JP2009501789A

JP2009501789A - 顆粒球コロニー刺激因子（ｇ−ｃｓｆ）の変異型およびその化学的に抱合されたポリペプチド

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Publication number: JP2009501789A
Application number: JP2008522703A
Authority: JP
Inventors: カン・クワンユブ; ホン・ジョンウン
Original assignee: Mogam Institute for Biomedical Research
Current assignee: Mogam Institute for Biomedical Research
Priority date: 2005-07-20
Filing date: 2006-07-19
Publication date: 2009-01-22
Anticipated expiration: 2026-07-19
Also published as: KR20070010817A; EP2174951A2; ES2428863T3; ATE551361T1; WO2007011166A1; EP1919945A1; EP1919945B1; JP4782834B2; EP1919945A4; CN102153643B; EP2174951A3; KR100735784B1; CN102153643A; CN101213208A; US8841426B2; EP2174951B1; ES2381256T3; US20080200657A1

Abstract

特異的な化学抱合用に設計したヒト顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）の変異型、およびがん治療におけるアジュバンドとしての使用されるその化学抱合体を提供する。本発明は、配列番号１で同定されるアミノ酸配列を含むＧ−ＣＳＦの位置１３３のスレオニン（Ｔｈｒ）残基がシステイン（Ｃｙｓ）残基に置換されたＧ−ＣＳＦ変異型を提供する。加えて、本発明は、システイン（Ｃｙｓ）残基がＧ−ＣＳＦの位置１３５のグリシン（Ｇｌｙ）残基と位置１３６のアラニン（Ａｌａ）残基間に挿入されるＧ−ＣＳＦ変異型を提供する。さらに、本発明は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のごとき生体適合性重合体がシステイン残基に結合した化学的に抱合された変異型Ｇ−ＣＳＦを提供し、該重合体は置換または挿入変異によって導入され、生体適合性重合体との抱合によってインビボの生物学的活性を減少することなくインビボの保持時間を増加させ、それにより最終的にインビボの生物学的活性を延長する。

Description

本発明は、抗がん薬物が投与される際に骨髄細胞から好中性顆粒球コロニーの形成を刺激し、骨髄細胞の分化を最終段階に導くことにより白血球減少症を抑制するがん治療におけるアドジュバントとしてのヒト顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）の変異型およびその化学抱合体、特に、Ｇ−ＣＳＦの特異的な部位のアミノ酸置換または挿入により修飾されたヒト顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）の変異型、およびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のごとき非タンパク質重合体を有するその化学抱合体に関する。

ヒトの造血活性は最初に骨髄で行われ、様々な種類の血球細胞が多くの複雑な経路を介して産生される。造血活性は特異的な糖タンパク質によって制御され、それらは一般的にコロニー刺激因子（ＣＳＦ）と称される。ＣＳＦはそれらの活性によって同定され、区別されてきた。すわなち、ＣＳＦは、血球細胞が半液体培地で培養される際には成長因子として供給され、単球、顆粒球またはその他の血球細胞のクローン形成を刺激する。例えば、顆粒球−ＣＳＦ（Ｇ−ＣＳＦ）およびマクロファージ−ＣＳＦ（Ｍ−ＣＳＦ）は、それぞれ好中性顆粒球およびマクロファージコロニーのインビトロ形成を刺激する一方で、インターロイキン−３として知られる多能性ＣＳＦはまた、顆粒球、マクロファージ、巨核球、赤血球、またはその類似物のごとき多種類型の血球および組織細胞のクローン増殖を刺激する。

特に、Ｇ−ＣＳＦは、骨髄の外側にある延髄内幹細胞と白血球細胞の***と分化を指令するサイトカインの１つであり、好中性の前駆体細胞の分化および／または増殖を刺激し、成熟型好中球を活性化することにより好中球の食作用活性、ならびに化学走化性因子に対する反応性を促進することが知られている（(Metcalf, Blood) 67:257 (1986); (Yan, et al., Blood) 84(3): 795-799 (1994); (Bensinger, et al., Blood) 81(11):3158-3163(1993); (Roberts, et al., Expt'l Hematology) 22:1156-1163 (1994); (Neben, et al., Blood) 81(7): 1960-1967 (1993)）。

悪性腫瘍の治療は、一般的には放射性治療および／または化学治療によって行われ、それらは望ましくない白血球の顕著な減少を生じ、白血球の減少に付随して免疫力が低下する。それゆえ、放射性治療および／または化学治療が長期間にわたって行われる場合には、著しい不利益を引き起こすことになる。Ｇ−ＣＳＦは、患者の免疫力を活性化することにより効果的にがんを治療することができるアドジュバントとして最初に報告され（Lopez et al., J. Immunol. 131(6):2983-2988, 1983; Platzer et al., J. Exp.Med. 162:1788-1801, 1985）、現在では多種のがんおよび難治性白血病の治療に効果的に用いられている。

Ｇ−ＣＳＦの研究は、初めに、顆粒球−ＣＳＦ物質が、ヒトがんＣＨＵ−２細胞株（Nomura et al, EMBO J. 8(5):871-876, 1986）またはヒト膀胱がん細胞株５６３７（Welte et al., Proc. Narl. Acad. Sci. USA82:1526-1530, 1985; Strige et al., Blood69(5):1508-1523, 1987）の培養培地に存在することが見出され、顆粒球コロニー刺激因活性を示す１８から１９ｋＤａの分子量を有するタンパク質が精製された（Nomura et al., EMBO J. 5(5):871-876, 1986）ことで開始した。

Ｇ−ＣＳＦのｃＤＮＡは、最初に、L.M. Souzaら（Science, 232 : 61-65(1986)）によってヒト膀胱がん細胞株５６７３から単離され（韓国特許公報番号1998-77885を参照)、次いで、扁平上皮がん細胞株および末梢血マクロファージ（S. Nagata et al., Nature, 319: 415-417 (1986); S. Nagata et al., EMBO J., 5: 575-581 (1986); Y. Komatsu et al., Jpn. J. Cancer Res., 78: 1179-1181 (1987)）のｃＤＮＡライブラリーからクローン化された。

遺伝子組み換え技術の登場に伴い、Ｇ−ＣＳＦは大腸菌に由来する大量のＧ−ＣＳＦを発現する過程において不溶性封入体として産生され、リフォールディング（ｒｅｆｏｌｄｉｎｇ）によって活性型Ｇ−ＣＳＦに変換されることが明らかになった。大腸菌から産生される組み換え体Ｇ−ＣＳＦ（ｒＧ−ＣＳＦ）は、配列番号２（１７５個のアミノ酸）で同定されるタンパク質、すなわち、配列番号１で同定される天然型Ｇ−ＣＳＦ（１７４個のアミノ酸）とＮ末端のメチオニンを含み、約１９ｋＤａの分子量を有する。

加えて、天然型Ｇ−ＣＳＦは位置番号１３３のアミノ酸スレオニン（Ｔｈｒ）にＯ−糖鎖付加部位を有する一方、大腸菌に由来するｒＧ−ＣＳＦは糖鎖付加部位を有さない。しかしながら、糖鎖付加部位の存在もしくは非存在および／またはＮ末端のメチオニンは、生物学的活性に全く効果がないことが知られている（Souza et al.: Science 232, 1986, 61）。

Ｇ−ＣＳＦのごとき生物学的タンパク質の治療剤が有利に高い選択性および低い毒性を示す一方、インビボの保持時間が短く、不安定である。このような欠点を克服するために、生物学的タンパク質（ポリペプチド）、例えば、Ｇ−ＣＳＦまたはインターフェロンに対して生体適合性重合体、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）またはポリビニルピロリドンを抱合する方法が開発されてきた。かかるＰＥＧ抱合は、効果的にプロテアーゼを阻害することにより生物学的タンパク質の分解を妨げ、腎臓からの生物学的タンパク質治療剤の早急な分泌を阻止することにより生物学的タンパク質治療剤の安定性および半減期を増加させ、免疫原性を減少させる（Sada et al. J. Fermentation Bioengineering 71: 137-139(1991)）。

特に、ペグ化タンパク質治療剤の例は、複合免疫不全の治療剤として開発されたアデノシンジアミナーゼのペグ化製剤；肝炎の治療剤として開発されたインターフェロンのペグ化製剤；グルコセレブロシダーゼおよびヘモグロビンのペグ化製剤などを含む。

ＰＥＧに加えて、エチレングリコール／プロピレングリコール共重合体、カルボキシメチルセルロース、デキシトラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ１，３−ジオキソラン、ポリ−１，３，６−トリオキサン、エチレン／無水マレイン酸共重合体、ポリアミノ酸（ホモ重合体またはランダム共重合体のどちらか一方）が、一般的にタンパク質治療剤の化学的カップリングに用いられる。

ＰＥＧは、一般式：ＨＯ−（−ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ−）ｎ−Ｈを有する重合体化合物であり、高い親水性を有するため、医学的に用いられるタンパク質に結合し、それによって溶解性を高める。タンパク質に結合するＰＥＧは、約１０００および約１０００００の範囲の分子量を有する。ＰＥＧの分子量が１０００を超えると、ＰＥＧは著しく低い毒性を示す。約１０００および約６０００の範囲の分子量を有するＰＥＧは全身に提示され、腎臓により代謝される。特に、約４００００の分子量を有する分岐ＰＥＧは血液、肝臓、またはその類似する臓器のごとき器官に提示され、腎臓により代謝される。

米国特許番号４１７９３３７号は、５００から２００００ダルトンの分子量を有するポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはポリプロプロピレングリコール（ＰＰＧ）にカップルしたポリペプチドを有する生理学的に活性な非免疫原性水溶性ポリペプチド組成物を開示する。ポリペプチドにＰＥＧをカップルするために、活性化ＰＥＧが一般的に用いられる。活性化ＰＥＧは、ＰＥＧの一末端のヒドロキシ基をメチルエーテル基に、他方末端のヒドロキシ基を求電子基に変換し、それにより求電子基を介してポリペプチドにＰＥＧをカップルすることによって調製される。しかしながら、かかる化学カップリング反応が非特異的であることから、タンパク質、すなわち、ポリペプチドの活性化部位へのペグ化は、望ましくないタンパク質活性の減少を生じる。その例としては、ＲｏｃｈｅとＳｃｈｅｒｉｎｇによって開発されたペグ化インターフェロン−αに見られる。ＲｏｃｈｅとＳｃｈｅｒｉｎｇによって開発されたインターフェロン−αのＰＥＧ抱合体は、ＰＥＧ分子がインターフェロン−αに結合している抱合体である。ＰＥＧ抱合はペグ化インターフェロン−αのインビボ半減期を増加させるが、ＰＥＧはインターフェロン−αの様々な部位にカップルし、それにより生物学的活性を大きく減少させる。

一般的に用いられる活性化ＰＥＧの例は、（ａ）ＰＥＧジクロロトリアジン、（ｂ）ＰＥＧトレシレート（ｔｒｅｓｙｌａｔｅ）、（ｃ）ＰＥＧサクシニミジルカルボン酸、（ｄ）ＰＥＧベンゾトリアゾールカルボン酸、（ｅ）ＰＥＧｐ−ニトロフェニルカルボン酸、（ｆ）ＰＥＧトリクロロフェニルカルボン酸、（ｈ）ＰＥＧサクシニミジルコハク酸、およびその類似物を含む（M.J. Roberts, M.D. Bentley, J.M. Harris, Chemistry for peptide and protein PEG conjugation, Advanced Drug Delivery Reviews 54 (2002) 459-476）。化学カップリング反応が非特異的であるため、それに結合する複数のＰＥＧを有する多量体、またはその異なる部位に結合するＰＥＧを有する異性体が産生されうる。その多量体および異性体はペグ化生成物の生物学的活性を減少させ、正確な薬学動態学的測定およびＰＥＧ抱合の精製工程を困難にする。

これらの問題を克服するために、米国特許第５７６６８９７号およびＷＯ００／４２１７５は、ＰＥＧマレイミドを用いてタンパク質のシステイン（Ｃｙｓ）残基にＰＥＧを選択的にカップルする方法を開示する。ジスルフィド結合に関連しない遊離システインが、システイン特異的なＰＥＧ抱合を介してタンパク質にＰＥＧをカップルするのに必須である。５個のシステインを含むＧ−ＣＳＦにおいて、ジスルフィド結合が（天然型Ｇ−ＣＳＦに基づいた）位置３６と４２のシステイン間および（天然型Ｇ−ＣＳＦに基づいた）位置６４と７４のシステイン間で形成される一方、位置１７のシステインは遊離システインである。位置３６のシステインと位置４２のシステイン間および位置６４のシステインと位置７４のシステイン間の２つのジスルフィド結合の形成は、天然型Ｇ−ＣＳＦの構築およびＧ−ＣＳＦの生物学的活性の維持に極めて重要である。Ｇ−ＣＳＦの生物学的活性が位置１７のシステインのセリンへの置換により大きく影響を受けないことから、天然型Ｇ−ＣＳＦの構築およびＧ−ＣＳＦの生物学的活性は、位置１７のシステインのセリンへの置換によって影響されることはない（Winfield et al.: Biochem. J. 256, 1988, 213）。しかしながら、Ｐｉｇｅｔらは、位置１７のシステインが反応条件によっては分子間ジスルフィド結合または分子内ジスルフィド結合を形成し、それによりリフォールディングを妨害し、Ｇ−ＣＳＦの生物学的活性および安定性を低下させると報告した（Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 83, 1986, 7643）。

その一方で、Ｇ−ＣＳＦに存在する唯一の遊離システインであるＧ−ＣＳＦ位置１７のシステイン（Kyowa Hakko, Tokyo, Japan）のセリンへの置換は、Ｇ−ＣＳＦの生物学的活性にほとんど変化を引き起こさないと報告されている（韓国特許登録第１０−０１１４３６９号を参照）。

変異型Ｇ−ＣＳＦを用いて開発された典型的な治療剤の１つは、日本、東京の協和発酵で製造されるＮｅｕ−ｕｐ（登録商標）（成分名：ナルトグラスチム）である。報告によれば、変異型Ｇ−ＣＳＦは、天然型Ｇ−ＣＳＦと比較して顕著に高い活性およびより長いインビボ半減期を示した。しかしながら、変異型Ｇ−ＣＳＦの臨床的有用性はまだ報告されていない。

Ｇ−ＣＳＦとＰＥＧ間のＮ−末端特異的な抱合のペグ化産物はＰＥＧ−Ｇ−ＣＳＦと称され、アムジェン（Ａｍｇｅｎ）社（Ｎｅｕｌａｓｔａ（登録商標）、ペグフィルグラスチム）により市販された。

化学抱合用の変異型Ｇ−ＣＳＦの開発はマキシジェン（Ｍａｘｙｇｅｎ）社によって掲示されている。（ＰＣＴ／ＤＫ２００１／０００１１）。しかしながら、掲示公報によると、そこで産生された変異型Ｇ−ＣＳＦとＰＥＧ−Ｇ−ＣＳＦの特性がほとんど記載されていない。前記変異型は様々な方法で製造されうる。すなわち、変異の位置、変異型（挿入、置換、欠失）、変異の程度（１−２残基〜断片）、およびそれらの組み合わせの選択によると数千から数万の可能な変異型が存在し、各ケースにおける生物学的特性および物理化学的特性は異なるであろう。明らかに、変異型から産生された化学的抱合体は異なるであろう。

一般的には、化学結合を形成する変異型の製造はそれらの構造の知見に基づいて設計される。Ｏｓｓｌｕｎｄら（米国特許第５５８１４７６号）によると、結合部位は受容可能な残基に基づいて選択され、化学結合に妨害されない結合部位は、Ｇ−ＣＳＦ分子がＧ−ＣＳＦ受容体に結合する構造から選択されて標的変異型の数が制限され、それにより、実際に化学結合を形成しやすい変異型を選択した。しかしながら、かかる様式における構造の知見によって変異の位置を選択することは、当業者にとって容易に想到されうるであろう。

付加と挿入が変異に関連する場合、付加および挿入される残基数および変異の性質（すなわち、変異する残基型）は、変異型の生物学的活性に著しく影響する。疎水性残基と親水性残基の交換または多数の残基と少数の残基の交換は、変異型の構造に実質的な効果をもたらす。当業者は、かかる構造の効果がＧ−ＣＳＦの生物学的活性および安定性に著しい変化を招くであろうことを容易に推測できる。特に、Ｇ−ＣＳＦへの遊離システインの誘導は、ＦｒｅｅｍａｎＭＬらにより提示されるように、タンパク質の安定性に多大な効果を発揮する（Destabilization and denaturation of cellular protein by glutathione depletion, Cell Stress Chaperones. 1997 Sep; 2 (3):191-8）。

上記課題を解消するために、Ｇ−ＣＳＦの特異的な部位にシステインを導入することによりポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のごとき生体適合性重合体との特異的な抱合を促進し、生体適合性重合体との抱合のためにインビボ生物学的活性を減少させることなくインビボ保持時間を増加させ、それによりインビボ生物学的活性を著しく延長する、システインを導入したヒト顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）の変異型、ならびにその生体適合性抱合ポリペプチドを提供することが本発明の目的である。

本発明によるＧ−ＣＳＦの変異型およびその化学的抱合体についてより詳細に説明する。

本発明では、自然に生じるＧ−ＣＳＦが配列番号１によって発現され、組み換え体Ｇ−ＣＳＦ（ｒＧ−ＣＳＦ）が配列番号２によって発現される。別段の特定がない限り、本発明で用いられる用語Ｇ−ＣＳＦは、天然型Ｇ−ＣＳＦと組み換え型Ｇ−ＣＳＦの両方を含む。

本発明の目的を達成するために、配列番号３で同定されるアミノ酸配列を含むヒト顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）の変異型であって、配列番号１で同定されるアミノ酸配列を含むＧ−ＣＳＦの位置１３３のスレオニン（Ｔｈｒ）残基がシステイン（Ｃｙｓ）残基に置換される変異型が提供される。

加えて、本発明は、Ｇ−ＣＳＦの変異型であって、配列番号１で同定されるアミノ酸配列を含むＧ−ＣＳＦの位置１３３のスレオニン（Ｔｈｒ）残基がシステイン（Ｃｙｓ）残基に置換され、置換されたＣｙｓ残基に非タンパク質化合物が修飾される変異型を提供する。

本発明はまた、配列番号４で同定されるアミノ酸配列を含むＧ−ＣＳＦの抱合変異型であって、前記配列番号４は、配列番号１で同定されるＧ−ＣＳＦの位置１３３のスレオニン（Ｔｈｒ）残基がシステイン（Ｃｙｓ）残基に置換されるアミノ酸配列を示し、配列番号１の位置１７のシステイン（Ｃｙｓ）残基がセリン（Ｓｅｒ）に置換され、位置１３３の置換されたシステイン残基に非タンパク質化合物が修飾される変異型を提供する。

非タンパク質化合物は、位置１３３のシステインのチオール基と化学的に抱合される活性化生体適合性重合体であり、好ましくは、マレイミド、ビニルスルホン、ヨードアセトアミドおよびオルトピリジルジスルフィドからなる群から選択される１種類と結合する、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリカルボキシル酸およびポリビニルピロリドンからなる群から選択される１種類の化合物である。より好ましくは、非タンパク質化合物がＰＥＧ−マレイミドの生体適合性重合体である。

加えて、非タンパク質化合物は、好ましくは約２から約１００ｋＤａまでの範囲、より好ましくは約５から約１００ｋＤａまでの範囲の分子量を有する。

別の態様では、配列番号５で同定されるアミノ酸配列を含むヒト顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）の変異型であって、システイン（Ｃｙｓ）残基が、配列番号１で同定されるアミノ酸配列を有するＧ−ＣＳＦの位置１３５のグリシン（Ｇｌｙ）残基と位置１３６のアラニン（Ａｌａ）残基間に挿入される変異型が提供される。

本発明はまた、配列番号５で同定されるアミノ酸配列を含むＧ−ＣＳＦの抱合された変異型であって、システイン（Ｃｙｓ）が、配列番号１で同定されるアミノ酸配列を有するＧ−ＣＳＦの位置１３５のグリシン（Ｇｌｙ）残基と位置１３６のアラニン（Ａｌａ）残基間に挿入され、挿入されたシステイン残基に非タンパク質化合物が修飾される変異型を提供する。

本発明はまた、配列番号６で同定されるアミノ酸配列を含むＧ−ＣＳＦの抱合された変異型であって、システイン（Ｃｙｓ）残基が、配列番号１で同定されるアミノ酸配列を含むＧ−ＣＳＦの位置１３５のグリシン（Ｇｌｙ）残基と位置１３６のアラニン（Ａｌａ）間に挿入され、位置１７のシステイン残基がセリン（Ｓｅｒ）残基に置換され、挿入された位置１３６のシステイン（Ｃｙｓ）残基に非タンパク質化合物が修飾される変異型を提供する。

非タンパク質化合物は、位置１３３のシステインのチオール基と化学的に抱合される活性化生体適合性重合体であり、好ましくは、マレイミド、ビニルスルホン、ヨードアセトアミドおよびオルトピリジルジスルフィドからなる群から選択される１種類と結合する、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリカルボン酸およびポリビニルピロリドンからなる群から選択される１種類の化合物である。より好ましくは、非タンパク質化合物はＰＥＧ−マレイミドの生体適合性重合体である。

加えて、非タンパク質化合物は、好ましくは約２から約１００ｋＤａまでの範囲、より好ましくは約５から約６０ｋＤａまでの範囲の分子量を有する。

本発明の実施に有用なＧ−ＣＳＦの変異型は、哺乳類生物から単離された形態、代替的には、化学合成法、あるいはゲノムもしくはｃＤＮＡクローニングまたはＤＮＡ合成によって得られた外因性ＤＮＡ配列の原核生物もしくは真核生物の宿主発現の産物であってよい。適する真核生物の宿主は種々の細菌（例、大腸菌）を含み；適する真核生物の宿主は酵母（例、出芽酵母）および哺乳類細胞（例、チャイニーズハムスター卵母細胞、サル細胞）を含む。用いられる宿主に依存して、Ｇ−ＣＳＦ発現産物は糖鎖付加されてもよく、されなくてもよい。Ｇ−ＣＳＦ発現産物はまた、最初のメチオニンアミノ酸残基を含んでよい。Ｇ−ＣＳＦの変異型はトランスジェニック哺乳類生物から産生されてもよく、ウシ、ヒツジ、ブタ、ラビット、ヤギ、および様々な哺乳類動物の乳、血液または尿から得られてもよい。

導入した遊離システインにＰＥＧを結合させるため、ペグ化が容易に行われ、ＰＥＧの結合後でも生物学的活性が維持される位置に遊離システインを有するＧ−ＣＳＦの変異型を調製することが必要である。この目的を達成するため、本発明の発明者らは、置換または挿入によって構造的に可擣性のあるＣＤ−ループ領域に遊離システインを導入し、導入した遊離システインにＰＥＧを抱合して変異型Ｇ−ＣＳＦを作成した。次いで、彼らは、ペグ化の過程において、生物学的活性および構造的な安定性を維持するＰＥＧ−Ｇ−ＣＳＦ抱合体の変異型をスクリーンした。

Ｇ−ＣＳＦのＸ線回折構造（ＰＤＢ番号、１ｂｇｃ）において、ＣＤループ領域は大きな可擣性を有し、Ｇ−ＣＳＦの構造全体に大きな効果を及ぼさないと考えられている。したがって、本発明者らは、配列番号２で同定されたｒＧ−ＣＳＦのＣＤループ（Ｇｌｙ^１２６−Ｓｅｒ^１４３）に導入されたシステインを有する変異型を調製した。数個のＸ線結晶構造（ＰＤＢ番号、１ｂｇｃ）から見られるように、ＣＤループ領域は、ペグ化によって構造的変化が抑制されうるために、構造的に流動性と可擣性があることが期待された。加えて、本発明者らは、ＣＤループ領域は、化学修飾を行うのに十分外側の部位であるため、重合体物質が容易に受容可能な領域であろうと予測しえた。さらに、ＣＤループ領域は、受容体と重複する領域のない受容体結合構造を有し、それにより化学結合を形成するのに有利である。

かかる方法において、本発明の発明者は、ＣＤループ領域（１２６−ＧｌｙＭｅｔＡｌａＰｒｏＡｌａＬｅｕＧｌｎＰｒｏＴｈｒＧｌｎＧｌｙＡｌａＭｅｔＰｒｏＡｌａＰｈｅＡｌａＳｅｒ−１４３：配列番号２）に導入されたシステインを有する変異型を調製し、次いで、ペグ化中のＰＥＧ−Ｇ−ＣＳＦ変異型をスクリーンした。得られたシステイン導入変異型は、導入位置によって安定性およびＰＥＧ抱合の性質において顕著な相違を示した。いくつかの変異型は、ＰＥＧの抱合効率が低い一方で、高い安定性および発現と精製効率の高いレベルを示した。すなわち、このことは、立体障害または近隣残基の効果によって変異が生じる微少環境下においてＰＥＧの抱合は容易に起きないことを示唆する。加えて、不安定性を示すいくつかの変異型は、発現および精製することが非常に困難であり、精製段階で沈殿物の形成を生じた。

システイン導入変異型Ｇ−ＣＳＦのＰＥＧ抱合により期待される利点の１つは、ＰＥＧ抱合の正確性である。タンパク質のリシンまたはＮ−末端アミンに対するＰＥＧ抱合は、（ａ）ＰＥＧジクロロトリアジン、（ｂ）ＰＥＧトレシレート（ｔｒｅｓｙｌａｔｅ）、（ｃ）ＰＥＧサクシニミジルカルボン酸、（ｄ）ＰＥＧベンゾトリアゾールカルボン酸、（ｅ）ＰＥＧｐ−ニトロフェニルカルボン酸、（ｆ）ＰＥＧトリクロロフェニルカルボン酸、（ｇ）ＰＥＧカルボニルイミダゾール、および（ｈ）ＰＥＧサクシニミジルコハク酸を介して行われる。上記ＰＥＧ抱合は非特異的であり、二重以上の等価なＰＥＧがタンパク質のリシンまたはＮ−末端アミンに抱合される。同一の等価なＰＥＧが抱合されても、領域異性体は、ランダム位置に抱合されて産生される。それゆえ、これらの方法は、産生した抱合体を削除するのに時間と費用がかかる（M.J. Roberts et al., Chemistry for peptide and protein PEG conjugation, Advanced Drug Delivery Reviews 54 (2002), 459-476）。ＰＥＧ抱合の別の利点は、必要に応じてＰＥＧ結合部位を選択することである。ＰＥＧ結合部位は、リシン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アルファ−アミン、カルボキシル、等を含み、広範囲である。したがって、ＰＥＧ結合部位が活性に影響する構造的に重要な部分である場合、ＰＥＧ抱合は活性を顕著に減少させてしまうかもしれない。この点から、システイン導入による特異的なペグ化は、生物学的活性を維持するＰＥＧ抱合の開発に有利に用いられるだろう。

遊離のチオール基は非常に反応性が高いため、容易に酸化される（Rigo A et al., Interaction of copper with cysteine: stability of cuprous complexes and catalytic role of cupric ions in anaerobic thiol oxidation, J Inorg Biochem. 2004, 98(9), 1495-501）。しかしながら、いくつかの場合では、遊離のチオール残基はジスルフィド結合を形成しうる。化学修飾を引き起こすため、タンパク質表面に導入される遊離のチオール基は分子間ジスルフィド結合を形成し、二次的沈降または酸化を生じ、それにより化学修飾が無効となる（Crow MK,et.al., Protein aggregation mediated by cysteine oxidation during the stacking phase of discontinuous buffer SDS-PAGE, Biotechniques 2001, 30(2), 311-6）。かかる望ましくない現象は、導入システイン残基の部位が外側に露出される時に顕著となる。構造の知見のみに基づいた特異的な化学修飾によるシステイン導入部位の選択は、深刻な問題、例えば、遊離システインによるタンパク質の不安定性に直面するかもしれない（Grzegorz Bulaj, Formation of disulfide bonds in proteins and peptides, Biotechnology Advances 23 (2005) 87-92）。

本発明で調製されるシステイン導入変異型Ｇ−ＣＳＦの大半は、低い発現と精製効率を示した。遊離システイン残基を有するタンパク質の非安定性の問題を解決するため、ＣＯＸＧ．Ｎ．らは、ＷＯ００／４２１７５に記載されるように、特に、システイン導入変異型の調製における非安定性の問題の克服のために考え出した方法を用いた。かかる試みられた方法は、遊離システイン導入変異型の内因性の非安定性を緩和するが、実際の製造過程に適用することは非常に困難である。例えば、ＷＯ００／４２１７５に記載されるように、タンパク質の細胞内発現は、システイン導入変異型の安定性を達成する場合に有利である。しかし、システイン導入変異型を精製するためには、システイン導入変異型が細胞外空間に分泌されなくてはならない。ＷＯ００／４２１７５に記載される発明の原理では、細胞外の安定性が、酸化還元カップリング剤などを用いて酸化還元電位のレベルを一定に保つことにより維持されることとされる。しかし、酸化還元電位を長期間、特に精製段階にわたり一定レベルに保つことは非常に困難である。しかしながら、本発明では、一般的なフォールディングおよび精製段階に適合性のあるシステイン導入変異型が選択的に調製され、本発明によるシステイン導入変異型は、遊離システイン残基を有するとしても構造の安定性を維持することが立証された。本発明で選択されたシステイン導入変異型Ｇ−ＣＳＦは、封入体として大腸菌で発現され、一般的なリフォールディング技術によって活性な変異型Ｇ−ＣＳＦに形質転換される。一般的なリフォールディング技術は、尿素またはグアニジウム塩中に封入体を可溶化し、希釈または除去によって尿素またはグアニジウム塩を取り除くことにより、生物学的活性が提供される。タンパク質中のジスルフィド結合の存在または非存在によって、酸化還元カップリング剤（グルタチオンまたはシステインの酸化または還元された形態のどちらか一方）がリフォールディング段階で添加されてもよい（Ronald W et al., Disulphide bond formation in food protein aggregation and gelation, Biotechnology Advances 23 (2005) 75-80）。本発明では、リフォールディングは以下の様式で行われる。すわなち、システイン導入変異型Ｇ−ＣＳＦの封入体は、好ましくは６−８Ｍの尿素に溶解され、グルタチオンの存在下で２−４Ｍの尿素に希釈されてリフォールディングされる。

抱合に用いられるＰＥＧ重合体は、分子量に特に制限はないが、好ましくは約２ｋＤａから１００ｋＤａまでの範囲の分子量であり、より好ましくは約１０ｋＤａから６０ｋＤａまでの範囲の分子量である。システイン導入Ｇ−ＣＳＦの導入されたシステイン−チオール残基に、生体適合性重合体としてＰＥＧ−マレイミドをカップリングする方法が本発明で用いられる。すなわち、Ｇ−ＣＳＦが２０ｋＤａまたは３０ｋＤａのＰＥＧ−マレイミドと反応されることにより、２０ｋＤａまたは３０ｋＤａのＰＥＧ−Ｇ−ＣＳＦ抱合体が調製された。

システイン導入Ｇ−ＣＳＦのチオール残基に対する生体適合性重合体のＰＥＧ抱合反応において、ＰＥＧのＧ−ＣＳＦに対するモル比は、好ましくは２：１から２００：１の比であり、反応温度は、好ましくは約０から約６０℃の範囲である。反応は、好ましくは約５．０から約７．７のｐＨで行われ、反応時間は、好ましくは約５分から約２４時間の範囲であった。

本明細書に記載の方法におけるペグ化を行った後、ＰＥＧと変異型Ｇ−ＣＳＦ間の抱合がＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析によって同定された。抱合された反応物からモノ−ＰＥＧ−Ｇ−ＣＳＦ抱合体を得るために、モノ−ＰＥＧ−Ｇ−ＣＳＦ誘導体が陽イオン交換クロマトグラフィーを用いて単離された。陽イオン交換クロマトグラフィーを用いて単離された誘導体をさらにサイズ排除クロマトグラフィーにかけることにより、微量の未反応Ｇ−ＣＳＦを取り除いたモノ−ＰＥＧ−Ｇ−ＣＳＦ抱合体のみを単離した。

本発明のモノ−ＰＥＧ−Ｇ−ＣＳＦの生物学的活性を測定するために、様々な文献に記載される公知の方法（Baldwin et al., Acta Endocrinologica., 119:326, 1988; Clark et al., J. Biol. Chem., 271(36):21969, 1996; and Bozzola et al., J. endocrinol. Invest., 21:768, 1998）が用いられた。測定結果は、本発明によるＰＥＧ−Ｇ−ＣＳＦ抱合体がインビボ保持時間を増加させた上で、高レベルの生物学的活性を維持することを示した。

Ｎ−末端にモノペグ化したフィルグラスチムは、報告によると、フィルグラスチムの６８％のインビトロ生物学的活性を有する（米国特許第５８２４７８４）。対照的に、本発明によるＰＥＧ−Ｇ−ＣＳＦ抱合体の各々は、フィルグラスチムの約２．１ないし約３．５倍のインビトロ生物学的活性（すなわち、２５０〜３００％）であった。加えて、本発明によるＰＥＧ−Ｇ−ＣＳＦ抱合体各々のインビトロ半減期は、フィルグラスチムの少なくとも約５倍であった。さらに、好中球活性の生物活性においてもフィルグラスチムより優れていた。前記の理由はおそらく以下の通りである。すなわち、Ｇ−ＣＳＦの生物活性および安定性は導入システインの選択される位置によって影響されず、選択される位置はＧ−ＣＳＦのペグ化による構造変化が可擣的に抑えられ得る位置であるからである。

上記に記載されるように、本発明は、Ｇ−ＣＳＦの特異的な部位にシステインを導入することによってポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のごとき生体適合性重合体との特異的な抱合を促進し、その生体適合性重合体との抱合によりインビボの生物学的活性を減少させることなくインビボ保持時間を増加させ、それによりインビボ生物学的活性を大幅に延長するシステイン導入顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）の変異型、ならびにその生体適合的に抱合されたポリペプチドを提供しうる。加えて、本発明によるＰＥＧ−Ｇ−ＣＳＦ抱合体は、４．２−５．１倍長いインビボ半減期という薬物動態プロファイルに照らして、フィルグラスチムより高い膜安定性を示すことから、活性および延長した治療効果を維持する。さらに、好中球活性の効果は、薬物動力学において、フィルグラスチムより優れる。

（図面の簡単な説明）
図１は、ＰＥＧ−Ｇ−ＣＳＦ抱合反応の模式図である。

図２は、本発明によるＧ−ＣＳＦとＰＥＧ抱合体の精製した変異型のＳＤＳＰＡＧＥ（ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動）解析の結果を示す。

図３は、本発明によるＧ−ＣＳＦ−ＰＥＧ抱合反応物のＳＤＳＰＡＧＥ解析の結果を示す。

図４は、本発明によるＧ−ＣＳＦ−ＰＥＧ抱合体のインビボ薬物動態の測定結果を示す。

図５は、Ｇ−ＣＳＦ−ＰＥＧ抱合体間の好中球活性のインビボ活性を比較する薬物動態の測定結果を示すグラフ表示である。

以下に、本発明は、下記の実施例を参照にしてより詳細に記載されている。下記の実施例は例示するためのものであって、本発明を限定することを目的としていない。

実施例１〜１１．配列番号２で同定されたＧ−ＣＳＦのＣＤループ（Ｇｌｙ^１２６−Ｓｅｒ^１４３）におけるアミノ酸のシステイン置換による抱合された変異型Ｇ−ＣＳＦの調製
Ａ．組み換え体Ｇ−ＣＳＦ（ｒＧ−ＣＳＦ）の調製
本発明で用いられる組み換え体Ｇ−ＣＳＦ（ｒＧ−ＣＳＦ）を、本発明の出願人による韓国特許第２３０５７９号に記載される株（ＫＦＣＣ−１０９６１）を用いて発現させた。それゆえ、調製した組み換え体Ｇ−ＣＳＦはフィルグラスチムのごとく大腸菌に由来し、配列番号２で同定したアミノ酸配列を有する。

これらの実施例では、組み換え体Ｇ−ＣＳＦをＧ−ＣＳＦとして用いることとし、調製した組み換え体Ｇ−ＣＳＦに配列番号２で同定したアミノ酸配列に基づいてアミノ酸番号を割り当てる。

Ｂ．組み換え体Ｇ−ＣＳＦのシステイン導入変異型の調製
システイン導入変異型Ｇ−ＣＳＦを、韓国特許第２３０５７９号に記載されるＧ−ＣＳＦ発現株（ＫＦＣＣ−１０９６１）から調製した。Ｇ−ＣＳＦ発現株をＬＢ培養培地中で撹拌させながら１２時間培養し、次いでキアゲン（Ｑｕｉａｇｅｎ）社製のプラスミド調製キットを用いてＧ−ＣＳＦ発現ベクター（ｐＧＷ２）を単離した。表１にリストされるシステイン導入遺伝子（３０−４０塩基対の大きさの相補的ポリヌクレオチド二本鎖）を含む相補的変異プライマーを用いて鋳型として単離したＧ−ＣＳＦ発現ベクター（ｐＧＷ２）上においてポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）を行った。次いで、ＰＣＲでクローン化したＧ−ＣＳＦ発現ベクターをＤＰＮ１酵素で処理して鋳型を取り除き、続いてルビジウムにより処理したＭＣ１０６１大腸菌に形質導入した。形質導入株をスクリーニングするために形質導入した宿主をアンピシリン培養培地で培養した。変異と鋳型除去のためのＰＣＲ産物の酵素処理を、部位特異的変異キット（ストラタジーン社のQuickChange Site-Directed Mutagenesis Kit）で利用可能なｐｆｕＴｕｒｂｏＤＮＡポリメラーゼとＤＰＮ１酵素各々を用いて使用説明書に従って行った。変異をプライマー（５’−ＧＣＧＧＡＴＣＣＴＧＣＣＴＧＡ−３’）を用いるＰＣＲによる塩基配列決定の解析により確認した。

Ｃ．システイン導入変異型Ｇ−ＣＳＦの発現
システイン導入変異型Ｇ−ＣＳＦ発現株を５μｇ／ｍｌアンピシリンを添加した５ｍｌＬＢ培養培地で１２時間培養し、次いで５μｇ／ｍｌアンピシリンを添加した５００ｍｌＬＢ培地に移して撹拌しながら培養した。この株の吸光度（ＯＤ）が０．５に達したら、最終濃度１％（ｗ／ｖ）でアラビノースを各培養培地に添加し、約７時間撹拌しながら培養してシステイン導入変異型Ｇ−ＣＳＦを過剰発現させた。

Ｄ．システイン導入変異型Ｇ−ＣＳＦのリフォールディング
過剰発現させたシステイン導入変異型Ｇ−ＣＳＦ発現株を遠心分離し、Ｔｒｉｓ２０ｍＭと１５０ｍＭＮａＣｌで懸濁し、懸濁した株をソニケーターを用いて破壊した。破壊した株を遠心分離し、２％（ｗ／ｖ）のデオキシコール酸ナトリウムで洗浄して封入体に回復させた。システイン導入変異型の封入体をｐＨ８．８の７Ｍ尿素、２０ｍＭＴｒｉｓ、および１００ｍＭＮａＣｌに溶解させ、ｐＨ８．８の３．３Ｍ尿素、５ｍＭＴｒｉｓ、２ｍＭ還元型グルタチオン、および０．２Ｍ酸化型グルタチオンで１０倍希釈した。リフォールディングの段階を４℃で１８時間撹拌しながら行った。

Ｅ−１．ペグ化システイン導入変異型Ｇ−ＣＳＦの調製
リフォールディングサンプルとしてのシステイン導入変異型Ｇ−ＣＳＦをＨＣｌによる滴定でｐＨ４．５にした後、生じた沈殿物を遠心分離により除去した。活性を有するシステイン導入変異型Ｇ−ＣＳＦを精製するため、２０ｍＭリン酸ナトリウムをｐＨ４．０で平衡化したＳＰ−セファロースファーストフロー（ｆａｓｔｆｌｏｗ）カラムに注入し、平衡化緩衝液を用いて洗浄し、塩濃度１００〜５０００ｍＭＮａＣｌの勾配で溶離した。

溶離したシステイン導入変異型Ｇ−ＣＳＦサンプルのｐＨを６．８に調整し、約２０ｋＤａまたは約３０ｋＤａの平均分子量を有するメトキシ−ＰＥＧ−マレイミド（アメリカのシェアウォーター（Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ）社）を生じた溶液に添加してシステイン導入変異型Ｇ−ＣＳＦ：メトキシ−ＰＥＧ−マレイミドのモル比が１：２になるようにした。次いで、ゆっくり撹拌しながら４℃で約１８時間反応させた。

Ｅ−２．ビニルスルホン−ペグ化システイン導入変異型Ｇ−ＣＳＦの調製
セクションＥ−１の記載と同一の方法により単離したシステイン導入変異型Ｇ−ＣＳＦのＳＰ−セファロース流出液サンプルのｐＨをｐＨ７．５に調整した後、生じた溶液に約２０ｋＤａの平均分子量を有するメトキシ−ＰＥＧ−ビニルスルホンを添加してシステイン導入変異型Ｇ−ＣＳＦ：メトキシ−ＰＥＧ−マレイミドのモル比が１：５になるようにした。次に、ゆっくり撹拌しながら４℃で約１８時間反応させた。

Ｅ−３．ヨードアセトアミドーペグ化システイン導入変異型Ｇ−ＣＳＦの調製
セクションＥ−１の記載と同一の方法により単離したシステイン導入変異型Ｇ−ＣＳＦのＳＰ−セファロース流出液サンプルのｐＨをｐＨ７．０に調整した後、生じた溶液に約２０ｋＤａの平均分子量を有するメトキシ−ＰＥＧ−ヨードアセトアミドを添加してシステイン導入変異型Ｇ−ＣＳＦ：メトキシ−ＰＥＧ−ヨードアセトアミドのモル比が１：２になるようにした。次に、ゆっくり撹拌しながら４℃の暗室で約４８時間反応させた。

Ｆ．モノ−ＰＥＧ−Ｇ−ＣＳＦ誘導体の融合体の単離
調製したペグ化システイン導入変異型Ｇ−ＣＳＦのｐＨをｐＨ４．０に調整した後、生じた生成物を緩衝溶液（２０ｍＭ第一Ｎａ_２ＨＰＯ_４、ｐＨ４．８）で３倍に希釈し、平衡化緩衝液と同一の緩衝液、すなわち２０ｍＭ第一Ｎａ_２ＨＰＯ_４、ｐＨ４．８を含む平衡化緩衝液を用いて平衡化したＳＰ−セファロースファーストフローカラムに注入した。次いで、生じた生成物を緩衝溶液（２０ｍＭ第一Ｎａ_２ＨＰＯ_４、５０ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ４．８）で洗浄し、塩濃度５０〜５００ｍＭＮａＣｌの勾配で溶離した。システイン導入変異型Ｇ−ＣＳＦから未反応のＧ−ＣＳＦを除去するために、ＳＰ−セファロースカラムから溶離したペグ化システイン導入変異型Ｇ−ＣＳＦにサイズ除外クロマトグラフィーを行った。ＳＰ−セファロース流出液を濃縮し、緩衝溶液（２０ｍＭ第一Ｎａ_２ＨＰＯ_４、１００ｍＭＮａＣｌ（ｐＨ４．０））で平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ２００（２．５Ｘ５０ｃｍ、ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ））に注入し、１ｍｌ／分の溶離速度において同一の緩衝溶液で溶離した。単離したペグ化システイン導入変異型Ｇ−ＣＳＦの精製度をＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析により調べた。

表１は、実施例１から１１で調製した各ペグ化システイン導入変異型の回収と抱合の実施をパーセンタイルで示す。
（表１）

本発明の表おいて、変異部位の欄に示す表示方法は、例えば、「Ａｌａ１２８Ｃｙｓ」は、アミノ酸番号１２８、すなわちＡｌａがＣｙｓに置換していることを意味し、この表示方法は同一の様式で他の例に適用される。

変異型回収は、ＰＥＧ−変異型抱合に対して行ったリフォールディングと精製を通しての変異型の収率、すなわち、精製変異型Ｇ−ＣＳＦ数の封入体発現変異型Ｇ−ＣＳＦの全カウント数に対する割合を意味する。

ＰＥＧ抱合の実施は、ＰＥＧ抱合Ｇ−ＣＳＦ数のＰＥＧ抱合変異型Ｇ−ＣＳＦの合計数に対する割合を意味する。

実施例１２〜２２．ＣＤループ（Ｇｌｙ^１２６−Ｓｅｒ^１４３）におけるＧ−ＣＳＦアミノ酸のシステイン置換および位置１８のシステインのセリン置換による抱合された変異型Ｇ−ＣＳＦ抱合体の調製
アミノ酸におけるセリンによるシステイン（Ｃｙｓ）の置換とＣＤループ（Ｇｌｙ^１２６−Ｓｅｒ^１４３）におけるセリンによる位置１８のシステインの置換を包含することにより変異型を調製するために、システイン導入変異をＣｙｓ１８Ｓｅｒ置換変異型の株を用いて行い、システイン導入変異を上記に記載と同一の方法で行ったことを除いて、対象の変異型を実施例１から１１と同一の方法で調製した。本発明者らは、配列番号２で同定されるｒＧ−ＣＳＦのＣＤループに導入されたシステインを有する変異型を調製した。

表２は、パーセンタイル（％）で示した実施例１２から２２で調製した各ペグ化システイン導入変異型の回収および抱合の実施を示す。
（表２）

（実施例２３〜２８．Ｇ−ＣＳＦのＣＤループ（Ｇｌｙ^１２６−Ｓｅｒ^１４３）におけるシステイン（Ｃｙｓ）の挿入によるＧ−ＣＳＦ抱合体の変異型の調製）
ＣＤループ（Ｇｌｙ^１２６−Ｓｅｒ^１４３）へのシステイン（Ｃｙｓ）の挿入によって変異型を調製するために、表３に記載したシステイン導入遺伝子を含む相補的変異プライマー（３０−４０塩基対の大きさを有する相補的ポリヌクレオチド二本鎖）を用いて鋳型として単離したＧ−ＣＳＦ発現ベクター（ｐＧＷ２）上でポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）を行ったことを除いて、対象の変異型を実施例１から１１と同一の方法で調製した。

表３は、パーセンタイル（％）で示した実施例２３から２８で調製した各ペグ化システイン導入変異型の回収および抱合の実施を示す。
（表３）

本発明の表において、変異部位の欄に示す表示方法は、例えば、「１３０Ｃｙｓ１３１」は、アミノ酸システインが１３０と１３１と番号付けられたアミノ酸の間に挿入されることを意味し、この表示方法は同一の様式で他の実施例に適用される。

実施例２９〜３４．Ｇ−ＣＳＦのＣＤループ（Ｇｌｙ^１２６−Ｓｅｒ^１４３）におけるシステイン（Ｃｙｓ）の挿入および位置１８システインのセリン置換によるＧ−ＣＳＦ抱合体の変異型の調製
アミノ酸におけるシステイン（Ｃｙｓ）の挿入およびＣＤループ（Ｇｌｙ^１２６−Ｓｅｒ^１４３）におけるセリンと位置１８システインの置換の両方を包含することにより変異型を調製するために、Ｃｙｓ１８Ｓｅｒにより置換された変異型株を用いてシステイン導入変異を行い、システイン導入変異を上記の記載と同一の様式で行うことを除いて、実施例２３から２８と同一の様式で対象の変異型を調製した。

表４は、パーセンタイル（％）で示した実施例２９から３４で調製した各ペグ化システイン導入変異型の回収および抱合の実施を示す。
（表４）

図２は、実施例３３（Ｍ２＿Ｓ）で調製した変異型Ｇ−ＣＳＦの精製ＰＥＧ抱合体のＳＤＳＰＡＧＥ解析の結果を示す。実施例３３では、Ｃｙｓ１８がＳｅｒに置換され、Ｃｙｓが位置１３６のＧｌｙと位置１３７のＡｌａの間に挿入される。２０ｋＤａＰＥＧ−マレイミドまたは３０ｋＤａＰＥＧ−マレイミドに抱合され、精製されることによよって得られた精製ＰＥＧ抱合体は、単一のバンドを示す。

図３は、実施例３３（Ｍ２＿Ｓ）で調製した変異型Ｇ−ＣＳＦの２０ｋＤａＰＥＧ抱合体のＳＤＳＰＡＧＥ解析の結果を示す。実施例３３では、Ｃｙｓ１８がＳｅｒに置換され、Ｃｙｓが位置１３６のＧｌｙと位置１３７のＡｌａの間に挿入される。

図３に示すように、システイン導入変異型Ｇ−ＣＳＦのＰＥＧ−マレイミド抱合反応は導入されるシステインに対して非特異的であるので、モノ−ＰＥＧ−Ｇ−ＣＳＦはオリゴマーまたはポリゴマーを形成することなく得られうる。

実験的実施例（ＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌＥｘａｍｐｌｅ）１．インビトロ活性の測定
実施例１から３４で調製したシステイン導入変異型Ｇ−ＣＳＦＰＥＧ抱合体の生物学的活性を測定し、フィルグラスチン（大腸菌由来のＧ−ＣＳＦ）の活性と比較した。マウス骨髄性白血病細胞株ＮＦＳ−６０（ＡＴＣＣＸ６５６２２）の細胞増殖を介して活性測定を行った。ＮＦＳ−６０細胞を１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ（ウシ胎児血清）と５％ＷＥＨＩ−１６４０細胞株培地溶液を含むＲＰＭＩ１６４０培地で培養し、１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳを含むＲＰＭＩ培地中で懸濁して約２Ｘ１０^５細胞／ｍｌの濃度にした。懸濁した細胞懸濁液各５０μｌを添加して９６ウェルマイクロタイタープレートの各ウェルに約１Ｘ１０^４細胞を含むようにした。

フィルグラスチムと実施例で調製したシステイン導入変異型のＰＥＧ抱合体を、１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳを含有するＲＰＭＩ１６４０培地で希釈してＢＣＡ（ビシンコニン酸）タンパク質アッセイを用いて１５ｎｇ／ｍｌにした。１２段階における１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地でさらに３倍希釈を行う。調製したサンプルの各１００μｌを、ＮＦＳ−６０細胞を培養する各ウェルに添加することにより、培養培地のサンプル濃度を、最終サンプル濃度が１００００から０．０５ｐｇ／ｍｌの範囲に達するまで連続的に減少させた。３７℃のインキュベーターで４８時間インキュベートした後、細胞の増殖をＣｅｌｌＴｉｔｅｒ９６（登録商標）（カタログ番号Ｇ３５８０）（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ））を用いて確認した。

表５は、実施例１から３４で調製したペグ化システイン導入変異型の回収および抱合の実施の全データを示す。

変異型回収は、封入体に由来する精製変異型Ｇ−ＣＳＦ数の変異型Ｇ−ＣＳＦの合計数に対する収率を示す。比較的高い回収率を有する変異型は比較的高い安定性を有するシステイン導入変異型であることがわかる。一方で、ＰＥＧ抱合の実施は、ＰＥＧを抱合したＧ−ＣＳＦ数のＰＥＧ抱合体に結合した変異型Ｇ−ＣＳＦの合計数に対する割合を示す。より高いＰＥＧ実施率は、ＰＥＧが容易に導入システインにカップルできることを意味する。ＮＦＳ６０活性は、フィルグラスチムのインビトロ生物学的活性を１００％とした時のＰＥＧ抱合体のインビトロ生物学的活性を示す。

（表５）

表１に示すように、実施例１、１０、１１、１２、２１および２２で調製したシステイン導入変異型は容易に発現および精製されなかった。容易に発現および精製されるシステイン導入変異型間では、Ｃｙｓ１８がセリンに置換する変異型の生物学的活性は、位置１８のシステインを維持する変異型の生物学的活性と大きく変化しなかった。しかしながら、位置１８にシステインを維持するシステイン導入変異型はペグ化後の生物学的活性のわずかな減少を示した。この知見は、Ｐａｒｋらの報告（韓国特許出願第１０−２００３−００１７６０６号）に一致する。ＰＥＧ抱合が位置１８のシステインで行われたと考えられる。

スクリーニングの段階後、ＰＥＧ抱合、すなわちペグ化を生じさせるために、最終的なスクリーニング段階を行うことにより、Ｇ−ＣＳＦのＴｈｒ１３４がシステインに置換される変異型Ｇ−ＣＳＦ（Ｍ１）、ＣｙｓがＧｌｙ１３６とＡｌａ１３７の間に挿入される変異型Ｇ−ＣＳＦ（Ｍ２）、位置１８のＣｙｓがＳｅｒに置換し、ＣｙｓがＧｌｙ１３６とＡｌａ１３７の間に挿入された変異型Ｇ−ＣＳＦ（Ｍ２＿Ｓ）を調べた。ペグ化されたＭ１、Ｍ１＿Ｓ、Ｍ２、およびＭ２＿Ｓ変異型を各々、２０ｋＤａＰＥＧ−Ｍ１、２０ｋＤａＰＥＧ＿Ｍ１＿Ｓ、２０ｋＤａＰＥＧ−Ｍ２、および２０ｋＤａＰＥＧ−Ｍ２＿Ｓと名付けた。

実験的実施例２．薬物動態測定
実験的実施例１で調べた各２０ｋＤａＰＥＧ抱合システイン導入変異型Ｇ−ＣＳＦ、すなわち、２０ｋＤａＰＥＧ−Ｍ１、２０ｋＤａＰＥＧ＿Ｍ１＿Ｓ、２０ｋＤａＰＥＧ−Ｍ２、および２０ｋＤａＰＥＧ−Ｍ２＿Ｓの血清の保持時間を測定した。各群にについて、フィルグラスチム（コントロール）ならびに実施例で調製した２０ｋＤａＰＥＧ−Ｍ１、２０ｋＤａＰＥＧ＿Ｍ１＿Ｓ、２０ｋＤａＰＥＧ−Ｍ２、および２０ｋＤａＰＥＧ−Ｍ２＿Ｓを各５匹のＳＤラット（体重２００−２５０ｇ、６週齢のスプラーグドーリーラットの雄）に対して１ｋｇ体重あたり１００μｇで皮下注射し、注射後０．５、１、２、４、８、１２、１６、２０、２４、３０、３６、４８、６０、７２、９６、１２０、１４４、１６８時間後に血液サンプルを採取した。血液サンプルを室温で１時間凝血させ、微量遠心機を用いて１００００ｒｐｍで５分間遠心分離し、それにより細胞を除去した。モノクローナル抗体を用いる酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）により血しょうＧ−ＣＳＦの量を測定した。

表６は、テスト群とプルーフ群の血しょう半減期を示す。
（表６）

図４は、本発明によるＧ−ＣＳＦ−ＰＥＧ抱合体のインビトロ薬物動態の測定結果を示す。

表６および図４に関して、本発明の２０ｋＤａはフィルグラスチムより高い血しょう安定性、すなわち、フィルグラスチムより４．２−５．１倍長いインビボ半減期を示し、このことは、本発明によるシステイン導入変異型Ｇ−ＣＳＦの２０ｋＤａＰＥＧ抱合体がフィルグラスチムより長い期間インビボ活性を維持し、それにより治療効果を改善することを示唆する。

実験的実施例３．薬物の薬力学測定
実験的実施例１で決定した２０ｋＤａＰＥＧ抱合システイン導入変異型Ｇ−ＣＳＦ各々、すなわち、２０ｋＤａＰＥＧ−Ｍ１、２０ｋＤａＰＥＧ＿Ｍ１＿Ｓ、２０ｋＤａＰＥＧ−Ｍ２、および２０ｋＤａＰＥＧ−Ｍ２＿Ｓの好中球活性を測定した。各群について、フィルグラスチム（コントロール）ならびに実施例で調製した２０ｋＤａＰＥＧ−Ｍ１、２０ｋＤａＰＥＧ＿Ｍ１＿Ｓ、２０ｋＤａＰＥＧ−Ｍ２、および２０ｋＤａＰＥＧ−Ｍ２＿Ｓを各５匹のＳＤラット（体重２００−２５０ｇ、６週齢のスプラーグドーリーラットの雄）に対して１ｋｇ体重あたり１００μｇで皮下注射し、血液サンプルを経時的に目から採血することによって採取した。次いで、血漿中の好中球数をカウントした。

図５は、Ｇ−ＣＳＦ−ＰＥＧ抱合体間の好中球のインビボ活性を比較する薬物動態の測定結果を表す図である。

図５で示されるように、２０ｋＤａＰＥＧ抱合システイン導入変異型Ｇ−ＣＳＦ各々、すなわち、２０ｋＤａＰＥＧ−Ｍ１、２０ｋＤａＰＥＧ＿Ｍ１＿Ｓ、２０ｋＤａＰＥＧ−Ｍ２、および２０ｋＤａＰＥＧ−Ｍ２＿Ｓの好中球活性はフィルグラスチムより顕著に高かった。

上記に記載するように、本発明は、抗がん薬物が投与される際に、骨髄細胞からの好中球の顆粒球コロニーの形成を刺激し、骨髄細胞の最終段階への分化を誘導するための治療におけるアジュバンドとしてのヒト顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）の変異型を対象とする。したがって、本発明は、医療目的および病気の治療に対して有利に利用可能である。

ＰＥＧ−Ｇ−ＣＳＦ抱合反応の模式図である。本発明によるＧ−ＣＳＦとＰＥＧ抱合体の精製した変異型のＳＤＳＰＡＧＥ（ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動）解析の結果を示す。本発明によるＧ−ＣＳＦ−ＰＥＧ抱合反応物のＳＤＳＰＡＧＥ解析の結果を示す。本発明によるＧ−ＣＳＦ−ＰＥＧ抱合体のインビボ薬物動態の測定結果を示す。Ｇ−ＣＳＦ−ＰＥＧ抱合体間の好中球活性のインビボ活性を比較する薬物動態測定の結果を示すグラフ表示である。

Claims

配列番号３で同定されるアミノ酸配列を含むヒト顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）の変異型であって、配列番号１で同定されるアミノ酸配列を有するＧ−ＣＳＦの位置１３３のスレオニン（Ｔｈｒ）残基がシステイン（Ｃｙｓ）残基に置換された変異型。
配列番号３で同定されるアミノ酸配列を含むヒトＧ−ＣＳＦの抱合された変異型であって、配列番号１で同定されるアミノ酸配列を含むＧ−ＣＳＦの位置１３３のスレオニン（Ｔｈｒ）残基がシステイン（Ｃｙｓ）残基に置換され、前記置換Ｃｙｓ残基が非タンパク質化合物に結合している変異型。
前記変異型が、配列番号４で同定されるアミノ酸配列を含むタンパク質であって、位置１７のシステイン（Ｃｙｓ）残基がセリン（Ｓｅｒ）残基に置換された、請求項２の抱合された変異型。
非タンパク質化合物が、マレイミド、ビニルスルホン、ヨードアセトアミドおよびオルトピリジルジスルフィドを含む群から選択される１種類と結合する、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリカルボキシル酸およびポリビニルピロリドンを含む群から選択される１種類の化合物である、請求項２または３の抱合された変異型。
非タンパク質化合物が、約２から約１００ｋＤａまでの範囲の分子量であり、請求項２または３の抱合された変異型。
ＰＥＧが約５ないし約１００ｋＤａの範囲の分子量を有する、請求項４の抱合された変異型。
配列番号５に含まれるアミノ酸配列を含むヒト顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）の変異型であって、システイン（Ｃｙｓ）残基が、配列番号１に含まれるＧ−ＣＳＦの位置１３５のグリシン（Ｇｌｙ）残基と位置１３６のアラニン（Ａｌａ）残基の間に挿入される変異型。
配列番号５に含まれるアミノ酸配列を含むヒト顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）の抱合された変異型であって、システイン（Ｃｙｓ）残基が配列番号１に含まれるアミノ酸配列を含むＧ−ＣＳＦの位置１３５のグリシン（Ｇｌｙ）と位置１３６のアラニン（Ａｌａ）残基の間に挿入され、非タンパク質化合物が挿入されたシステイン残基に結合されている変異型。
変異型が、位置１７のシステイン（Ｃｙｓ）残基がセリン（Ｓｅｒ）残基に置換された配列番号６に含まれるアミノ酸配列を含むタンパク質である、請求項８の抱合された変異型。
非タンパク質化合物が、マレイミド、ビニルスルホン、ヨードアセトアミドおよびオルトピリジルジスルフィドを含む群から選択される１種類と結合している、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリカルボキシル酸およびポリビニルピロリドンを含む群から選択される１種類の化合物である、請求項８または９の抱合された変異型。
非タンパク質化合物が、約２から約１００ｋＤａまでの範囲の分子量を有する、請求項８または９の抱合された変異型。
ＰＥＧが約５から約１００ｋＤａまでの範囲の分子量を有する、請求項１０の抱合された変異型。