KR100743727B1 - 신속한 조직 프로세서 - Google Patents
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- G01N35/00—Automatic analysis not limited to methods or materials provided for in any single one of groups G01N1/00 - G01N33/00; Handling materials therefor
- G01N35/0099—Automatic analysis not limited to methods or materials provided for in any single one of groups G01N1/00 - G01N33/00; Handling materials therefor comprising robots or similar manipulators
Abstract
신속한 조직 처리를 위하여 개선된 마이크로파 유닛 및 이 유닛을 포함하는 조직 처리 시스템이 제공된다. 마이크로파 유닛은 에너지 공급원, 마이크로파 에너지를 반응 챔버로 유도하는 도파관, 및 조직학을 위하여 조직 표본을 처리하기에 적합하게 된 반응 챔버를 포함하여 이루어질 수 있다. 이 유닛은 부드럽고 균일한 가열을 제공하는데, 열 손실 및 휘발성 화학물질 누출이 최소화된다. 이 시스템은, 수동 작업 또는 자동적으로 연속적 및/또는 배치식으로 작동될 수 있다. 자동화된 시스템을 연속처리로 작동하여, 예를 들어 두 시간 내의 신속한 처리 및/또는 세포 구조 및 조직 구조의 보존과 같은 본 발명의 장점을 얻을 수 있다.
Description
본 발명은, 1997년 8월 20일에 출원된 가출원 제 60/056,102호의 권리를 주장하는 1998년 8월 19일에 출원된 특허출원 제 09/136,292호의 일부 계속 출원이다. 이 출원은 또한 1999년 12월 14일에 출원된 가출원 제60/170,545호의 권리를 주장한다.
본 발명은 고정에서 함침까지 신속하고 연속적인 흐름의, 조직학을 위한 조직 처리 공정에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 연속 처리로 작동가능하며, 순차적인 일련의 상이한 비-수성 화학 용액을 사용하여 조직 표본을 경화시키고, 포매 및 절단하기에 적당한 왁스-함침된 조직 표본을 생산하는, 자동화된 조직 처리 시스템에 관한 것이다.
통상적으로 조직학에서 조직을 준비하기 위해서는, 함침시키기 전에, 고정용 인산-완충 10% 포름알데히드, 탈수용의 일련의 증가된 농도의 에탄올 및 조직에서 탈수 시약을 세척하기 위한 크실렌의 분리된 용액들에서 배양하게 된다. 이러한 공정에 필요한 시간이 보통 8시간 이상이므로, 이러한 분리 단계들-고정, 탈수, 세척 및 함침-을 이런 작업용으로 고안된 자동화된 기계 장치(예를 들어, 미국 특허 제 3,892,197호, 제 4,141,312호 및 제 5,049,510호 참고)에서 밤새도록 실시하는 것이 통상적이다.
이러한 통상적인 처리를 실시하는 자동화된 조직 프로세서는, 예를 들어 Shandon(모델명 HYPERCENTER 및 PATHCENTRE), Miles-Sakura(모델명 TISSUE-TEK) 및 Mopec-Medite(모델명 TPC15)가 제조 및 판매한다.
종래 기술에 따르면, 이러한 자동화된 시스템은 연속 처리가 불가능하다는 단점이 있다. 조직 처리를 완료하기 위하여 필요한 시간이 주어지면, 조직을 함유하는 카세트는 낮동안 시스템에 로딩되고, 조직처리는 밤샘 주기에서 완료된다. 따라서, 종래 기술에 따른 시스템 작동으로는, 조직-함유 카세트를 작업일동안 처리하여 완성할 수 없었다.
예를 들어, TISSUE-TEK 진공 침투 프로세서(VIP)는 처리 완료를 위하여 8시간 이상이 필요하다. 카세트를 담은 바스켓을 조직이 처리되는 레토르트에 놓는다. 또한, 14 스테이션은 다양한 조성 용액을 레토르트에 공급한다. 사용자-프로그램가능한 소프트웨어가 이 자동화된 처리를 조절한다. 회전 밸브가 레토르트와 다양한 스테이션 간의 용액 이동을 조절한다; 밸브가 개방되는 경우에 가압 또는 진공을 레토르트에 공급하면, 각각 용액이 레토르트 안으로 펌핑되거나 밖으로 펌핑된다. 처리 완료 후, 이 장치는 자동적으로 세정 주기를 필요로 하게 된다; 이는 파라핀이 사용되지 않는 경우에만 생략될 수 있다. 전형적으로, 조직 표본은 하기 프로그램에 따라 배치 처리된다:
| 단계 | 용액 | 농도 | 설정시간(분) | 설정온도 | P/V ** | 교반 | 용액의 양 |
| 1 | 완충 포르말린 | 10% | 50 | 40℃ | On | On | 2.2-3.2리터 |
| 2 | 완충 포르말린 | 10% | 50 | 40℃ | On | On | 2.2-3.2리터 |
| 3 | 알코올* | 80% | 50 | 40℃ | On | On | 2.2-3.2L |
| 4 | 알코올 | 95% | 50 | 40℃ | On | On | 2.2-3.2L |
| 5 | 알코올 | 95% | 50 | 40℃ | On | On | 2.2-3.2L |
| 6 | 알코올 | 100% | 50 | 40℃ | On | On | 2.2-3.2L |
| 7 | 알코올 | 100% | 50 | 40℃ | On | On | 2.2-3.2L |
| 8 | 알코올 | 100% | 50 | 40℃ | On | On | 2.2-3.2L |
| 9 | 크실렌 | 100% | 50 | 40℃ | On | On | 2.2-3.2L |
| 10 | 크실렌 | 100% | 50 | 40℃ | On | On | 2.2-3.2L |
| 11 | 파라핀 | 50 | 60℃ | On | On | 4L | |
| 12 | 파라핀 | 50 | 60℃ | On | On | 4L | |
| 13 | 파라핀 | 50 | 60℃ | On | On | 4L | |
| 14 | 파라핀 | 50 | 60℃ | On | On | 4L | |
| **-P/V(가압/진공): "P/V"가 on 되는 경우에, 가압 및 진공이 레토르트에 교대 적용됨으로써 교반이 제공된다. 이와 달리, "교반"이 on되는 경우에, 매 20분 마다 동일한 용액을 안으로 펌핑한 후 밖으로 펌핑하여 교반이 또한 제공될 수 있다. *-대부분의 실험실에서 사용되는 알코올은 90%에틸, 5%메틸 및 5%이소프로필 알코올의 혼합물이다. | |||||||
이러한 통상의 방법에서 일반적으로, 조직 표본을 작업일동안 실험실, 보건소 또는 그외 장소로부터 병리학 실험실로 이따금씩 보내야 한다; 조직 표본은 밤새 배치 처리되고(batch processing); 일러야 그 다음날 아침에 블로킹(blocking) 및 절단(sectioning)에 적합한 조직 표본을 얻을 수 있고; 그 다음날 늦게, 병리학자가 블로킹 및 절단된 표본으로 제조된 절편의 현미경 검사를 토대로 진단하게 된다(도 1). 표본 수령 및 병리학자 보고서 전달 간에 약 24 시간이 필요하다. 현재 통상적인 방법이 단축 실행된다 하더라도, 작은 생체 조직편의 검사 시에만 용이하다. 이러한 생체 조직편 검사를 위해서는 처리 주기 개시 전에 약 30분 이상 고정이 필요하다. 장치 처리 주기는 최소 70분 지속되도록 프로그램할 수 있으나, 2 내지 2 1/2 시간이 바람직하다.
이 경우 병리학자가 외과의에게 도움이 되는 결과를 주는데 최소 하루가 지 체되는데다, 필수적인 표본의 배치 공정에 의해서 요구되는 병리학 실험실에서의 작업 흐름 저해와 관련된 문제가 있다. 공정이 자동화된 경우, 밤새 장치를 가동시키는데 따른 안전문제, 장치의 고장 위험와 그에 따른 장치의 모니터 필요성, 시약이 다량으로 사용되어 버려지는 것 등과 관련된 문제가 있다. 더욱이, 이 공정에 사용되는 시약과 관련된 독성 증기 및 독성 물질에 실험자들이 노출되는 것을 막기 위하여 고가의 장비가 필요하다. 또한, 적절히 폐기되지 않는 경우, 종래의 방법에서 발생하는 다량의 폐용매 및 파라핀 잔여물은 환경을 오염시킨다.
통상의 고정 및 처리공정은 또한 핵산(예를 들어, DNA, 특히 RNA) 구조에 비가역적인 손상(예를 들어, 포스포디에스테르 결합의 가수분해 및/또는 탈아미드화)을 가져와 진단 및 조사를 위한 유전자 기술의 적용을 제한한다. 통상적인 방법에 의해서는 역 유전자 분석(retrospective genetic analysis)을 할 수 없으므로, 대부분의 DNA와 특히 RNA분석은 열화를 막기 위하여 신선한 조직의 긴급 동결과 같이 재료 취급에 있어서 특별한 사전 조치가 필요하다.
파라핀 블럭에서 준비된 절편과 비교하여, 동결 절편을 사용할 경우 조직학적 진단에서 여러가지 어려움이 있다. US 특허 제 3,961,097호에는, 동결 절편으로부터 준비된 슬라이드는 "균일한 품질(로) … 가공처리되지 않고"; "일련의 동일 표본의 절편을 검사하는 것이 기술적으로 더욱 어렵고"; "충분히 얇은 절편을 얻고, 표본의 세부 손상을 피하기 위하여 표본을 자르는데 극도의 주의를 기울여야 하며"; 그리고 "조직 절편을 만들기 위하여 조직이 해동되거나 재동결되면, 심하게 손상되기 때문에", 모든 슬라이드는 "조직이 초기 동결 상태에 있는 동안" 준비되어야 한다고 주의를 주고 있다.
진단을 목적으로 한 조직의 처리공정 및 분석에서 신속한 처리는 항상 관심의 대상이었다. 게다가, 최근에는 의료계의 초점이 조직 처리공정을 포함한 다양한 과정의 비용을 줄이는데 모아지고 있다. 조직 처리공정의 비용은 표본 처리 및 분석을 위한 시간, 실험실에서의 인원수 및 장비를 위해 필요한 공간, 시약 부피(순수한 화학물질의 구입가격 및 폐기물 처리 비용 모두), 필요한 인원수와 관련되어 있다. 더욱 중요한 것은, 환자들 및 그들의 의사들이 치료가이드로서 병리학자들의 평가 및 진단에 의존한다는 것이다. 조직 처리공정을 완료하는데 필요한 시간을 줄이는 것은 표본을 얻은 시간과 병리학자의 기록이 외과의에게 전달되는 시간 사이에 격게 될 불안을 줄일 수 있다.
다른 이들도 조직 처리공정에 필요한 시간을 줄일 필요성을 인지하고 있으나, 통상의 방법에서 크게 벗어나지 않은 개선만이 이루어지고 있다. 조직 처리공정을 가속하기 위해, 미국 특허 제4,656,047호, 제4,839,194호 및 제 5,244,787호는 마이크로파 에너지를 이용하며; 미국 특허 제3,961,097호 및 제5,089,288호는 초음파 에너지를 사용하며; 미국 특허 제 5,023,187호는 적외선 에너지를 사용한다. 미국 특허 제 5,104,640호는 혈액 스미어를 슬라이드에 부착시키는 고정제, 안정화 시약 및 가용성 시약의 비-수성 조성물을 개시하고 있다. 그러나, 전술한 특허는 고정에서 함침까지 표본의 연속 처리를 두시간 내에 달성하는 진단용 조직 슬라이드 준비의 전체 공정을 교시하거나 제안하지 않는다.
홈쿠킹에 사용되는 것과 디자인이 유사한 마이크로파 오븐이 조직 처리에 사용되는 시간을 줄이기 위하여 사용되었다. US 특허 제 4,656,047호에는, 탈수, 세정 또는 함침 단계 중 하나 이상에 마이크로파 에너지를 사용하는 조직 처리 방법이 청구되어 있다. 조직 표본을 화학 고정제에 침지시킨 후, 표본을 화학적으로 고정시키기에 충분한 시간동안 마이크로파 에너지에 노출시킴으로써 고정을 실시할 수 있다. US 특허 제 4,839,194호에는, 마이크로파 에너지의 비-열적 효과를 이용하는, 40℃를 초과하지 않는 온도에서 조직 표본을 고정시키는 방법이 청구되어 있다. US 특허 제 4,839,194호 및 5,244,787호에는, 마이크로파 에너지를 이용하여 조직 표본을 염색하는 방법이 청구되어 있다.
이러한 통상적인 조직 처리 방법에서, 마이크로파가 공진하는 챔버 내 반사 및 간섭 효과 및, 공급원으로부터 챔버로 마이크로파 에너지를 유도하는 도파관으로 인해, 마이크로파 에너지 분포가 균일하지 않다. US 특허 제 4,835,354호에는, 마이크로파와 균일하게 접촉하도록 하기 위하여 회전 플랫폼과, 마이크로파를 분산 및 흡수하는 분산기 및 혼합기를 사용하는 기계적 용액이 제안되어 있다. US 특허 제 5,289,140호에는, 다른 파장 및/또는 강도의 마이크로파의 조합 또는 다른 주파수의 마이크로파 공급원을 사용하는 용액이 제안되어 있다. US 특허 제 5,796,080호에는, 도파관의 마이크로파의 전파된 모우드가 실질적으로 변화되지 않도록, 각 챔버의 화학 반응을 개별적으로 조절하기 위한 다수의 공명 챔버 및 도파관 간의 조정가능한 완화 수단이 개시되어 있다.
본 발명자는 이제, 상기 특허에 개시된 것과 다른 방법으로 조직 처리 동안 에 천천히 균일하게 가열하는 마이크로파 유닛을 기재한다. 이러한 작업으로 처리 조직의 손상을 최소화하고, 병리학자 또는 세포 생물학자가 연이어 조직학 연구를 하기 위한 우수한 표본을 얻을 수 있다. 상기 특허에 개시된 용액과 대조적으로, 본 발명의 마이크로파 유닛은 챔버의 내용물에 대하여 민감한 공명 챔버를 사용하지 않는다. 이는, 모든 크기가 사용되는 마이크로파 파장의 약 10% 내지 20%보다 큰 영역을 가열하고, 다른 처리 단계에서 챔버 내 화학적 조성이 변하는 경우, 중요한 고려 사항이다. 본 발명에서, 간섭 효과를 최소화하는 방식으로 초음파 에너지를 용액 및 조직에 분배한다. 에너지를 분배함으로써, 에너지는 이 물질에 일회 통과로 용액 및 조직에 흡수된다.
본 발명에 의하여 개선되는 몇가지를 여기에 요약하지만, 다른 개선사항도 하기한다. 반응 챔버로부터의 대류 열 손실 및 반응 챔버 안의 액체 증발율이 감소되며, 휘발성 물질이 전자 성분과 접촉하는 것이 방지되고, 휘발성 물질이 배출되어 유닛 근처의 실험실 작업자가 보호되고, 작업자가 처리하는 동안 발생하는 오류가 제거되고, 반응 챔버의 액체 온도를 유지하기 위하여 유닛에 필요한 전력이 감소되고, 이 시스템을 사용하여 수작업에 비해 노동력 및 시약 비용이 감소된다. 특히, 개시된 처리에 의하여 처리된 조직 표본의 질 유지가 개선된다. 하나의 마이크로파 유닛을 유리하게 사용할 수 있으나, 다수의 유닛을 조작 및 물리적으로 연결하여 배치 및/또는 연속 모우드로 형성된 화학 반응을 가속화할 수 있다.
본 발명의 목적은, 처리 및 분석에 필요한 시간을 단축시키고 이의 비용을 줄이는 조직 처리용 마이크로파 유닛 및 시스템를 제공하는 것이다. 조직 처리 시 스템은 자동화가 가능하며, 바람직하게는 연속 방식으로 표본을 받아들인다. 이를 통하여, 수술 중인 환자의 외과적 병리학에서 현재의 방법이 신속하게 반응하도록 할 수 있으며, 병리학자가 수술실 근처에서 관심 부위(point-of-care)를 진단할 수도 있다.
특히, 마이크로파 유닛으로 조직 표본을 천천히 가열할 수 있으며 오버쿠킹(over cooking)되는 것을 막을 수 있다. 반응 챔버 내에 균일한 가열을 통하여, 챔버 내 다른 위치의 표본이 거의 동일한 온도로 유지되도록 할 수 있다. 따라서, 챔버 전반 및 처리 단계동안의 온도가 모두 실질적으로 동일하게 유지된다. 챔버의 형태는 속삭임의 회랑 모우드(whispering gallery mode)로 만들어지는 것이 바람직하다. 본 발명으로, 통상적인 마이크로파 오븐(예를 들어, 챔버 내에서 용액을 실질적으로 동일한 온도로 유지하지 않고, 조직을 오버 쿠킹하는 고온 점)의 단점을 피할 수 있다.
조직 처리 시스템에서는, 마이크로파 유닛을 시스템의 하나 이상의 모듈로서 사용할 수 있다. 이러한 시스템은 수동 또는 자동화될 수 있다. 조직 표본은 연속 및/또는 배치식으로 시스템에 로딩 및 처리될 수 있다. 처리량은 또한 병렬로 배열된 다수의 개별 시스템을 사용하여 증가될 수 있다. 연속 처리는, 시스템을 방해하지 않고, 처리 완료 전에 조직 표본을 갖는 일련의 개별 모듈 또는 이의 배치에 접근하고 있다. 이 시스템은, 본 명세서에 기재된 방법 및 이전에 출원된 출원; 또는 다른 조직화학 반응에 사용하기 적합하도록 될 수 있다.
본 발명의 마이크로파 유닛은, (a) 마이크로파 에너지 공급원, (b) 공급원으 로부터 반응 챔버로 마이크로파 에너지를 전달하는 도파관, 및 (c) 전달된 마이크로파 에너지를 수용하고, 적어도 경화(예를 들어, 고정, 탈수 또는 이의 조합) 개시를 통하여 조직 표본을 처리하는 반응 챔버를 포함하여 이루어진다. 반응 챔버는 다수의 다른 조직 표본을 함유할 수 있다; 예를 들어, 반응 챔버는 조직 표본이 로딩된 캐리어 또는 바스켓을 함유하도록 배치할 수 있다. 바람직하게는, 반응 챔버의 내부 기하학적 배열은, 마이크로파 에너지를 균일하게 분배하고 이의 내용물을 가열하도록 배치한다. 유사하게, 공급원 및 도파관은 마이크로파 방사선의 전달동안 에너지 손실이 최소화되도록 배치할 수 있다. 마이크로파 공급원에 의한 동력, 및 이에 따른 반응 챔버 내용물의 가열은 가변 전류 공급원으로 조절하여, 동력을 연속적으로 변화시킬 수 있다.
마이크로파 유닛은, 반응 챔버 내에 맞도록 조정된 이동가능한 용기가 구비되거나 구비되지 않은 조합체; 반응 챔버 내에 조건을 모니터하는 하나 이상의 온도 및/또는 압력 탐침; 작업자의 주변환경으로부터 반응 챔버를 분리하고 반응 챔버에 맞도록 조정된 마개(예를 들어, 반응 챔버로부터 이동가능하거나 부착된 뚜껑); 반응 챔버 내 열을 유지하는 열절연체; 반응 챔버내 화학물질로부터 전자 성분을 분리하는 밀봉; 및 하나 이상의 탐침 및/또는 타이머로부터의 입력을 수용하고 공급원으로부터의 마이크로파 에너지를 조절하는 제어 회로를 추가로 포함하여 이루어질 수 있다.
본 발명과 달리, 종래 기술에 따르면, 통상적인 방법은 8시간 이상이 소요될 수 있으므로, 배치 처리가 필요하다. 종래 기술에서, 표본은 자동화된 장치 내에 로딩되며, 전체 장치 주기가 완료되기까지는 추가의 표본이 로딩될 수 없었다. 종래 장치에 로딩된 모든 조직 표본은, 전체 장치 주기동안 동일한 처리 단계에 있다.
본 발명의 추가적 장점 및 개선점은 이하에 기재한다.
도 1은 의사가 조직 표본을 입수한 시간부터 병리학자가 조직 절편를 현미경 검사하여 진단한 시간까지 약 24시간이 소요됨을 보이는 흐름도이고,
도 2는 본 발명으로 병리학자의 진단이 조직 표본을 제공한 의사에게 약 2시간 안에 이용될 수 있음을 보여주는 흐름도이고,
도 3은 배치 및/또는 연속 모우드로 수동 작업될 수 있는 조직 처리 시스템의 개략도이고,
도 4는 수동으로 작동되는 조직 처리 시스템에 사용하기 위한, 마이크로파 가열 또는 진공을 제공하지 않은 셰이커 조를 도시한 것이고,
도 5는 수동 작동되는 조직 처리 시스템에 사용하기 위하여 제공되는 통상적인 마이크로파 오븐을 도시한 것이고,
도 6은 수동 작동되는 조직 처리 시스템에 사용하기 위하여 제공되는 파라핀 조를 도시한 것이고,
도 7은 자동화되고 배치 및/또는 연속 모우드로 작동가능한 조직 처리 시스템의 개략도이고,
도 8은 본 발명의 마이크로파 유닛을 도시한 것으로, 도 8a는 일부절제 평면 도이고, 도 8b는 일부절제 측면도이고, 도 8c는 마이크로파 유닛의 반응 챔버의 상세 측면도이고,
도 9는 본 발명의 마이크로파 유닛의 전기 성분을 도시한 것이고,
도 10은 본 발명의 마이크로파 유닛의 조절 특징부의 블럭도이고,
도 11은 본 발명의 함침기 유닛을 도시한 것이고,
도 12는 본 발명의 대체 조직 처리 시스템의 개략도이고,
도 13은 본 발명의 대체 조직 처리 시스템의 개략도(즉, 병렬 처리를 위하여 배치된 일련의 두 모듈)이다.
본 명세서에 개시된 마이크로파 유닛은, 통상적인 조직 처리에 유리하게 사용할 수 있으나, 본 명세서에 개시된 방법과 US 특허출원 제 60/056,102호 및 09/136,292호와 관련하여 개발되었으며, 이에 사용하기에 적합하게 될 수 있다.
150,000 이상의 조직 표본이 본 발명으로 처리되었다(예로 도 2 참조). 이는, 해마다 약 30,000이며, 건 당 세 표본을 처리한 평균이다. 고정, 탈수 및 함침 단계는 약 2 시간 내에 실시될 수 있다. 이를 통하여, 병리학자는 받은 직후; 아마도 환자가 계속 수술 중에 있거나 회복실에 있는 동안, 표본을 평가할 수 있다. 병리학적 진단에 필요한 시간이 단축됨으로써, 환자의 근심이 줄어들 수 있어 유리하다. 조직 표본의 두께 감소, 혼합물로 구성되는 비-수성 용액의 사용, 승온 및 교반 하의 용액 교환, 마이크로파 방사선(예를 들어, 약 3℃ 또는 1℃ 이하의 편차 처리)을 이용한 조직 및 용액의 균일한 가열, 진공압 하의 함침 또는 이의 결합을 통하여, 신속하고 연속적인 흐름 처리가 가능하다.
고체 조직의 처리공정 및 분석에 있어서, 조직 슬라이스는 현미경 검사를 위해 3 내지 6 미크론 정도이어야 하지만, 잘라서 얻은 신선한 조직의 가장 얇은 슬라이스가 약 1mm이다(일반적인 슬라이스는 2~3mm정도). 현미경 검사에 충분히 얇은 슬라이스를 생산하기 위해서, (예를 들면 마이크로톰으로 절단하여) 더 얇은 조직을 얻을 수 있도록 조직을 단단히 할 필요가 있다. 본 발명은 이 조직 경화 공정을 매우 가속화하여, 통상의 밤샘 공정을 총 65분정도가 소요되는 공정으로 전환시킨다.
본 발명자들은 병리학 실험실에서 조직을 받은 시점으로부터 2시간 이내에 마이크로톰으로 절단하기에 적합한 함침된 조직 블럭을 준비하는 단순하고, 안전하고, 비용이 적게 들고, 신속하고, 신뢰할만한 방법을 개발하였다. 본 방법은 표본의 연속 처리 및 흐름을 가능하게 하고, 자동화에 적합하며, 유해 가스가 있는 포르말린 및 크실렌이 필요 없고, 조직 처리공정의 표준화가 가능하며, 통상의 방법에서보다 매우 소량의 시약을 필요로 한다. 신선하거나 사전에 이미 고정된 조직을 처리할 수 있다.
본 공정에 의해, 조직 처리공정에 필요한 시간을 줄일 수 있을 뿐만 아니라, 신속한 처리에 따라 종래의 방법에 의해서 손실되었던 조직 구조 및 형상을 보존할 수 있게 되었다. 글리코겐은 통상적인 방법을 사용하여 거의 항상 손실된다. 림프관, 특히 자궁근의 림프관은, 통상적으로 처리하는 동안에 손실되나, 본 발명을 사용하는 경우에는 남아있게 되는 것이 매우 명백하다.
나아가, 본 발명에 따라 처리된 조직의 연구 결과 통상의 방법과 비교하여 DNA 및 RNA 추출이 더욱 보호되는 것으로 나타났다. 병원 및 그 외 장소에서 얻은 조직을 실험실에서 전달된 직후, 조직학 및 유전학 연구를 위해 처리할 수 있고, 보관된 재료는 장래에 연구 및 그 외 적용에 유용할 수 있다. 종래 기술과 비교하여 개선된 기술에서는 유전 물질의 수율, 기록 보관형 유전 물질의 안정성, 유전 물질의 크기 및 완전도, 및 유전 물질의 화학적 변형의 감소가 기대된다.
본 발명의 명세서에 있어서, "조직 표본"은 개시된 방법으로 공정처리할 수 있는 조직의 단편이다. 또한 생물학적 유체(예를 들어, 복수, 혈액, 늑막 삼출물)로부터 단일 세포, 또는 고체 장기의 흡출 또는 신체 강(cavities)의 세척으로부터 얻은 세포 부유물을 지칭할 수 있다. 단일 세포는 처리하기 전에 침강 또는 부력(byouant) 원심 분리로 펠렛을 만들 수 있다. 실시예에서와 같이, 고체 단편(즉, 조직 슬라이스)은 공통적으로 조직학 및 병리학을 위하여 처리된다.
"연속적인" 처리공정이란, 처리 완료에 필요한 시간(즉, 한 시간 내지 수 시간) 대신 각 처리 단계 완료에 필요한 시간(즉, 수 분)으로 결정되는 시간 간격으로, 추가의 조직 표본을 본 발명의 시스템에 접근시키는 것을 의미한다. 본 발명을 사용하여 소정 시간에, 조직 표본은 다른 처리공정 단계에 있을 수 있다. 다시 말하면, 본 발명을 사용하여, 다양한 조직 처리 단계를 따라 표본의 연속 처리 및 흐름이 가능하다. 수동 또는 자동화된 장치로 연속 처리가 가능하다.
이 공정의 제 1 실시형태에서, 조직 표본이 고정, 탈수, 지방 제거(즉, 탈지방화)된다. 사용하기 위한 적합한 혼합물은 고정제 및 탈수 시약, 바람직하게는 케톤 및 알코올을 포함하여 이루어지는 비-수성 용액이며; 알코올 대 케톤의 체적비는 약 1:10 내지 약 10:1, 약 1:6 또는 약 1:3 이상, 약 3:1 또는 약 6:1 이하, 약 1:1, 또는 이의 중간 범위(예를 들어, 약 1:1 내지 6:1)가 될 수 있다(이러한 한계가 변할 수 있더라도, 처리 시간 또는 결과가 신뢰성이 떨어질 수 있다). 조직 표본은 약 25분 이내, 약 15분 이내, 또는 약 5분 이내로 배양될 수 있다. 배양 온도는 약 30℃ 내지 약 80℃, 약 40℃ 또는 약 50℃ 이상, 약 70℃ 또는 약 75℃ 이하, 또는 이의 중간 범위(예를 들어, 약 40℃ 내지 75℃)가 될 수 있다.
본 공정의 다른 실시형태에서는, 조직 표본이 고정, 탈수, 지방 제거 및 세정된다. 바람직한 용액은 알코올 및 세정제이다. 이 공정 단계는 약 5분 이내에 달성될 수 있다.
본 공정의 다른 형태에서, 조직 표본은 세정제 및 함침 시약을 포함하여 이루어지는 단일 용액에 세척되고 함침된다. 이 공정의 이 단계는 약 5분 이내에 달성될 수 있다. 절단하기 전에, 함침된 조직 표본은 함침 시약에 포매(embed)시킬 수 있다.
고정, 탈수, 및 지방 제거된 조직 표본은 이어 왁스 용액에 함침될 수 있다. 조직 표본의 탈수와 일관되게, 왁스 용액은 물을 가능하면 적게 함유하는 것이 바람직하다. 따라서, 왁스 용액은 함침 전에 왁스를 가열하여 용해된 물을 증발시키고, 감압하여 가스를 제거하여 준비할 수 있다. 조직 표본의 함침은 조직 표본으로부터 용매를 제거하고, 왁스 용액을 조직 표본으로 넣기 위해 대기압보다 낮은 압력 및 승온하에서 실시한다. 진공은 확산을 가속화하고, 표본 내에 존재할 수 있는 용매의 증발 온도를 낮추어 함침 시간을 감소시킨다. 왁스 용액은 가스를 제거한 파라핀 및/또는 광유를 포함하여 이루어질 수 있다. 조직 표본의 함침은 약 25분 이내, 20분 이내, 또는 약 15분 이내로 완료될 수 있다. 왁스 용액은 실온에서 고화되고, 약 65℃ 또는 약 70℃ 이상에서 용융될 수 있다(예를 들어, 약 45℃ 내지 약 75℃에서 함침). 절단하기 전에, 함침된 조직 표본은 함침 시약에 포매되어 조직 블럭을 형성할 수 있다.
본 발명의 또다른 실시형태에서는 조직 표본을 고정에서 함침까지 일련의 용액들내에서 처리하며, 이 용액들 중 적어도 일부는 하나 이상의 작업(고정, 탈수, 지방 제거, 및 함침)을 동시에 수행하는 혼합물이다. 혼합물은 고정제, 탈수 시약, 및 지방 용매(예를 들어, 케톤 및 알코올)를 포함할 수 있다. 다른 용액은 고정제, 탈수 시약, 지방 용매, 및 세정제(예를 들어, 알코올 및 크실렌)를 포함할 수 있다. 다른 용액은 세정제 및 함침 시약(예를 들어, 크실렌 및 파라핀)을 포함할 수 있다. 조직 표본은 다른 사슬길이의 혼합물(예를 들어, 실온에서 액체인 광유 및 고체인 파라핀)을 포함하여 이루어지는 왁스 용액에 함침될 수 있다. 많은 화학물질이 다작용성일지라도, 바람직한 혼합물은 하나 이상의 화학물질을 포함한다. 바람직하게는, 혼합물은 둘 또는 셋 이상의 서로 다른 화학물질(예를 들어, 알콜 및 케톤; 알콜, 케톤 및 미네랄 오일 또는 왁스)을 포함한다.
비-수성 혼합물(예를 들어, 고정제-탈수 시약-지방 용매, 고정제-탈수 시약-지방 용매-세정제, 세정제-함침 시약), 조직 표본 안에 일정하게 가열하기 위한 공급원으로서 마이크로파 에너지, 및 진공 공급원을 이용한 감압으로 공정 시간을 줄일 수 있다. 조직 표본으로의 용액의 확산 및 화학적 교환은 기계적 교반, 가열, 감압, 또는 이들의 조합으로 촉진할 수 있다.
상기 단계들은 강화제(enhancer), 계면 활성제, 또는 이들 모두를 공정에 사용되는 용액에 첨가하여 가속할 수 있다. 강화제는 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 모노- 및 디메틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 폴리비닐 피롤리돈 등이 가능하고; 사용되는 중합체의 평균 분자량은 약 100 내지 약 500, 또는 약 300 분자량이 가능하다. 계면 활성제는 디메틸 술폭사이드(DMSO), 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르(예를 들어, TWEEN 80), 소디움 디메틸 술포숙시네이트, 약한 가정 세제 등이 가능하다.
고정을 통해, 조직 표본의 경화가 개시되며, 단백질이 안정화되고 세포 열화가 중지되어 세포 형태가 보존될 수 있다. 화학적 고정이 없으면, 내재성 효소가 세포를 대사분해 및 용해할 것이며, 조직 마이크로아나토미가 바뀔 것이다. 고정제는 케톤(예를 들어, 아세톤, 메틸 에틸 케톤); 알데히드(예를 들어, 아세틸알데히드, 포름알데히드, 글루타르알데히드, 글리옥살); 알콜(예를 들어, 메탄올, 에탄올, 이소프로판올); 아세트산; 중금속(예를 들어, 납 아세트산염 및 시트르산염, 수은염, 크롬산 및 이의 염, 피크르산, 오스뮴 테트록사이드); 등이 가능하다. 고정이 부적절한 표시로는 : 조직 구조의 분열, 조직 절편의 버블, 불규칙하고 조악한 염색, 쭈그러진 세포, 세포질 엉김, 응축 및 구별이 잘 안 되는 핵 염색질, 및 적혈구의 자가분해/용혈이 포함될 수 있다. 일반적으로, 노출이 길면 조직이 파괴되기 쉽게 되고, 극도로 쭈그러지게 되므로, 아세톤을 사용하여 시간이 아닌 분의 시간 스케일로 고정한다. 또한, 포르말린을 사용하는 통상적인 고정과 대조적으로, 케톤 및 알콜을 사용하면, 이들을 화학적으로 결합시키지 않고 단백질을 물리적으로 안정화함으로써(예를 들어, 침전), 고정제 역할을 하는 것으로 생각된다.
탈수하면 조직 표본에서 물이 제거되어 경화가 촉진된다. 또한, 조직 표본 내 물을 탈수제로 대체하면, 이어서 탈수제를 함침에 사용되는 재료로 대체하기 용이하다. 이러한 용액 교환은 탈수용 휘발성 용매를 사용하여 촉진된다. 탈수제는 저분자량 알콜(예를 들어, 메탄올, 이소프로판올, 에탄올, 프로판올, 부탄올, 이소부탄올, 에틸 부탄올, 아밀 알콜), 케톤, 디옥산, 알킬렌 글리콜, 에틸렌 글리콜, 또는 폴리알킬렌 글리콜이 가능하다. 표본을 탈수하지 못하면, 부적절한 함침, 절단시 바람직하지 못한 조각(ribbon) 형성, 조직 절편의 단열(clefts), 구조의 분열, 조직 절편 내 물의 결정 및 염색성 저하가 나타날 수 있다.
마이크로파 방사선은 또한 화학적 방법이라기보다는 물리적 방법으로 경화를 도울 수 있다. 화학적 혼합물에 대한 논의에서 주목되는 바와 같이, 물리적 및 화학적 공정을 결합하면 처리공정 시간을 감소시키고, 및/또는 표본 질을 높일 수 있다. 이 처리를 생략하는 경우에 조직 처리 공정에 미치는 효과를 주목함으로써, 특정한 물리적 또는 화학적 처리의 효과를 결정할 수 있다.
지방은 세정 및 함침을 막기 때문에 조직 표본 안의 지방은 용매를 사용하여 제거한다. 지방 제거가 적절하지 못하면, 조직 절편의 인공산물이 스프레딩되고, 조직 절편이 주름잡히고, 염색성이 나빠질 수 있다. 지방은 예를 들어 아세톤, 클로로포름 또는 크실렌과 같은 유기 용매를 사용하여 조직 표본으로부터 제거할 수 있다.
선택적으로, 조직 표본을 세정한다. 탈수 및/또는 탈지용 용매가 함침제와 혼화될 수 없는 경우, 세정제는 조직 표본에서 탈수 및/또는 탈지용 용매를 추출한다. 이 추출로 인해 조직은 "투명"하게 될 수 있으며, 이의 불투명도가 감소될 수 있다. 세정제의 예로는 크실렌, 리모넨, 벤젠, 톨루엔, 클로르포름, 석유 에테르, 이황화탄소, 사염화탄소, 디옥산, 정향유(clove oil), 삼나무유(cedar oil)가 포함된다.
최종적으로, 조직 표본이 적당히 고정 및 탈수되면, 파라핀, 미네랄오일, 비-수용성 왁스, 셀로이딘, 폴리알킬렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리비닐 알콜, 아가, 젤라틴, 니트로셀룰로오스, 메타크릴레이트 수지, 에폭시 수지 또는 다른 플라스틱과 같은 시약으로 함침하거나 이들 중에 포매함으로써 경화시킨다. 함침된 표본을 블럭 안에 넣어, 마이크로톰 나이프로 10 미크론 이하의 절편으로 만들기 전에, 조직 표본을 경화하여 세포 형태를 적당히 보존해야 한다. 바람직한 함침 재료는 시판 왁스 조성물, 융점이 다른 왁스 혼합물(예를 들어, 액상 광유 및 고형 파라핀), 초자형질(paraplast), 바이올로이드, 엠베돌, 플라스틱 등이다. 본 명세서에서 파라핀을 예를 들어 사용을 위해 선택되는데, 저렴하고, 취급이 쉽고, 이런 재료를 사용하여 제공되는 구조가 밀착되어 조각 절단이 용이하기 때문이다.
본 발명의 방법은 특히 세포-세포 접촉, 조직 구성, 기관 구조, 또는 이들의 조합이 보존되어야 하는 조직 표본에 적합하다. 본 발명(예를 들어, 실시예 3)에서, 이러한 표본은 가장 작은 치수에서 약 3mm이내, 약 2mm이내, 약 1.5mm이내, 또는 약 1mm이내의 조직 슬라이스이다.
조직 표본은 신선하거나, 부분적으로 고정(예를 들어, 2-3시간 동안 10% 포르말린에서 고정)되거나, 고정(예를 들어, 10% 포르말린 또는 그 외 고정제에서 밤샘 고정)된 것일 수 있다. 상기한 방법에 따르면, 고정에서 함침까지 조직 표본 처리공정은 약 2시간 이내, 약 90분 이내, 약 1시간 이내, 또는 약 45분 이내, 또는 약 30분 이내가 소요된다. 적당한 온도에 이르기 위하여 각 단계에서 용액에 필요한 시간은, 각 단계의 배양 시간과 비교하여 길지 않으며, 처리공정의 총 시간을 계산하기 위하여 무시할 수 있다. 특히, 약 1.5mm 두께 이내의 작은 생체 조직편 및 조직과, 지방이 거의 없거나 전혀 없는 것은 신속하게 처리될 수 있다. 조직은 수술실로부터 비-수성 용액 속에서 수술실에서 병리학 실험실로 이동될 수 있다; 이러한 이동 용액은 본 명세서에 기재된 PEG 및 비-수성 혼합물의 동일 용적량으로 구성될 수 있다.
함침에 이어, 조직 표본은 포매되어 블럭을 생성할 수 있다. 조직 표본을 포매하는데 사용된 시약은 함침에 사용한 동일 물질을 사용하는 것이 바람직하나, 다른 함침 시약을 사용할 수도 있다. 블럭 조직 표본은 마이크로톰에 올려져 약 1미크론 내지 약 50미크론, 또는 약 2미크론 내지 약 10미크론의 조직 절편을 생성할 수 있다. 조직 절편은 조직 화학 염색, 항체 결합, in situ 핵산 혼성화/증폭, 또는 이들의 조합을 위해 더욱 처리될 수 있다. 그리고 나서, 조직 표본은 일반적으로 현미경으로 검사되지만, 세포의 특성을 검사하는 다른 기술을 사용하여 공정된 조직 표본을 검사할 수도 있다(예를 들어, 자동화된 세포 계산, 오토라디오그라피, 핵산의 전기영동).
함침 전 조직을 만들기 위하여, 고정, 탈수 및 지방 제거가 필요하다. 이러한 단계를 용이하게 하기 위해서는, 조직을 처리 전에 적당한 크기로 자르고, 이 조직 블럭을 보유하며 고정, 탈수, 지방 제거 및 함침용 용액 간에 이동을 쉽게 하는 카세트를 사용한다.
조직 표본 처리가 불완전한 경우, 마이크로톰 나이프로 절단한 절편은 망가지거나, "파열(exploded)"된다. 포매된 조직 블럭이 너무 연하거나 너무 단단하고, 절편의 압착량이 포매 용제와 상이하고, 절편이 무르고, 조직 조각이 형성되지 않거나 구부러지고, 절편이 부서지거나 찢어지고, 적혈구가 용해되고, 세포질이 부서지고, 염색질이 응축되고, 핵인의 호염기성 염색이 일어나고, 세포가 찌그러지고, 인공 산물이 스프레딩되고 모스 이튼 효과(moth-eaten effect)가 나타나는 문제점 중 하나 이상이 생길 경우, 조직 처리는 실패이다. 불완전한 처리의 또다른 표시는, 저장 후에 포매된 조직이 수축하거나 및/또는 블럭에서 유기 용매의 냄새가 나는 것이다.
본 발명에 의하여 만들어진 유리 슬라이드 상의 왁스-함침 절편에서, 왁스는 염색 또는 면역조직화학처리 이전에 용융되어 제거될 수 있다. 조직 절편은 다시 수화한 후, 염료 또는 항체를 사용하여 기재된 바와 같이 분석한다. 염색 완료 또는 조직화학 반응 후, 슬라이드는 커버 글라스를 덮어 현미경으로 관찰할 수 있다. 이와 달리, 염색 또는 항체 장식 표본을 세포 혈구 계산용 기구를 사용하여 검사할 수 있다. 조직 블럭은 기록의 목적이나 이후 역 연구를 위하여 보관할 수 있다.
본 발명은 처리 조직으로부터 핵산, DNA 또는 RNA을 준비하여 사용할 수 있다. 따라서, 임상 병리학 실험실에서 통상 수집되는 표본으로 유전 연구가 가능하다. 이러한 기술을 결합하면 그 파워가 상당할 것이다. 염색 또는 면역조직화학 을 사용하여 하나의 절편을 분석하고, 인접한 절편에서 핵산을 얻어 유전 분석 함으로써, 조직학적 관찰 결과를 유전학과 연계시킬 수 있다. 예를 들어, 같은 절편 중의 병든 영역과 정상인 영역을 비교하여 유전적 차이(예를 들어, 돌연변이, 전사 수준)를 감지할 수 있고, 여러 시점에서 시료를 취하여 유전적 차이를 비교하여 병의 진행과정을 알 수 있고, 1차 암으로부터 전이까지의 유전적 차이의 축척 사항을 따라 종양 진행정도를 평가할 수 있다.
돌연변이는 점라인(germline)일 수 있으며, 질환의 유전성 경향을 알아보기 위하여 사용할 수 있다. 또는 돌연변이는 체세포가 될 수 있으며, 질환의 병원론에서 유전적 변형을 결정하기 위하여 사용할 수 있다. 질환은 대사성 또는 신경학적 질환, 악성 종양, 발육상 결함이 될 수 있으며, 또는 감염성 물질에 의해 발병될 수 있다. 본 발명으로는 단순한 절차 및 실온 저장을 통하여 유전 분석용 재료가 보존된다.
본 발명은, 통상의 방법으로 처리된 조직보다 평균 분자량이 큰 핵산이 다량 수득되는 조직을 보존할 것으로 예상된다.
조직 처리 공정에 있어서 통상적인 방법에 비해 본 발명에서는 여러 특징이 두드러진다. : (a) 처리 전에 조직을 얇게 슬라이싱; (b) 조직 표본의 연속 투입 및 시스템을 통한 연속적 흐름; (c) 용액들(즉, 비수용성 용액들)로부터 물의 제거; (d) 고정, 탈수, 지방 제거, 세정, 및 균일 가열(예를 들어, 마이크로파 에너지)을 통한 조직 함침; (e) 고정-탈수-지방 제거, 고정-탈수-지방 제거-세정, 및 세정-함침용 혼합 용액들; (f) 탈기된 함침 시약을 사용한 감압 하의 조직 함침; (g) 독성 화학물질(예를 들어, 포름알데히드 및 크실렌) 제거; 및 (h) 시약 부피 감소. 이러한 특징으로 인하여, 본 발명은 단순하고, 실제적이며, 연속 처리 및 흐름을 위하여 용이하게 실시되고, 자동화하여 다루기 쉽다. 하나 이상의 이런 특징을 본 발명에 따른 조직 처리에 사용하여, 이의 장점을 얻을 수 있다.
헤마톡실린-에오신 염색은 조직학 연구에 통상적으로 사용되며, 병리학자들은 비교용 표준물로 생각할 수 있다. 또한, 본 발명은 트리크롬, 레티큘린, 뮤시카르민을 포함하는 다른 염료, 및 Thompson 문헌(Selected Histochemical and Histopathological Methods, C.C. Thomas, Springfield, Illinois, 1966), Sheehan and Hrapchak 문헌(Theory and Practice of Histotechnology, C.V. Mosby, St. Louis, Missouri, 1973) 및 Bancroft and Stevens 문헌(Theory and Practice of Histological Techniques, Churchill Livingstone, New York, New York, 1982과 같은 일반 문헌)에 기재된 바와 같은 탄성 염료와도 사용할 수 있는 것을 밝혀졌다. 완결에 단지 5분이 소요되는 Fisher Scientific의 신속한 염색 방법도 사용할 수 있지만, 상기 염색 방법은 30분 내지 수 시간 걸려 완결된다.
부검, 생체검사(예를 들어, 내시경 검사) 또는 수술을 통하여 조직을 얻을 수 있다. 암의 수술시, 염색 조직 절편으로부터 병리학적 진단을 제공하는 능력은 수술실에서 환자를 옮기기 전에 사용 가능한 정보를 의사에게 제공할 것이다. 예를 들어, 병리학자가 암이 절제된 조직에만 한정되어 있다고 진단하면, 의사는 치료를 완화하고 주변의 건강한 조직을 남겨둘 수 있을 것이다. 이와 달리, 병리학자가 암이 절제된 기관에만 한정된 것이 아님을 알아내면, 환자가 수술실에 있는 동안에 더욱 적극적으로 수술 치료가 가능할 것이다.
본 발명으로 150,000개 이상의 조직 샘플을 성공적으로 처리하였는데, 뇌, 유방, 암(예를 들어, 창자, 비인강, 유방, 폐, 위), 연골, 심장, 신장, 간, 림프종, 수막종, 태반, 전립선, 흉선, 편도, 배꼽, 자궁)이 포함된다. 석화된 조직(예를 들어, 뼈, 이)은 본 방법으로 처리하기 전에 탈석회화해야 한다. 예를 들어, Stephens Scientific(Allegiance Healthcare Supply, catalog no. 1209-1A)으로부터의 염산/에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA) 용액을 사용하여 제조자의 지시사항에 따라 조직을 탈석회화 수 있다. 큰 뼈 조각을 탈석회화하기 위해서는, 몇시간 또는 몇일도 걸릴 수 있으나, 골수 생체검사는 약 30분 내지 약 한 시간 내에 탈석회화될 수 있다. 인체의 거의 모든 기관 및 다수의 다른 질환 조직으로부터의 조직 샘플이 성공적으로 처리되었다.
본 방법으로 처리된 조직 절편은 또한 면역조직화학에 사용할 수 있다. 본 방법은, 특정 항원의 회복 및 보존을 위해 고정제 선택을 최적화할 수 있으므로, 항원이 회복 및 보존된 조직 표본을 제공한다. 비-특이 결합 부위를 차단하고, 항원을 특이 항체(예를 들어, 1차 항체)에 결합시키고, 비-결합 항체를 제거한다. 탐침 또는 시그널 발생 잔기로 라벨링하면, 1차 항체를 바로 검출할 수 있으나, 1차 항체에 특이적으로 결합하는 단백질(예를 들어, 2차 항체)에 탐침을 부착시키는 것이 바람직하다. 2차 항체는 1차 항체의 중쇄 또는 경쇄의 불변부위에 대하여 생성될 수 있다. 이는 항원-항체 컨쥬게이트를 통하여 발생되는 시그널을 증폭하는데, 각각의 1차 항체가 많은 2차 항체들과 결합하기 때문이다. 이와 달리, 비오틴-스트렙타비딘과 같은 다른 특정 상호작용을 통하여 증폭이 일어날 수 있다. 적은 체적으로 항체 결합되므로, 비싼 시약을 적게 사용할 수 있고, 고도의 결합율을 유지할 수 있다. 이러한 적은 체적은 가습 챔버에서 인큐베이팅함으로써 적게 증발된다. 시그널 발생 잔기는, 이와 같은 경우가 아니면 조직 내에 존재하지 않는 효소가 바람직하다. 예를 들어, 알칼라인 포스파타아제 및 호오스래디시(horseradish) 퍼옥시다아제를 2차 항체에 부착시키거나, 스트렙타비딘에 컨쥬게이트할 수 있다. 이들 효소에는, 가시적으로 검출이 가능한 색원체(chromogenic), 형광 또는 인광 생성물을 얻을 수 있는 기질을 사용할 수 있다.
항원 염색 패턴은, 대조 염색을 통하여 밝혀진 세포 구조의 배경 하에 항원의 발현을 알아내기 위하여 사용할 수 있다. 항원 발현으로, 세포 또는 조직 형태, 발육상 단계, 종양 전조 마커, 퇴행성 대사 과정 또는 병원균으로 인한 감염을 확인할 수 있다.
항원-항체 결합은, 형광, 방사성 또는 콜로이드 금속 탐침에 에피플루오로레슨스, 오토라디오그라피 또는 전자 현미경을 각각 사용하여 가시화할 수도 있다. 유사한 탐침을 사용하여, in situ 혼성화로 조직 절편 내 핵산을 검출함으로써, 유전적 돌연변이 또는 전사를 확인할 수 있다; 이와 달리, 핵산(DNA 또는 RNA)을 조직 절편으로부터 추출하여, 블로팅으로 즉시 분석하거나, 증폭 후 추가 유전 분석할 수 있다.
본 발명에 따라 제공되는 조직 처리용 시스템의 일예에 의하면, 예를 들어, 단일 조직 처리 유닛 또는 영역에 일련의 조직 처리 스테이션들이 제공될 수 있다. 비제한적인 예로서, 적당한 조직 처리 설비가 도 3에 도시되어 있다. 이러한 용이성으로, 조직 처리 시스템은, 배치 및/또는 연속 모우드에서 수작업하기에 적합하다.
수술 장소, 병리학 실험실 등에서 실시 가능한 처리 제 1 단계는, 경화 및 최종적으로 검사하기에 적당한 조직 표본을 만드는 것이다. 일반적으로, 관심 대상이 되는 조직의 슬라이스를 만든다. 처리를 위하여 두께 약 1 내지 약 3mm, 약 1mm 내지 약 2.5mm, 또는 약 1.5mm 내지 약 2mm의 미세한 슬라이스를 얻을 수 있다. 조직 슬라이스를, 연이은 처리동안, 경화된 표본이 절단을 위해 준비될 때까지, 조직이 담겨있게 되는 조직 카세트 또는 다른 홀더에 넣는다. 많은 카세트를 취급하기 용이하도록, 캐리어 또는 바스켓에 카세트를 넣을 수 있다. 이어서, 카세트 또는 홀더를 본 발명에 따라 제공되는 제 1 용액에 넣는다.
실시예에서, 카세트 또는 홀더(10)를 제 1 용액(14)이 담긴 파이렉스 비커(12)에, 단독으로 또는 제한된 수의 다른 유사한 조직 카세트 또는 홀더와 함께 배치식으로 넣을 수 있다. 실질적으로 연속된 방법으로 처리공정을 수동으로 처리할 수 있다. 이어서, 도 4에 도시한 바와 같이, 비커(12)를 셰이커 조(16)에 넣고 부드럽게 교반 및 가열한다. 이러한 목적으로, LAB-LINE/DUBNOFF 인큐베이터-셰이커조를 사용하였다(도 3의 B). 조직 샘플이 노출되는 수분을 최소화하고, 사실상 궁극적으로는 조직 샘플을 탈수하는 것이 목적이므로, 셰이커 조(16) 안에 온도 전달 유체(18)로서 물보다는 글리세린을 사용한다. 글리세린을 사용하면, 글리세린이 열 에너지의 효과적인 전달체이고 증발되지 않는다는 장점이 있다. 증발되면 바람직하지 못하게도 조직이 처리되는 환경에 수분이 증가되고, 주기적으로 보충해 주어야 한다. 글리세린을 사용하면 대체도 필요없고, 주변환경에 수분이 증가되지도 않아 가장 바람직하다. 이러한 처리 단계에서, 조직 표본(카세트 또는 홀더(10) 내)을 셰이커 조(18) 안의 제 1 용액에 약 3-15분동안 넣어둔다.
셰이커-조 단계동안 추가 교반하는 것도 바람직하다. 현재, 외부 펌프(A)(도 3)에, 내용물을 버블링한 후 교반하기 위하여 이로부터 용액 비커(12) 또는 다른 리셉터클로 삽입되는 튜브(도시하지 않음)가 제공된다. 폭기 확산 노즐 또는 플레이트를 제공하여, 필요한만큼 또는 바람직한 정도로 용액을 더욱 균일하게 교반한다.
조직 카세트 또는 홀더(10) 및 제 1 용액 함유 비커(12)를 위쪽으로 바람직하게 배치하기 위하여, 통상의 셰이커-조를 변형하여 가로 와이어 또는 스테이(20)(예를 들어, 조직 카세트- 또는 홀더-함유 비커(12)가 배치될 수 있는 5개의 길이방향 채널을 정의하는 4개의 와이어 등)을 제공하였다. 따라서, 예를 들어, 표본-함유 비커(12)는 규칙적으로 셰이커-조(18)에 첨가되어 충분히 처리될 수 있으며, 충분히 처리된 조직 표본은, 새로운 시료를 셰이커 조의 왼쪽 말단에 첨가하고 충분히 처리된 표본을 이의 오른쪽 말단으로부터 이동시킴으로써, 하기와 같이 더욱 처리하기 위하여 이로부터 차례로 이동될 수 있다.
조직 카세트 또는 홀더(10)를 일련의 유체들에 노출시키면서 이와 동시에 교반하고, 마이크로파를 조사한다. 일실시형태에서는, 도 3의 C,D,E에 도시된 바와 같이 세 개의 마이크로파 유닛이 제공되어 있으며, 이들은 각각 조직 카세트 또는 홀더가 일정 기간동안 침지되는 다른 용액을 갖는다. 이와 달리, 도파관이 마이크로파 에너지를 다른 용액에 전달하거나, 다른 용액의 순차적 이동이 있는 경우, 단일 마이크로파 에너지 공급원이 제공될 수 있다. 도파관은 제조하기가 더 복합하고, 단일 조직 표본에서, 이와 같이 용액을 배치 및 대체하면 조직 처리 주기 기간이 크게 증가되지 않으나, 다수의 용액을 수용하는 단일 마이크로파 유닛을 사용하면, 연이은 표본과 관련하여 처리 연속성이 방해될 수 있음을 예상할 수 있다. 실제로, 일련의 마이크로파 유닛이 제공되는 경우, 주어진 조직 표본이 한 마이크로파로부터 다음 용액을 갖는 다음 마이크로파로 이동될 때, 다음 조직 표본이 제 1 마이크로파 유닛에 이어서 수용될 수 있다. 따라서, 개별 용액 각각을 위하여 하나의 마이크로파 유닛을 제공한다는 의미는, 선행 처리 표본의 마이크로파 처리 단계가 모두 완결되는 동안, 다음 조직 표본을 보류할 필요가 없다는 의미이다. 그러나, 상기한 연속성이 방해되는 경우, 도시된 세 개의 마이크로파 유닛은 둘 또는 하나로 감소될 수 있는 것으로 이해해야 한다. 유사하게, 인력, 장비, 공간 요건 등의 포텐셜 감소에 대한 처리 연속성의 균형상 필요하거나 바람직하다면 상기 처리에 다른 단계들을 조합할 수 있다. 이러한 더욱 콤팩트한 유닛의 예는 도 7을 참조하여 하기에 더욱 상세히 설명한다.
도 5를 참조로, 조직 처리용 마이크로파 유닛(22)의 예를 도시한다. 마이크로파를 조사하기 위하여, 현재 Energy Beam Sciences, Inc.제 실험실 마이크로파 오븐을 사용한다. 출원인은 H-2800 및 H-2500의 두개의 마이크로파 프로세서 모델 을 사용하였다. 각 모델 또는 다른 유사한 이러한 시스템을 사용할 수 있다. 예로, 파이렉스 비커 또는 다른 투명한 마이크로파 유체 리셉터클(24)을 사용하여, 세 개의 마이크로파 유닛에 각각 본 발명에 따라 제공되는 제 2, 제 3 및 제 4 용액을 각각 수용한다(도 3). 온도 탐침(26)을 용액에 넣어, 각 조의 온도가 소정 범위 내에 있도록 한다. 또한, 교반하여 조직 처리를 촉진하기 위하여 폭기한다. 출원인이 사용한 마이크로파 유닛에는 폭기용 튜브(28)가 포함된다. 단일 튜브를 조 내에 삽입할 수 있으나, 더욱 균일하고 완전하게 교반하기 위하여, 가스 튜브(28)와 함께, 확산 플레이트 또는 노즐 헤드(상세히 도시하지 않음)를 교반 버블을 확산시키기 위하여, 예를 들어 용액 전체를 균일하게 교반하기 위하여 용액 리셉터클 직경 중 실질적으로 일부를 가로질러 제공하는 것이 바람직하다. 이러한 확산 플레이트 및 노즐은 공지되어 있으며, 예를 들어 용액 리셉터클의 베이스에 제공될 수 있다. 리셉터클의 안 및 밖으로 용액을 펌핑하거나(예를 들어, 리셉터클을 통하여 용액을 순환) P/V 주기를 사용함으로써(예를 들어, 일부 진공으로의 갑압 하 및 다시 가압 하에 10 내지 30초) 교반할 수도 있다.
통상 조직 처리 절차 중 일부로서 파라핀이 탈기된다. 탈기를 통하여 파라핀으로부터 유기 용매가 제거된다. 이러한 방법을 촉진하기 위하여, 그리고 이 시스템에 파라핀을 재사용하기 위하여, 연속 탈기를 제안한다. 이는 640mmHg에서 도포된 Pyrex 데시케이터 병(32) 내에 진공을 유지하여 실시한다.
마이크로파를 조사하는 연속 3 단계 후, 조직 카세트(들) 또는 홀더(들)를 파라핀 조(J)에 넣는다(도 3). 도 6을 참조하여, 도포된 병(32) 안에 세 개의 파라핀 조 스테이션(비커)(30)을 포함하여 이루어지는 파라핀 조가 제공되어 있다. 온도를 조절할 목적으로, 병(32)을 예를 들어 Poly Science 브랜드 수 조(G)에 넣는다(도 3). 그리이스 등을 뚜껑 및 병 상의 플랜지 내부 가장자리에 적용함으로써, 뚜껑 및 단지 간에 밀폐 연결이 가능하고, 이어서 뚜껑 내에 제공된 연장 호오스 연결기(36)를 통하여 진공화될 수 있다. 적당한 이러한 도포된 병으로 Fisher Scientific 제(모델 01-092-25)를 사용한다. 도포된 병(32) 안을 진공화하기 위하여, 통상의 가압/진공 펌프(38)(F)(도 3)를 차례로 커넥터(36)에 연결되어 있는 튜브(40)에 연결한다. 이러한 적당한 전력 작동 펌프로 Fisher Scientific 제를 사용할 수 있으며, 최대 약 100 psi의 압력를 갖는다.
이어서, 조직 표본을 포매하여야 한다. 이러한 목적으로, 통상의 Miles/Sakura제, 예를 들어 모델명 4708인 TISSUE-TEK 포매 콘솔 시스템(I)(도 3)을 사용한다.
이어서, 포매된 조직 표본을 마이크로톰(L)(도 3)을 사용하여 통상의 방법으로 절단하고, 부유시켜(M)(도 3) 배치한다. 출원인은 Leitz 1512 마이크로톰 및 Lipshaw Electric Tissue Float Model 375를 사용한다. 고온 플레이트(N)(도 3)가 제공된다.
슬라이스를 슬라이드 위에 배치한 후, 슬라이드를 가열하여 파라핀을 용융시키고 절편을 유리에 부착시킨다. 출원인은 Fisher(K) 제 Isotemp Oven 300 시리즈를 사용하였다(도 3).
이어서, 슬라이드를 염색하였다. 염색 처리를 촉진하기 위하여, 자동 염색기(automated stainer: O)(도 3)를 사용하여 인원수 및 소요 시간을 감소시키도록 제안한다. 불-연속 처리시는 배치 내 슬라이드를 염색하는 Miles-Sakura 다양화 염색기 DRS-601를 사용할 수 있다.; 이와 달리, 왁스 제거 단계를 함유하는 Leica 자동 염색기 XL을 사용하여 연속 처리함으로써, 오븐 내에서 별도 배양 단계를 생략할 수 있다. 면역조직화학(IHC) 염색기(P)(도 3) 및 IHC 콘트롤(Q)(도 3)도 도시되어 있다. 이어서, 고정 및 염색 조직 표본은 예를 들어, TISSUE-TEK 커버슬리퍼[모델 번호 4764(R)]를 사용하여 덮는다(도 3).
상기한 바와 같이, 본 처리에 따른 탈수 및 함침 실시용 시스템은 일련의 개별 유닛들이 될 수 있다. 이와 달리, 상기한 바와 같이, 하나 이상의 단계들을 단일 처리 성분 또는 유닛으로 실시할 수 있다. 제공되어 있는 유닛 및 각 유닛으로 실시되는 단계들의 수는, 조직 처리 시스템의 연속성 및 완료에 필요한 시간에 영향을 준다. 따라서, 체적이 적은 환경에서는, 다수의 조직 처리 단계를 실시하기 위한 단일 유닛이 유리하며, 이는 처리 연속성에 크게 영향을 주지 않을 것이다. 체적이 큰 시스템 환경에서는, 조직 처리 시스템이 둘 이상의 유닛 또는 병렬의 일련의 유닛을 포함하여 이루어질 수 있다.
조직 처리 시스템(42)의 예를 도 7에 도시한다. 시스템(42)은 두 서브유닛; 마이크로파 유닛(44) 및 함침기 유닛(46)를 포함한다. 마이크로파 유닛(44)은, 용액 A, 용액 B, 용액 C에서 처리되는 조직을 계속적으로 용액에 담그기 위하여 제공되며, 각 경우에 용액을 교반하고, 조직을 마이크로파 에너지에 노출시킨다. 따라서, 도시된 실시형태에서, 예를 들어 하나 이상의 조직 카세트(10)을 넣을 수 있는 하나 이상의 트레이 캐리어(50)를 수용하기 위한 용기(48)가 제공된다. 용기(48)는 유체를 통하여 조직 탈수용 용액의 각 공급원에 연결되어 있다. 따라서, 일단 조직 카세트(들)를 개별 트레이 캐리어(들)(50)에 위치시키면, A 용액은 용기(48)로 흐르게 되고, 예를 들어 폭기 튜브(도 7에 도시하지 않음)를 통한 교반과 동시에 마이크로파 에너지가 이에 적용된다. 용액에 초음파 에너지를 전달하거나 이의 버블링, 셰이킹, 또는 진동을 일으키는 기계적 장치로 교반을 제공할 수 있다. 이와 달리, 펌프를 사용한 순환 또는 P/V 주기를 통하여 교반을 제공할 수 있다. 충분한 시간 노출시킨 후, A 용액을 배출하고, 조직 카세트를 B 용액 또는 A 용액 및 B 용액 혼합액으로 플러싱하여 실질적으로 잔류 용액 A를 제거하는 것이 바람직하다. 이어서, B 용액을 용기(48)에 공급하여, 일정 기간동안 다시 마이크로파 에너지를 적용하고 교반한다. B 용액을 적용한 후, B 용액을 이의 저장 용기에 다시 되돌려보내고, 조직 표본을 C 용액 또는 B 용액 및 C 용액의 혼합액으로 플러싱한다. 이어서, C 용액을 용기(48)에 공급하고, 교반 및 마이크로파 에너지를 적용하고, 최종적으로 C 용액을 배출한다. 동일한 수의 저장 용기, 저장 및 반응 용기 사이의 튜브 또는 파이프에 유체를 이동시키기 위한 펌프, 및 공동 튜브 또는 파이프를 사용하는, 다른 저장 용기를 반응 용기에 연결하기 위한 다위치(multi-position) 회전 밸브를 사용하여, 용기(48)에 다른 용액을 쉽게 이동시킬 수 있다. 이어서, 조직 표본을 함침 준비한다.
도시된 실시형태에서, 조직 처리 시스템의 제 2 함침기 유닛(46)에서 함침을 실시한다. 이를 통하여, 다음 조직 표본(들)에 마이크로파 에너지가 적용되는동안 함침을 실시할 수 있다. 단일 유닛이 제공되는 경우에는, 마이크로파 처리용 용기를 함침에 사용할 수 있으나, 함침 단계동안에는 마이크로파 에너지를 이에 적용할 수 없다.
제안되어 있는 함침 처리법에 따라, 조직 제조 방법의 최종 단계로서 순차적 파라핀 조를 제공하여 조직 표본을 함침하기 위하여, 일련의 파라핀 용액(예를 들어 3 또는 4)을 예를 들어, 적당한 용기(54) 내 트레이 캐리어(52)에 배치된 조직 카세트에 적용한다. 함침기 유닛(46)에, 승온으로 조절하여 진공 하에 조직 표본을 넣는다. 이 단계에서, 용액에 초음파 에너지를 이동시키거나 이의 버블링, 셰이킹 또는 진동을 일으키는 기계적 장치로 교반을 제공할 수 있다. 이와 달리, 펌프를 사용하여, P/V 주기 또는 용액 순환을 이용하는 교반도 가능하다.
본 명세서에서, 트레이 운반장치는 수작업으로, 또는 전기자 또는 트랙 운반체(도 7에서 도시되지 않음)에 의해 용기 사이에서 옮겨질 수 있다. 조직표본의 이동은 다른 용액과 함께 고정운반장치를 포함하는 용기를 충전한 후 용액을 바꾸는 사이에 용기를 배출함으로써 최소화될 수 있다. 슬라이드 표본의 나머지 포매 등의 단계는 도 3을 참조하여 상기 약술된 바와 같이 행해진다.
마이크로파 유닛은 이들이 오버쿠킹되는 것을 방지하면서 조직 표본을 완만하게 가열하고, 챔버 내의 다른 위치에 있는 표본들이 대략 동일한 온도로 유지될 수 있도록 반응챔버 내를 균일하게 가열한다. 오버쿠킹이란 마이크로파 영역이 너무 강하기 때문에 조직 표본의 조직학적 구조에서 변화가 생기는 것으로 정의된다. 마이크로파는 주위용액보다 조직표본을 더 잘 가열할 수 있다; 이 효과는 열이 조 직표본으로부터 주위로 분산되기에 충분한 시간을 허용함으로써 최소화된다.
본 발명의 마이크로파 유닛은 (a) 마이크로파 에너지의 공급원(예를 들면, 마그네트론, 클라이스트론, 가동파 튜브), (b) 상기 공급원으로부터 반응챔버로 마이크로파 에너지를 전달하는, 그 크기와 형태가 본 목적에 적합한 도파관, 및 (c) 전달된 마이크로파 에너지를 수용하고 적어도 화학적 고정, 탈수, 및 탈지에 의해 조직표본을 처리하기에 적합한 반응챔버를 포함한다. 반응챔버는 다수의 다른 조직표본을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 반응챔버의 내부 기하학은 마이크로파 에너지를 균일하게 분배하고 그 내용물을 균일하게 가열하도록 만들어진다. 균일성은 주로 2가지 인자를 고려하여 달성된다.
첫번째로, 반응챔버의 외주는 챔버 내의 마이크로파 방사선의 반파장의 정수가 되도록 만들어진다. 반응챔버 속으로 도파관 입구를 적절하게 배열하면, 외벽 주위로 전파될 모드가 여기될 것이다. 이러한 형태의 모드는 마이크로파 영역이 외벽 주위에서 우세하다는데 특징이 있다. 유사한 현상은 음파가 고체벽 옆으로 매우 효과적으로 이동하는 음향효과에서 일어난다. 이러한 형태의 모드를 속삭임의 회랑모드라 한다.
두번째 고려사항은 반응챔버 내 용액의 경계와 이의 벽 사이의 반지름이다. 최적 간격은 그 간격을 변화시킴으로써 경험적으로 결정된다. 간격이 너무 좁다면, 마이크로파 방사선은 반응챔버에 대한 도파관 입구 가까이에서 먼저 흡수된다. 간격이 너무 넓다면, 반응챔버는 공명 공동이 되어 비수성 용액과 그 속의 고체(예를 들면, 조직표본, 카세트 및 바스켓)의 양에 민감하다. 간격이 적절하면, 반응챔버 외부 레벨 센서에 의해 측정되는 바와 같은 광범위한 레벨의 내용물(즉, 그 속의 부피)에 대해 용액과 고체의 효과적인 가열이 이루어진다. 최고 레벨(즉, 총부피)의 10% 정도로 적어도 여전히 내용물은 효과적으로 가열된다.
이와 유사하게, 공급원과 도파관은 마이크로파 방사선이 전달되는 동안 에너지손실이 최소가 되도록 만들어진다. 마이크로파 유닛은 도파관이 공급원으로부터 반응챔버까지 약 2% 이하의 에너지 손실을 가지도록 만들어진다. 에너지 손실이 더 높으면 마이크로파 에너지의 공급원을 위한 고가의 차폐 및 다른 보호장치를 사용할 필요가 있을 것이다.
가열은 마이크로파 공급원의 캐소드의 가열특성에 의해 최소시간이 필요하기 때문에 약 10초 내지 약 25초의 주기에서 전력 온-오프를 반복함으로써 조절할 수 있다. 그러나, 이것은 조직에 화상을 입힐 수 있으므로, 가열은 마이크로파 공급원에 의해 반응챔버로 전달되는 전력이 지속적으로 변화하도록 가변전류공급원을 통해 조절될 수 있다. 그러한 화상 또는 오버쿠킹은 세포의 특징을 구분하지 않고 조직구조를 균일하게 염색함으로써 표시된다.
마이크로파 유닛은 반응챔버 내에 적합하고 적어도 하나의 조직표본를 수용하기에 적합한 떼어낼 수 있는 컨테이너(예를 들면, 바스켓); 반응챔버 내의 조건들을 조사하기 위한 적어도 하나의 온도 및/또는 압력 탐침; 공급원에 의해 보내지고, 도파관을 통해 전달되고, 및/또는 반응챔버에 의해 수용되는 마이크로파 에너지를 조사하기 위한 하나 이상의 에너지 탐침; 반응챔버에 적합하고 반응챔버를 조작자 주위로부터 분리하기에 적합한 마개; 반응챔버 내에 열을 보유하기 위한 열절 연체; 전자성분을 반응챔버 내의 화학물질로부터 분리하기 위한 차폐물; 및 적어도 하나의 탐침 또는 타이머로부터 입력을 받고, 그것에 의해 공급원으로부터 보내지고, 도파관을 통해 전달되고, 및/또는 반응 챔버 내에 수용되는 적어도 하나의 마이크로파 에너지를 조절하기 위한 제어회로망의 조합을 더 포함할 수 있다.
밀봉에 사용되는 물질의 특징은 반응챔버를 환경으로부터 밀봉하듯이 분리하는 능력, 마이크로파 방사선에 대한 실질적 투명도, 마개와 일치하는 단단한 맺음새를 보증하는 적응성, 및 공정의 용액들에 대한 화학적 저항성이다. 반응챔버를 (a) 증발을 감소시키기 위한 마개와 밀폐봉인 및 (b) 열절연체로 변형시키면 마이크로파 유닛을 작동하는데 필요한 전력을 2배 또는 3배 감소시킬 수 있다.
도 8a는 예시적인 마이크로파 유닛의 상단면도를 나타내고, 도 8b는 예시적인 마이크로파 유닛의 측단면도를 나타낸다. 마이크로파 에너지는 도파관(62)에 의해 마이크로파 튜브(58)로부터 반응챔버(60)로 운반된다. 연동장치(64)는 마이크로파 유닛이 열린 동안 작동하지 않을 것이라는 것을 보증하고, 정렬핀(66)은 장치가 닫혀있다는 것을 보증한다. 절연인서트(68)는 열손실을 감소시키기 위하여 반응챔버(60)의 내용물(70)을 둘러싼다. 교반기(72)와 열전쌍(74)은 반응챔버(60) 속으로 돌출하여 도시된다. 뚜껑(76)은 조직표본을 함유하는 바스켓(도시하지 않음)을 잡아 이것을 반응챔버(60) 속에 배치하거나 반응챔버(60) 밖으로 꺼내기 전에 (예를 들면 핸들(78)을 들어올리는 로보트 암에 의해) 제거되어야 한다.
예시적인 마이크로파 유닛의 반응챔버(60)의 보다 상세한 도면은 도 8c에 도시되어 있다. 마이크로파 유닛은 반응챔버(60)가 환경으로부터 분리되기 때문에 선택적으로 MW 레토르트(80)라고도 불리지만, 조직표본을 경화시키는데 진공은 필요하지 않다. 시약출입구(82)는 용액을 반응챔버(60) 속으로 및 밖으로 운반하는데 사용될 수 있고, 또는 공기출입구(84)로서 사용될 수 있다. 용접된 ¼-인치 소켓은 절연인서트(68)와 MW 레토르트(80) 사이를 밀봉한다. 용액레벨은 반응챔버(60)의 내부에 연결된 외부관측튜브(86)를 통해 가시화될 수 있다. 근접스위치(88)는 레벨센서로 기능한다.
예시적인 마이크로파 유닛의 전기성분은 도 9에 도시되어 있다. 반응챔버(60)의 내용물의 온도조절은 도 10에 도시되어 있다. 온도제어장치(90)는 원하는 온도로 프로그램된다. 제어신호(92)는 전력(94)을 마이크로파 공급원(58)에 가하기 위해 마이크로파 유닛로 보내지고, 마이크로파 에너지는 도파관(62)에 의해 반응챔버(60)로 전달된다. 열전쌍(74)은 반응챔버(60)의 내용물의 온도를 감지하여 온도제어장치(90)로 피드백된다. 그 다음에 온도제어장치(90) 내의 알고리즘이나 다른 프로그램은 제어신호(92)가 감지된 온도가 원하는 온도와 대략 동일하도록 조절한다.
조직처리용 시스템은 조직표본의 고정, 탈수, 탈지, 세정 및/또는 함침의 조합을 수행하도록 물리적으로 연결된 일련의 모듈(예를 들면 작동가능하게 연결된 마이크로파 유닛을 가지거나 가지지 않은 반응챔버들)을 포함하여 이루어질 수 있다. 이 시스템은 하나의 모듈 또는 다수의 모듈을 포함하여 구성될 수 있다. 각 모듈을 전체처리주기의 일부를 구성할 것이지만, 그 속에 함유된 화학적 조성때문에 개별모듈은 조직처리의 단계들 중 하나 이상(즉, 고정, 탈수, 탈지, 세정 및 함침) 을 수행할 수 있다. 적어도 하나의 모듈과 시스템의 다른 성능특성(예를 들면, 모듈 내의 화학물질의 양, 조직표본이 모듈 내에서 또는 화학물질과 접촉하여 소비한 시간)에서의 반응조건 측정내용을 수용하고, 조작자가 검색하도록 측정내용을 저장하기 위한 기록장치를 포함할 수 있다.
모듈은 동일한 공간을 차지할 수 있고 및/또는 조직표본은 정적으로 존속할 수 있다. 마이크로파 또는 열에너지는 동일한 공간 속으로, 또는 공정에서 다른 시간에 정적 조직표본 위로 조절되고 전달될 수 있다. 화학용액 및/또는 증기는 동일한 공간 속으로 또는 밖으로 이동하거나 정적 조직표본과 접촉하거나 접촉하지 않을 수 있다. 하나 또는 2개의 반응챔버를 사용하고, 별도의 저장 및/또는 폐기챔버로부터 튜빙 또는 파이핑에 의해 반응챔버 속으로 다른 화학적 조성을 운송함으로써 시스템을 위한 공간요건을 최소화하는 것이 바람직하다. 제어장치는 반응챔버로부터 및/또는 처리주기의 그 부분에 알맞은 시간으로부터 입력을 받음으로써, 다른 화학적 조성의 운송을 조절할 수 있다.
선택적으로, 적어도 4, 5, 또는 6개의 다른 화학적 조성을 함유하고 적어도 하나의 전기자 또는 트랙 운반체를 가져 모듈 사이에서 조직표본을 이동시키는 다수의 모듈이 제공될 수 있다. 따라서, 상기 시스템은 적어도 1, 2, 3 또는 4개의 마이크로파 유닛을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 조직표본이 하나의 화학적 조성에서 동일한 화학적 조성을 가진 다른 것으로 운반된다면, 그 속의 화학적 조성을 교환하여 처리주기의 부분들을 동일한 모듈 속으로 결합시킬 수 있다. 따라서, 처리주기의 어떤 부분들은 조합될 수 있고 요구되는 다른 모듈의 수는 감소될 수 있다. 유체운반용 배관은 전체 처리주기 동안 화학적 조성이 반응챔버 내에서 유지되고 충전단계에서 주기의 개시에서만 반응챔버 속으로, 또는 비우는 단계에서 주기의 종료 시에 반응챔버 밖으로 이동될 수 있기 때문에 이미 설명한 다른 실시형태들과 비교할 때 단순화될 수 있다. 또한 반응챔버와 유체연통하고 다른 화학적 조성을 포함하여 이루어지는 저장챔버를 사용하고, 필요에 따라 그들을 적합한 반응챔버속으로 및 밖으로 이동시킴으로써 모듈의 수를 하나 또는 둘(예를 들면, 단 하나의 마이크로파 유닛 및 하나의 함침유닛)까지 줄일 수 있다. 예를 들면, 펌프와 다위치 회전 밸브는 펌핑에 의해 리저버와 반응챔버 사이의 유체이동을 조절하는데 사용될 수 있다. 또한 제어장치 회로망은 모듈 간의 이동이 시간의 공통블럭의 집적 다단자에서 일어난다면 단순화될 수 있다. 조직표본의 이동은 조직표본으로 로딩된 운반장치 또는 바스켓이 설정된 배양시간 동안 특정 순서로 모듈들을 만나도록 메모리에 저장된 프로그램에 의해 조절될 수 있다. 모듈들 중 일부가 동일한 화학적 조성을 포함할 수 있는 다른 모듈들의 수는 적어도 4 내지 10의 임의의 정수일 수 있다. 2, 3 또는 4라인의 모듈이 평행처리를 위해 배열될 수 있다.
예시적인 함침기 유닛은 함침제(114)를 액체로 유지하기 위한 가열코일(112)을 통과한 고온유체(예를 들면, 물)와 함께 도 11에 도시되어 있다. 방사선열은 반응챔버(120)의 내부의 그러한 코일(예를 들면, 가열코일(112)) 또는 그 외부를 싸고 있는 전기와이어(도시되지 않음)에 의해 제공될 수 있다. 뚜껑(100)과 개스킷(102)은 반응챔버(120)를 덮고 조직표본을 포함하는 바스켓(도시되지 않음)이 잡히기 전에 핸들(104)을 사용하여 제거된다. 여기서, 힌지(106)는 뚜껑(100)이 어떻게 반응챔버(120)에 부착되는지를 보여준다. 스테인레스 스틸이 함침기 유닛의 외면으로 사용될 수 있다. 절연인서트(110)에 대한 정렬링(108)은 바스켓이 반응챔버(120) 속으로 바르게 배치되도록 한다. 절연인서트(110)(예를 들면 DELRIN 또는 다른 플라스틱물질)는 조직표본을 함침하는 동안 열손실을 감소시킨다. 진공출입구(116)를 사용하여 반응챔버(120) 내의 압력을 감소시키면 함침이 촉진된다. 뚜껑(100)과 개스킷(102)은 그 배출 후 반응챔버(120) 내의 진공을 유지한다. 운반하는 동안, 함침기유닛의 반응챔버(120)의 내용물의 온도는 약 2℃ 내에서 유지된다.
다른 용액들을 반응챔버 속으로 및 밖으로 운반하거나 다른 용액들을 포함하는 반응챔버들 사이에서 바스켓을 운반하는 것은 반응단계에서 변화를 초래할 수 있다. 반응챔버의 내부 위에 바스켓을 약 10초동안 유지하면, 바스켓이 운반되기 전에 바닥 및/또는 측면의 하나 이상의 개구를 통해 과량의 용액은 배출된다. 따라서, 바스켓이 각각 조직처리화학물질의 특정 조성을 유지하는 반응챔버들 사이에서 이동하는 순서와, 각 반응챔버 내에서 바스켓이 배양되는 시간은 본 발명에 따른 방법을 수행하는데 필요한 일련의 화학반응을 지시할 것이다.
뚜껑은 제거될 수 있다; 개스킷은 뚜껑에 부착되어 그것과 함께 이동할 수 있다. 뚜껑과 개스킷을 제거하는 이 방법은 처음 조직표본을 함유하는 반응챔버와 조직표본이 이어서 운반될 다음 반응챔버 모두에 대해 행해진다. 그 다음에 바스켓을 제거하고, 그 속에 포함될 수 있는 바스켓과 임의의 카세트로부터 용액이 약 10초 동안 반응챔버 속으로 다시 배출되도록 하고, 바스켓을 공정 중의 다음 화학용액을 포함하는 반응챔버로 운반한다. 마지막으로, 뚜껑과 개스킷을 재배치한다. 그러한 운반을 위한 총 시간은 약 1분이다.
조직처리를 위하여, 적어도 4, 5 또는 6가지의 다른 화학적 조성을 포함하고 적어도 하나의 전기자 또는 트랙 운반체를 가져 모듈 사이에서 조직표본을 이동시키는 다수의 모듈이 사용될 수 있다. 상기 시스템은 적어도 1, 2, 또는 3개의 마이크로파 유닛을 포함하여 이루어질 수 있을 것이다. 본 발명의 바람직한 실시형태에서, 조직표본이 하나의 화학적 조성에서 동일한 화학적 조성을 가진 다른 것으로 운반된다면, 그 속의 화학적 조성을 교환하여 처리주기의 이 부분들을 동일한 모듈 속으로 결합시킬 수 있다. 따라서, 처리주기의 어떤 부분들은 조합될 수 있고 요구되는 다른 모듈들의 수는 감소될 수 있다. 배관은, 많은 고려되는 실시형태에서, 전체 처리주기 동안 화학적 조성이 반응챔버 내에서 유지되고 충전단계에서 주기의 개시에서만 반응챔버 속으로, 또는 비우는 단계에서 주기의 종료 시에 반응챔버 밖으로 이동될 수 있기 때문에 단순화될 수 있다. 제어장치 회로망은 모듈 간의 이동이 시간의 공통블럭의 집적 다단자에서 일어난다면 단순화될 수 있다. 모듈들 중 일부가 동일한 화학적 조성을 함유할 수 있는 다른 모듈들의 수는 적어도 4 내지 10의 임의의 정수일 수 있다.
본 발명에 따르면, 상기 실시형태에 대한 변화를 고려할 수 있다. 조직처리시스템의 다양한 형태가 가능하고, 광학모듈은 연결되어 시스템의 일부를 형성할 수 있다. 선택된 특정형태는 임상실험실에서 일일기준으로 처리될 평균 표본의 수, 및/또는 조직학 또는 병리학 보고서가 준비되어야 하는 속도에 의해 결정될 수 있 다.
상기 시스템은 통상적인 마이크로파 오븐, 본 발명의 개선된 마이크로파 유닛, 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다.
상기 시스템은 수동 작동되거나 자동화될 수 있다. 수동 작동은 방법 또는 장치 내의 변화가 신속하게 평가될 수 있기 때문에 연구 및 개발에 특히 적합하다. 자동화된 기구에 대해, 조직표본은 전기자 또는 트랙 운반체에 의해 운송될 수 있고 및/또는 화학적 조성은 내부식성 배관에 의해 운반될 수 있다. 따라서, 조직처리는 조직표본을 설정된 시간동안 특정순서로 정적 모듈들 사이에서 이동시키는 것, 정적 조직표본이 설정된 시간동안 특정 순서로 배양되도록 다른 화학물질의 모듈을 충전하고 비우는 것, 또는 이들의 임의의 조합에 의해서 자동화될 수 있다.
전기자 운반체는 예를 들면, 집게형 메카니즘으로 표본을 잡거나 갈고리형 장치로 표본을 긁을 수 있다. 암은 사람과 유사한 동작을 수행하도록 관절을 형성할 수 있거나; 직선 또는 2차원 운동, 및 선택적으로 상기 시스템에 대해 암의 레벨을 변화시킴으로써 제공되는 다른 차원의 운동을 하는 고정된 조정래크 내에 설치될 수 있다. 트랙 운반체는 탄력이 있거나 끈적끈적한 물질로 만들어져 마찰력에 의해 트랙 위에 표본을 고정할 수 있거나, 규칙적인 일련의 범프 또는 벽이 있어서 그 사이에 표본을 가둘 수 있다. 상기 트랙은 연속벨트로 형성될 수 있거나, 벨트를 롤러 또는 스프로켓 메카니즘을 가진 운동을 하게 하면서 조직표본을 운반하는 일련의 벨트일 수 있다. 카세트 또는 홀더는 암에 의해 잡히는 (손잡이를 가지거나 가지지 않은) 자루 또는 암에 의해 잡히는 루프를 가지거나, 또는 트랙 내의 그루 브 또는 새김자국 내에 꼭 맞음으로써 운반체에 적합해질 수 있다. 이와 유사하게, 카세트나 홀더는 많은 수의 표본을 처리하기 위하여 운반장치 또는 바스켓 내에 조직화될 수 있고, 운반장치나 바스켓은 전기자 또는 트랙 운반체에 의한 운송에 적합해질 수 있다.
전기모터와 제어장치는 조작자의 실시간 명령 또는 저장된 프로그램의 선택에 의해 조직표본을 운송하는데 사용될 수 있다. 각 모듈에서 조직표본에 의해 소비되는 시간을 조절하는 단순한 메카니즘은 일정한 속도에서 조직시료 또는 그 홀더를 이동시키거나 원하는 배양시간을 조절하도록 각 모듈을 통과하는 경로의 길이를 조절하는 것이다.
배관의 다른 성분뿐 아니라 파이핑 또는 가요성 튜빙은 조직처리에 사용되는 화학물질(예를 들면, 폴리에틸렌, 폴리비닐 클로라이드, 테플론, 스테인레스 스틸)에 의한 부식에 저항성이 있어야 한다. 기계적 또는 전기적 펌프/밸브 및 제어장치는 저장챔버에서 반응챔버로, 조성이 재사용될 수 있다면 반응챔버에서 저장챔버로, 조작자의 실시간 명령 또는 저장된 프로그램의 선택에 의해 조성이 시스템으로부터 흘러나오고, 저장챔버를 충전하고, 폐기챔버를 씻어낸다면 반응챔버에서 폐기챔버로의 임의의 조합으로 화학적 조성을 이동시키는데 사용될 수 있다. 배관성분의 조합을 가열하는 것은 반응온도에서 화학적 조성을 유지하거나 화학적 조성(예를 들면, 파라핀-함유)을 운반가능한 유체상태로 유지하는데 필요할 수 있다. 이와 대조적으로, 증기밀봉 및/또는 냉각이 시스템의 기계적 및 전기적 성분으로부터 부식성 증기를 분리하는데 필요할 수 있다.
표본은 연속적으로 및/또는 배치로 처리될 수 있다.
자동화된 기구에 대한 안전성 고려 및 예방조치(예를 들면, 경보 모니터, 근접센서)를 시스템 속에 넣을 수 있다. 또한, 악세서리, 1회용부품(예를 들면, 카세트, 망상자류) 및 상기 시스템에 사용하기에 적합한 시약도 시스템의 일부로 고려될 수 있다. 이러한 특별히 디자인된 기구와 장치는 미국특허출원 제60/056,102호 및 제09/136,292호에도 기재되어 있다.
본 발명은, 실제 병리학, 환자 간호, 생의학 연구 및 교육 분야에서 통상적인 방법에 비하여 많은 장점을 갖는다.
조직 표본을 입수한 후 약 1 내지 6 시간 내에 현미경 진단이 가능하면, 외과적 방법과 병리학적 평가 간에 신속한(또는 실-시간의) 임상적 상호적용이 가능할 것이다. 예를 들어, 조직을 처리하기 위하여 65분이 소요되는 경우, 약 두 시간 내에 즉각적인 진단이 가능하다. 이를 통하여, 질병의 진단 결과, 예상 및 치료 계획이 나올 때까지의 환자의 불안을 최소화하거나 없앨 수 있으므로, 환자 간호를 크게 진보시킬 수 있다.
결과적으로, 병리학 실험실에서의 작업 흐름이 전면적으로 바뀔 것이다. 임상 실험실 공간, 병리학적 전문기술, 및 사무 및 기술 직원을 더욱 효과적으로 쓸 수 있을 것이다. 연속적인 작업 흐름으로 인하여 표본을 처리 및 평가하는 병리학자들은 이를 쉽고 간단하게 실시할 수 있고, 표본을 처리 및 평가하기 위하여 필요한 병리학자의 수가 감소될 것이며, 또한 의학적 교육법이 개선되어, 특히 연수 프로그램이 쉽고 간단하게 될 것이다.
소량의 시약을 사용하여 비용이 절감될 것이다. 포름알데히드 및 크실렌이 사용되지 않고, 다른 유해한 화학제의 필요성이 줄어들어, 환경 보호에 도움이 되고, 실험실이 더욱 안전하게 될 것이다. 유해한 화학물질의 취급 및 폐기와 관련되는 비용이 감소될 것이다.
조직 고정 및 처리 방법이 표준화되어, 다른 실험실에서 얻은 표본을 쉽게 비교할 수 있을 것이다. 포름알데히드 및/또는 장기 처리로 인한 조직학의 인공산물이 제거될 것이다. 따라서, 정상 및 병든 조직의 현미경적 형태를 더욱 정확히 평가할 수 있을 것이다. 유사하게, 항원 회수 및 염색이 개선될 것이다. 유전적 분석에서, 포름알데히드-유도된 DNA 돌연변이가 없어질 것이며, 기록 보존 재료로부터의 핵산 추출이 개선될 것이다. 저장, 고정된 파라핀-포매 조직으로 RNA 연구가 가능하게 되어, 제한 없이 진단 및 연구가 가능하게 된다.
본 명세서에 인용된 모든 문헌, 기사, 출원서 및 특허는 전부 본 명세서에 참조 병합되었다.
하기 실시예는 본 발명을 설명하기 위한 것으로, 본 발명을 제한하고자 하는 것이 아니다. 시판중인 통상적인 마이크로파 오븐의 예로는 N.B.Energy Beam Sciences' 조직 마이크로파 프로세서가 있다.
실시예 1
두꺼운 조직을 최대 2mm, 바람직하게는 1.5mm 이하로 슬라이스하였다. 신선하거나 사전에 고정된 조직의 2mm 두께 또는 이보다 얇은 슬라이스, 또는 작은 생 체 조직편은 조직 카세트에 넣고, 다음의 비-수성 제 1용액에 위치시켰다:
40% 이소프로필 알코올,
40% 아세톤,
20% 폴리에틸렌 글리콜(평균 분자량 300), 및
1% 디메틸 술폭사이드(DMSO)(즉, 상기 혼합물의 리터 당 10ml).
조직 표본은 45℃ 내지 50℃ 글리세린 조 온도에서 15분 동안 배양되었다. 400ml 고정용 용액을 수조 셰이커(5cm/초의 선형 변위)내의 500ml 비이커에 넣었다. 고정 용액의 부가적 교반은 공기 펌프로 버블링하여 제공되었다.
고정, 탈수, 지방 제거, 세척, 및 함침은 조직 표본을 세 개의 다른 용액(즉, 하기 제 2, 제 3 및 제 4 용액)에 에너지 빔 사이언스로부터 각 세 개의 마이크로파 오븐에서 연속하여 노출시킴으로써 실시하였다. 70% 이소프로필 알코올 및 30% 폴리에틸렌 글리콜(평균 분자량 300)의 용액 1리터는 1500ml 비이커에 담겨 첫번째 오븐(H2800 모델)에 위치시켰고, 70% 이소프로필 알코올 및 30% 크실렌으로 구성된 용액 1리터는 1500ml 비이커에 담겨 두번째 오븐(H2800 모델)에 위치시켰고, 크실렌 1000ml 및 파라핀 300gm의 용액은 1500ml 비이커에 담겨 세번째 오븐(H2500 모델)에 위치시켰다. 이 세 용액에 리터 당 DMSO 10ml를 첨가하였다. 마이크로파로 60℃의 열을 첫번째 오븐에는 15분, 두번째 및 세번째 오븐에는 각각 5분 동안 방사하였다(2초 싸이클로 75% 전력 세팅).
마이크로파 방사 단계를 완료한 후, 파라핀 함침을 계속하기 위하여, 조직 절편을 파라핀으로 채워진 큰 데시케이터 안에 녹은 파라핀이 있는 네 개의 500ml 조에서 배양하고, 75℃ 글리세린 조에 두었다. 조직 절편은 한 파라핀 조에서 다음 조로 3분 간격으로 이동되었고, 총 함침 시간은 12분이었다. 각 3분 간격은 압력이 약 640mm Hg을 가리킬 때의 시간으로부터 측정되었다. 이 단계 동안 교반하지 않았다.
실시예 2
새로 만들어거나 고정되어 있는 조직 절편(약 1mm 두께)의 고정, 탈수, 지방 제거, 및 파라핀 함침은, 이 조직 절편을 하기한 연속적인 네 단계에 노출시킴으로써 40분 만에 달성되었다.
단계 1.
이 실시예에서 제 1 용액은 다음과 같이 구성한다:
60% 이소프로필 알코올,
10% 아세톤,
30% 폴리에틸렌 글리콜(평균 분자량 300), 및
총 체적의 약 1% 농도로 첨가된 디메틸 술폭사이드(DMSO). 조직 카세트에 든 60개의 조직 표본을 고정시키려면 이 용액 1리터면 충분하다. 이 표본들은 제 1 용액을 포함한 일련의 세개의 조에서 각각 5분 동안 55℃로 시판 조직 마이크로파 프로세서(H2500 또는 H2800, 에너지 빔 사이언스)에서 배양되었다(총 배양 시간은 15분); 용액을 버블링으로 교반하여 용액 교환을 촉진하였다.
단계 2.
표본은 60℃에서 70% 이소프로필 알코올, 30% 아세톤, 및 약 1% 농도로 첨가 된 DMSO의 용액 속에서 배양되었다. 표본들은 이 용액을 함유한 두 비이커에서 각각 시판 조직 마이크로파 프로세서(H2800, 에너지 빔 사이언스)에서 5분 동안 가열하고(총 10분 배양), 버블링으로 교반하였다.
단계 3.
마이크로파 조사에 이어, 60℃ 또는 70℃ 글리세린 조에 놓아둔 큰 데시케이터에 위치한 25% 광유 및 75%의 용융 파라핀 왁스 용액에 5분 동안 약 200mm Hg의 진공 하에서 배양하여 함침을 시작하였다. 실시예 1에 기재한 바와 같이 파라핀은 사용하기 전에 가스가 제거되었다.
단계 4.
75℃ 글리세린 조에 놓아둔 큰 데시케이터 안에 위치한 네 개의 용융 파라핀 조에서 배양하여 함침을 완료하였다. 조직 절편은 3분 간격으로 한 파라핀 조에서 다음 조로 이동되어, 총 12분동안 함침시켰다. 압력이 약 640mmHg가 되는 시간을 위해 각각 3분 간격으로 측정되었다.
이 실시예에서, 각각의 이소프로필 알코올 및 아세톤 용액에 색 반응 지시약 원료 용액(1000ml 이소프로필 알코올에 10gm 메틸렌 블루) 6ml가 첨가되었다. 조직 절편은 푸른빛을 얻어 함침 및 취급시 취급하기 용이하다; 또한 조직 표본의 청색을 관찰하여 조직 표본의 투과성을 모니터할 수 있다.
실시예 3
새로 만들거나 고정되어 있는 조직 절편(약 1 내지 2mm 두께 이하)의 고정, 탈수, 지방 제거, 및 파라핀 함침은 하기한 바에 따라 약 65분 동안에 달성되었다. 일관성이 있도록 1.5mm 이하의 절편이 바람직하다.
단계 1.
이 실시예에서 제 1 용액은 다음과 같이 구성한다:
40% 이소프로필 알코올,
40% 아세톤,
20% 폴리에틸렌 글리콜(평균 분자량 300),
총 체적의 약 0.5%의 농도로 첨가된 빙초산, 및
총 체적의 약 1% 농도로 첨가된 디메틸 술폭사이드(DMSO). 조직 카세트에 든 60개의 조직 표본을 고정시키려면 이 용액 1리터면 충분하다. 이 표본들은 제 1 용액이 들어 있는 1500ml 비이커에서 15분 동안 65℃로 시판 조직 마이크로파 프로세서(H2500 또는 H2800, 에너지 빔 사이언스)에서 배양된다; 용액을 버블링으로 교반하여 용액 교환을 촉진한다.
단계 2.
표본은 55% 이소프로필 알코올, 25% 아세톤, 10% 폴리에틸렌 글리콜(평균 분자량 300), 10% 저점성 광유, 총 체적의 약 0.5% 농도로 첨가된 빙초산, 및 약 1% 농도로 첨가된 DMSO의 용액 속에서 배양된다. 표본은 용액이 들어 있는 1500ml 비이커에서 15분 동안 65℃로 시판 조직 마이크로파 프로세서(H2800, 에너지 빔 사이언스)에서 가열되고, 버블링으로 교반된다.
단계 3.
표본은 55% 이소프로필 알코올, 25% 아세톤, 20% 저점성 광유, 총 체적의 약 0.5% 농도로 첨가된 빙초산 및 총 체적의 약 1% 농도로 첨가된 DMSO의 용액에서 배양된다. 표본은 용액이 들어 있는 1500ml 비이커에서 5분 동안 65℃로 시판 조직 마이크로파 프로세서(H2800, 에너지 빔 사이언스)에서 가열되고, 버블링으로 교반된다.
단계 4.
마이크로파 조사에 이어, 60℃ 글리세린 조에 놓아둔 큰 데시케이터에 위치한 30% 저점성 광유 및 70% 용융 파라핀의 왁스 용액을 갖는 두 개의 조에서 각 조에 대해 5분 동안 640mmHg의 진공 하에서 배양하여 함침을 시작한다.
단계 5.
글리세린 조에 놓아둔 큰 데시케이터 안에 위치한 네 개의 용융 파라핀 조에서, 각각에 대해 5분 동안 약 75℃ 내지 80℃, 약 640mmHg의 감압 하에 배양하여 함침을 완료한다. 조직 절편은 5분 간격으로 한 파라핀 조에서 다음 조로 이동되어, 총 20분동안 함침하였다. 약 640mmHg가 되는 시간을 위해 각각의 5분 간격으로 압력이 측정되었다.
실시예 4
도 12에 도시된 시스템을 사용하여 다음의 방법으로 조직 처리공정을 실시할 수 있다. 저장소의 유체 수준을 확인하고, 레토르트를 세정하고, 작동 전에 배관을 플러싱한다. 진공화하고, 용액을 이동시키기 위하여 공기 압력을 높이며, 필요시, P/V 주기로 레토르트 내 용액을 교반한다. 마이크로파 레토르트 내에서의 조직 처리(예를 들어, 경화 및 초기 함침)는 대기압에서 실시되므로, 진공 레토르트 내에서의 함침에만 감압이 필요하다. 용액 및 레토르트는 적당한 작동 온도로 가온된다.
카세트의 시료를 담은 바스켓을 로딩한다. 도 13에 도시된 시스템을 사용하는 경우, 일련의 각 레토르트에 독립적으로 접근할 수 있으므로 조직 처리는 병렬로 실시할 수 있다. 아암 또는 트랙은 로딩 스테이션으로부터 마이크로파 레토르트까지 로딩된 바스켓을 이동시킨 후, 진공 레토르트로 이동시킨다. 레토르트는, 경화 및 함침 각각을 위한 도 8 및 11에 도시된 반응 챔버와 유사할 수 있다: 비커 인서트는 사용되지 않으며 뚜껑은 힌지에 의해 반응 챔버의 나머지 부분에 부착된다. 뚜껑을 옆으로 움직여(예를 들어, 뚜껑 상부의 핸들을 잡는다) 반응 챔버를 열 수 있다. 이를 통하여, 홀딩 스테이션에 뚜껑을 남겨둘 필요 없이 내부에 접근이 가능하다. 마지막으로, 조직 함침이 완료되는 경우, 로딩된 바스켓을 진공 레토르트로부터 용융 파라핀을 함유하는 언로딩 스테이션으로 이동시킨다. 스테이션 간에 바스켓을 이동시키기 위하여 필요한 시간은 약 10초 이하이다. 이어서, 조직 카세트를 바스켓으로부터 언로딩할 수 있다.
함침제(예를 들어, 미네랄오일, 왁스)를 갖는 반응 챔버를 공동 가열원을 사용하여 가열할 수 있다. 이와 달리, 히터는 함침제와 접촉하는 배관에 순환하는 물의 온도를 유지하여, 이를 용융 상태로 유지시킨다. 고온수를, 고온수가 필요한 각 스테이션에 순환시킬 수 있다;각 반응 챔버는 공급 및 반송 다기관에 부착될 수 있다. 예를 들어, 배관 코일을 반응 챔버 내부에 위치시킬 수 있다; 이어서, 이 가열 코일은 열을 내용물에 전달한다. 반응 챔버의 외벽을 전선으로 둘러싸, 벽을 통하여 반응 챔버의 내용물로 열을 전달하여, 가열 코일을 제거하는 것이 바람직하다.
실시예 3에 기재된 방법을 이 시스템에 사용할 수 있다. 각각의 다른 용액을 세 저장소 중 하나에 저장하고, 레토르트에 또는 레토르트로부터 이동시킬 수 있다. 예를 들어, 삼위치 회전 밸브로 그 단계에 적당한 저장소를 선택할 수 있으며, 바람직하게는 250mmHg의 압력으로 펌핑하면 용액을 레토르트 안으로 이동시킬 수 있고, 0.35Kg/㎠으로 용액을 레토르트 밖으로 이동시킬 수 있다; 바람직한 압력 0.35Kg/㎠ 및 500mmHg 진공의 P/V 주기로 교반을 실시할 수 있다. 저장소 및 레토르트 간의 연결부(예를 들어, 가요성 배관) 및 연결부가 각 저장소 또는 레토르트를 이어주는 포트는 도시되어 있지 않다. 다른 조건(예를 들어, 각 단계를 위한 시간 또는 온도)은 실시예 3에 기재된 바와 같다.
실시예 5: 조직 절편 내 항원 검사
마이크로톰 위에서 파라핀 절편을 3미크론 두께로 절단하여 수조에 넣고, 유리 슬라이드 위에 띄운다. 파라핀을 슬라이드를 30분간 58℃ 오븐, 또는 바람직하기는 약 18시간 또는 밤새 37℃ 오븐에서 녹였다. 그리고 나서, 10분 동안 크실렌 조에서 왁스를 제거했다. 슬라이드는 각각 1분 동안 감소하는 에탄올 용액(순수 에탄올 두 조, 95% 두 조, 90% 한 조)에서 재수화시켰고, 2분 동안 수도물에 담궈 헹구었다.
내인성 퍼옥시다아제는 6% 과산화수소(H2O2) 및 메탄올, 또는 140ml 메탄올을 포함하는 6% H2O2 35ml 용액으로 블로킹하여 15분 동안 배양하였다. 슬라이드는 2분간 수도물 및 2분간 PBS에 담궈 헹구고 나서 건조하였다.
슬라이드는 습기찬 챔버로 옮겨졌고, 정상 말 혈청(NHS)은 블럭에 첨가되었다(10분간). 과량의 정상 말 혈청은 슬라이드에서 따라내고, 특이 제 1 항체를 상온에서 습기찬 챔버내 조직 절편 위에서 30분 동안 배양하였다. 슬라이드는 스퀴즈 병을 사용하여 앞뒤로 움직여 PBS로 플러싱하고, 2분간 PBS 조에 담그고, 과량의 PBS는 각 슬라이드에서 건조시켰다. 링킹 용액(제 2항체 도는 비오티닐화 항-래빗 또는 항-마우스로도 알려진)이 각각의 조직 절편에 첨가되었고, 습기찬 챔버에서 실온으로 25분 동안 배양되었다. 이러한 래빗, 래트 및 마우스 제 2 항체(예를 들어, 항-IgM, 항-IgG)는 Dako(Carpinteria, CA)로부터 입수하였으며, 약 1:600희석하여 사용하였다. 슬라이드는 스퀴즈 병을 사용하여 PBS로 플러싱하고, 2분간 PBS 조에 담그고, 과량의 PBS는 각 슬라이드에서 건조시켰다.
제조업자의 지침에 따라 신호를 전개하였다(Vector 실험실). 아비딘-비오틴 복합체(ABC) 용액을 조직 절편에 첨가하여, 습기찬 챔버에서 25분 동안 배양하였다. 슬라이드는 스퀴즈 병에서 PBS로 플러싱하고, 2분간 PBS 조내 랙에 담궜다. 랙은 디아미노벤지딘(DAB) 색원체 조에 6분 동안 담그고 나서, 흐르는 물에 담궈 4분간 부드럽게 세척하였다. 조직 절편은 약 15초 내지 90초 동안 실온에서 헤마톡실린으로 대조염색하였다. 염색 시간은 헤마톡실린의 숙성에 달려 있다. 슬라이드는 흐르는 물에 3분간 세척하여 과량의 대조염색제를 제거하였고, 85% 내지 100% 알코올 조에서 탈수하였고(각각 약 10초), 크실렌으로 세척하였고, 커버 글라스로 덮었다.
프로제스테론 수용체, 인자 Ⅷ-관련 항원, CD-31, CD-68, 세포케라틴-7, 크로모그라닌, 및 평활근 항원에 대해 우수한 활성이 나타났는데, 항원 보존성이 개선되었기 때문으로 보인다(예를 들어, 신호-대-노이즈 비가 커짐).
| 약자 | 항체 | 특정 방법 | 배양 시간 | 링킹 용액 |
| (ACTH) (AACT) (AAT) (ADENO) (AFP) (AEI/3) (ALA) (ACTIN) (APP-A4) (ASPE) (AR) | 부신피질자극 호르몬 알파-1 항카이모트립신 알파-1 항트립신 아데노바이러스(Adenoviurs) 알파 페토프로테인 시토케라틴 알파 락트알부민 액틴 근육 항-알즈하이머 전구 단백질 A4 아스페르질루스 안드로젠 수용체 | 1:2000 1:50000 1:2000 1:1000 1:2500 1:200(M) 1:600 1:200 1:500(M) 1:500 1:20(M) (FG) | 30' 30' 30' 30' 30' 45' 30' 30' 45' 30' 45' | R R R MIgG R MIgG R MIgG MIgG R MIgG |
| (BCA) (bcl-2) (BerEp4) (B72.3) (BLA36) | B-세포 항-인간 온코프로테인 인간 상피성 항원 TAG72 종양-관련 당단백질72 B 림프구 항원 | 1:200 1:100(M) 1:25 1:100 1:100 | 30' 45' 30' 30' 30' | MIgG MIgG MIgG MIgG MIgG |
| (CMV) (CHRG) (CALC) (CEA) (CERb'B2) | 시토메갈로바이러스 크로모그라닌 칼시토닌 배발암(Carcinoembryonic) 항원 c-erbB-2 종양유전자 Mabl | 1:50(P) 1:50 1:2000 1:6000 1:1500 | 30' 30' 30' 30' 90' | MIgG MIgG R R R |
| 약자 | 항체 | 특정 방법 | 배양시간 | 링킹 용액 |
| (CATH) (CAM 5.2) (CK 7) (CK 20) (COLL Ⅳ) (CA 125) (CD 30) | 카텝신 D 시토케라틴 시토케라틴 시토케라틴 교원질 Ⅳ 항-인간 CA 125(MⅡ) 항-인간 Ki-1 항원(BER-H2) | 1:2000(M) 1:500(M) 1:200(M) 1:25(M) 1:25(P) 1:20(M) 1:200(M) | 45' 45' 45' 45' 30' 45' 45' | R R MIgG MIgG MIgG MIgG MIgG |
| (ER) | 에스트로겐 수용체 | 1:50(M)(FG) | 45' | MIgM |
| (FVⅢ) (FSH) (5 HT) (FXⅢ) | Von Willebrand 인자 여포 자극 호르몬 세로토닌 항-응고 인자 | 1:50(P) 1:3000 1:50 1:1200 | 30' 30' 30' 30' | MIgM R MIgM R |
| (GAST) (GFAP) (GLUC) (GH) (GCDFP) (GRP) | 가스트린 신경교원섬유 산성 단백질 글루카곤 성장 호르몬 거대 방광 질병 유체 단백질 가스트린-방출 펩티드 | 1:2000 1:1500 1:10000 1:5000 1:250 1:1000 | 30' 30' 30' 30' 30' 30' | MIgM R R R MIgM R |
| (HMWK) (Hbcore) (HBsAg) (HSVⅠ) (HSVⅡ) (HCG) (HPL) | 고분자량 케라틴(34βE12) 간염 B 핵 항원 간염 B 표면 항원 허피스 단일 형태 Ⅰ 허피스 단일 형태 Ⅱ 인간 융모막 생식선 자극 호르몬 인간 태반 최유물질 | 1:10 1:5000 1:100 1:10 1:10 1:50000 1:100000 | 45' 30' 30' 30' 30' 30' 30' | MIgM R MIgM R R R R |
| 약자 | 항체 | 특정 방법 | 배양시간 | 링킹 용액 |
| (HIST) (H.Pyl) (β-HCG) (IgA) (IgG) (IgAs) (IgM) (INS) | 히스토플라즈마 헬리오박테르 필로리 β-인간 융모막 생식선 자극 호르몬 알파 중연쇄 감마 중연쇄 IgA의 분비말 MU 중연쇄 IgM 인슐린 | 1:1000 1:500(M) 1:10000 1:400 1:1000 1:200 1:1000 1:100 | 30' 45' 30' 30' 30' 30' 30' 30' | R R R R R R R R |
| (Ki-67) (K) (KERATIN) | 핵 항원 MIB-1 카파 경쇄 AEI/3 CAM | 1:50(M)(FG) 1:200(M) 1:50/1:500(M) | 45' 45' 45' | MIgG MIgG MIgG |
| (LCA) (Leu M1) (Leu 7) (Lectin) (Anti-Lectin) (LEA135) | 백혈구 보통 항원 백혈구 Ml 항원 백혈구 7 항원 렉틴 항-렉틴 항원 항-인간 내강 상피성 항원 | 1:50 1:200(M) 1:50(M) 1:4000 1:10000 1:50 | 30' 45' 45' NHS대신 사용 30' 30' | MIgG MIgM MIgM G MIgG |
| (LH) (L) (LMK-8) (LIP-AS 105) | 황체 형성 호르몬 람다 경쇄 저분자량 케라틴 리파제 | 1:3000 1:6000(M) 1:25(M) 1:400 | 30' 45' 45' 30' | R MIgG MIgG MIgG |
| (MCA) (MUR) (MYOGL) (MAPH) | 골수양성 조직구 항원(MAC 387) 무라미다제 미오글로빈 대식세포 | 1:400(M) 1:2000 1:5000 1:50 | 45' 30' 30' 30' | MIgG R R MIgG |
| 약자 | 항체 | 특정 방법 | 배양시간 | 링킹 용액 |
| (MTLT) (MEL) (MAK6) (MBP) (MESO) (MAST-C) (MPO) (MGN) (NB) (N-FIL) (NSE) | 금속티오닌 흑색종 HMB 45 항-시토케라틴 미엘린 중피 항원 비만 세포 마이엘로퍼록시다제 마이오제닌(Myogenin) 신경아세포종 N-필라멘트(2F11) 뉴론 특이 에놀라제 | 1:50 1:50 1:50(T) 1:500 1:500 1:2000(T) 1:5000 1:15 1:200 1:250 1:4000(M) | 30' 30' 90' 30' 30' 30' 30' 45' 90' 30' 45' | MIgG MIgG MIgG R MIgM MIgG R MIgG MIgG MIgG MIgG |
| (PAMYL) (PCP) (PLAP) (PPP) (PTH) (PROL) (PAPH) (PML)(SV40) (PR) (PR 1A6) (PSA) (PCNA) (PS2) (P53) | 췌장 아밀라아제 뉴모시스티스 카리니 태반 알칼리성 포스파타제 췌장 폴리펩티드 부갑상선 호르몬 황체자극호르몬 전립선염 포스파타제 진행성 다소성 뇌질환 프로제스테론 수용체 프로제스테론 수용체 전립선 특이 항원 증식 세포 핵 PS2 단백질 p53 항원 | 1:20 1:25 1:800 1:3000 1:250(M) 1:500 1:4000 1:10000 1:100(M) 1:50(M) 1:750 1:100(M)(FG) 1:1000 1:50(M)(FG) | 30' 30' 30' 30' 45' 30' 30' 30' 45' 45' 30' 45' 45' 45' | MIgG MIgM R R (RAT) R R R R MIgG R MIgG R MIgG |
| 약자 | 항체 | 특정 방법 | 배양시간 | 링킹 용액 |
(S100A) (S100) (SOMAT) (SYNAP) (SMA) ( |
S100A 단백질 S100 단백질 성장억제 호르몬 시냅토파이신(Synaptophysin) 평활근 액틴 근절 액틴 | 1:3000 1:2000 1:3000 1:800(M) 1:100 1:100 | 30' 30' 30' 45' 30' 30' | R R R R MIgG MIgG |
| (TESTOS) (TGB) (TP-103) (TM) (TSH) (TCA) (TOXO) | 테스토스테론 타이로글로불린 트레포네마 혈전모둘린(Thrombomodulin) 갑상선 자극 호르몬 T-세포 항원 톡소플라즈마 | 1:250 1:20000 1:50(T) 1:50 1:2000 1:800(M) 1:1000 | 30' 30' 30' 30' 30' 45' 30' | R R MIgG MIgG R MIgG R |
| (UBT) | 유비퀴틴 | 1:250 | 30' | R |
| (VIP) (VIM) (VZV) | 혈관작용 장 단백질 비멘틴(Vimentin) Variecella-Zoster 바이러스 | 1:1500 1:800(M) 1:100 | 30' 45' 30' | R MIgG MIgG |
| (WSKER) | 광스펙트럼 케라틴 | 1:500 | 30' | R |
실시예 6: 처리된 조직 절편으로부터 DNA 추출
두 개의 6미크론 조직 절편을 1.5㎖ 마이크로퓨즈 튜브에 위치시키고, 800㎕ 크실렌을 첨가하여 보텍싱으로 혼합하고, 400㎕ 순수 에탄올을 첨가하여 보텍싱으로 혼합하고, 고속 마이크로퓨즈에서 튜브를 5분 동안 원심 분리하고, 상청액을 따라내었다. 펠렛에 800㎕ 순수 에탄올을 첨가하여 보텍싱으로 혼합하였다.
상기와 같이 원심 분리한 후, 상청액을 따라내고, 세제/단백질 가수 분해 효소 K 용액(1% NP40 또는 트리톤 X-100, 2.5㎎/ml 단백질 가수 분해 효소 K 2.4㎕)100㎕을 펠렛에 첨가하고, 한 시간동안 55℃에서 배양하였다. 단백질 가수 분해 효소 K는 10분 동안 95℃에서 배양하여 불활성화하였다. 5분 동안 마이크로퓨즈에서 원심 분리한 후 DNA를 함유한 상청액을 얻는다. 이 물질은 PCR을 위해 준비한다. 추가로 서던 블로팅하려는 경우 이를 침전 및/또는 추출해야 한다. 제한 분석을 위해 충분한 DNA를 얻으려면 더 많은 절편이 필요하다.
실시예 7: 처리된 조직 절편으로부터의 RNA 추출
일회용 블레이드를 사용하여 파라핀 블럭에서 10개의 절편(각각 7㎛)을 절단하였다. 이 블럭은 본 발명 및 일반적인 조직 처리를 통하여 제조하였다. 이들을 50ml Falcon 튜브에 넣어, 20ml의 크실렌을 사용하여 파라핀을 제거한 후, 남은 조직을 30분동안 순수한 알콜로 2회 세척하였다. 이 조직을, 4M 구아니디늄 티오시아네이트, 25mM Na 시트레이트 pH 7.0, 0.5% N-라우릴사르코신 및 0.1M 2-메르캅토에탄올을 함유하는 용액에 0.5g/ml로 현탁시켰다. 이 용액을 보텍싱(vortexing)하여 혼합하고, 18 내지 22 게이지 시린지 니들을 통과시켜 DNA를 절단하였다.
몇개의 5ml 원심분리 튜브(Sorvall)에서, RNA-함유 용액을 주의깊게 5.7M CsCl 2.8ml에 층지게 하고, Beckman L8-53 초원심분리기에서 14시간동안 18℃, 35,000rpm으로 SW55Ti 로터로 원심분리하여 RNA를 침전시켰다. 상부를 주의깊게 제거하여 튜브 바닥의 RNA 펠렛을 남겼다. 펠렛을 리보뉴클레아제가 없는 물로 재현탁시키고, 에펜도르프 튜브를 14,000 rpm에서 10분간 회전시켰다. RNA 함유 상청액을 얻어, UV흡광도를 측정하였다. 흡광 계수 1 OD280/cm는 약 40㎍/ml RNA와 등가인 것으로 평가되고, OD260/OD280 비는 약 1.8 내지 약 2.0이 되어야 한다. 총 45㎍의 RNA를 본 발명에 따라 제조한 조직 표본으로부터 추출하였고, 통상적으로 처리한 조직 표본에서는 RNA가 전혀 검출되지 않았다.
본 발명은 현재 실질적이고 바람직한 실시형태로 생각되는 것과 관련지어 기재하였으나, 본 발명이 개시된 실시 형태에만 한정되는 것은 아니며, 특허청구범위의 정신 및 범위에 속하는 다양한 변형 및 이에 상당하는 배치가 가능한 것으로 이해해야 한다. 따라서, 본 발명의 변형된 내용은, 본 발명의 실시형태에서 벗어난 것이 아니라 당업자에게 자명한 것이며, 이러한 변형된 내용이 하기 특허청구범위의 범주에 속하는 것으로 이해해야 한다.
또한, 특허청구범위에 명시되어 있지 않는 한, 본 명세서에 기재된 요소는 청구된 본 발명의 한정사항이 아닌 것으로 이해해야 한다. 따라서, 특허청구범위는, 특허청구범위에 명시되어 있지 않는 사항을 이용하고자 본 명세서가 사용되는 대신에 허락되는 법적 보호 범위를 결정하기 위한 근간이다.
Claims (28)
- (a) 에너지 형태로서 마이크로파 방사선을 발생시키는 공급원,(b) 마이크로파 방사선을 전달하는 도파관, 및(c) 제 1 비-수성 용액 및 이와 접촉하는 조직 표본이 제 1 반응 챔버 벽에 둘러싸여 있는 것을 특징으로 하는, 마이크로파 방사선을 수용하는 제 1 반응 챔버를 포함하여 이루어지고,마이크로파 방사선은 공급원으로부터 제 1 반응 챔버로 도파관에 의하여 전달되고, 제 1 반응 챔버는, 마이크로파 방사선 에너지로 인해 균일한 내부 온도 분포를 제공하는 내부 형태를 가지고, 제 1 비-수성 용액은 제 1 저장 챔버로부터 제 1 반응 챔버로 옮겨지고, 조직 표본은, 제 1 비-수성 용액, 마이크로파 방사선 또는 이들 모두에 의하여 초기에 경화되는 것을 특징으로 하는, 조직학을 위한 약 3mm 이하의 조직 표본 처리용 마이크로파 유닛.
- 제 1항에 있어서,(d) 제 1 반응 챔버를 분리하기에 적합하게 된 마개,(e) 제 1 반응 챔버를 둘러싸는 열 절연체,(f) 조직 표본 및 제 1 화학적 조성 간의 화학적 교환을 촉진하기 위한 제 1 반응 챔버 안의 교반기, 및(g) 제 1 반응 챔버를, 제 1 저장 챔버로부터의 제 1 화학적 조성으로 충전 하고, 제 1 반응 챔버를 비우기에 적합하게 된 포트를 더 포함하여 이루어지는 마이크로파 유닛.
- 제 1항에 있어서,상기 제 1 반응 챔버 안의 용액 온도가 약 50℃ 내지 약 70℃로 유지되는 것을 특징으로 하는 마이크로파 유닛.
- 제 1항에 있어서,상기 제 1 비-수성 용액이 고정제 및 탈수제를 포함하여 이루어지는 비-수성 용액인 것을 특징으로 하는 마이크로파 유닛.
- 제 4항에 있어서,상기 제 1 비-수성 용액은 케톤 및 알콜을 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 마이크로파 유닛.
- 제 5항에 있어서,상기 제 1 비-수성 용액이 알콜과 케톤의 부피비가 약 1:3 내지 3:1인 것을 특징으로 하는 마이크로파 유닛.
- 제 4항에 있어서,상기 제 1 비-수성 용액이 평균 분자량 약 100 내지 500인 중합체 및 계면활성제를 더 포함하여 이루어지는 것임을 특징으로 하는 마이크로파 유닛.
- 제 4항에 있어서,상기 조직 표본이, 케톤 및 알콜을 포함하는 비-수성 용액인 일련의 둘 이상의 다른 화학적 조성와 접촉하고, 일련의 둘 이상의 비-수성 용액 사이에서 알콜과 케톤의 부피비가 변하는 것을 특징으로 하는 마이크로파 유닛.
- 제 1항에 있어서,상기 조직 표본이 다수의 다른 화학적 조성, 마이크로파 방사선 또는 이들 모두에 의하여 경화되는 것을 특징으로 하는 마이크로파 유닛.
- 제 1항에 있어서,상기 조직 표본이 30분 이하로 경화되는 것을 특징으로 하는 마이크로파 유닛.
- 제 1항에 있어서,상기 조직 표본이 두 시간 이하로 경화되는 것을 특징으로 하는 마이크로파 유닛.
- 제 1항에 있어서,상기 공급원이 주파수 2425 내지 2575 메가헤르쯔의 마이크로파 방사선을 발생시키는 마그네트론인 것을 특징으로 하는 마이크로파 유닛.
- 제 1항에 있어서,상기 내부 형태는, 제 1 반응 챔버 안의 용액에 균일한 온도 분포를 제공하는 속삭임의 회랑 모우드를 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 마이크로파 유닛.
- 제 1항에 있어서,각각의 반응 챔버가 도파관에 의하여 공급원으로 연결되는, 다수의 반응 챔버를 포함하여 이루어지는 마이크로파 유닛.
- 각각의 모듈이 반응 챔버 및 그 속에 함유되는 화학적 조성을 포함하는, 다수의 모듈을 포함하여 이루어지고,조직 표본이 각 모듈:(a) 제 1항의 마이크로파 유닛을 포함하여 이루어지고, 제 2 화학적 조성이 제 2 저장 챔버로부터 제 1 반응 챔버로 옮겨짐으로써 조직 표본이 초기에 함침되는 것을 특징으로 하는, 하나 이상의 제 1 모듈;(b) 제 2 반응 챔버를 포함하여 이루어지고, 조직 표본의 함침이 제 2 반응 챔버 벽 내에서 대기압 이하에서 완료되는 것을 특징으로 하는, 하나 이상의 제 2 모듈; 및(c) 상기 제 1 모듈 및 상기 제 2 모듈 간에 조직 표본을 이동시키는 운반체의 반응 챔버 안에서 각 화학적 조성과 접촉함으로써 처리되는 것을 특징으로 하는, 조직학을 위한 약 3 밀리미터 이하의 조직 표본을 처리하기 위한 시스템.
- 제 15항에 있어서,상기 운반체가 상기 제 1 모듈 및 상기 제 2 모듈을 연결하는 트랙을 포함하여 이루어지는 것임을 특징으로 하는 조직 처리 시스템.
- 제 15항에 있어서,상기 운반체가 상기 제 1 모듈 및 상기 제 2 모듈을 연결하는 전기자를 포함하여 이루어지는 것임을 특징으로 하는 조직 처리 시스템.
- 제 15항에 있어서,(d) 제 2 반응 챔버를 분리하기에 적합하게 된 마개,(e) 제 2 반응 챔버를 둘러싸는 열 절연체,(f) 제 2 반응 챔버 내에서 왁스를 용융 형태로 유지하는 가열기, 및(g) 제 2 반응 챔버를 용융된 왁스 용액으로 충전하기에 적합하게 된 포트를 더 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 조직 처리 시스템.
- 제 15항에 있어서,상기 제 2 반응 챔버 안의 용액 온도를 약 50℃ 내지 약 70℃로 유지하는 것을 특징으로 하는 조직 처리 시스템.
- 제 15항에 있어서,상기 제 2 화학적 조성이 고정제, 탈수제 및 함침제를 포함하여 이루어지는 비-수성 용액인 것을 특징으로 하는 조직 처리 시스템.
- 제 15항에 있어서,상기 제 2 화학적 조성이 케톤, 알콜, 및 미네랄 오일을 포함하여 이루어지는 비-수성 용액인 것을 특징으로 하는 조직 처리 시스템.
- 제 15항에 있어서,상기 제 1 모듈 및 하나 이상의 상기 제 2 모듈과 유체 연통하는 각 저장 챔버 내에 네가지 이상의 다른 화학적 조성이 있는 것을 특징으로 하는 조직 처리 시스템.
- 제 15항에 있어서,(a) 및 (b) 타입의 둘 이상의 일련의 병렬 모듈이 있으며, 일련의 모듈 내로의 조직 표본 전달이 독립적으로 조절되는 것을 특징으로 하는 조직 처리 시스템.
- 제 15항에 있어서,조직 표본이 25분 이하로 왁스에 의해 함침되는 것을 특징으로 하는 조직 처리 시스템.
- 제 15항에 있어서,조직 표본이 두 시간 이하로 왁스에 의해 함침되는 것을 특징으로 하는 조직 처리 시스템.
- (a) 마이크로파 방사선을 발생시키는 공급원,(b) 내부에 전달된 마이크로파 방사선의 균일한 분포를 제공하도록 만들어진 내부를 포함하여 이루어지는 반응 챔버,(c) 마이크로파 방사선을 공급원으로부터 반응 챔버로 전달하는 도파관,(d) 고정제 및 탈수제 혼합물을 포함하여 이루어지는 제 1 비-수성 용액이 제 1 저장 챔버 및 반응 챔버 사이에서 전달되는 것을 특징으로 하는, 반응 챔버와 유체 연통하는 제 1 저장 챔버,(e) 고정제 및 탈수제 혼합물을 포함하여 이루어지는 제 2 비-수성 용액이 제 2 저장 챔버 및 반응 챔버 사이에서 전달되는 것을 특징으로 하는, 반응 챔버와 유체 연통하는 제 2 저장 챔버,(f) 고정제, 탈수제 및 함침제의 혼합물을 포함하여 이루어지는 제 3 비-수성 용액이 제 3 저장 챔버 및 반응 챔버 사이에서 전달되는 것을 특징으로 하는, 반응 챔버와 유체 연통하는 제 3 저장 챔버를 포함하여 이루어지고;조직 경화는 제 1 비-수성 용액, 마이크로파 방사선 또는 이들 모두와 접촉하여 반응 챔버에서 개시되고; 탈수제 및 고정제 간의 부피비는 제 1 비-수성 용액으로부터 제 2 비-수성 용액까지 증가하고; 조직 함침은 제 3 비-수성 용액과 접촉하여 반응 챔버에서 개시되고; 반응 챔버는 조직 경화 및 조직 함침 속도를 증가시키는 교반기 및 가열기를 더 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 하는, 조직 처리용 마이크로파 유닛.
- 제 26항에 있어서,가압/진공 주기로 저장 챔버 및 반응 챔버 간의 유체 이동을 조절하는 펌프 및 다위치 회전 밸브를 더 포함하여 이루어지는 마이크로파 유닛.
- 제 26항에 있어서,반응 챔버내 압력이 약 500mmHg 이상으로 유지되는 것을 특징으로 하는 마이크로파 유닛.
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