JP7191115B2 - エンドヌクレアーゼ媒介移動平衡(EM-SEq)による核酸の増幅のための方法 - Google Patents
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Description
SDAは、迅速且つ効率的な等温核酸増幅方法であり、この方法では、配列特異性DNAエンドヌクレアーゼ、例えば、制限酵素又はニッキング酵素を、5’-3’エキソヌクレアーゼ活性を欠き、遊離の3’末端を鋳型鎖にわたって伸長する間に下流で接触する相補DNA鎖を置換(分解ではなく)することが可能なDNAポリメラーゼと組み合わせて使用する。SDAは、元々、当時利用可能な酵素の温度プロファイルのため、摂氏37~40度の温度で操作するように説明されていたが、高レベルのオフターゲット増幅を生じる。しかし、好熱性SDA(tSDA)では、熱安定性酵素を使用し、摂氏50度以上で反応を実行することが可能と記載されている。
天然に見出される多くの配列のようなエンドヌクレアーゼ認識部位を欠く標的配列を増幅する場合、反応は、最初の温度変性ステップにより典型的に開始し、これにより2つの一本鎖プライミングオリゴヌクレオチド(後にプライマーと呼ぶ)が、標的DNA配列の2つの末端に特異的に結合することが可能となる。2つのプライマーは、これらの5’末端に、反応において使用される所与のDNAエンドヌクレアーゼの結合部位として作用する、短い(典型的には6~8ヌクレオチド長)認識配列を有する。DNAポリメラーゼによるプライマー伸長時、二本鎖DNA種が生成され、これは、選択されたDNAエンドヌクレアーゼ認識配列と両端で隣接する標的DNA配列を含む。次いで、この分子は、引き続くSDA反応のための基質として作用する(図1A)。
a.該集団における鎖の末端を、該末端の少なくとも1つが、37℃よりも高く80℃未満の温度で、少なくとも一過性に一本鎖である、低融点領域の配列を含むように修飾するステップと、
b.該低融点末端を有する核酸分子の集団を、該低融点末端とハイブリダイズする1つ又は複数の増幅プライマーを使用して複製するステップであって、該プライマーが、核酸分子の鋳型集団の3’末端を越えて5’一本鎖区画を有し、これにより鋳型の3’末端が伸長してエンドヌクレアーゼの完全認識部位を形成し、該プライマーの3’末端が鎖置換により伸長して鋳型を複製する、ステップと、
c.該エンドヌクレアーゼの完全認識部位を使用して、伸長した鎖をニッキングし、これによりプライマーにおける遊離3’-OH基を遊離させるステップと、
d.遊離3’-OH基を鎖置換により伸長して鋳型を再複製するステップと
を含み、ステップb、c及びdが、等温的に実施され、これにより二本鎖核酸配列の集団の鎖置換増幅が生じる、方法を記載する。
3’-CAGTTG-5’
5’-GTCAAC-3’
であり得る。
3’-CAG*TTG-5’
5’-GTCSAAC-3’
であり、ここで、*は、切断部位であり、Sは、ホスホチオアート(phosphothioate)であり得る。
b.リガーゼ酵素
を含むキットを開示する。
生成されたアンプリコン分子においてDNAニックがフィリングされると、EM-SEq生成物のほとんどが、二本鎖となり、使用される2つのEM-SEqプライマーのうちの1つの5’末端配列を含む。これにより、固定化したプライマーが反応において存在する場合、表面結合アンプリコンの生成におけるEM-SEqの使用が可能となる(図6)。
a.二本鎖核酸配列の集団の末端を修飾するための核酸アダプター分子の第1の対であって、アダプター対の第1の鎖の5’末端が、エンドヌクレアーゼの認識部位の一部を含み、アダプター対の中央部が、37℃よりも高く80℃未満の温度で、少なくとも一過性に一本鎖である、低融点領域の配列を含み、アダプター対の第1の鎖の3’末端及びアダプター対の第2の鎖の5’末端が、二本鎖核酸配列の集団の両鎖とのライゲーションを受け得る、第1の対、並びに
b.リガーゼ酵素
を含むキットを開示する。
配列番号18:<223>20%GCのLRを有するリバースプライマー
配列番号19:<223>50%GCのLLを有するフォワードプライマー
配列番号20:<223>50%GCのLRを有するリバースプライマー
配列番号21:<223>20%GCのLL及びLRを有する完全長鋳型
配列番号22:<223>50%GCのLL及びLRを有する完全長鋳型
配列番号23:<223>完全長鋳型
配列番号24:<223>鋳型としてのデッドエンド生成物
配列番号25:<223>非修飾フォワードプライマー
配列番号26:<223>非修飾リバースプライマー
配列番号27:<223>ハイブリッド侵入フォワードプライマー
配列番号28:<223>ハイブリッド侵入リバースプライマー
Claims (29)
- 二本鎖核酸配列の集団の鎖置換増幅のための方法であって、
a.該集団における鎖の末端を、該末端の少なくとも1つが、37~80℃の温度で、少なくとも一過性に一本鎖である、低融点領域の配列を含むように修飾するステップと、
b.低融点末端を有する核酸分子の集団を、該低融点末端とハイブリダイズする1つ又は複数の増幅プライマーを使用して複製するステップであって、該プライマーが、核酸分子の鋳型集団の3’末端を越えて5’一本鎖区画を有し、これにより該鋳型の3’末端が伸長してエンドヌクレアーゼの完全認識部位を形成し、該プライマーの3’末端が鎖置換により伸長して該鋳型を複製する、ステップと、
c.該エンドヌクレアーゼの該完全認識部位を使用して、伸長した該鎖をニッキングし、これにより該プライマーにおける遊離3’-OH基を遊離させるステップと、
d.該遊離3’-OH基を鎖置換により伸長して該鋳型を再複製するステップと
を含み、ステップb、c及びdが、等温的に実施され、これにより二本鎖核酸配列の該集団の該鎖置換増幅が生じる、方法。 - 前記集団における鎖の末端は、該末端の少なくとも1つが、37~65℃の温度で、少なくとも一過性に一本鎖である、低融解領域の配列を含むように修飾される、請求項1、ステップaに記載の方法。
- 前記増幅が、単一の増幅プライマーを用いて実行され、これにより前記二本鎖核酸配列の集団の一方の鎖を複製する、請求項1又は請求項2に記載の方法。
- 前記増幅が、2つの増幅プライマーを用いて実行され、これにより前記二本鎖核酸配列の集団の両鎖を複製する、請求項1又は請求項2に記載の方法。
- 前記増幅プライマーの1つ又は複数が、固体支持体上に固定化されている、請求項3又は請求項4に記載の方法。
- 一方の鎖の前記増幅プライマーのみが、固体支持体上に固定化されている、請求項5に記載の方法。
- 伸長ステップb及びdが、鎖置換ポリメラーゼを使用して実施される、請求項1から6までのいずれか一項に記載の方法。
- 前記ポリメラーゼが、Bstポリメラーゼ又はクレノウ断片ポリメラーゼである、請求項7に記載の方法。
- 前記集団における鎖の末端が、アダプターライゲーションにより修飾されている、請求項1から8までのいずれか一項に記載の方法。
- 前記集団における鎖の前記修飾末端が、前記修飾を有するプライマーの伸長を使用して得られる、請求項1から8までのいずれか一項に記載の方法。
- 前記修飾末端が、エンドヌクレアーゼの認識部位の一部を含む、請求項1から10までのいずれか一項に記載の方法。
- 前記鋳型集団の3’末端を越えて5’一本鎖区画を有する前記増幅プライマーの配列が、エンドヌクレアーゼの認識部位の完全鎖を該一本鎖区画に有し、完全二本鎖認識部位が、鎖伸長により生成される、請求項1から11までのいずれか一項に記載の方法。
- 前記低融点領域が、ミスマッチ塩基対を含む、請求項1から12までのいずれか一項に記載の方法。
- 前記低融点領域が、30%未満のGC含量を有する20ヌクレオチドの領域を含む、請求項1から13までのいずれか一項に記載の方法。
- 前記プライマーが、天然の塩基よりも高い融解温度に上昇させる塩基を含む、請求項1から14までのいずれか一項に記載の方法。
- 前記低融点領域が、等温増幅温度で一本鎖である、請求項1から15までのいずれか一項に記載の方法。
- 前記等温増幅温度が、50~65℃である、請求項1から16までのいずれか一項に記載の方法。
- 前記低融点領域が、天然には存在しない配列を有する、請求項1から17までのいずれか一項に記載の方法。
- 前記伸長した鎖のニックが、ニッキングエンドヌクレアーゼを使用して生成される、請求項1から18までのいずれか一項に記載の方法。
- 前記ニッキングエンドヌクレアーゼが、Nt.BspQI、Nt.CviPII、Nt.BstNBI、Nb.BsrDI、Nb.BtsI、Nt.AlwI、Nb.BbvCI、Nt.BbvCI又はNb.BsmIから選択される、請求項18に記載の方法。
- 前記伸長が、切断不可能な核酸骨格を生成する非天然dNTPを使用して実施される、請求項1から19までのいずれか一項に記載の方法。
- 前記プライマーが、ブロッキング部分により、これらの3’末端でブロッキングされて、ニッキングが生じるまでは、3’末端伸長が防がれる、請求項1から17までのいずれか一項に記載の方法。
- 前記固定化した伸長生成物が、引き続いてシーケンシングされる、請求項5又は請求項6に記載の方法。
- 前記増幅が、2つの固定化プライマーを使用して実施され、両鎖がシーケンシングされ、これにより、それぞれ前記二本鎖核酸配列の集団の各鎖からの1つの読取り配列である、一対の読取り配列を生成する、請求項23に記載の方法。
- 核酸配列の修飾のためのキットであって、
a.二本鎖核酸配列の集団の末端を修飾するための核酸アダプター分子の第1の対であって、該アダプター対の第1の鎖の5’末端が、エンドヌクレアーゼの認識部位の一部を含み、該アダプター対の中央部が、37~80℃の温度で、少なくとも一過性に一本鎖である、低融点領域の配列を含み、該アダプター対の第1の鎖の3’末端及び該アダプター対の第2の鎖の5’末端が、該二本鎖核酸配列の集団の両鎖とのライゲーションを受け得る、第1の対と、
b.リガーゼ酵素と
を含むキット。 - 1つ又は複数の増幅プライマーをさらに含む、請求項25に記載のキット。
- 鎖置換ポリメラーゼをさらに含む、請求項25に記載のキット。
- 前記増幅プライマーの1つ又は複数が、固定化されている、請求項27に記載のキット。
- 前記アダプター対の前記中央部が、50~65℃の温度で、少なくとも一過性に一本鎖である、低融点領域の配列を含む、請求項24から28までのいずれか一項に記載のキット。
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