KR100758610B1 - 염기서열이 전혀 알려지지 아니한 디옥시리보핵산의선택적 증폭 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 생물체의 디옥시리보핵산(DNA)의 선택적 증폭 방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 생물체의 DNA를 증폭하는데 필요한 프라이머에 대한 어떠한 정보가 없이도 중합효소 연쇄 반응(Polymerase Chain Reaction)을 통하여 생물체의 디옥시리보핵산(DNA)을 증폭시키는 방법에 대한 것이다.

머리핀 어댑터, 선택적 증폭

Description

염기서열이 전혀 알려지지 아니한 디옥시리보핵산의 선택적 증폭 방법{Selective Polymerase Chain Reaction of DNA of which base sequence is completely unknown}

도 1은 행(a) 또는 열(b)로 나타내는 염기 서열을 갖는 머리핀 구조 어댑터의 예이며(여기에서 rN은 리보뉴클레오티드 또는 고리 구조를 형성할 수 있는 디옥시리보뉴클레오티드를 뜻하며, 나머지는 DNA를 구성하는 각 뉴클레오티드를 뜻한다.)

도 2는 행(a) 또는 열(b)의 시험관에 담긴 어댑터에 사용된 중합효소 연쇄반응 및 염기서열 결정 반응용 프라이머의 염기서열의 예이며,

도 3은 라이게이션, 엑소뉴클레아제 반응, RNA 또는 고리 DNA 분해 반응, 중합효소연쇄반응에 사용되는 16x16 시험관 배열의 예이다(여기에서, AA 등은 각 시험관에 사용되는 머리핀 구조의 어댑터의 단일가닥 말단부위의 2개의 염기서열이다)를 나타낸다.

도 4는 전기영동방법을 통해 분리된 DNA 절편을 은 염색법으로 현상시켜 얻은 DNA절편 밴드의 사진이다(여기에서, AT+GA등은 헤어핀 구조 어댑터의 말단의 염기의 조합을 나타내며, DNA 밴드의 오른쪽에 표시된 숫자는 DNA 밴드의 상대적 크기를 나타낸다. 그리고, 화살표는 2종류의 대장균(E.coli)간에 나타나는 DNA절편의 차이를 보여준다.)

본 발명은 생물체의 디옥시리보핵산(DNA)의 선택적 증폭 방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 생물체의 DNA를 증폭하는데 필요한 프라이머에 대한 어떠한 정보가 없이도 중합효소 연쇄 반응(Polymerase Chain Reaction)을 통하여 생물체의 디옥시리보핵산(DNA)을 증폭시키는 방법에 대한 것이다.

하나의 생물체가 갖는 DNA와 이로부터 전사되는 mRNA는 매우 다양하고 미량이므로, 이들의 염기 서열을 밝히기 위해서는 예외적인 경우를 제외하고는 모두 증폭 과정을 필요로 하게 된다. 이를 위해 일반적으로 두 가지 기술이 사용된다.

첫번째 방법은 DNA를 미생물에서 선택적으로 클로닝을 하거나, 라이브러리 형태로 만들고 미생물을 다량 증식시킨 후 목적하는 DNA절편을 포함한 미생물로부터 분리해낸다.

두번째 방법은 중합효소연쇄반응(PCR)을 이용하여 원하는 DNA부위만을 선택적으로 증폭하는 것이다. 그러나, 이 방법은 원하는 부위의 양 말단의 일정 길이의 염기서열을 미리 알고 있어야 한다는 문제점이 있다. 따라서, 이미 염기서열이 완전히 밝혀진 생물체가 아닌 경우에는, 생물체가 가지는 전장의 DNA 또는 상보DNA를 종래의 중합효소연쇄반응만을 통하여 빠지는 부분이 없이 완전하게 증폭하는 것은 불가능하다. 대규모의 DNA 염기서열 분석 작업을 수행함에 있어서, 하나의 생물체 가 가지는 전체 DNA를 비교적 균일한 크기로 분할하고, 이것을 증폭용 운반자에 넣고, 증폭한 후에 염기 서열을 분석하게 된다.

일반적으로, 이를 위해 사용하는 종래의 기술은 이미 염기 서열이 밝혀진 라이브러리(ordered library)를 이용한 기술이다. 그러나, 이 기술은 매우 복잡하고 어려우며, 많은 시간과 비용이 드는 문제점으로 인하여, 현재 대규모의 생물체 염기서열 결정 작업에 있어서 가장 큰 장애물 중의 하나로 작용하고 있다.

따라서, 본 발명은 증폭하고자 하는 DNA의 염기 서열에 대한 정보가 전혀 알려져 있지 아니한 생물체의 DNA를 누락 부분없이 증폭하는 방법을 제공함을 목적으로 한다.

본 발명은 생물체의 디옥시리보핵산(DNA)의 선택적 증폭 방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는

제한 효소를 사용하여 DNA를 단일 가닥의 점착성 말단을 갖는 수개의 절편들로 자르는 단계 및 이와는 독립적으로, 이러한 DNA절편의 단일 가닥의 점착성 말단과 상보적으로 결합할 수 있는 단일 가닥의 점착성 말단과 머리핀 고리 부분으로 이루어진 어댑터를 준비하는 단계;

상기의 DNA절편과 상기 머리핀 고리 구조를 갖는 어댑터를 DNA리가아제를 사용하여 결합시키는 단계;

상기 DNA 리가아제에 의한 결합 반응에 참여하지 않은 DNA절편 및 머리핀 고 리 구조를 갖는 어댑터를 엑소뉴클레이즈를 사용하여 제거하는 단계;

선택적 단계로서, 알카리 용액, RNA 분해효소(RNase) 또는 단일 가닥 선택성 엑소뉴클레아제를 사용하여 머리핀 구조를 제거하는 단계;

상기 어댑터의 머리핀 고리 부분만의 제거 이후에 잔류하는 부위에 상보적으로 결합하는 프라이머를 사용하여 DNA절편을 증폭하는 단계를 포함하는 염기 서열이 전혀 알려지지 아니한 DNA 일부의 선택적 증폭 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은, 제한 효소를 사용하여 디옥시리보핵산(DNA)을 단일 가닥 점착성 말단을 갖는 절편들로 자르는 단계 및 이와는 독립적으로, 염기 서열을 이미 알고 있는 단일 가닥 점착성 말단을 갖는 머리핀 고리 구조의 어댑터들을 제조하는 단계;

상기 DNA절편과 머리핀 고리 구조 어댑터를 DNA 리가아제(ligase)를 사용하여 결합시키는 단계; 그리고,

상기 어댑터와 결합된 DNA절편들에 알카리 용액, RNA 분해효소 또는 단일 가닥 선택성 엑소뉴클레아제(single strand specific exonuclease)를 사용하여, 상기 어댑터의 머리핀 고리 부분만을 제거하는 단계를 포함하는 염기 서열이 전혀 알려지지 아니한 DNA로부터 양 말단의 염기 서열이 알려진 DNA절편 라이브러리를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은, 4종의 뉴클레오타이드의 조합에 의하여 제조될 수 있는 모든 종류의 단일 가닥 DNA들로 이루어지는 단일 가닥 점착성 말단을 갖는 머리핀 고리 어댑터들을 포함하는 머리핀 고리 어댑터 세트를 제공하는 것이다.

이하 본 발명의 방법, DNA절편, 머리핀 고리 어댑터, 제한 효소 및 프라이머를 도면을 통하여 보다 상세히 설명한다. 이하의 도면 내용은 본 발명의 내용을 예시하여 설명하기 위한 것일 뿐이며, 본 발명의 범위를 한정하기 위한 것은 아니다.

도 1에 나타낸, 머리핀 고리 구조를 갖는 어댑터들은 도 3에서 나타낸 바와 같이 배열에 다음 예와 같은 방식으로 분배한다. 예를 들어, 도 3에서 7행이 CG이고 3열이 AG인 경우에는, 단일 가닥 점착성 말단 부위가 CG의 서열을 갖는 어댑터와 단일 가닥 점착성 말단 부위가 AG의 서열을 갖는 어댑터를 혼합시켜 놓는다.

단일 가닥 점착성 말단을 구성하는 염기의 갯수가 2개인 경우에는, 이 때 필요로 하는 시험관의 갯수는 112개가 된다. 만약, 단일 가닥 말단부위를 구성하는 염기의 갯수가 N이라면, 머리핀 고리 어댑터의 종류는 (4²ⁿ-2×4ⁿ)/2가지가 된다. 또한, DNA절편의 5', 3'의 말단과 어댑터의 5', 3'의 말단이 상보적으로 결합하는 것들이어야 한다.

위에서 기술한 바와 같이, 각 어댑터들은 시험관들에 분배한 다음에 제한 효소로 절단된 DNA 절편들을 각 시험관들에 대해 적당량씩 혼합한다. 그 다음 라이게이션 반응을 진행시킨다.

라이게이션 반응이 완료되면, 결합 반응에 참여하지 않은 DNA절편 및 어댑터를 엑소뉴클레아제를 사용하여 제거한다. 이 때, 말단이 머리핀 고리 구조를 갖는 어댑터가 라이게이션된 DNA절편들은 엑소뉴클레아제에 의해 절단되지 아니한다.

알칼리 용액, RNase, 또는 단일 가닥 선택성 엑소뉴클레아제로 처리하여 머리핀 고리 부위만을 분해함으로써, 일반적인 형태의 이중가닥 DNA절편으로 만든다. 이렇게 머리핀 고리를 제거한 이후에 상기 이중 가닥 DNA 절편에 잔류하는 어댑터의 일부에 상보적으로 결합할 수 있는 프라이머를 사용하여 중합효소 연쇄 반응을 수행한다.

중합효소 연쇄 반응 산물을 폴리아크릴아미드 젤 전기영동 등의 방법으로 분리하고, 겔의 각 밴드로 부터 얻어진 DNA는 DNA 염기서열 분석을 위하여 사용되어질 수 있다.

상기의 과정들을 인식 부위가 서로 다른 제한효소을 사용하여 반복하여 동일하게 수행한다. 서로 다른 두 가지, 또는 그 이상의 제한효소를 사용하여 얻어진 염기서열을 서로 중첩시켜서, 생물체가 가지는 전체 DNA의 염기서열을 얻어낼 수 있다. mRNA의 경우에도 본 발명에 의한 방법을 사용하여 하나의 생물체가 가지는 모든 종류의 mRNA의 염기서열을 결정할 수 있다.

실시예 1. 대장균 게놈의 선택적 증폭

1) 타입 IIs 의 제한효소 Hpy118III을 이용한 대장균 게놈의 제한효소 절편화

관찰하고자 하는 대장균 균주 DH5α 와 BL21에서 전체 게놈을 각각 분리해 낸다. 분리된 각 게놈 10㎍에 Hpy118III 제한효소 30unit을 넣고 50 mM 초산칼륨, 20 mM Tris-acetate, 10 mM 초산마그네슘, 1 mM DTT, pH 7.9의 완충용액에 넣고 제한 효소 반응을 수행한다.

2) DNA 절편과 머리핀 고리 구조를 갖는 어댑터의 라이게이션

1)에서 얻어진 DNA절편 Accuprep ^TM PCR purification KIT( (주)바이오니아 ) 로 정제하고, 여기서 얻어진 DNA 절편 1㎍을 50mM Tris-HCl, 10mM MgCl2, 5mM DTT, 2mM ATP, 25mg/mL BSA 가 들어간 완충용액에 희석하고, 여기에 9가지 조합의 i) 머리핀 어댑터 2μM, ii) 머리핀 어댑터 2μM을 각각 첨가한 후 1unit의 T4 DNA 리가제를 넣어 전체 부피 50㎕에서 선택적으로 결합시킨다. 본 실시예에서는 도3의 행과 열의 쌍중 AT+GA, CC+CG, CA+AA, CT+CC, GA+GC, AG+CA, GC+AC, AC+AT, CG+AG 의 각 9쌍을 이용하였다.

3) 엑소뉴클레아제 III를 이용한 결합되지 않은 DNA의 제거.

2)에서 얻어진 결합반응물들 5㎕ 각각에 500mM Tris-HCl (pH 8.0), 50mM MgCl₂, 100mM 2-Mercaptoethanol 이 혼합된 완충용액에 넣고, 20unit의 엑소뉴클리아제 III를 첨가한후, 전체 부피를 30㎕로 맞춘후 37℃에서 45분 동안 반응 시켰다.

4) 중합효소연쇄반응을 통한 증폭반응

3)에서 얻어진 반응물중 3㎕를 주형으로 하여 도2에 나타잰 행의 프라이머와 열의 프라이머 각각 1μM 와 100 mM Tris-HCl (pH 8.3), 400 mM KCl, 15 mM MgCl2, 10 mM DTT, 5ug/ml acetylated BSA, Taq DNA polymerase 1unit을 전체 부피 2㎕에 넣은후 1회의 94℃에서 5분, 55℃에서 35초, 72℃에서 2분, 30회의 94℃에서 35초, 55℃에서 35초, 72℃에서 2분, 1회의 94℃에서 35초, 55℃에서 35초 72℃에서 5분 반응으로 증폭하였다.

5)은 염색법을 이용한 폴리아크릴아미드젤에서의 시료 전개

4)에서 얻어진 반응물 중 10㎕를 8M 우레아가 든 4% 폴리아크릴아미드 겔에 서 전기영동 한 후, 겔을 고정액(10%) 아세트산이 든 용액에서 30분간 반응시킨다. 그 다음 이온이 제거된 증류수에 겔을 3번 씻어 준다. 이러한 겔을 1g AgNO3과 1.5mL37%포름알데히드가 든 1L 용액에서 30분간 염색시킨다. 염색된 겔을 5초가 이온이 제거된 증류수에서 씻어준후, 4℃로 맞추어진 현상액(40g 탄산나트륨, 1.5mL 37%포름알데히드 20㎕ 소듐티오설페이트(10mg/mL) 가 넣어진 1L 용액 )에서 염색한 후, 다시 고정액으로 5분간 반응시키고, 증류수로 10분간 씻어서 보관한다. 그 결과를 도4에 나타내있다. 여기서 AT+GA등은 는 실시예 2)에서 이용된 머리핀 어댑터의 각각의 조합을 의미하며 DNA 밴드의 오른쪽의 숫자는 상대적인 DNA 밴드의 크기이고 화살표는 두 가지 종류의 대장균에서 나타나는 DNA 절편의 차이이다.

이러한 실시예의 결과를 종합해 보면, 평균적으로 각각의 조합에서 나타나는 밴드의 평균크기는 400b.p. 정도이고 하나의 조합에서 나오는 평균 밴드수는 110개 정도이다. 120개의 모든 반응을 수행했을 때 결론적으로 이 방법은 5.28 mega b.p. 정도로 전개하였으므로 대장균의 전체 게놈크기(4.72mega b.p.)를 모두 포함할 수 있을 것으로 판단된다. 또한 도4에서 보는 바와 같이 AA+CT쌍에서 11개, GC+AG쌍에서 3개, AC+AT, CG+AG쌍에서 각1개의 서로 다른 밴드를 확인하였고, E.coli DH5α와 E.coliBL21 균주간에는 약 5000b.p.정도가 게놈상에서 다른 서열을 보이며, 현재 본 실시예에서 찾아진 다른 서열은 모든 반응을 수행하였다고 가정하면, 약 7200b.p.정도이므로 본 방법으로 두 종류의 다른 개체의 게놈에서 다른 부위 모두를 찾을 수 있다.

위에서 기술한 바와 같이, 본 발명의 방법을 사용하면, 염기 서열이 완전히 밝혀지지 않은 생물체의 전장 DNA를 중합효소연쇄반응을 통하여 완전히 증폭할 수 있다. 따라서, 다른 시료에서 발현되는 mRNA의 정도를 비교하고 측정할 수 있으며 각각의 변이의 염기서열에서의 돌연변이 다형상(mutation polymorphism)을 본 발명의 방법에 의하여 쉽게 분석할 수 있다.

Claims (12)

1) 제한 효소를 사용하여 DNA를 단일 가닥 점착성 말단을 갖는 절편들로 자르는 단계 및 이와는 독립적으로, 염기 서열을 이미 알고 있는 단일 가닥 점착성 말단을 갖는 머리핀 고리 구조의 어댑터들을 제조하는 단계;

2) 상기 DNA 절편과 머리핀 고리 구조 어댑터를 DNA 리가아제(ligase)를 사용하여 결합시키는 단계;

3) 상기 DNA 리가아제에 의한 결합 반응에 참여하지 아니한 DNA 절편과 머리핀 고리 어댑터를 엑소뉴클레아제(exonuclease)를 사용하여 제거하는 단계; 및

4) 상기 어댑터와 결합된 DNA 절편들에 알카리 용액, RNA 분해효소 또는 단일 가닥 선택성 엑소뉴클레아제(single strand specific exonuclease)를 사용하여, 상기 어댑터의 머리핀 고리 부분만을 제거하는 단계를 포함하는

염기 서열이 전혀 알려지지 아니한 DNA로부터 양 말단의 염기 서열이 알려진 DNA 절편 라이브러리를 제조하는 방법.

삭제

1) 제한 효소를 사용하여 DNA를 단일 가닥 점착성 말단을 갖는 절편들로 자르는 단계 및 이와는 독립적으로, 이렇게 절단된 DNA 절편의 양 말단과 상보적으로 결합할 수 있는 단일 가닥 점착성 말단을 갖는 머리핀 고리 어댑터들을 준비하는 단계;

2) 상기 DNA 절편과 머리핀 고리 구조 어댑터를 DNA 리가아제를 사용하여 결합시키는 단계;

3) 상기 DNA 리가아제에 의한 결합 반응에 참여하지 아니한 DNA 절편과 머리핀 고리 어댑터를 엑소뉴클레아제를 사용하여 제거하는 단계; 및

4) 상기 머리핀 구조 어댑터의 일부분에 상보적으로 결합하는 프라이머와 DNA 중합 효소를 사용하여 DNA 절편을 증폭하는 단계를 포함하는

염기 서열이 전혀 알려지지 아니한 DNA 일부의 선택적 증폭 방법.

제 3 항에 있어서, 상기 단계 3) 이후에 상기 단계 2)에서 제조되는 머리핀 고리 어댑터와 결합된 DNA 절편으로부터 머리핀 고리 부분만을 제거하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 염기 서열이 전혀 알려지지 아니한 DNA 일부의 선택적 증폭 방법.

제 3항에 있어서, 상기 제한 효소가 타입 IIs 제한 효소인 것임을 특징으로 하는 염기 서열이 전혀 알려지지 아니한 DNA 일부의 선택적 증폭 방법.

제 3항에 있어서, 상기 제한 효소가 타입 IIp 제한 효소인 것임을 특징으로 하는 염기 서열이 전혀 알려지지 아니한 DNA 일부의 선택적 증폭 방법.

제 3항에 있어서, 상기 DNA 리가아제가 T4 DNA 리가아제인 것임을 특징으로 하는 염기 서열이 전혀 알려지지 아니한 DNA 일부의 선택적 증폭 방법.

제 3항에 있어서, 상기 단계 3)의 엑소뉴클레아제가 엑소뉴클레아제 III인 것임을 특징으로 하는 염기 서열이 전혀 알려지지 아니한 DNA 일부의 선택적 증폭 방법.

제 4항에 있어서, 알카리 용액을 사용하여 상기 머리핀 고리 부분만을 제거하는 것임을 특징으로 하는 염기 서열이 전혀 알려지지 아니한 DNA 일부의 선택적 증폭 방법.

제 4항에 있어서, RNase를 사용하여 상기 머리핀 고리 부분만을 제거하는 것임을 특징으로 하는 염기 서열이 전혀 알려지지 아니한 DNA 일부의 선택적 증폭 방법.

제 4항에 있어서, 단일 가닥 선택성 엑소뉴클레아제를 사용하여 상기 머리핀 고리 부분만을 제거하는 것임을 특징으로 하는 염기 서열이 전혀 알려지지 아니한 DNA 일부의 선택적 증폭 방법.

제 3항에 있어서, 상기 DNA 중합효소가 Taq 중합효소인 것임을 특징으로 하는 염기 서열이 전혀 알려지지 아니한 DNA 일부의 선택적 증폭 방법.

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