는 나노입자의 크기를 조절할 수 있다. 따라서, 수동표적지향을 위한 약물송달시스템을 설계하고자 할 경우, 금속이온의 함량을 조절함으로써, EPR 효과(Enhanced permeation and retention effect)를 최적화할 수 있는 크기의 나노입자를 얻을 수 있다.
본 발명의 나노입자는 암세포의 성장, 전이 등을 억제하는 활성을 갖는 화학적 및/또는 생물학적 물질, 즉 항암제(항종양제)를 포함한다. 상기 항암제가 수성 용매 중에서 이온성 즉, + 또는 - 전하를 갖는 경우에는(예, 이리노데칸, 멜파란, 클로람부실, 옥살리플라틴 등) 히알루론산 또는 그의 염에 존재하는 카르복실기, 히드록시기, 아민기 등과 이온적 상호작용(ionic interaction)을 하게 된다. 또한, 상기 항암제가 수성 매질에서 소수성의 성질을 갖는 경우에는(예, 파크리탁셀 등), 히알루론산 또는 그의 염의 소수성 부위(hydrophobic sites)와 소수적 상호작용(hydrophobic interaction)에 의해서 항암제 분자가 히알루론산 또는 그의 염에 함유되거나 끼워지게(embeding) 되게 된다. 따라서, 본 발명의 나노입자에 함유되는 항암제는 그 종류가 제한되지 않는다. 본 발명의 나노입자에 함유되는 항암제의 예는 이리노테칸 (Irinotecan), 옥살리플라틴 (Oxaliplatin), 멜파란 (Melphalan), 클로람부실 (Chlorambucil), 테니포사이드 (Teniposide), 파클리탁셀 (Paclitaxel), 도세탁셀 (Docetaxel), 우라실 (Uracil), 5-플루오로우라실 (5-Fluorouracil), 테가퍼 (Tegafur), 비노엘바인 비타르트레이트 (Vinorelbine bitartrate), 메토트렉세이트 (Methotrexate), 카르보플라틴 (Carboplatine), 시스플라틴 (Cisplatine), Doxorubicine HCl (Doxorubicin HCl), 사이토신 아라비노사이드 HCl (Cytocine arabinoside HCl), 미톡산트론 HCl (Mitoxantrone HCl), 타목시펜 시트레이트 (Tamoxifen Citrate), 니무스틴 HCl (Nimustine HCl), 다우노루비신 HCl (Daunorubicin HCl), 에피루비신 HCl (Epirubicin HCl), 아이다루비신 HCl (Idarubicin HCl), 독시플루리딘 (Doxifludine), 다카르바진 (Dacarbazine), 티오구아닌(Thioguanine), 포르메스탄 (Formestane), 레우프로렐린 아세테이트 (Leuprorelin acetate), 트레티노인 (Tretinoin), 빈블라스틴 설페이트 (Vinblastine sulfate), 빈크리스틴 설페이트 (Vincristine sulfate), 테니포사이드(Teniposide), 에토포사이드 HCl(Etoposide HCl), 카르무스틴(Carmustine(BCNU)), 로무스틴, 에스트라무스틴, 라니무스틴, 사이마이드, 사이클로포스파마이드, 포카르바진 (Porcarbarzine), 젬시타빈, 도세탁셀, 카페시타빈 (Capecitabine), 이마티닙 메실레이트 (Imatinib mesylate), 리툭시맵 (Rituximab), 독시플루리딘 (Doxifluridine), 토레미펜 시트레이트(Toremifene citrate) 등을 포함하며, 바람직하게는 도세탁셀, 카페시타빈 (Capecitabine), 이마티닙 메실레이트 (Imatinib mesylate), 리툭시맵 (Rituximab), 독시플루리딘 (Doxifluridine), 토레미펜 시트레이트(Toremifene citrate), 파클리탁셀, 독소루비신, 젬시타빈, 이리노데칸, 옥살리플라틴, 멜파란, 또는 클로람부실 등을 포함한 다. 또한, 상기 "치료학적으로 유효한 양(therapeutically effective amount)"는 사용되는 항암제에 따라 상이하며, 당업자는 각각의 항암제에 대하여 공지된 유효량 범위를 어려움 없이 선택할 수 있다.
본 발명에 따른 나노입자는 나노입자의 안정성을 증진시키기 위해 안정화제를 포함할 수 있다. 상기 안정화제로는 카르복실 기를 갖는 아미노산을 사용할 수 있으며, 예를 들어 아스파르트산(aspartic acid) 또는 글루탐산(glutamic acid)을 사용할 수 있다. 상기 안정화제는 자신의 카르복실기를 매개로 금속이온과 상호작용함으로써, 나노입자 전체를 안정화시키게 된다.
상기 안정화제(예를 들어, 아스파르트산 또는 글루탐산)의 양은 나노입자에 함유되는 히알루론산 또는 그의 염의 이당체의 기본 단위 당 0.2∼15의 몰비로 사용될 수 있으며, 0.25∼10의 몰비로 사용하는 것이 더욱 바람직하다.
본 발명은 상기 나노입자의 제조방법을 포함한다. 즉, 본 발명은 (a) 히알루론산 또는 그의 염 및 항암제를 물, 유기용매, 또는 물과 유기용매의 혼합용매에 용해시키는 단계; (b) 단계(a)에서 얻어진 용액에 2가 또는 3가의 전이금속 이온 또는 알카리 토금속 이온을 가하여 나노입자가 분산된 분산액을 제조하는 단계; 및 (c) 단계(b)에서 얻어진 분산액을 건조시키는 단계를 포함하는, 10 ∼ 1,000 nm, 바람직하게는 50 ∼ 500 nm, 더욱 바람직하게는 50 ∼ 300 nm의 평균 입자경을 갖는, 나노입자의 제조방법을 포함한다.
본 발명의 제조방법에 있어서, 상기한 바와 같이, 히알루론산의 평균분자량은 1,000 ∼ 10,000,000 달톤일 수 있고, 바람직하게는 1,000 ∼ 4,000,000 달톤, 더욱 바람직하게는 1,000 ∼ 1,500,000 달톤일 수 있다. 또한, 상기 히알루론산의 염은 예를 들어, 히알루론산 코발트, 히알루론산 마그네슘, 히알루론산 아연, 히알루론산 칼슘, 히알루론산 칼륨, 히알루론산 나트륨, 히알루론산 테트라부틸암모늄 등의 형태일 수 있다. 바람직하게는 히알루론산 나트륨을 사용할 수 있다. 또한, 히알루론산 또는 히알루론산의 염을 각각 사용하거나, 이를 혼합하여 사용할 수도 있다.
또한, 상기 2가 또는 3가의 전이금속 이온 또는 알카리 토금속 이온은 예를 들어 염화구리, 염화아연, 염화니켈, 염화마그네슘, 염화칼슘, 염화코발트, 염화바륨, 질산철, 황산철, 또는 염화철로부터 유래될 수 있다. 또한, Fe2 + 또는 Fe3 + 이온을 바람직하게 사용할 수 있으며, 상기 Fe2 + 또는 Fe3 + 이온은 질산철, 황산철 또는 염화철로부터 유래될 수 있다.
상기 2가 또는 3가의 전이금속 이온 또는 알카리 토금속 이온은 히알루론산 또는 그의 염 이당체의 기본 단위 당 0.05∼0.8의 몰비로 사용될 수 있으며, 0.1∼0.4의 몰비로 사용하는 것이 더욱 바람직하다.
또한, 상기한 바와 같이, 상기 항암제는 그 종류가 제한되는 것은 아니며, 상기에서 열거한 항암제를 제한 없이 사용할 수 있고, 예를 들어 도세탁셀, 카페시타빈 (Capecitabine), 이마티닙 메실레이트 (Imatinib mesylate), 리툭시맵 (Rituximab), 독시플루리딘 (Doxifluridine), 토레미펜 시트레이트(Toremifene citrate), 파클리탁셀, 독소루비신, 젬시타빈, 이리노데칸, 옥살리플라틴, 멜파란, 또는 클로람부실 등을 사용할 수 있다.
상기 히알루론산 또는 그의 염 및 항암제를 물, 유기용매, 또는 물과 유기용매의 혼합용매에 용해시키는 단계[단계 (a)]에 있어서, 상기 유기용매 또는 상기 물과 유기용매의 혼합용매에 있어서의 유기용매는 히알루론산 또는 그의 염 및 항암제를 용해시킬 수 있다면 제한 없이 사용할 수 있다. 상기 유기용매의 예는 C1 -5 알콜, 디메틸술폭시드, 클로로포름, 이염화탄소, 에틸아세테이트, 메틸아세테이트, 피리딘, 벤젠, 톨루엔, 아세토니트릴, 테트라히드로퓨란, 사염화탄소, 아세톤 등을 포함하며, 바람직하게는 에탄올을 사용할 수 있다. 또한, 물과 유기용매의 혼합용매로는 물과 에탄올의 혼합용매를 바람직하게 사용할 수 있다.
상기한 바와 같이, 히알루론산 또는 그의 염 및 항암제를 포함한 용액의 매질은 유기용매 또는 유기용매와 물의 혼합용매를 사용할 수 있으나, 바람직하게는 물을 사용하는 것이 유기용매의 사용으로 인한 독성 문제 혹은 제조과정에서의 환경오염 문제를 배제할 수 있다. 또한, 매질의 pKa의 변화를 최소화하기 위해서 MOPS (3-(N-morpholino)propanesulfonic acid) 완충액 등의 양성이온성 완충액(zwitterionic buffer)을 사용할 수도 있다.
히알루론산 또는 그의 염 및 항암제를 포함한 용액의 제조에 있어서, 필요할 경우 가온하거나 계면활성제를 가할 수도 있다. 예를 들어, 정제수에 히알루론산 또는 그의 염 및 항암제를 가하여 교반하면서 약 40 ∼ 60 ℃로 가온하거나, 계면활성제를 가하여 수용액을 제조할 수도 있다. 상기 계면활성제는 스판20, 스판40, 스판60, 스판83과 같은 소르비탄 에스테르류(Sorbitan esters) 및 트윈20, 트윈40, 트윈60, 트윈80과 같은 폴르소르베이트류(Polysorbates) 및 HCO(Hydrogenerated castor oil)과 같은 폴리옥시에틸렌 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 제조방법에 있어서, 상기 단계(a)는 pH를 2.6 내지 11.8의 범위로 조절하는 단계를 더욱 포함할 수 있다. 항암제의 종류에 따라 얻어지는 용액의 pH가 상이하며, 따라서 별도의 pH 조절이 불필요할 수 있다. 그러나, 용액의 pH가 상기 범위(즉, pH 2.6 내지 11.8)를 벗어나는 경우, 나노입자의 형성이 곤란해 질 수 있다.
본 발명의 제조방법은 상기 단계(a)로부터 얻어진 용액에 상기한 2가 또는 3가의 전이금속 이온 또는 알카리 토금속 이온을 가함으로써 나노입자가 분산된 분산액을 얻는 단계[단계(b)]를 포함한다. 예를 들어, 상기 단계(a)에서 얻어진 용액에 금속이온을 가하고, 100 ∼ 1,000 rpm, 바람직하게는 약 200 ∼ 400 rpm 으로, 약 5 분 내지 24 시간 동안, 바람직하게는 약 5 분 내지 2 시간 동안 교반하면, 금속이온과 히알루론산(또는 그의 염)과의 상호작용에 의하여 나노입자를 형성한다. 즉, 용액 상태로 존재하는 히알루론산(또는 그의 염)-항암제가 금속이온을 매개로 입자화되어(즉, bottom-up) 나노 크기의 입자를 형성하게 된다. 상기에서 얻어진 분산액은 나노입자가 수성 매질에 골고루 미세하게 분산되어 있는 형태로서, 육안으로는 용액으로 보여질 수 있다.
본 발명의 제조방법은 상기 단계(b)에서 얻어진 분산액을 건조시키는 단계[단계 (c)]를 포함한다. 상기 건조는 통상의 건조방법, 예를 들어 동결건조 또는 분무건조에 의해 수행될 수 있으며, 바람직하게는 동결건조에 의해 수행될 수 있다. 상기와 같이 얻어진 나노입자 분말은 사용시 조제용 주사제 형태로 환자에게 투여될 수 있다.
본 발명의 제조방법에 있어서, 상기 단계(b)에서 얻어진 분산액을 장시간 보관하지 않고, 건조 과정을 수행할 경우에는 별다른 어려움 없이 나노입자를 얻을 수 있다. 그러나, 생산 현장에서의 제조 과정에서, 건조 과정을 수행하기 전에 상기 분산액을 소정의 기간 동안 보관하여야 하는 경우가 발생하게 된다. 이 경우, 상기 분산액에 존재하는 나노입자들 사이에 응집 현상이 발생하여 나노입자를 얻는 것이 곤란할 수 있으므로, 제조 과정이 복잡해 질 수 있다.
따라서, 분산액 중에 존재하는 나노입자의 안정화 및 얻어지는 나노입자의 안정화를 위해 안정화제를 포함할 수 있다. 상기 안정화제로는 상기한 카르복실 기를 갖는 아미노산을 사용할 수 있으며, 예를 들어 아스파르트산 또는 글루탐산을 사용할 수 있다. 상기 안정화제는 자신의 카르복실기를 매개로 금속이온과 상호작용함으로써, 나노입자 전체를 안정화시키게 된다.
상기 안정화제(예를 들어, 아스파르트산 또는 글루탐산)는 단계(a)의 수용액 제조시 첨가하거나, 단계(b)의 분산액 제조시 첨가할 수 있다.
상기 안정화제(예를 들어, 아스파르트산 또는 글루탐산)의 양은 나노입자에 함유되는 히알루론산 또는 그의 염의 이당체의 기본 단위 당 0.2∼15의 몰비로 사용될 수 있으며, 0.25∼10의 몰비로 사용하는 것이 더욱 바람직하다.
이하, 본 발명을 실시예를 통하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나 이들 실시 예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예
하기 실시예를 위해 사용된 재료 및 구입처는 다음과 같다. 히알루론산 및 그의 염(소듐염)은 바이오랜드(한국), 파인 케미칼(한국), Bioiberica(스페인), 아피(일본), 기븐 푸드(일본)에서 각기 다른 분자량의 것들을 공급받았다. 아세톤, 인산완충용액, MOPS (3-(N-morpholino)propanesulfonic acid) 완충액, 글루탐산, 아스파르트산, 글라이신, 형광 이소티오시아네이트(Fluorescein isothiocyanate, FITC), 에틸렌디아민(ethylenediamine), N-히드록시숙신이미드(N-hydroxysuccinimide, NHS), 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)-카르보디이미드(1-Ehtyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide, EDC), 1,3-디시클로헥실 카르보디이미드(1,3-dicyclohexyl carbodiimide, DCC) 및 Cu2 +, Zn2 +, Ni2 +, Mg2 +, Ca2 +, Co2 +, Ba2+ 등 2가 금속이온과 Fe3 +와 같은 금속이온들은 모두 시그마-알드리치(미국)와 플루카화학(독일)에서 구입하였다. 나노입자의 형상분석 장비는 Hitachi S-4300SE모델의 주사전자현미경을 사용하였으며, 나노입자크기에 대한 분석은 Malvern사의 Zetasizer NanoZS 분석장비를 이용하였으며, 건조 과정 전의 분산액 중의 입자크기를 측정하였다. 입자크기의 비교신뢰를 위해 Nicomp 388 Submicron Particle Sizing Analyzer를 사용하였다. 분석 암세포의 친화도 테스트를 위해, CD44를 발현하는 MDA-MB-231셀(ATCC : HTB-26, Manassas, VA)과 CD44를 발현하지 않는 ZR- 75-1셀(ATCC : CRL-1500, Manassas, VA)을 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection, ATCC)에서 구입하였다. 그 외 모든 시약들은 분석용 급을 사용하였다.
실시예 1. 3가 질산철을 사용하여 제조한 히알루론산 나노입자
소디움 히알루론산(분자량 80만, Bioland사) 45 mg을 0.02M 글루탐산 수용액 15 mL에 가하여 0.3 % 히알루론산 용액을 제조하였다. 얻어진 용액을 400 rpm으로 교반하면서, 0.05M 질산철(III) 수용액 360 ∼ 480 uL을 가하고 2시간 동안 계속 교반하였다. 얻어진 용액을 동결건조하여, 나노입자 분말을 얻었다. 얻어진 입자의 입자크기를 분석한 결과는 다음 표 1과 같다.
0.05M 질산철(III)용액 나노입자크기
360 uL 첨가 235 nm
380 uL 첨가 240 nm
400 uL 첨가 253 nm
420 uL 첨가 256 nm
440 uL 첨가 271 nm
460 uL 첨가 275 nm
실시예 2. 3가 염화철을 사용하여 제조한 히알루론산 나노입자
0.05M 질산철(III) 수용액 대신 0.05M 염화철(III) 수용액을 사용한 것을 제외하고는 실시예 1과 동일한 방법으로 나노입자 분말을 얻었다. 얻어진 입자의 입자크기를 분석한 결과는 다음 표 2와 같다.
0.05M 염화철(III)용액 나노입자크기
360 uL 첨가 240 nm
380 uL 첨가 255 nm
400 uL 첨가 259 nm
420 uL 첨가 267 nm
440 uL 첨가 275 nm
460 uL 첨가 295 nm
실시예 3. 항암제( 이리노테칸 )를 함유하는 히알루론산 나노입자
이리노테칸 염산염 360 mg 및 소디움 히알루론산(분자량 95만, Kibun사) 135 mg을 0.02M 글루탐산 수용액 45 mL에 가하고, 약 60 ℃로 가온하여 수용액이 얻어질 때까지 교반하였다. 2 N 수산화나트륨을 사용하여 pH를 약 8.0 으로 조절하였다. 얻어진 용액을 400 rpm으로 교반하면서, 0.05M 질산철(III) 수용액 1290 uL을 가하고 2시간 동안 계속 교반하였다. 얻어진 용액을 동결건조하여, 나노입자 분말을 얻었다. (입자크기: 약 278 nm)
실시예 4. 항암제( 옥살리플라틴 )를 함유하는 히알루론산 나노입자
옥살리플라틴 225 mg 및 소디움 히알루론산(분자량 95만, Kibun사) 135 mg을 0.02M 글루탐산 수용액 45 mL에 가하고, 약 40 ℃로 가온하여 수용액이 얻어질 때까지 교반하였다. 얻어진 용액을 400 rpm으로 교반하면서, 0.05M 질산철(III) 수용액 1260 uL을 가하고 2시간 동안 계속 교반하였다. 얻어진 용액을 동결건조하여, 나노입자 분말을 얻었다. (입자크기: 약 310 nm)
실시예 5. 항암제( 멜파란 )를 함유하는 히알루론산 나노입자
멜파란 270 mg 및 소디움 히알루론산(분자량 95만, Kibun사) 135 mg을 0.02M 글루탐산 수용액 45 mL에 교반하면서 가하여 수용액을 얻었다. 얻어진 용액을 300 rpm으로 교반하면서, 0.05M 질산철(III) 수용액 1260 uL을 가하고 2시간 동안 계속 교반하였다. 얻어진 용액을 동결건조하여, 나노입자 분말을 얻었다. (입자크기: 약 250 nm)
실시예 6. 항암제( 클로람부실 )를 함유하는 히알루론산 나노입자
클로람부실 225 mg 및 소디움 히알루론산(분자량 95만, Kibun사) 135 mg을 0.02M 글루탐산 수용액 45 mL에 교반하면서 가하여 수용액을 얻었다. 얻어진 용액을 300 rpm으로 교반하면서, 0.05M 질산철(III) 수용액 1260 uL을 가하고 2시간 동안 계속 교반하였다. 얻어진 용액을 동결건조하여, 나노입자 분말을 얻었다. (입자크기: 약 280 nm)
실시예 7 항암제( 파클리탁셀 )를 함유하는 히알루론산 나노입자
파클리탁셀 225 mg 및 소디움 히알루론산(분자량 95만, Kibun사) 45 mg을 0.02M 글루탐산이 함유된 70% 에탄올용액 45 mL에 교반하면서 가하여 수용액을 얻었다. 얻어진 용액을 300 rpm으로 교반하면서, 0.05M 질산철(III) 수용액 840 uL을 가하고 2시간 동안 계속 교반하였다. 얻어진 용액을 동결건조하여, 나노입자 분말을 얻었다. (입자크기: 약 132 nm)
실시예 8 항암제( 젬시타빈 )를 함유하는 히알루론산 나노입자
젬시타빈 1,800 mg 및 소디움 히알루론산(분자량 95만, Kibun사) 45 mg을 0.02M 글루탐산 수용액 45 mL에 교반하면서 가하여 수용액을 얻었다. 얻어진 용액을 300 rpm으로 교반하면서, 0.05M 질산철(III) 수용액 840 uL을 가하고 2시간 동안 계속 교반하였다. 얻어진 용액을 동결건조하여, 나노입자 분말을 얻었다. (입자크기: 약 150 nm)
실시예 9. 2가 염화마그네슘을 사용하여 제조한 히알루론산 나노입자
소디움 히알루론산(분자량 80만, Bioland사) 15 mg을 0.02M 글루탐산 수용액 15 mL에 가하여 0.1 % 히알루론산 용액을 제조하였다. 얻어진 용액을 400 rpm으로 교반하면서, 0.1M MgCl2 수용액 860 uL을 가하고 2시간 동안 계속 교반하였다. 얻어진 용액을 동결건조하여, 나노입자 분말을 얻었다. (입자크기: 약 500 nm)
실시예 10. 2가 염화마그네슘을 사용하여 제조한 히알루론산 나노입자
0.1% 소디움 히알루론산(분자량 80만, Bioland사) 수용액 21 mL에 5 mg/mL의 농도가 되도록 이리노테칸을 가하고 1 시간 동안 교반하였다. 100 mM 염화나트륨이 함유된 20 mM MOPS 완충액에 20 mg/ml의 농도가 되도록 MgCl2를 용해시켜 얻은 용액 12 mL을 상기 수용액에 가하였다. 얻어진 용액을 동결건조하여 나노입자 분말을 얻었다. (입자크기: 약 150 nm)
실시예 11. 2가 염화구리를 사용하여 제조한 히알루론산 나노입자
소디움 히알루론산(분자량 80만, Bioland사) 15 mg을 0.02M 글루탐산 수용액 15 mL에 가하여 0.1 % 히알루론산 용액을 제조하였다. 얻어진 용액을 400 rpm으로 교반하면서, 0.1M CuCl2 수용액 860 uL을 가하고 2시간 동안 계속 교반하였다. 얻어진 용액을 동결건조하여, 나노입자 분말을 얻었다. (입자크기: 약 500 nm)
실시예 12. 2가 염화구리를 사용하여 제조한 히알루론산 나노입자
0.1% 소디움 히알루론산(분자량 80만, Bioland사) 수용액 21 mL에 5 mg/mL의 농도가 되도록 이리노테칸을 가하고 1 시간 동안 교반하였다. 100 mM 염화나트륨이 함유된 20 mM MOPS 완충액에 20 mg/ml의 농도가 되도록 CuCl2를 용해시켜 얻은 용액 12 mL을 상기 수용액에 가하였다. 얻어진 용액을 동결건조하여 나노입자 분말을 얻었다. (입자크기: 약 200 nm)
실시예 13. 2가 염화코발트를 사용하여 제조한 히알루론산 나노입자
소디움 히알루론산(분자량 80만, Bioland사) 15 mg을 0.02M 글루탐산 수용액 15 mL에 가하여 0.1 % 히알루론산 용액을 제조하였다. 얻어진 용액을 400 rpm으로 교반하면서, 0.1M CoCl2 수용액 860 uL을 가하고 2시간 동안 계속 교반하였다. 얻어진 용액을 동결건조하여, 나노입자 분말을 얻었다. (입자크기: 약 500 nm)
실시예 14. 2가 염화코발트를 사용하여 제조한 히알루론산 나노입자
0.1% 소디움 히알루론산(분자량 80만, Bioland사) 수용액 21 mL에 5 mg/mL의 농도가 되도록 이리노테칸을 가하고 1 시간 동안 교반하였다. 100 mM 염화나트륨이 함유된 20 mM MOPS 완충액에 20 mg/ml의 농도가 되도록 CoCl2를 용해시켜 얻은 용액 12 mL을 상기 수용액에 가하였다. 얻어진 용액을 동결건조하여 나노입자 분말을 얻었다. (입자크기: 약 120 nm)
실시예 15. 2가 염화아연을 사용하여 제조한 히알루론산 나노입자
소디움 히알루론산(분자량 80만, Bioland사) 15 mg을 0.02M 글루탐산 수용액 15 mL에 가하여 0.1 % 히알루론산 용액을 제조하였다. 얻어진 용액을 400 rpm으로 교반하면서, 0.1M ZnCl2 수용액 860 uL을 가하고 2시간 동안 계속 교반하였다. 얻어진 용액을 동결건조하여, 나노입자 분말을 얻었다. (입자크기: 약 400 nm)
실시예 16. 2가 염화아연을 사용하여 제조한 히알루론산 나노입자
0.1% 소디움 히알루론산(분자량 80만, Bioland사) 수용액 21 mL에 5 mg/mL의 농도가 되도록 이리노테칸을 가하고 1 시간 동안 교반하였다. 100 mM 염화나트륨이 함유된 20 mM MOPS 완충액에 20 mg/ml의 농도가 되도록 ZnCl2를 용해시켜 얻은 용액 12 mL을 상기 수용액에 가하였다. 얻어진 용액을 동결건조하여 나노입자 분말을 얻었다. (입자크기: 약 200 nm)
실시예 17. 2가 염화니켈을 사용하여 제조한 히알루론산 나노입자
소디움 히알루론산(분자량 80만, Bioland사) 15 mg을 0.02M 글루탐산 수용액 15 mL에 가하여 0.1 % 히알루론산 용액을 제조하였다. 얻어진 용액을 400 rpm으로 교반하면서, 0.1M NiCl2 수용액 860 uL을 가하고 2시간 동안 계속 교반하였다. 얻어진 용액을 동결건조하여, 나노입자 분말을 얻었다. (입자크기: 약 400 nm)
실시예 18. 2가 염화니켈을 사용한 히알루론산 나노입자 제조방법 #2
0.1% 소디움 히알루론산(분자량 80만, Bioland사) 수용액 21 mL에 5 mg/mL의 농도가 되도록 이리노테칸을 가하고 1 시간 동안 교반하였다. 100 mM 염화나트륨이 함유된 20 mM MOPS 완충액에 20 mg/ml의 농도가 되도록 NiCl2를 용해시켜 얻은 용액 12 mL을 상기 수용액에 가하였다. 얻어진 용액을 동결건조하여 나노입자 분말을 얻었다. (입자크기: 약 150 nm)
실시예 19. 2가 염화바륨을 사용하여 제조한 히알루론산 나노입자
소디움 히알루론산(분자량 80만, Bioland사) 15 mg을 0.02M 글루탐산 수용액 15 mL에 가하여 0.1 % 히알루론산 용액을 제조하였다. 얻어진 용액을 400 rpm으로 교반하면서, 0.1M BaCl2 수용액 860 uL을 가하고 2시간 동안 계속 교반하였다. 얻어진 용액을 동결건조하여, 나노입자 분말을 얻었다. (입자크기: 약 450 nm)
실시예 20. 2가 염화바륨을 사용하여 제조한 히알루론산 나노입자
0.1% 소디움 히알루론산(분자량 80만, Bioland사) 수용액 21 mL에 5 mg/mL의 농도가 되도록 이리노테칸을 가하고 1 시간 동안 교반하였다. 100 mM 염화나트륨이 함유된 20 mM MOPS 완충액에 20 mg/ml의 농도가 되도록 BaCl2를 용해시켜 얻은 용액 12 mL을 상기 수용액에 가하였다. 얻어진 용액을 동결건조하여 나노입자 분말을 얻었다. (입자크기: 약 100 nm)
실시예 21. 3가 질산철을 사용하여 제조한 히알루론산 나노입자
0.02M 글루탐산 수용액 45mL에 소디움 히알루론산(분자량 80만, Bioland사)을 가하여 7.71 x 10-3 M 소디움 히알루론산 수용액을 제조하였다. 얻어진 용액을 200 rpm으로 교반하면서, 1.235 x 10-3 M 질산철(III) 용액을 가하고, 24 시간 동안 교반하였다. 얻어진 용액을 동결건조하여 나노입자 분말을 얻었다. (입자크기: 약 300 nm)
실시예 22. 3가 염화철을 사용하여 제조한 히알루론산 나노입자
0.02M 글루탐산 수용액 45mL에 소디움 히알루론산(분자량 80만, Bioland사)을 가하여 7.71 x 10-3 M 소디움 히알루론산 수용액을 제조하였다. 얻어진 용액을 200 rpm으로 교반하면서, 1.235 x 10-3 M 염화철(III) 용액을 가하고, 24 시간 동안 교반하였다. 얻어진 용액을 동결건조하여 나노입자 분말을 얻었다. (입자크기: 약 350 nm)
실시예 23. 히알루론산 염으로부터 히알루론산의 제조
100% 에탄올과 0.1M 염산 수용액의 7 : 3 혼합용액 3 L에 12 g의 소디움 히알루론산을 넣어 분산시켰다. 얻어진 분산액을 상온에서 400 rpm으로 24 시간 동안 교반하고, 0.45 마이크론 멤브레인 필터를 사용하여 여과하였다. 필터 상에 남은 소디움 히알루론산을 100% 에탄올로 3회 세척하고, 진공 데시케이터에서 건조시켜 히알루론산을 제조하였다. (얻어진 히알루론산은 pH 측정(pH 2.68) 및 FT-IR기기를 사용한 분석(염 피이크를 존재 여부 확인)을 통하여 확인하였다.)
실시예 24. 3가 질산철을 사용하여 제조한 히알루론산 나노입자
실시예 23과 동일한 방법으로 얻은 히알루론산(분자량 80만) 45 mg을 0.02M 글루탐산 수용액 15 mL에 가하여 0.3 % 히알루론산 용액을 제조하였다. 얻어진 용액을 200 rpm으로 교반하면서, 0.05M 질산철(III) 수용액 360 ∼ 480 uL을 가하고 2시간 동안 계속 교반하였다. 얻어진 용액을 동결건조하여, 나노입자 분말을 얻었다. 얻어진 입자의 입자크기를 분석한 결과는 다음 표 3과 같다.
0.05M 질산철(III)용액 나노입자크기
360 uL 첨가 211 nm
380 uL 첨가 220 nm
400 uL 첨가 233 nm
420 uL 첨가 241 nm
440 uL 첨가 255 nm
460 uL 첨가 279 nm
480 uL 첨가 956 nm
실시예 25. 3가 염화철을 사용하여 제조한 히알루론산 나노입자
0.05M 질산철(III) 수용액 대신 0.05M 염화철(III) 수용액을 사용한 것을 제외하고는 실시예 22과 동일한 방법으로 나노입자 분말을 얻었다. 얻어진 입자의 입자크기를 분석한 결과는 다음 표 4와 같다.
0.05M 염화철(III)용액 나노입자크기
360 uL 첨가 222 nm
380 uL 첨가 225 nm
400 uL 첨가 229 nm
420 uL 첨가 247 nm
440 uL 첨가 249 nm
460 uL 첨가 258 nm
실시예 26. 항암제( 이리노테칸 )를 함유하는 히알루론산 나노입자
이리노테칸 염산염 360 mg 및 실시예 23과 동일한 방법으로 얻은 히알루론산(분자량 80만) 135 mg을 0.02M 글루탐산 수용액 45 mL에 가하고, 약 60 ℃로 가온하여 수용액이 얻어질 때까지 교반하였다. 2 N 수산화나트륨을 사용하여 pH를 약 8.0 으로 조절하였다. 얻어진 용액을 400 rpm으로 교반하면서, 0.05M 질산철(III) 수용액 1290 uL을 가하고 2시간 동안 계속 교반하였다. 얻어진 용액을 동결건조하여, 나노입자 분말을 얻었다. (입자크기: 약 290 nm)
실시예 27. 항암제( 옥살리플라틴 )를 함유하는 히알루론산 나노입자
옥살리플라틴 225 mg 및 실시예 23과 동일한 방법으로 얻은 히알루론산(분자량 80만) 135 mg을 0.02M 글루탐산 수용액 45 mL에 가하고, 약 40 ℃로 가온하여 수용액이 얻어질 때까지 교반하였다. 얻어진 용액을 400 rpm으로 교반하면서, 0.05M 질산철(III) 수용액 1260 uL을 가하고 2시간 동안 계속 교반하였다. 얻어진 용액을 동결건조하여, 나노입자 분말을 얻었다. (입자크기: 약 280 nm)
실시예 28. 항암제( 멜파란 )를 함유하는 히알루론산 나노입자
멜파란 270 mg 및 실시예 23과 동일한 방법으로 얻은 히알루론산(분자량 80만) 135 mg을 0.02M 글루탐산 수용액 45 mL에 교반하면서 가하여 수용액을 얻었다. 얻어진 용액을 300 rpm으로 교반하면서, 0.05M 질산철(III) 수용액 1260 uL을 가하고 2시간 동안 계속 교반하였다. 얻어진 용액을 동결건조하여, 나노입자 분말을 얻었다. (입자크기: 약 250 nm)
실시예 29. 항암제( 클로람부실 )를 함유하는 히알루론산 나노입자
클로람부실 225 mg 및 실시예 23과 동일한 방법으로 얻은 히알루론산(분자량 80만) 135 mg을 0.02M 글루탐산 수용액 45 mL에 교반하면서 가하여 수용액을 얻었다. 얻어진 용액을 300 rpm으로 교반하면서, 0.05M 질산철(III) 수용액 1260 uL을 가하고 2시간 동안 계속 교반하였다. 얻어진 용액을 동결건조하여, 나노입자 분말을 얻었다. (입자크기: 약 230 nm)
실시예 30 항암제( 파클리탁셀 )를 함유하는 히알루론산 나노입자
파클리탁셀 225 mg 및 실시예 23과 동일한 방법으로 얻은 히알루론산(분자량 95만) 45 mg을 0.02M 글루탐산이 함유된 70% 에탄올용액 45 mL에 교반하면서 가하여 수용액을 얻었다. 얻어진 용액을 300 rpm으로 교반하면서, 0.05M 질산철(III) 수용액 840 uL을 가하고 2시간 동안 계속 교반하였다. 얻어진 용액을 동결건조하여, 나노입자 분말을 얻었다. (입자크기: 약 120 nm)
실시예 31 항암제( 젬시타빈 )를 함유하는 히알루론산 나노입자
젬시타빈 1,800 mg 및 실시예 23과 동일한 방법으로 얻은 히알루론산(분자량 95만) 45 mg을 0.02M 글루탐산 수용액 45 mL에 교반하면서 가하여 수용액을 얻었다. 얻어진 용액을 300 rpm으로 교반하면서, 0.05M 질산철(III) 수용액 840 uL을 가하고 2시간 동안 계속 교반하였다. 얻어진 용액을 동결건조하여, 나노입자 분말을 얻었다. (입자크기: 약 130 nm)
실시예 32. 2가 염화마그네슘을 사용하여 제조한 히알루론산 나노입자
실시예 23과 동일한 방법으로 얻은 히알루론산(분자량 80만) 15 mg을 0.02M 글루탐산 수용액 15 mL에 가하여 0.1 % 히알루론산 용액을 제조하였다. 얻어진 용액을 400 rpm으로 교반하면서, 0.1M MgCl2 수용액 860 uL을 가하고 2시간 동안 계속 교반하였다. 얻어진 용액을 동결건조하여, 나노입자 분말을 얻었다. (입자크기: 약 500 nm)
실시예 33. 2가 염화마그네슘을 사용하여 제조한 히알루론산 나노입자
실시예 23과 동일한 방법으로 얻은 히알루론산(분자량 80만, 0.1%) 수용액 21 mL에 5 mg/mL의 농도가 되도록 이리노테칸을 가하고 1 시간 동안 교반하였다. 100 mM 염화나트륨이 함유된 20 mM MOPS 완충액에 20 mg/ml의 농도가 되도록 MgCl2를 용해시켜 얻은 용액 12 mL을 상기 수용액에 가하였다. 얻어진 용액을 동결건조하여 나노입자 분말을 얻었다. (입자크기: 약 150 nm)
실시예 34. 2가 염화구리를 사용하여 제조한 히알루론산 나노입자
실시예 23과 동일한 방법으로 얻은 히알루론산(분자량 80만) 15 mg을 0.02M 글루탐산 수용액 15 mL에 가하여 0.1 % 히알루론산 용액을 제조하였다. 얻어진 용액을 400 rpm으로 교반하면서, 0.1M CuCl2 수용액 860 uL을 가하고 2시간 동안 계속 교반하였다. 얻어진 용액을 동결건조하여, 나노입자 분말을 얻었다. (입자크기: 약 500 nm)
실시예 35. 2가 염화구리를 사용하여 제조한 히알루론산 나노입자
실시예 23과 동일한 방법으로 얻은 히알루론산(분자량 80만, 0.1%) 수용액 21 mL에 5 mg/mL의 농도가 되도록 이리노테칸을 가하고 1 시간 동안 교반하였다. 100 mM 염화나트륨이 함유된 20 mM MOPS 완충액에 20 mg/ml의 농도가 되도록 CuCl2를 용해시켜 얻은 용액 12 mL을 상기 수용액에 가하였다. 얻어진 용액을 동결건조하여 나노입자 분말을 얻었다. (입자크기: 약 200 nm)
실시예 36. 2가 염화코발트를 사용하여 제조한 히알루론산 나노입자
실시예 23과 동일한 방법으로 얻은 히알루론산(분자량 80만) 15 mg을 0.02M 글루탐산 수용액 15 mL에 가하여 0.1 % 히알루론산 용액을 제조하였다. 얻어진 용액을 400 rpm으로 교반하면서, 0.1M CoCl2 수용액 860 uL을 가하고 2시간 동안 계속 교반하였다. 얻어진 용액을 동결건조하여, 나노입자 분말을 얻었다. (입자크기: 약 500 nm)
실시예 37. 2가 염화코발트를 사용하여 제조한 히알루론산 나노입자
실시예 23과 동일한 방법으로 얻은 히알루론산(분자량 80만, 0.1%) 수용액 21 mL에 5 mg/mL의 농도가 되도록 이리노테칸을 가하고 1 시간 동안 교반하였다. 100 mM 염화나트륨이 함유된 20 mM MOPS 완충액에 20 mg/ml의 농도가 되도록 CoCl2를 용해시켜 얻은 용액 12 mL을 상기 수용액에 가하였다. 얻어진 용액을 동결건조하여 나노입자 분말을 얻었다. (입자크기: 약 120 nm)
실시예 38. 2가 염화아연을 사용하여 제조한 히알루론산 나노입자
실시예 23과 동일한 방법으로 얻은 히알루론산(분자량 80만) 15 mg을 0.02M 글루탐산 수용액 15 mL에 가하여 0.1 % 히알루론산 용액을 제조하였다. 얻어진 용액을 400 rpm으로 교반하면서, 0.1M ZnCl2 수용액 860 uL을 가하고 2시간 동안 계속 교반하였다. 얻어진 용액을 동결건조하여, 나노입자 분말을 얻었다. (입자크기: 약 450 nm)
실시예 39. 2가 염화아연을 사용하여 제조한 히알루론산 나노입자
실시예 23과 동일한 방법으로 얻은 히알루론산(분자량 80만, 0.1%) 수용액 21 mL에 5 mg/mL의 농도가 되도록 이리노테칸을 가하고 1 시간 동안 교반하였다. 100 mM 염화나트륨이 함유된 20 mM MOPS 완충액에 20 mg/ml의 농도가 되도록 ZnCl2를 용해시켜 얻은 용액 12 mL을 상기 수용액에 가하였다. 얻어진 용액을 동결건조하여 나노입자 분말을 얻었다. (입자크기: 약 220 nm)
실시예 40. 2가 염화니켈을 사용하여 제조한 히알루론산 나노입자
실시예 23과 동일한 방법으로 얻은 히알루론산(분자량 80만) 15 mg을 0.02M 글루탐산 수용액 15 mL에 가하여 0.1 % 히알루론산 용액을 제조하였다. 얻어진 용액을 400 rpm으로 교반하면서, 0.1M NiCl2 수용액 860 uL을 가하고 2시간 동안 계속 교반하였다. 얻어진 용액을 동결건조하여, 나노입자 분말을 얻었다. (입자크기: 약 400 nm)
실시예 41. 2가 염화니켈을 사용한 히알루론산 나노입자 제조방법 #2
실시예 23과 동일한 방법으로 얻은 히알루론산(분자량 80만, 0.1%) 수용액 21 mL에 5 mg/mL의 농도가 되도록 이리노테칸을 가하고 1 시간 동안 교반하였다. 100 mM 염화나트륨이 함유된 20 mM MOPS 완충액에 20 mg/ml의 농도가 되도록 NiCl2를 용해시켜 얻은 용액 12 mL을 상기 수용액에 가하였다. 얻어진 용액을 동결건조하여 나노입자 분말을 얻었다. (입자크기: 약 150 nm)
실시예 42. 2가 염화바륨을 사용하여 제조한 히알루론산 나노입자
실시예 23과 동일한 방법으로 얻은 히알루론산(분자량 80만) 15 mg을 0.02M 글루탐산 수용액 15 mL에 가하여 0.1 % 히알루론산 용액을 제조하였다. 얻어진 용액을 400 rpm으로 교반하면서, 0.1M BaCl2 수용액 860 uL을 가하고 2시간 동안 계속 교반하였다. 얻어진 용액을 동결건조하여, 나노입자 분말을 얻었다. (입자크기: 약 450 nm)
실시예 43. 2가 염화바륨을 사용하여 제조한 히알루론산 나노입자
실시예 23과 동일한 방법으로 얻은 히알루론산(분자량 80만, 0.1%) 수용액 21 mL에 5 mg/mL의 농도가 되도록 이리노테칸을 가하고 1 시간 동안 교반하였다. 100 mM 염화나트륨이 함유된 20 mM MOPS 완충액에 20 mg/ml의 농도가 되도록 BaCl2를 용해시켜 얻은 용액 12 mL을 상기 수용액에 가하였다. 얻어진 용액을 동결건조하여 나노입자 분말을 얻었다. (입자크기: 약 150 nm)
실시예 44. 3가 질산철을 사용하여 제조한 히알루론산 나노입자
0.02M 글루탐산 수용액 45mL에 실시예 23과 동일한 방법으로 얻은 히알루론산(분자량 80만)을 가하여 7.71 x 10-3 M 히알루론산 수용액을 제조하였다. 얻어진 용액을 200 rpm으로 교반하면서, 1.235 x 10-3 M 질산철(III) 용액을 가하고, 24 시간 동안 교반하였다. 얻어진 용액을 동결건조하여 나노입자 분말을 얻었다. (입자크기: 약 300 nm)
실시예 45. 3가 염화철을 사용하여 제조한 히알루론산 나노입자
0.02M 글루탐산 수용액 45mL에 실시예 23과 동일한 방법으로 얻은 히알루론산(분자량 800,000)을 가하여 7.71 x 10-3 M 히알루론산 수용액을 제조하였다. 얻어진 용액을 200 rpm으로 교반하면서, 1.235 x 10-3 M 염화철(III) 용액을 가하고, 24 시간 동안 교반하였다. 얻어진 용액을 동결건조하여 나노입자 분말을 얻었다. (입자크기: 약 350 nm)
실시예 46. 0.1% 히알루론산과 3가 질산철을 사용하여 제조한 히알루론산 나노입자
실시예 23과 동일한 방법으로 얻은 히알루론산(분자량 95만) 15 mg을 0.02M 글루탐산 수용액 15 mL에 가하여 0.1 % 히알루론산 용액을 제조하였다. 얻어진 용액을 250 rpm으로 교반하면서, 0.05M 질산철(III) 수용액 140 ∼ 320 uL을 가하고 30분 동안 계속 교반하였다. 얻어진 용액을 동결건조하여, 나노입자 분말을 얻었다. 얻어진 입자의 입자크기를 분석한 결과는 다음 표 5와 같다.
0.05M 질산철(III)용액 화학적 결합비 (HA 이당체:Fe3 +) 나노입자크기 (nm) 다중 분산도 (Poly Dispersion Index)
140 uL 첨가 1 : 0.17 142 nm 0.365
145 uL 첨가 1 : 0.183 120 nm 0.220
150 uL 첨가 1 : 0.189 130 nm 0.208
155 uL 첨가 1 : 0.195 118 nm 0.208
160 uL 첨가 1 : 0.201 97.8 nm 0.212
165 uL 첨가 1 : 0.209 106 nm 0.196
170 uL 첨가 1 : 0.215 103 nm 0.206
200 uL 첨가 1 : 0.252 108 nm 0.192
230 uL 첨가 1 : 0.291 110 nm 0.178
260 uL 첨가 1 : 0.328 120 nm 0.157
270 uL 첨가 1 : 0.341 116 nm 0.149
280 uL 첨가 1 : 0.353 122 nm 0.144
290 uL 첨가 1 : 0.367 133 nm 0.125
300 uL 첨가 1 : 0.379 137 nm 0.127
310 uL 첨가 1 : 0.391 177 nm 0.252
320 uL 첨가 1 : 0.403 233 nm 0.262
실시예 47. 0.3% 히알루론산과 3가 질산철을 사용하여 제조한 히알루론산 나노입자
실시예 23과 동일한 방법으로 얻은 히알루론산(분자량 95만) 45 mg을 0.02M 글루탐산 수용액 15 mL에 가하여 0.3 % 히알루론산 용액을 제조하였다. 얻어진 용액을 250 rpm으로 교반하면서, 0.05M 질산철(III) 수용액 400 ∼ 650 uL을 가하고 30분 동안 계속 교반하였다. 얻어진 용액을 동결건조하여, 나노입자 분말을 얻었다. 얻어진 입자의 입자크기를 분석한 결과는 다음 표 6과 같다.
0.05M 질산철(III)용액 화학적 결합비 (HA 이당체:Fe3 +) 나노입자크기 (nm) 다중 분산도 (Poly Dispersion Index)
400 uL 첨가 1 : 0.167 542 nm 0.416
410 uL 첨가 1 : 0.172 406 nm 0.314
420 uL 첨가 1 : 0.176 424 nm 0.277
430 uL 첨가 1 : 0.180 409 nm 0.252
440 uL 첨가 1 : 0.184 492 nm 0.352
450 uL 첨가 1 : 0.188 469 nm 0.379
460 uL 첨가 1 : 0.192 479 nm 0.306
470 uL 첨가 1 : 0.196 433 nm 0.219
480 uL 첨가 1 : 0.202 428 nm 0.236
490 uL 첨가 1 : 0.206 408 nm 0.232
500 uL 첨가 1 : 0.210 407 nm 0.214
510 uL 첨가 1 : 0.214 425 nm 0.214
520 uL 첨가 1 : 0.218 392 nm 0.217
530 uL 첨가 1 : 0.222 390 nm 0.190
540 uL 첨가 1 : 0.226 407 nm 0.219
600 uL 첨가 1 : 0.252 504 nm 0.278
650 uL 첨가 1 : 0.273 902 nm 0.499
실시예 48. 분무건조방법을 사용한 히알루론산 나노입자 제형
실시예 23과 동일한 방법으로 얻은 히알루론산(분자량 95만) 15 mg을 0.02M 글루탐산 수용액 15 mL에 가하여 0.1 % 히알루론산 용액을 제조하였다. 얻어진 용액을 250 rpm으로 교반하면서, 0.05M 질산철(III) 수용액 140 ∼ 320 uL을 가하고 30분 동안 계속 교반하였다. 얻어진 용액을 분무건조(Spray dry)를 위해 Model B(Switzerland)기기를 사용하여 나노입자 분말을 얻었다. 재분산 시 나노입자는 약 230 nm에서 900 nm까지의 분포를 보였다.
실시예 49. 분자량에 따른 히알루론산 나노입자 크기
평균분자량이 800,000 달톤, 950,000 달톤, 1,500,000 달톤, 3,600,000 달톤인 소디움 히알루론산(Bioland 사)을 실시예 23과 동일한 방법으로 염을 각각 제거하여 히알루론산을 얻었다. 각각의 히알루론산 15 mg을 0.02M 글루탐산 수용액 15 mL에 가하여 0.1 % 히알루론산 용액을 제조하였다. 얻어진 용액을 250 rpm으로 교반하면서, 0.05M 질산철(III) 수용액 200 ∼ 500 uL을 가하고 30 분 동안 계속 교반하였다. 얻어진 용액을 동결건조하여, 분말을 얻었다. 얻어진 입자의 입자크기를 분석한 결과는 다음 표 7과 같다.
0.05M 질산철(III)용액 800,000 달톤 950,000 달톤 1,500,000 달톤 3,600,000 달톤
150 uL 첨가 139 nm 130 nm 163 nm -
200 uL 첨가 112 nm 108 nm 140 nm -
250 uL 첨가 109 nm 120 nm 164 nm 95.2 nm
300 uL 첨가 125 nm 137 nm 151 nm 102 nm
350 uL 첨가 233 nm 282 nm 144 nm 117 nm
상기 표 7에서 알 수 있는 바와 같이, 분자량 800,000 달톤에서 분자량 3,600,000 달톤의 히알루론산에서 입자 형성이 가능하였다. 4,000,000 달톤 이상 10,000,000 달톤 이하의 분자량을 지녔을 때도 위와 유사한 경향을 가질 것을 예상할 수 있다.
실시예 50. 시간에 따른 히알루론산 나노입자의 안정성 시험
실시예 23과 동일한 방법으로 얻은 히알루론산(분자량 80만, Bioland사) 45 mg을 0.005M에서 0.05M의 글루탐산 수용액 15 mL에 가하여 0.3 % 히알루론산 용액을 제조하였다. 얻어진 용액을 400 rpm으로 교반하면서, 0.05M 질산철(III) 수용액 420 uL을 가하고 2시간 동안 계속 교반하였다. 얻어진 입자의 입자크기를 시간에 따라 분석한 결과는 다음 표 8과 같다.
글루탐산의 농도 시간에 따른 나노입자 크기 (nm)
1일 7일 14일 30일
0.00 M 206 nm 침전물 침전물 침전물
0.005 M 202 nm 응집 침전물 침전물
0.01 M 208 nm 247 nm 응집 침전물
0.02 M 213 nm 220 nm 228 nm 232 nm
0.03 M 232 nm 249 nm 255 nm 268 nm
0.04 M 243 nm 262 nm 269 nm 271 nm
0.05 M 245 nm 260 nm 270 nm 274 nm
상기 표 8에서 알 수 있는 바와 같이, 0.02M 이상의 글루탐산을 함유할 경우 한달이 지나도 나노입자의 크기변화는 약 10% 이내로 안정하였다.
실시예 51. 히알루론산 나노입자의 CD44 에 대한 친화력 실험
히알루론산 나노입자의 CD44에 대한 친화도 정도를 알아보기 위하여 유방암세포인 MDA-MB-231셀(ATCC : HTB-26, Manassas, VA)과 ZR-75-1셀(ATCC : CRL-1500, Manassas, VA)을 이용하였다. MDA-MB-231셀에는 셀표면에 CD44가 발현되어 있는 셀이며 ZR-75-1셀은 셀표면에 CD44가 발현되어 있지 않은 셀이다. 상기 셀들을 100U/mL의 페니실린과 0.1 mg/mL의 스트렙토마이신 및 10% 소태아혈청(Fetal Bovine Serum, FBS)이 들어있는 RPMI 1640 배지(HA free 배지, Gibco, Carlsbad, USA)에서 5% CO2 환경, 37℃에서 배양하였다. 히알루론산 안에 FITC를 녹인 후 나노입자로 제조하여 FITC를 라벨링(labeling) 시켰다. 얻어진 FITC-히알루론산 나노입자를 1 x 106 셀에서 37℃에서 4시간 동안 상기한 배지에 배양하였다. 이때 PBS에서 두 번 세척하고 트립신화(trypsinization)에 의해 모았다. 이것들을 다시 0.2% 소태아혈청(FBS)와 0.02% 소디움 아자이드(Sodium Azide)가 들어있는 PBS용액에 3회 세척하였다. 이 시료는 FACS(Fluorescence-activated cell sorter)와 epi-fluorescent microscopy을 사용하여 CD44에 대한 친화력을 시험하였으며 시료를 4% 파라포름알데히드 400 uL에 재 분산시켰다. 이때 유방암세포에 히알루론산 나노입자가 붙어 있는지 형광으로 스캐닝하기 위해 FACScalibur (Beckton-Dickinson, Mansfield, MA)로 488 nm의 파장대를 사용하였다. 또한 육안으로 나노입자의 친화력을 확인하기 위해 epi-fluorescence 현미경(Olympus BX51; Olympus Optical, Tokyo, Japan)을 사용하였다.
상기와 같이 친화력을 분석한 결과는 도 3a, 3b 및 4a, 4b와 같다. 도 3a 및도 3b는 실시예 24에서 제조한 히알루론산 나노입자가 MDA-MB-231셀과 ZR-75-1셀에 1.6 uM이 배양되었을 경우 epi-fluorescence microscopy에 의해 특이적 결합에 대한 형광이미지를 나타낸 것이다. 도 4a 및 4b에서 확인할 수 있는 바와 같이, FACS기기에 의한 히알루론산 나노입자와 CD44와의 친화도를 알아내기 위해 다음의 4가지 시료를 가지고 실험하였다. Control로서 0.05M 질산철 용액을 사용하였으며 실시예 38에서 제조된 HA-Zn(II) 나노입자와 실시예 36에서 제조된 HA-Co(II) 나노입자, 실시예 24에서 제조된 HA-Fe(III) 나노입자를 각각 40uL씩 4% paraformaldehyde 400 uL에 재 분산시켰다. 이때 유방암세포에 히알루론산 나노입자의 결합유무에 의해 형광으로 스캐닝하기 위해 FACScalibur (Beckton-Dickinson, Mansfield, MA)로 488 nm의 파장대로 측정하였다. 실시예 24에 의해 제조된 3가 질산철이온의 히알루론산 나노입자에서 가장 좋은 친화력을 나타냈으며, 도 4a 및 4b의 결과에 의해 본 발명에 따른 나노입자는 히알루론산을 매개로 능동표적지향을 나타냄을 알 수 있다.
본 발명의 나노입자는 히알루론산 또는 그의 염과 다양한 구조의 항암제와의 혼합물을 금속이온을 이용하여 나노입자화시켜 제조된 약물송달시스템으로서, 나노입자에 의한 EPR 효과를 통한 항암제의 수동표적지향 및 히알루론산과 암세포와의 친화력을 통한 항암제의 능동표적지향을 동시에 가능하게 한다. 즉, 본 발명에 따른 나노입자는 암세포에 선택적으로 작용할 수 있는 나노-약물송달시스템으로서, 고형암 뿐만 아니라 전이암에도 선택적으로 작용할 수 있다. 또한, 본 발명의 나노입자는 생체적합성이 우수하고, 암세포에 대하여 높은 친화력을 가지며, 물리화학적인 안정성을 갖는다.

Claims (34)

  1. 히알루론산 또는 그의 염; 2가 또는 3가의 전이금속 이온 또는 알카리 토금속 이온; 및 치료학적으로 유효한 양의 항암제를 포함하는, 10 ∼ 1,000 nm의 평균 입자경을 갖는, 나노입자.
  2. 제1항에 있어서, 상기 2가 또는 3가의 전이금속 이온 또는 알카리 토금속 이온이 Cu2 +, Cu3 +, Zn2 +, Zn3 +, Ni2 +, Ni3 +, Mg2 +, Mg3 +, Ca2 +, Ca3 +, Co2 +, Co3 +, Ba2 +, Ba3 +, Fe2+, 및 Fe3 +로 이루어진 군으로부터 1 종 이상 선택되는 것을 특징으로 하는 나노입자.
  3. 제1항에 있어서, 상기 히알루론산 또는 그의 염의 이당체 단위 당 상기 2가 또는 3가의 전이금속 이온 또는 알카리 토금속 이온의 몰비(molar ratio)가 0.05∼0.8 인 것을 특징으로 하는 나노입자.
  4. 제3항에 있어서, 상기 히알루론산 또는 그의 염의 이당체 단위 당 상기 2가 또는 3가의 전이금속 이온 또는 알카리 토금속 이온의 몰비가 0.1∼0.4 인 것을 특징으로 하는 나노입자.
  5. 제1항에 있어서, 카르복실기를 갖는 아미노산을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 나노입자.
  6. 제5항에 있어서, 상기 카르복실기를 갖는 아미노산이 아스파르트산(aspartic acid) 또는 글루탐산(glutamic acid)인 것을 특징으로 하는 나노입자.
  7. 제5항에 있어서, 상기 히알루론산 또는 그의 염의 이당체 단위 당 상기 카르복실기를 갖는 아미노산의 몰비가 0.2∼15 인 것을 특징으로 하는 나노입자.
  8. 제7항에 있어서, 상기 히알루론산 또는 그의 염의 이당체 단위 당 상기 카르복실기를 갖는 아미노산의 몰비가 0.25∼10 인 것을 특징으로 하는 나노입자.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 히알루론산의 평균분자량이 1,000 ∼ 10,000,000 달톤인 것을 특징으로 하는 나노입자.
  10. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 히알루론산 염이 히알루론산 코발트, 히알루론산 마그네슘, 히알루론산 아연, 히알루론산 칼슘, 히알루론산 칼륨, 히알루론산 나트륨, 또는 히알루론산 테트라부틸암모늄인 것을 특징으로 하는 나노입자.
  11. 제10항에 있어서, 상기 히알루론산 염이 히알루론산 나트륨인 것을 특징으로 하는 나노입자.
  12. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 2가 또는 3가의 전이금속 이온 또는 알카리 토금속 이온이 염화구리, 염화아연, 염화니켈, 염화마그네슘, 염화칼슘, 염화코발트, 염화바륨, 질산철, 황산철, 또는 염화철로부터 유래되는 것을 특징으로 하는 나노입자.
  13. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 2가 또는 3가의 전이금속 이온이 Fe2 + 또는 Fe3 +인 것을 특징으로 하는 나노입자.
  14. 제13항에 있어서, 상기 Fe2 + 또는 Fe3 + 이온이 질산철, 황산철 또는 염화철로부터 유래되는 것을 특징으로 하는 나노입자.
  15. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항암제가 도세탁셀, 카페시타빈 (Capecitabine), 이마티닙 메실레이트 (Imatinib mesylate), 리툭시맵 (Rituximab), 독시플루리딘 (Doxifluridine), 토레미펜 시트레이트(Toremifene citrate), 파클리탁셀, 독소루비신, 젬시타빈, 이리노데칸, 옥살리플라틴, 멜파란, 또는 클로람부실인 것을 특징으로 하는 나노입자.
  16. (a) 히알루론산 또는 그의 염 및 항암제를 물, 유기용매, 또는 물과 유기용매의 혼합용매에 용해시키는 단계;
    (b) 단계(a)에서 얻어진 용액에 2가 또는 3가의 전이금속 이온 또는 알카리 토금속 이온을 가하여 나노입자가 분산된 분산액을 제조하는 단계; 및
    (c) 단계(b)에서 얻어진 분산액을 건조시키는 단계를
    포함하는, 10 ∼ 1,000 nm의 평균 입자경을 갖는, 나노입자의 제조방법.
  17. 제16항에 있어서, 단계(a)가 pH를 2.6 내지 11.8의 범위로 조절하는 단계를 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 나노입자의 제조방법.
  18. 제16항에 있어서, 상기 유기용매 또는 상기 물과 유기용매의 혼합용매에 있어서의 유기용매가 C1 -5 알콜, 디메틸술폭시드, 클로로포름, 이염화탄소, 에틸아세테이트, 메틸아세테이트, 피리딘, 벤젠, 톨루엔, 아세토니트릴, 테트라히드로퓨란, 사염화탄소, 및 아세톤으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 나노입자의 제조방법.
  19. 제16항에 있어서, 상기 물과 유기용매의 혼합용매가 물과 에탄올의 혼합용매인 것을 특징으로 하는 나노입자의 제조방법.
  20. 제16항에 있어서, 상기 2가 또는 3가의 전이금속 이온 또는 알카리 토금속 이온이 Cu2 +, Cu3 +, Zn2 +, Zn3 +, Ni2 +, Ni3 +, Mg2 +, Mg3 +, Ca2 +, Ca3 +, Co2 +, Co3 +, Ba2 +, Ba3+, Fe2 +, 및 Fe3 +로 이루어진 군으로부터 1 종 이상 선택되는 것을 특징으로 하는 나노입자의 제조방법.
  21. 제16항에 있어서, 상기 히알루론산 또는 그의 염의 이당체 단위 당 상기 2가 또는 3가의 전이금속 이온 또는 알카리 토금속 이온의 몰비가 0.05∼0.8 인 것을 특징으로 하는 나노입자의 제조방법.
  22. 제21항에 있어서, 상기 히알루론산 또는 그의 염의 이당체 단위 당 상기 2가 또는 3가의 전이금속 이온 또는 알카리 토금속 이온의 몰비가 0.1∼0.4 인 것을 특징으로 하는 나노입자의 제조방법.
  23. 제16항에 있어서, 상기 단계(a)의 수용액 또는 단계(b)의 분산액이 카르복실기를 갖는 아미노산을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 나노입자의 제조방법.
  24. 제23항에 있어서, 상기 카르복실기를 갖는 아미노산이 아스파르트산(aspartic acid) 또는 글루탐산(glutamic acid)인 것을 특징으로 하는 나노입자 의 제조방법.
  25. 제23항에 있어서, 상기 히알루론산 또는 그의 염의 이당체 단위 당 상기 카르복실기를 갖는 아미노산의 몰비가 0.2∼15 인 것을 특징으로 하는 나노입자의 제조방법.
  26. 제25항에 있어서, 상기 히알루론산 또는 그의 염의 이당체 단위 당 상기 카르복실기를 갖는 아미노산의 몰비가 0.25∼10 인 것을 특징으로 하는 나노입자의 제조방법.
  27. 제16항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 히알루론산의 평균분자량이 1,000 ∼ 10,000,000 달톤인 것을 특징으로 하는 나노입자의 제조방법.
  28. 제16항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 히알루론산 염이 히알루론산 코발트, 히알루론산 마그네슘, 히알루론산 아연, 히알루론산 칼슘, 히알루론산 칼륨, 히알루론산 나트륨, 또는 히알루론산 테트라부틸암모늄인 것을 특징으로 하는 나노입자의 제조방법.
  29. 제28항에 있어서, 상기 히알루론산 염이 히알루론산 나트륨인 것을 특징으로 하는 나노입자의 제조방법.
  30. 제16항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 2가 또는 3가의 전이금속 이온 또는 알카리 토금속 이온이 염화구리, 염화아연, 염화니켈, 염화마그네슘, 염화칼슘, 염화코발트, 염화바륨, 질산철, 황산철, 또는 염화철로부터 유래되는 것을 특징으로 하는 나노입자의 제조방법.
  31. 제16항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 2가 또는 3가의 전이금속 이온 또는 알카리 토금속 이온이 Fe2 + 또는 Fe3 +인 것을 특징으로 하는 나노입자의 제조방법.
  32. 제31항에 있어서, 상기 Fe2 + 또는 Fe3 + 이온이 질산철, 황산철 또는 염화철로부터 유래되는 것을 특징으로 하는 나노입자의 제조방법.
  33. 제16항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항암제가 도세탁셀, 카페시타빈 (Capecitabine), 이마티닙 메실레이트 (Imatinib mesylate), 리툭시맵 (Rituximab), 독시플루리딘 (Doxifluridine), 토레미펜 시트레이트(Toremifene citrate), 파클리탁셀, 독소루비신, 젬시타빈, 이리노데칸, 옥살리플라틴, 멜파란, 또는 클로람부실인 것을 특징으로 하는 나노입자의 제조방법.
  34. 제16항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 건조가 분무건조 또는 동결건조에 의해 수행되는 것을 특징으로 하는 나노입자의 제조방법.
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