KR20180043800A - Ny-eso-1 특이적 tcrs 및 그의 사용 방법 - Google Patents

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Abstract

본 개시내용은 NY-ESO-1 특이적 TCR 아미노산 서열 및 그의 사용 방법에 관한 것이다.

Description

NY-ESO-1 특이적 TCRS 및 그의 사용 방법
암 환자를 치료하기 위한 일 접근법은 입양 세포 요법 (adoptive cell therapy: ACT)을 위한 키메라 항원 수용체 (chimeric antigen receptors: CARs) 또는 재조합 T-세포 수용체 (recombinant T-cell receptors: rTCRs)의 발현을 통해 종양 세포에서 발현된 항원을 표적화하도록 T-세포를 유전적으로 변형시키는 것이다. CARs는 인간 백혈구 항원-비의존적 방식으로 세포 표면 항원을 인식하도록 디자인된 항원 수용체이다. 특정 타입의 암을 치료하기 위해 CARs를 발현하는 유전적으로 변형된 세포를 사용하려는 시도는 특히 CD19 발현 액형 종양 (liquid tumors)에서 인상적인 성공을 거두었다. 예를 들면, Porter David L, Levine Bruce L, Kalos Michael, Bagg Adam, June Carl H: Chimeric antigen receptor-modified T cells in chronic lymphoid leukemia를 참조한다. The New England journal of medicine 365(8): 725-33, Aug 2011.;Kalos Michael, Levine Bruce L, Porter David L, Katz Sharyn, Grupp Stephan A, Bagg Adam, June Carl H: 키메라 항원 수용체를 갖는 T 세포는 강력한 항종양 (antitumor) 효과를 가지며, 진행성 백혈병을 앓는 환자에서 기억을 확립할 수 있다. Science translational medicine 3(95): 95ra73, Aug 2011. 마찬가지로, 암-고환 (testis) 항원 NY-ESO-1로부터 유래된 MHC-제한된 펩티드에 특이적인 재조합 T 세포 수용체를 발현하도록 조작된 (engineered) 자가유래 (autologous) T 세포는 최근에 다발 골수종 (multiple myeloma) 및 육종 (sarcoma)에서 인상적인 임상적 효능을 보여주었다. 예를 들면, Rapoport AP, Stadtmauer EA, Binder-Scholl GK, Goloubeva O, Vogl DT, Lacey SF, Badros AZ, Garfall A, Weiss B, Finklestein J, Kulikovskaya I, Sinha SK, Kronsberg S, Gupta M, Bond S, Melchiori L, Brewer JE, Bennett AD, Gerry AB, Pumphrey NJ, Williams D, Tayton-Martin HK, Ribeiro L, Holdich T, Yanovich S, Hardy N, Yared J, Kerr N, Philip S, Westphal S, Siegel DL, Levine BL, Jakobsen BK, Kalos M, June CH를 참조한다. NY-ESO-1-특이적 TCR-조작된 T 세포는 골수종에서 지속된 항원-특이적 항종양 효과를 매개한다. Nat Med. 2015 Aug;21(8):914-21; Robbins PF, Kassim SH, Tran TL, Crystal JS, Morgan RA, Feldman SA, Yang JC, Dudley ME, Wunderlich JR, Sherry RM, Kammula US, Hughes MS, Restifo NP, Raffeld M, Lee CC, Li YF, El-Gamil M, Rosenberg SA. Pilot trial using lymphocytes genetically engineered with an NY-ESO-1-reactive T-cell receptor: long-term follow-up and correlates with response. Clin Cancer Res. 2015 Mar 1;21(5):1019-27.)
그러나, 특히 인 비트로 친화도가 증강된 rTCR의 사례에서 독성과 같은 차질을 또한 겪었다 (예컨대, Linette GP, Stadtmauer EA, Maus MV, Rapoport AP, Levine BL, Emery L, Litzky L, Bagg A, Carreno BM, Cimino PJ, Binder-Scholl GK, Smethurst DP, Gerry AB, Pumphrey NJ, Bennett AD, Brewer JE, Dukes J, Harper J, Tayton-Martin HK, Jakobsen BK, Hassan NJ, Kalos M, June CH. Cardiovascular toxicity 및 titin cross-reactivity of affinity-enhanced T cells in myeloma and melanoma. Blood. 2013 Aug 8;122(6):863-71. 참조). 따라서, 전술한 노력에도 불구하고, T 세포를 종양 또는 관심있는 다른 표적으로 재지향시키기 위한 더 효과적이고 안전한 방법이 지속적으로 필요하다.
인간 HLA 이식유전자 (transgenic) 마우스 (mice)의 면역화 및 환자의 종양 침윤 림프구 (tumor infiltrating lymphocytes: TIL)로부터 TCR의 분리를 포함하는, 입양 세포 요법을 위한 T 세포 수용체의 선별을 위한 몇 가지 방법이 현재 사용되고 있다 (예를 들면; Linnemann C, Heemskerk B, Kvistborg P, Kluin RJ, Bolotin DA, Chen X, Bresser K, Nieuwland M, Schotte R, Michels S, Gomez-Eerland R, Jahn L, Hombrink P, Legrand N, Shu CJ, Mamedov IZ, Velds A, Blank CU, Haanen JB, Turchaninova MA, Kerkhoven RM, Spits H, Hadrup SR, Heemskerk MH, Blankenstein T, Chudakov DM, Bendle GM, Schumacher TN. High-throughput identification of antigen-specific TCRs by TCR gene capture. Nat Med. 2013 Nov;19(11):1534-41.; Rosati SF, Parkhurst MR, Hong Y, Zheng Z, Feldman SA, Rao M, Abate-Daga D, Beard RE, Xu H, Black MA, Robbins PF, Schrump DA, Rosenberg SA, Morgan RA. A novel murine T-cell receptor targeting NY-ESO-1. J Immunother. 2014 Apr;37(3):135-46 참조. 그러나, 이러한 모든 방법은 제공된 HLA 컨텍스트 (context)에서만 기능하는 TCRs을 식별하여, 특정 환자 개체군에 대한 그 유용성이 제한되는 잠재적인 단점을 가지고 있다.
상기 TCR은 신호 전달을 매개하는데 관여된 CD3 복합체의 불변 (invariant) 단백질과 관련된 면역글로불린 상과 (superfamily)의 헤테로이량체 (heterodimeric) 세포 표면 단백질이다. TCRs은 αβ 및 γδ 형태로 존재하고, 이는 구조적으로 유사하지만, 이들을 발현하는 T 세포는 상당히 다른 해부학적 위치 및 기능을 갖는다. 상기 수용체의 세포외 부분은 2개의 막-근위 불변 영역 (membrane-proximal constant regions) 및 항체의 상보성 결정 영역 (complementarity determining regions: CDRs)과 유사한 3개의 다형 루프를 갖는 2개의 막-원위 가변 영역 (membrane-distal variable regions)으로 구성된다. 상기 루프는 TCR 분자의 결합 부위를 형성하고, 펩티드 특이성을 결정한다. 특히, CDR1 및 CDR2는 대개 상기 MHC-분자와 상호작용하지만, 반면에 CDR3은 MHC에 의해 제시된 펩티드 리간드와 특이적으로 상호작용한다 (Shore DA, Issafras H, Landais E, Teyton L, Wilson IA. The crystal structure of CD8 in complex with YTS156.7.7 Fab and interaction with other CD8 antibodies define the binding mode of CD8 alphabeta to MHC class I. J Mol Biol. 2008 Dec 31;384(5):1190-202; Borg NA, Ely LK, Beddoe T, Macdonald WA, Reid HH, Clements CS, Purcell AW, Kjer-Nielsen L, Miles JJ, Burrows SR, McCluskey J, Rossjohn J. The CDR3 regions of an immunodominant T cell receptor dictate the 'energetic landscape' of peptide-MHC recognition. Nat Immunol. 2005 Feb;6(2):171-80). 가능한 TCR 다양성의 수학적 추정치는 그러나 자기-허용 (self-tolerance)을 촉진하는데 1012 - 1015의 다른 TCR 범위에 있지만, 흉선 (thymic) 포지티브 및 네가티브 선별은 개인의 나이브 (naive) TCRαβ 레퍼토리의 크기를 각 인간에 대해 대략 2x107 TCRs로 감소시킨다 (Davis, M.M. & Chien, Y.H. in Fundamental Immunology 341-366, Lippincott-Raven, Philiadelphia 1999); Arstila, T.P. et al., A direct estimate of the human αβ T cell receptor diversity. Science 1999: 286958-961). 상기 TCR 알파 및 베타 사슬의 CDR3 영역은 상기 MHC-제시된 펩티드와의 상호작용에 특이성을 부여하기 때문에, CDR3 서열 변이의 특성화는 항원-선별된 T-세포 레퍼토리에서 T-세포 다양성의 척도를 제공한다 (Liaskou E, Henriksen EK, Holm K, Kaveh F, Hamm D, Fear J, Viken MK, Hov JR, Melum E, Robins H, Olweus J, Karlsen TH, Hirschfield GM. High-throughput T-cell receptor sequencing across chronic liver diseases reveals distinct disease-associated repertoires. Hepatology. 2015 Aug 7. doi: 10.1002/hep.28116; Fang H, Yamaguchi R, Liu X, Daigo Y, Yew PY, Tanikawa C, Matsuda K, Imoto S, Miyano S, Nakamura Y. Quantitative T cell repertoire analysis by deep cDNA sequencing of T cell receptor α 및 β chains using next-generation sequencing. Oncoimmunology. 2015 Jan 7;3(12):e968467). 흥미롭게도, TCR 레퍼토리에는 편향 (bias)이 있으며, 종종 동일하거나 거의-동일한 TCR 레퍼토리가 다른 개체 간에, 소위 "공유 TCRs"가 관찰될 수 있다 (Miles JJ, Douek DC, Price DA. Bias in the αβ T-cell repertoire: implications for disease pathogenesis and vaccination. Immunol Cell Biol. 2011 Mar;89(3):375-87). 상기 공유 TCR 서열의 몇가지 특이적 분자 특성이 가정되었다 (Venturi V, Price DA, Douek DC, Davenport MP. The molecular basis for public T-cell responses? Nat Rev Immunol. 2008 Mar;8(3):231-8). 상기 MHC 클래스 I 및 클래스 II 리간드는 또한 면역글로불린 상과 단백질이지만, 상기 APC 세포 표면에서 짧은 펩티드 단편의 다양한 어레이를 제시할 수 있는 다형 펩티드 결합 부위와 함께 항원 제시에 특화되어 있다.
다수의 논문은 각각의 서브유닛을 연결하는 네이티브 (native) 디술피드 브릿지 (bridge)를 포함하는 rTCR 헤테로이량체의 생산을 개시하였다 (Garboczi, et al., (1996), Nature 384(6605): 134-41; Garboczi, et al., (1996), J Immunol 157(12): 5403-10; Chang et al., (1994), PNAS USA 91: 11408-11412; Davodeau et al., (1993), J. Biol. Chem. 268(21): 15455-15460; Golden et al., (1997), J. Imm. Meth. 206: 163-169; U.S. Pat. No. 6,080,840). 그러나, 이러한 TCRs은 TCR-특이적 항체에 의해 인식될 수 있지만, 상대적으로 고농도가 아닌 어느 것에서 그 네이티브 리간드를 인식하지 못하거나 및/또는 안정하지 않았다.
WO 99/60120에서, 그 네이티브 리간드를 인식할 수 있고, 일정 기간 동안 안정하며, 합리적인 양으로 생산될 수 있도록 정확하게 접혀진 가용성 TCR이 개시되어 있다. 상기 TCR은 루신 지퍼 (leucine zippers)와 같은 한 쌍의 C-말단 이량체화 펩티드에 의해 각각 TCR β 또는 δ 사슬 세포외 도메인에 이량체화된 TCR 알파 또는 감마 사슬 세포외 도메인을 포함한다. rTCRs을 생산하는 이러한 전략은 일반적으로 모든 TCRs에 적용할 수 있다.
NY-ESO-1에 의한 면역화는 항체 및 CD8+ CTL 반응을 유도하는데 사용되었고, 상기 연구에서 암 진행에 거의 영향을 주지 않는 것으로 관찰되었다 (Jager et al., Proc Natl Acad Sci USA. 2000;97:12198). 높은 항종양 활성을 갖는 림프구의 전달인 입양 면역요법 (adoptive immunotherapy)은 확립된 큰 종양의 퇴행을 매개할 수 있지만, HLA-매치된 (matched), 반응성 림프구의 생성이 어렵고, 값이 비싸며, 노동 집약적이다 (Rosenberg et al., N Engl J Med. 1988;319:1676; Walter et al., N Engl J Med. 1995;333:1038; Mackinnon et al., Blood. 1995;86:1261; Papadopoulos et al., N Engl J Med. 1994;330:1185; Dudley et al., J Immunother. 2003;26:332; Dudley et al., Nat Rev Cancer. 2003;3:666). 종양-침윤 림프구는 세포 전달 요법에서 사용되어 왔고, 다양한 흑색종 (melanoma) 종양-관련 항원 (tumor-associated antigens: TAA)을 인식하는 것으로 나타났다. 흑색종에서 가장 일반적으로 인식된 TAA는 MART-1인, 멜라노사이트 (melanocyte) 분화 항원이고, 이는 흑색종의 ~90%에서 발현되고, 반면에 NY-ESO-1은 흑색종의 ~34%에서 발현된다 (Chen et al., Proc Natl Acad Sci USA. 1997;94:1914).
Zhao et al, (J. Immunol., 2005 Apr 1; 174(7): 4415-4423)은 상기 NY-ESO-1 CT 항원에 특이적인 TCRs의 단리 및 레트로바이러스 벡터 (retroviral vectors)를 제작하는 그의 용도를 개시하고 있고, 이는 정상적인 1차 인간 T 세포에 항-NY-ESO-1 이펙터 (effector) 기능을 전달하는 것이 개시되어 있다. 공통의 TAA에 대한 rTCR 유전자 벡터는 각 환자로부터 고유한 항종양 T 세포를 식별할 필요 없이 그들 자신의 전달된 T 세포로 다수의 암 환자를 치료하는데 사용될 수 있는 가능성을 갖는다. 그러나 현재 rTCR에 기반한 ACT를 개발하기 위한 모든 접근법은 HLA 의존적이므로, 특정 환자 개체군에 국한된다.
본 개시내용의 일 양상은 a) TCR β 사슬 가변 영역, TCR β 사슬 불변 영역, 및 선택적으로 막횡단 도메인 (transmembrane domain) 및 세포질 신호전달 도메인 (cytoplasmic signaling domain)을 포함하는 제1 폴리펩티드; b) TCR 알파 사슬 가변 영역, TCR 알파 사슬 불변 영역, 및 선택적으로 막횡단 도메인 및 세포질 신호전달 도메인을 포함하는 제2 폴리펩티드를 포함하는 키메라 헤테로이량체 T 세포 수용체 (TCR) 폴리펩티드를 제공하고; 상기 헤테로이량체 TCR은 NY-ESO-1/MHC 복합체에 특이적으로 결합하고, 상기 TCR 베타 사슬 가변 영역은 서열번호: 9에 개시된 TCR 베타 사슬 가변 영역 아미노산 서열, 또는 상기에 대해 적어도 85% 동일성 (identity)을 갖는 그의 기능적 변이체를 포함하고; 상기 TCR 알파 사슬 가변 영역은 서열번호: 8에 개시된 동족 (cognate) TCR 알파 사슬 가변 영역 아미노산 서열, 또는 상기에 대해 적어도 85% 동일성을 갖는 그의 기능적 변이체를 포함하고; 및 상기 제1 폴리펩티드와 상기 제2 폴리펩티드 사이에 적어도 하나의 디술피드 결합 (disulfide bond)이 존재한다. 상기 키메라 TCR의 특정 구체예에서, 상기 베타 사슬 가변 영역 CDR3은 아미노산 CASRLAGQETQYF (서열번호: 4)를 포함한다. 본원에 개시된 키메라 헤테로이량체 TCR의 특정한 다른 구체예에서, 상기 제1 폴리펩티드 및 상기 제2 폴리펩티드는 상기 막횡단 도메인 및 상기 세포질 신호전달 도메인을 포함하지 않으므로, 상기 키메라 헤테로이량체 TCR은 가용성이다. 본 개시내용은 또한 본원에 개시된 키메라 헤테로이량체 TCRs를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 제공한다. 다른 구체예에서, 본 개시내용은 본원에 개시된 키메라 헤테로이량체 TCRs을 코딩하는 핵산을 포함하는 발현 벡터를 제공한다. 특정 구체예에서 상기 발현 벡터는 레트로바이러스 벡터, 가령 렌티바이러스 (lentiviral) 벡터이다. 특정 구체예에서, 본 개시내용은 또한 상기 조작된 TCR, 가령 본원에 개시된 키메라 헤테로이량체 TCRs을 코딩하는 본원에 개시된 핵산 또는 본원에 개시된 벡터를 포함하는 단리된 세포를 제공한다. 특정 구체예에서, 상기 단리된 세포는 T 세포이다.
본 개시내용은 또한 상기 키메라 헤테로이량체 TCRs, 또는 본원에 개시된 다른 조작된 TCRs, 또는 본원에 개시된 바와 같은 키메라 헤테로이량체 TCRs을 발현하는 벡터, 또는 본원에 개시된 키메라 헤테로이량체 TCRs을 코딩하는 핵산 또는 본원에 개시된 키메라 헤테로이량체 TCRs을 발현하도록 변형된 단리된 세포를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.
본 개시내용의 다른 양상은 TCR 베타 사슬 가변 영역, TCR 알파 사슬 가변 영역, 불변 영역 및 선택적으로 막횡단 도메인 및 세포질 신호전달 도메인을 포함하는 단일 사슬 TCR을 제공하고; 상기 TCR 베타 사슬 가변 영역 CDR3은 CASSLNRDYGYTF (서열번호: 2), CASSLNRDQPQHF (서열번호: 3) 및 CASRLAGQETQYF (서열번호: 4)로 구성된 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하고; 상기 단일 사슬 TCR은 NY-ESO-1/MHC 복합체에 대해 특이적이다. 상기 단일 사슬 TCR의 특정 구체예에서, 상기 TCR 베타 사슬 가변 영역은 서열번호: 9에 개시된 TCR 베타 사슬 가변 영역 아미노산 서열, 또는 상기에 적어도 85% 동일성을 갖는 그의 기능적 변이체를 포함하고; 및 상기 TCR 알파 사슬 가변 영역은 서열번호: 8에 개시된 바와 같은 동족 TCR 알파 사슬 가변 영역 아미노산 서열, 또는 상기에 적어도 85% 동일성을 갖는 그의 기능적 변이체를 포함한다.
특정 구체예에서, 상기 단일 사슬 TCR은 가용성 단일 사슬 TCR이다. 이와 관련하여, 상기 단일 사슬 TCR은 상기 막횡단 도메인 및 상기 세포질 신호전달 도메인을 포함하지 않는다.
본 발명의 또다른 양상은 본원에 개시된 바와 같은 단일 사슬 TCR을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 제공한다. 특정 구체예에서, 상기 핵산은 발현 벡터에 포함된다. 특정 구체예에서 상기 발현 벡터는 레트로바이러스 벡터, 가령 렌티바이러스 벡터이다. 본 개시내용은 또한 본원에 개시된 바와 같은 단일 사슬 TCR을 코딩하는 핵산 또는 벡터를 포함하는 단리된 세포를 제공한다. 특정 구체예에서, 상기 단리된 세포는 T 세포이다. 본 개시내용은 또한 본원에 개시된 단일 사슬 TCRs, 상기 단일 사슬 TCRs를 코딩 또는 달리 발현하는 벡터, 상기 단일 사슬 TCRs를 코딩하는 핵산, 및 또는 상기 단일 사슬 TCRs을 발현하는 단리된 세포를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 또다른 양상은, 치료적 조성물을 포유동물 피험체에게 투여하는 단계를 포함하는, 포유동물 피험체에서 NY-ESO-1 암을 치료하는 방법 또는 이의 증식을 저해하는 방법을 제공하고, 상기 조성물은 조작된 TCR, 가령 본원에 개시된 바와 같은 키메라 헤테로이량체 TCR 또는 단일 사슬 TCR을 발현하는 단리된 세포를 포함하고; 상기 치료적 조성물은 상기 피험체에서 상기 암을 치료하는데 유효한 양으로 투여된다.
본 개시내용의 또다른 양상은: (a) NY-ESO-1 암 요법으로부터 편익 (benefit)을 얻을 수 있는 포유동물 피험체를 식별하는 단계로서, (i) NY-ESO-1에 특이적인 TCR 베타 사슬 가변 영역 상보성 결정 영역 3 (VβCDR3)을 포함하는 TCR 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드로서, 상기 Vβ CDR3은 CASSLNRDXXXXF (서열번호: 1) 또는 CASRLAGQETQYF (서열번호: 4), 또는 둘 다의 아미노산 서열을 포함하는 것인 폴리뉴클레오티드; 또는 (ii) NY-ESO-1에 특이적인 VβCDR3을 포함하는 TCR 폴리펩티드로서, 상기 VβCDR3은 CASSLNRDXXXXF (서열번호: 1) 또는 CASRLAGQETQYF (서열번호: 4) 또는 둘 다의 아미노산 서열을 포함하는 TCR 폴리펩티드의 존재를 상기 포유동물 피험체로부터의 시료에서 결정하는 단계를 포함하고, 상기 (i) 및/또는 (ii)의 존재는 상기 피험체가 NY-ESO-1 암 요법으로부터 편익을 얻을 수 있다는 것을 나타내는 것인 단계; 및 (b) 상기 NY-ESO-1 암 요법을 상기 포유동물 피험체에게 투여하는 단계를 포함하는, 치료 방법을 제공한다. 상기 방법의 특정 구체예에서, 상기 VβCDR3은 CASSLNRDYGYTF (서열번호: 2), CASSLNRDQPQHF (서열번호: 3) 또는 CASRLAGQETQYF (서열번호: 4); 또는 상기 VβCDR3의 둘 이상의 조합으로 구성된 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다. 특정 구체예에서 상기 NY-ESO-1 암 요법은 NY-ESO-1 폴리펩티드를 코딩하는 벡터를 투여하는 단계를 포함한다. 특정 구체예에서, 상기 벡터는 레트로바이러스 벡터, 가령 렌티바이러스 벡터를 표적으로 하는 수지상 세포를 포함한다. 부가의 구체예에서 상기 방법은 아쥬반트 (adjuvant)를 상기 피험체에게 투여하는 단계를 더 포함한다. 이와 관련하여, 상기 아쥬반트는 글루코피라노실 리피드 A (glucopyranosyl lipid A: GLA)일 수 있다. 특정 구체예에서 상기 GLA는 안정한 수중유형 에멀젼에서 제제화 (formulated)되거나 또는 수성 제제 (formulation)로 존재할 수 있다. 특정 구체예에서, 상기 NY-ESO-1 암 요법은 GLA를 포함하는 조성물을 상기 피험체에게 투여하는 단계를 포함하고, 상기 조성물은:
(a) 하기 화학식의 GLA로서:
Figure pct00001
식 중에서:
R1, R3, R5 및 R6은 C11-C20 알킬이고; 및
R2 및 R4는 C12-C20 알킬인 것인 GLA; 및
(b) 약학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 포함하고;
상기 조성물은 항원을 포함하지 않는다. 특정 구체예에서, R1, R3, R5 및 R6은 운데실이고, 및 R2 및 R4는 트리데실이다. 본원의 방법은 포유동물, 구체적으로 인간 피험체의 치료를 위해 사용될 수 있다. 특정 구체예에서, 상기 GLA 조성물은 수성 제제이다. 다른 구체예에서, 상기 조성물은 수중유형 에멀젼, 유중수형 에멀젼, 리포좀, 미셀라 제제 (micellar formulation), 또는 미세입자 (microparticle)의 형태이다. 일 구체예에서, 상기 방법에 의해 치료될 암은 고형 종양을 포함한다. 이와 관련하여, 상기 암은 육종, 전립선암, 자궁암, 갑상샘암, 고환암, 신장암, 췌장암, 난소암, 식도암, 비-소-세포 폐암, 비-호지킨 (non-Hodgkin's) 림프종, 다발 골수종, 흑색종, 간세포 (hepatocellular) 암종, 두경부암, 위암, 자궁내막암 (endometrial cancer), 대장암 (colorectal cancer), 담관암종 (cholangiocarcinoma), 유방암, 방광암, 골수성 백혈병 및 급성 림프모구 백혈병으로 구성된 그룹으로부터 선택될 수 있다. 특정 구체예에서, 상기 조성물은 피하 (subcutaneous), 피내 (intradermal), 근육내 (intramuscular), 종양내 (intratumoral), 또는 정맥내 (intravenous) 주사에 의해 투여된다. 특정 구체예에서, 상기 조성물은 하나 이상의 추가의 치료제 또는 치료법과 함께 투여된다. 일 구체예에서 상기 치료제는 면역 체크포인트 저해제 (immune checkpoint inhibitor)이다. 다른 구체예에서 상기 치료제는 공자극 (costimulatory) 경로를 활성화시키는 항체, 가령 항-CD40 항체이다. 또다른 구체예에서, 상기 치료제는 암 치료제이고, 가령 암 치료제는 탁소텔 (taxotere), 카르보플라틴 (carboplatin), 트라스투주맙 (trastuzumab), 에피루비신 (epirubicin), 시클로포스파미드 (cyclophosphamide), 시스플라틴 (cisplatin), 도세탁셀 (docetaxel), 독소루비신 (doxorubicin), 에토포시드 (etoposide), 5-FU, 겜시타빈 (gemcitabine), 메토트렉세이트 (methotrexate), 및 파클리탁셀 (paclitaxel), 미톡산트론 (mitoxantrone), 에포틸론 (epothilone) B, 표피-성장 인자 수용체 (epidermal-growth factor receptor: EGFR)-표적 모노클로날 항체 7A7.27, 보리노스타트 (vorinostat), 로미뎁신 (romidepsin), 도코사헥사에노산, 보르테조밉 (bortezomib), 시코닌 (shikonin) 및 항암 바이러스 (oncolytic virus)로 구성된 그룹으로부터 선택된다. 또다른 구체예에서, 상기 하나 이상의 추가의 치료적 치료법은 방사선 요법이다.
본 개시내용의 또다른 양상은 NY-ESO-1 암 요법으로부터 편익을 얻을 수 있는 포유동물 피험체를 식별하는 방법을 제공하고, 상기 방법은: (a) 상기 포유동물 피험체로부터의 시료에서 (i) NY-ESO-1에 특이적인 VβCDR3을 포함하는 TCR 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드로서, 상기 VβCDR3은 CASSLNRDXXXXF (서열번호: 1) 또는 CASRLAGQETQYF (서열번호: 4)의 아미노산 서열을 포함하는 것인 폴리뉴클레오티드; 또는 (ii) NY-ESO-1에 특이적인 VβCDR3을 포함하는 TCR 폴리펩티드로서, 상기 VβCDR3은 CASSLNRDXXXXF (서열번호: 1) 또는 CASRLAGQETQYF (서열번호: 4)의 아미노산 서열을 포함하는 것인 TCR 폴리펩티드의 존재를 결정하는 단계를 포함하고, 상기 (i) 및/또는 (ii)의 존재는 상기 피험체가 NY-ESO-1 암 요법으로부터 편익을 얻을 수 있다는 것을 나타낸다. 상기 방법의 특정 구체예에서, 상기 VβCDR3은 CASSLNRDYGYTF (서열번호: 2), CASSLNRDQPQHF (서열번호: 3) 및 CASRLAGQETQYF (서열번호: 4); 또는 상기 VβCDR3의 둘 이상의 조합으로 구성된 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 부가의 양상은 MHC 복합체와 관련하여 세포 또는 조직 상에 제시되는 NY-ESO-1 펩티드 항원을 포함하는 세포 또는 조직을 검출하는 방법을 제공하고, 상기 방법은: a) 상기 제시된 NY-ESO-1 펩티드 항원과 본원에 개시된 바와 같은 적어도 하나의 가용성 TCR 분자 또는 그의 기능적 단편 사이에 특정 결합 복합체를 형성하는 조건하에 상기 적어도 하나의 가용성 TCR 분자 또는 그의 기능적 단편을 상기 세포 또는 조직과 접촉시키는 단계, b) 상기 제시된 펩티드 항원에 결합되지 않은 임의의 가용성 TCR 분자 또는 단편을 제거하기에 적합한 조건하에 상기 세포 또는 조직을 세척하는 단계; 및 c) 상기 제시된 펩티드 항원을 포함하는 세포 또는 조직을 나타내는 것으로 상기 특정 결합 복합체를 검출하는 단계를 포함한다.
도 1: LV305에 의한 치료로 폴리클로날 (polyclonal) NY-ESO-1 특이적 T 세포 반응의 증가된 친화도를 유도한다. Tx-전 (pre-Tx) 및 Tx-후 (post-Tx) 백혈구성분채집술 (leukapheresis) 시료로부터의 냉동보존된 (cryopreserved) PBMC가 해동되었고, ELISPOT 분석을 설정하기 위해 사용되었다. 200,000개의 세포가 ELISPOT 플레이트의 각 웰에 넣었다. 세포는 다른 농도의 NY-ESO-1 펩티드 믹스로 처리되었고, 이는 11개의 아미노산에 의해 중첩된 (overlapping) 15mer 펩티드의 43개를 포함하였다. 테스트된 펩티드의 농도는 2.5 ug/mL (1670 nM), 0.5 ug/mL (334nM), 0.1 ug/mL (60nM), 및 0.02 ug/mL (12nM)이었다. 세포는 상기 펩티드 또는 대조군 치료 배지와 40시간 동안 인큐베이트되었다. C.T.L Technologies로부터의 자동 스팟 카운터 (automated spot counter)를 사용하여 스팟이 카운터되었다. 데이터 기호는 상기 각 테스트된 농도에서 Tx-전 시료 (흰색 원) 또는 Tx-후 시료 (검정색 사각형)에서 PBMC 당 백만의 스팟-형성 유닛 (spot-forming units: SFU)의 평균 수를 나타낸다. 오차 바 (error bar)는 각 치료 조건에서 표준 편차를 나타낸다.
도 2: 종양 항원-특이적 TCR 서열은 Tx-전 PBMC와 비교하여 Tx-후 PBMC에서 풍부했다. 본 연구에서, 상기 PBMC는 LV305 치료 이전 및 LV305에 의한 3회의 백신화 후에 상기 환자로부터 수집되었다. 치료-전 종양 시료가 또한 상기 환자로부터 수집되었다. 상기 PBMC 및 종양 시료는 상기 T 세포 수용체 (TCR) 베타 사슬의 DNA 추출 및 후속한 시퀀싱 분석에 적용되었다. Tx-전과 Tx-후 PBMC 사이의 서열 유사성이 산점도 (scatter plot)를 사용하여 분석되었고, 상기 종양 시료로부터 수득된 TCR 서열은 유사성에 대해 환자의 Tx-전 및 Tx-후 PBMC와 비교되었다. 상기 결과에서 종양 항원을 인식하는 종양 침윤 림프구를 포함하는 종양 시료로부터의 TCR 서열은 Tx-전 PBMC와 비교하여 환자의 Tx-후 PBMC에서 풍부한 것을 보여주었다.
도 3: NY-ESO-1 특이적 T가 매우 풍부한, 인 비트로 배양물 (in vitro culture: IVS)을 통한 Tx-후 PBMC로부터의 올리고클로날 (oligoclonal) 배양물의 확립. PBMC가 환자 Pt151006으로부터 LV305에 의한 3회의 백신화 후에 수집되었다. 상기 PBMC는, IL-2 및 IL-7 (10 ng/mL)의 존재하에 NY-ESO-1 중첩 펩티드 (0.5 ug/mL, JPT Technologies, Berlin, Germany)를 갖는 OpTmizer T 세포 증식 배지 (expansion medium) (Invitrogen, Carlsbad, CA)에서 배양되었다. 반복된 자극 후에, 상기 PBMC 배양물이 ELSIPOT 분석에 의해 측정되는 바와 같이 NY-ESO-1 특이적 T 세포가 매우 풍부했다. (A) NY-ESO-1 펩티드 풀 (pool)로 자극시에 올리고클로날 T 세포의 IFN-γ의 분비를 보여주는 대표적인 ELISPOT. 상기 세포 (10K/웰)는 항-IFNγ 캡쳐 항체 (capture antibody) (MabTech)로 사전-코팅된 ELISPOT 플레이트에 삼중 (triplicate)으로 플레이트되었다. 상기 세포는 NY-ESO-1 펩티드 풀 (2.5 ug/mL) 또는 대조군 배지 (Ag 없음)로 처리되었고, CO2 인큐베이터에서 40시간 동안 인큐베이트되었다. 상기 세포가 그후 세척되었고, 상기 플레이트는 HRP-콘쥬게이트된 2차 항체와 2시간 동안 TMB 기질이 첨가되기 전에 인큐베이트되었다. 웰 당 스팟 형성 유닛 (SFU)의 수가 자동 플레이트 리더 (automated plate reader)에 의해 카운트되었다. Ag 없음 처리를 한 3개의 웰 (상단 열) 및 NY-ESO-1 처리를 한 3개의 웰 (하단 열)의 이미지가 개시되었다. (B) Ag 없음 대조군 및 NY-ESO-1 펩티드 믹스-처리된 웰에서 웰당 SFU의 수를 나타내는 요약 그래프. 상기 막대는 각 그룹의 평균 ± SEM을 나타낸다. (C) TCRβ 딥 (deep) 시퀀싱 분석에 의해 결정되는 바와 같이 상기 올리고클로날 배양물로부터 상위 클론을 보여줌. 각 막대는 독특한 TCRβ CDR3 서열을 갖는 하나의 클론을 나타낸다. y-축은 상기 올리고클로날 배양물로부터 모든 서열 판독 중 각 클론의 상대 빈도 (백분율)를 나타낸다. 상위 6개의 클론은 모든 TCRs의 90% 초과를 차지하며, 이는 상기 배양물은 고도의 올리고클로날임을 나타낸다.
도 4: 상기 올리고클로날 배양물에서 몇 개의 고-빈도 TCRβ CDR3 서열이 Tx-전 PBMC와 비교하여 Tx-후 PBMC에서 풍부하였다. NY-ESO-1 특이적 올리고클로날 배양물이 유래된, 동일한 환자의 Tx-전 PBMC (x-축) 대 Tx-후 PBMC (y-축)에서 TCR 서열을 비교하는 로그-스케일 (log-scaled)의 산점도가 개시되었다. 상기 올리고클로날 배양물로부터의 서열이 상기 PBMC 서열 상에 중첩되었다. 상기 y-축을 향한 중첩 시퀀싱의 편향이 있었고, 이는 LV305가 NY-ESO-1 특이적 T-세포 반응을 유도한다는 표시로서, 상기 NY-ESO-1 특이적 서열이 Tx-전 PBMC보다 Tx-후 PBMC에서 더 빈번하게 발견되는 것을 나타내었다.
도 5: PT151006 IVS3에서 20.5%의 빈도를 갖는 TCRβ CDR3 클론이 PT151016 Tx-후 PBMC에서 검출될 수 있다. PT151006 IVS3으로부터의 상기 올리고클로날 배양물의 TCR 서열 (y-축)을 제2 환자인 PT151016으로부터의 Tx-후 PBMC에서 검출된 TCR 서열과 비교하는 로그-스케일의 산점도가 개시되었다. IVS3에서 높은 빈도를 갖는 2개의 클론이 PT151016으로부터의 Tx-후 시료에서 또한 검출가능하다. 상기 산점도내 박스는 TCRβ의 CDR3 영역의 아미노산 서열 및 PT151016 Tx-후 PBMC에서 빈도 백분율 (0.000298) 및 IVS3에서 빈도 백분율 (20.5)을 나타내었다. 유사한 분석에서 상기 서열은 PT151016으로부터의 Tx-전 PBMC에서 검출가능하지 않음을 보여주었다.
도 6: PT151006 IVS3에서 8.5%의 빈도를 갖는 TCRβ CDR3 클론이 PT151016 Tx-후 PBMC에서 검출될 수 있다. PT151006 IVS3으로부터의 상기 올리고클로날 배양물의 TCR 서열 (y-축)을 제2 환자인 PT151016으로부터의 Tx-후 PBMC의 서열과 비교하는 로그-스케일의 산점도가 개시되었다. IVS3에서 높은 빈도를 갖는 2개의 클론이 또한 PT151016으로부터의 Tx-후 시료에서 검출가능하다. 상기 산점도내 박스는 TCRβ의 CDR3 영역의 아미노산 서열 및 PT151016 Tx-후 PBMC에서 빈도 백분율 (0.000642) 및 IVS3에서 빈도 백분율 (8.52)을 나타내었다. 유사한 분석에서 상기 서열은 PT151016으로부터의 Tx-전 PBMC에서 검출가능하지 않음을 보여주었다.
도 7: PT151006 IVS3에서 26.2%의 빈도를 갖는 TCRβ CDR3 클론이 PT151014 Tx-후 PBMC에서 검출될 수 있다. PT151006 IVS3으로부터의 상기 올리고클로날 배양물의 TCR 서열 (y-축)을 PT151014로부터의 Tx-후 PBMC의 서열과 비교하는 로그-스케일 산점도가 개시되었다. IVS3에서 높은 빈도 (26.2%)를 갖는 클론은 또한 PT151014로부터의 Tx-후 시료에서 검출가능하다. 상기 산점도내 박스는 TCRβ의 CDR3 영역의 아미노산 서열 및 PT151014 Tx-후 PBMC에서 빈도 백분율 (0.00076) 및 IVS3에서 빈도 백분율 (26.2)을 나타내었다. 유사한 분석에서 상기 서열은 PT151014로부터의 Tx-전 PBMC에서 검출가능하지 않음을 보여주었다.
도 8: 8명의 육종 환자로부터의 Tx-전 및 Tx-후 PBMC에서 3개의 공유 TCRβ CDR3 서열의 빈도. 본 막대 그래프는 8명의 테스트된 환자 각각으로부터 Tx-전 (빗금친 막대) 및 Tx-후 (검정색 막대) PBMC에서 공유 TCR의 빈도를 나타내었다. 모든 환자는 LV305 치료를 받았다. 관련 TCRβ CDR3의 아미노산 서열이 각 그래프의 상단에 포함되었다. 또한 표 1-3을 참조한다.
도 9: 환자들간에 공유된 공유 TCRs은 각 개체에서 다른 뉴클레오티드 서열을 갖는다. 3명의 환자로부터의 3개의 공유 TCR에 대한 뉴클레오티드 서열 및 아미노산 서열이 개시되었다. 상기 서열이 아미노산 수준에서 동일하더라도 다른 환자들 사이의 뉴클레오티드 수준에서 완전한 상동성은 없었다. 이는 공유 TCR의 생성을 위해 제안되어졌던 수렴 재조합의 개념과 일치한다 (Venturi et al., Nat Rev Immunol., 2008).
도 10: 공유 TCRβ CDR3 서열은 VJD 접합 영역에서 더 짧은 길이 및 더 적은 비-주형화된 (nontemplated) 뉴클레오티드 부가를 갖는다. (a) Pt151006으로부터 올리고클로날 NY-ESO-1 특이적 T-세포 인 비트로 배양물인 IVS3에서 TCRβ CDR3 길이 분포 (검정색 막대), 및 동일한 환자로부터 Tx-후 PBMC에서 TCRβ CDR3 길이 분포 (빗금친 막대)가 개시되었다. (b) 3개의 공유 TCRs의 CDR3의 뉴클레오티드 서열 (CDR3 코딩 서열에 밑줄) 및 아미노산 서열. 상기 접합 영역에서 결실 및 부가의 수가 또한 각 TCR에 대해 열거되었다. 모두 3개의 공유 TCR은 동일한 CDR3 뉴클레오티드 길이 (n=39)를 갖는다. 상기 TCRs은 또한 접합 영역에서 상대적으로 적은 비-주형화된 뉴클레오티드 부가를 갖는다. 본 발명자들이 식별한 공유 TCRs 중 하나인 CASRLAGQETQYF (서열번호: 4)는 N1 (VD)이나 N2 (DJ) 삽입 부위에서 뉴클레오티드 부가를 갖지 않았다. 더 짧은 CDR3 길이 및 제한된 nt 부가는 상기 TCRs이 공유 TCRs이라는 결론을 뒷받침한다.
도 11: 식별된 공유 TCR CDR3 CASRLAGQETQYF (서열번호: 4) 중 하나에 대한 전장 TCRα (서열번호: 8) 및 TCRβ (서열번호: 9) 가변 영역의 서열. 상기 CDR3 서열은 IVS3에서 26.2% 빈도를 가지며, 표 3에서 열거된 바와 같이, PT151014와 PT151050에서 또한 공유되었다. 개시된 주석은 IMGT 데이터베이스 (The international ImMunoGeneTics information system; internet address at IMGT (dot) org)로부터 이용가능한 표준 주석이다. 상기 TCRα 서열의 BLAST 서치는 공지된 NY-ESO-1 특이적 TCRα 서열과의 상동성을 나타낸다.
도 12: 다른 암 환자들로부터 식별된 공유 TCRβ CDR3s을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열의 정렬은 동일한 CDR3 아미노산 서열을 코딩하는 다른 환자들로부터 다른 핵산 서열을 보였주었다. 상기 뉴클레오티드 서열의 서열번호는 하기와 같다: 제1 공유 TCRβ CDR3 - PT006: 서열번호: 5; PT016: 서열번호: 10; PT050: 서열번호: 11; 제2 공유 TCRβ CDR3 - PT 006: 서열번호: 6; PT 016: 서열번호: 12; PT 050; 서열번호: 13; 제3 공유 TCRβ CDR3 - PT 006: 서열번호: 7; PT 016: 서열번호: 14; PT 050: 서열번호: 15. (또한 도 9 참조)
도 13은 암 환자로부터 PBMCs로부터 증식된 NY-ESO-1 증식된 T 세포 배양물 (IVS3)로부터 식별된 TCRβ 사슬의 아미노산 서열 (서열번호: 16)을 나타내었다. 상기 서열은 실시예 11에 개시된 바와 같이 단리되었다.
도 14: MCC 환자 G2는 NY-ESO-1을 발현하고, 상기 발현 수준은 G100으로 치료 후에 감소한다. 종양 생검은 종양내 G100 치료 전 기준선 (baseline)에서 및 G100으로 치료하고 4주 후에 채취되었다. RNA가 즉석 동결된 생검 조직으로부터 추출되었고, 200ng의 RNA가 human panCancer Immune Profiling 키트를 사용하여 유전자 발현 분석을 나노스트링 (nanostring)하는데 사용되었다. 암 고환 항원인 NY-ESO-1을 코딩하는 CTAG1B 유전자의 발현이 개시되었다. Y-축은 결합 밀도를 나타내고, 이는 상기 유전자의 발현 수준을 반영하였다. 상기 발현 수준은 기준선과 비교하여 G100-후 시료에서 더 낮았다.
도 15: 공유 TCRs을 갖는 T 세포는 MCC 환자 G2의 림프절 생검에서 G100으로의 치료 후에 검출가능하다. 종양 생검은 종양내 G100 치료 전 기준선에서 및 G100으로 치료하고 4주 후에 채취되었다. DNA가 즉석 동결된 생검 조직으로부터 추출되었고, 상기 TCR 베타 사슬의 CDR3 영역의 딥 시퀀싱 분석에 사용되었다. 환자 G2로부터의 종양 생검과, LV305 시험에서 환자 151006으로부터 수득된 올리고클로날, NY-ESO-1 자극된 T-세포 배양물로부터 단리된 TCR 사이의 서열 중첩들을 나타내는 2개의 산점도가 개시되었다. 그래프 (a)는 G100-전 시료 (X-축)와 LV305 환자 151006으로부터의 NY-ESO-1 특이적 TCRs (Y-축) 사이의 상관관계를 나타내었다. 그래프 (b)는 G100-후 시료 (X-축)와 LV305 환자 151006으로부터의 NY-ESO-1 특이적 TCRs (Y-축) 사이의 상관관계를 나타내었다. MCC에서 G100-전 림프절 생검에서 검출가능하지 않은 2개의 공유 CDR3 서열이 G100 치료 후에 배액 림프절 (draining lymph node)의 생검에서 검출가능했다.
도 16. 3개의 공유 TCRβ CDR3 서열이 항-CTLA4 임상 시험으로부터 환자에서 검출되었다. 상기 항-CTLA4 시험에서 21명의 환자에서 3개의 공유 CDR3 아미노산 서열의 빈도가 개시되었다. X 축의 수는 환자의 수를 나타내었다. 각 수와 관련된 2개의 막대가 있다. 좌측의 막대는 Tx-전 PBMC에서 빈도를 나타내었다. 우측의 막대는 Tx-후 PBMC에서 빈도를 나타내었다.
도 17. 환자 151006 및 환자 151119는 동일한 CDR3 서열인, CASSLNRDQPQHF (서열번호: 3)에 대해 다른 TCRβ V-유전자를 사용한다. 대부분의 TCRβ는 V07-07 유전자를 사용한다. 그러나, 적은 비율의 TCRβ 수용체는 V07-08, V07-06, V07-09, V07-02, V07-03, V07-04, 또는 V11-02를 사용한다. 환자 151119에서, 상기 TCR CDR3에 대해 V07-08 만이 사용되었다. 두 환자들은 동일한 TCRβ J-유전자인, J01-05를 사용하였다.
도 18: 본 도면은 공유 TCRβ CDR3 중 하나인 CASSLNRDQPQHF (서열번호: 3)가 환자 PT151006에서 적어도 3개의 다른 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 것을 개시하였다. 상기 폴리뉴클레오티드 서열이 서열번호에 제공되었다.
도 19. 다른 임상 시험으로부터의 환자는 동일한 CDR3 아미노산 서열에 대해 다른 뉴클레오티드 서열 및 다른 TCRβ V-유전자 사용을 갖는다. 제1 공유 TCR인, CASSLNRDYGYTF (서열번호: 2)에 있어서, PT151006 (LV305 시험으로부터) 및 C131-001 (C131 시험으로부터) 및 환자 G2-C1W4B (G100-MCC 시험으로부터)는 TCRβ V07-08, TCRβ V02-01, 및 TCRβ V28-01을 각각 사용한다. 제2 공유 TCR인, CASSLNRDQPQHF (서열번호: 3)에 있어서, PT151006은 TCRβ V07-07을 사용한다. 환자 131-013은 3개의 다른 TCRβ V, V05-08, V13-01, 및 V05-05를 사용한다. 제3 공유 TCR인, CASRLAGQETQYF (서열번호: 4)에 있어서, PT151006, C131-001, 및 G2-C1W4B는 TCRβ V28-01, TCRβ V06-06, 및 TCRβ V25-01을 각각 사용한다.
도 20. PT151006 (IVS3)으로부터의 NY-ESO-1 특이적 T 세포 배양물은 CD4 T 세포이다. 정상 공여체로부터의 PBMC (상단 열)와 IVS3 세포 배양물 (하단 열)의 염색을 나란히 개시하였다. 상기 세포는 항-CD3-퍼시픽 블루 (pacific blue: PB), 항-CD4-FITC, 항-CD8-PerCP, 및 항-CD56-APC로 염색되었다. BD LSRII 유세포분석기 (flow cytometer)에서 시료가 획득되었다. 데이터 분석은 FlowJo 소프트웨어를 사용하여 수행되었다. 상기 림프구 개체군은 먼저 FSC/SSC 플롯에 게이트되었고 (gated), 그 후 CD4 T 세포가 CD3+CD4+ 림프구로서 게이트되었고, CD8 T 세포가 CD3+CD8+ 림프구로서 게이트되었다. NK 세포가 CD3-CD56+ 림프구로서 게이트되었다. 대조군 공여체 PBMC는, 건강한 공여체 PBMC에서 정상적으로 관찰되는 바와 같이, CD4, CD8 T 세포 및 NK 세포의 예상된 백분율을 갖는다 (상단 열). 대조적으로, PT151006-IVS3으로부터 배양된 세포는 NK 세포 및 CD8 T 세포가 결여되었고, CD4 T 세포만을 포함한다 (하단 열).
서열 식별번호의 간단한 설명
서열번호: 1은 공유 TCR CDR3 컨센서스 서열 (consensus sequence) CASSLNRDXXXXF의 아미노산 서열이다.
서열번호: 2는 제1 공유 TCR CDR3 CASSLNRDYGYTF의 아미노산 서열이다.
서열번호: 3은 제2 공유 TCR CDR3 CASSLNRDQPQHF의 아미노산 서열이다.
서열번호: 4는 제3 공유 TCR CDR3 CASRLAGQETQYF의 아미노산 서열이다.
서열번호: 5는 서열번호: 2에 개시된 CDR3 아미노산 서열을 포함하는 TCR V 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열이다.
서열번호: 6은 서열번호: 3에 개시된 CDR3 아미노산 서열을 포함하는 TCR V 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열이다.
서열번호: 7은 서열번호: 4에 개시된 CDR3 아미노산 서열을 포함하는 TCR V 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열이다.
서열번호: 8은 도 11에 개시된 바와 같이 공유 TCR의 알파 사슬의 아미노산 서열이다.
서열번호: 9는 도 11에 개시된 바와 같이 공유 TCR의 베타 사슬 가변 영역의 아미노산 서열이다. 상기 공유 TCR은 서열번호: 4에 개시된 바와 같은 V β CDR3 서열을 갖는다.
서열번호: 10은 서열번호: 2에 개시된 CDR3 아미노산 서열을 포함하는 TCR V 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열이다 (도 9 참조).
서열번호: 11은 서열번호: 2에 개시된 CDR3 아미노산 서열을 포함하는 TCR V 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열이다 (도 9 참조).
서열번호: 12는 서열번호: 3에 개시된 CDR3 아미노산 서열을 포함하는 TCR V 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열이다 (도 9 참조).
서열번호: 13은 서열번호: 3에 개시된 CDR3 아미노산 서열을 포함하는 TCR V 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열이다 (도 9 참조).
서열번호: 14는 서열번호: 4에 개시된 CDR3 아미노산 서열을 포함하는 TCR V 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열이다 (도 9 참조).
서열번호: 15는 서열번호: 4에 개시된 CDR3 아미노산 서열을 포함하는 TCR V 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열이다 (도 9 참조).
서열번호: 16은 실시예 11에 개시된 바와 같이 암 환자로부터 PBMCs로부터 증식된 NY-ESO-1 증식된 T 세포 배양물 (IVS3)로부터 식별된 TCRβ 사슬의 아미노산 서열이다. 상기 서열이 도 13에 개시되었고, IMGT 데이터베이스 웹사이트에 개시된 방법에 따라 주석을 달았다.
서열번호: 17-23은 도 19에 개시된 바와 같이 환자들 C131-001, G2-C1WB4, C131-013으로부터의 공유 TCRβ CDR3 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열이다.
서열번호: 24-26은 도 18에 개시된 바와 같이 공유 TCRβ CDR3 서열 CASSLNRDQPQHF (서열번호: 3)를 모두 코딩하는 PT151006으로부터의 뉴클레오티드 서열이다.
본 개시내용은 다른 MHC 클래스 I 하플로타입 (haplotypes)을 갖는 암 환자들 사이에서 공유되는 공유 NY-ESO-1 특이적 TCR 아미노산 서열들의 패널 (panel)의 발견에 일부 기반한다. 본원에서 사용되는 바와 같이 용어 "공유 TCR (public TCR)"은, 다수의 개체들 사이에서 공유되는, TCR 서열, 구체적으로 TCRβ 사슬 가변 영역 CDR3 (VβCDR3) 아미노산 서열을 나타낸다 (Venturi et al., Nat Rev Immunol. 2008; 8(3):231-238). 실시예에서 입증되는 바와 같이, 식별된 공유 TCRs의 빈도는 NY-ESO-1 특이적 치료적 면역화에 의한 치료 후 뿐만 아니라 합성 TLR4 작용제인 G100으로 치료한 후에 증가되었다.
조작된 TCR
상기 αβ TCR은 불변 CD3 사슬 분자와의 복합체의 일부로서 발현되는 고도의 가변 알파 (α) 및 베타 (β) 사슬을 포함하는 막-고착된 (membrane-anchored) 헤테로이량체 단백질이다. Janeway CA Jr, Travers P, Walport M et al. (2001). Immunobiology: The Immune System in Health and Disease. 5th edition . Glossary: Garland Science. 상기 T 세포 수용체의 각 사슬은 2개의 세포외 도메인인: 가변 (V) 영역 및 불변 (C) 영역으로 구성된다. 상기 불변 영역은 상기 세포 막에 근접하고, 막횡단 영역 및 짧은 세포질 테일 (cytoplasmic tail)이 뒤따르고, 상기 가변 영역은 상기 펩티드/MHC 복합체에 결합한다. 상기 TCR α-사슬 및 β-사슬 각각의 가변 도메인은 3개의 초가변 (hypervariable) 또는 상보성 결정 영역 (CDRs)을 가지며, 상기 β-사슬의 가변 영역은 항원과 정상적으로 접촉하지 않는 부가의 초가변성 영역 (HV4)을 가지므로, CDR로 간주되지 않는다. 상기 TCR은 결합된 막이지만, 그러나 그의 짧은 세포질 테일로 인해 신호 전달 자체를 매개할 수 없어서, 상기 TCR은 신호 전달을 수행하기 위해 CD3 및 제타 (zeta)를 필요로 한다.
본 발명은 NY-ESO-1/MHC 복합체에 대해 특이적인 조작된 T 세포 수용체 및 본원에 개시된 조작된 T 세포 수용체를 발현하는 단리된 세포를 제공한다. 본원에 개시된 특정 구체예에서, 상기 조작된 TCR은 서열번호: 8 및 9에 각각 제공되는 바와 같은 알파 사슬 가변 영역 및 베타 사슬 가변 영역을 포함한다. 본원에 개시된 다른 구체예에서, 상기 조작된 TCR은 서열번호: 9에 제공된 바와 같은 베타 사슬 가변 영역 및 MHC와 관련하여 NYESO1 에피토프를 인식하는 기능적 TCR을 알파/베타 쌍이 형성하는 알파 사슬 쌍을 포함한다. 특정 구체예에서, 본원에 개시된 조작된 TCRs의 VβCDR3은 CASSLNRDXXXXF를 포함하는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 X는 임의의 아미노산이다 (서열번호: 1). 일부 구체예에서, 상기 VβCDR3은 CASSLNRDYGYTF (서열번호: 2) 및 CASSLNRDQPQHF (서열번호: 3)로 구성된 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하고, 각각은 서열번호: 1의 컨센서스 서열에 속하는 서열의 예이다. 또다른 구체예에서, 상기 VβCDR3은 서열번호: 4에 개시된 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 일 양상에서, 상기 조작된 TCR은 헤테로이량체 TCR이다. 헤테로이량체 TCR은 적어도 하나의 디술피드 결합에 의해 연결된 2개의 폴리펩티드를 포함한다. 상기 헤테로이량체 TCR에서 하나의 폴리펩티드는 알파 사슬 가변 영역 및 알파 사슬 불변 영역을 포함한다. 일 구체예에서, 상기 알파 사슬 폴리펩티드는 선택적으로 막횡단 도메인을 포함한다. 특정 구체예에서, 상기 알파 사슬 폴리펩티드는 선택적으로 막횡단 도메인 및 세포질 도메인 (예컨대, 세포내 신호전달 도메인 가령 CD3 제타 사슬 신호전달 도메인 및 선택적으로 공자극 도메인)을 포함한다. 상기 헤테로이량체 TCR에서 제2 폴리펩티드는 베타 사슬 가변 영역 및 베타 사슬 불변 영역, 및 선택적으로 막횡단 도메인을 포함한다. 상기 헤테로이량체 TCR의 특정 구체예에서, 상기 제2 폴리펩티드는 베타 사슬 가변 영역 및 베타 사슬 불변 영역 및 선택적으로 막횡단 도메인 및 세포질 도메인 (예컨대, 세포내 신호전달 도메인 및 선택적으로 공자극 도메인)을 포함한다. 상기 헤테로이량체 TCR의 제1 및 제2 폴리펩티드가 상기 막횡단 도메인 및 상기 세포질 도메인 (예컨대, 세포내 신호전달 도메인)을 포함하지 않는 구체예에서, 상기 헤테로이량체 TCR은 가용성 헤테로이량체이다. 일 구체예에서, 상기 헤테로이량체 TCR은 발현을 안정화시키고, 숙주 세포에 존재할 수 있는 네이티브 TCR과의 상호작용을 최소화하기 위한 하나 이상의 변형을 포함할 수 있다. 특정 구체예에서, 상기 헤테로이량체 TCR은 키메라 헤테로이량체 TCR이다.
본 발명의 일 양상에서, 상기 조작된 T 세포 수용체는 키메라 T 세포 수용체 (TCR)이다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "키메라"는 다른 기원의 일부로 구성된 분자, 예컨대, TCR을 나타낸다. 상기 키메라 분자를 포함하는 일부가 자연 발생될 수 있을지라고, 키메라 분자는 전체적으로 자연발생하지 않는, 예컨대 합성 또는 재조합이다.
일부 구체예에서, 본원에 개시된 조작된 TCR은 키메라 헤테로이량체 TCR이다. 키메라 헤테로이량체 TCR은 적어도 하나의 디술피드 결합에 의해 연결되는 2개의 폴리펩티드를 포함한다. 상기 헤테로이량체 TCR에서 하나의 폴리펩티드는 알파 사슬 가변 영역 및 알파 사슬 불변 영역을 포함한다. 상기 알파 사슬 폴리펩티드는 선택적으로 막횡단 도메인, 또는 선택적으로 막횡단 도메인 및 세포질 도메인 (예컨대, 공자극 도메인을 갖거나 또는 갖지 않는, 세포내 신호전달 도메인 가령 CD3 제타 사슬 신호전달 도메인)을 포함한다. 상기 키메라 헤테로이량체 TCR에서 제2 폴리펩티드는 베타 사슬 가변 영역 및 베타 사슬 불변 영역, 및 선택적으로 막횡단 도메인, 또는 선택적으로 막횡단 도메인 및 세포질 도메인 (예컨대, 공자극 도메인을 갖거나 또는 갖지 않는 세포내 신호전달 도메인)을 포함한다. 상기 키메라 헤테로이량체 TCR의 제1 및 제2 폴리펩티드가 상기 막횡단 도메인 및 상기 세포질 도메인을 포함하지 않는 구체예에서, 상기 키메라 헤테로이량체 TCR은 가용성 키메라 헤테로이량체이다.
TCRs의 폴리펩티드 사슬이 당 분야에 알려져 있다.
본원에 개시된 조작된 TCRs은, 일반적으로 베타 사슬 가변 영역의 적어도 일부 및 알파 사슬 가변 영역의 적어도 일부로 이루어진 항원 결합 도메인을 포함하고, 상기 항원 결합 도메인은 NY-ESO-1/MHC에 특이적이거나 또는 이에 특이적으로 결합한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "특이적으로 결합 (specifically binds)"은 MHC와 관련하여 특정 항원을 인식하는 상기 TCR의 능력을 나타내지만, 시료에서 무관한 항원/MHC를 실질적으로 인식하거나 또는 결합하지 않는다. 일부 예에서, 상기 용어 "특이적 결합 (specific binding)" 또는 "특이적으로 결합하는 (specifically binding)"은 제2 화학종과 단백질, 또는 펩티드의 상호작용과 관련하여 사용될 수 있고, 상기 상호작용은 상기 화학종에서 특정 구조 (예컨대, 항원성 결정인자 또는 에피토프)의 존재에 의존하는 것을 의미하며; 예를 들면, 항체는 일반적으로 단백질보다는 특정 단백질 구조를 인식하고, 이에 결합한다. 항체가 에피토프 "A"에 특이적이라면, 에피토프 A를 포함하는 분자의 존재 (또는 유리, 표지되지 않은 A)는, 표지된 "A" 및 항체를 포함하는 반응에서, 상기 항체에 결합된 표지된 A의 양을 감소시킬 것이다.
단일 사슬 TCRs (예컨대, US20100113300 참조)이 또한 고려된다. 간단하게 말하자면, 단일 사슬 ("sc-") TCR 분자는 적합한 펩티드 링커 (linker) 서열을 통해 공유적으로 연결된 알파 사슬 가변 영역 (Vα) 및 베타 사슬 가변 영역 (Vβ)을 포함한다. 예를 들면, Vα의 C-말단 및 Vβ의 N-말단에 융합되는 적합한 펩티드 링커 서열을 통해, 상기 Vα는 상기 Vβ에 공유적으로 연결될 수 있다. 본 발명의 scTCR은 구조 Vα - L- Vβ를 가질 수 있거나 또는 다른 배향으로, 예컨대 Vβ - L- Vα로 존재할 수 있다. 특정 구체예에서, 상기 scTCR은 불변 도메인 (또한 불변 영역이라 함)을 더 포함한다. 부가의 구체예에서, 상기 scTCR은 불변 도메인, 막횡단 도메인 및 세포질 도메인을 더 포함한다. 일 구체예에서, 상기 세포질 도메인은, 공자극 도메인을 갖거나 또는 갖지 않는, 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 상기 sc-TCR 융합 단백질의 Vα 및 Vβ는 일반적으로 약 200 내지 400개의 아미노산 길이, 또는 약 300 내지 350개의 아미노산 길이이고, 자연-발생하는 TCR의 Vα 및 Vβ, 가령 NY-ESO-1/MHC 복합체에 특이적인 본원에 제공된 Vα 및 Vβ 아미노산 서열과 적어도 90%의 동일성, 및 바람직하게 100%의 동일성을 가질 것이다. 용어 "동일한 (identical)"은 상기 Vα 또는 Vβ의 아미노산이 대응하는 자연-발생하는 TCR Vβ 또는 Vα에 100% 동일한 것을 의미한다.
일부 구체예에서, 본원에 개시된 조작된 TCR은 세포내 신호전달 도메인 (예컨대, CD3 제타 사슬 신호전달 도메인)을 포함한다. 상기 세포질 신호전달 도메인이라고도 하는, 본원에 개시된 조작된 TCR 중 세포내 신호전달 도메인은 상기 조작된 TCR을 발현하는 면역 세포의 정상 이펙터 기능들 중 적어도 하나의 활성화를 담당한다. 용어 "이펙터 기능 (effector function)"은 세포의 전문화된 기능을 나타낸다. T 세포의 이펙터 기능은, 예를 들면, 시토킨의 분비를 포함하는 세포용해 (cytolytic) 활성 또는 헬퍼 (helper) 활성일 수 있다. 그러므로, 용어 "세포내 신호전달 도메인" 또는 "세포질 신호전달 도메인"은 상기 이펙터 기능 신호를 전달하고, 상기 세포가 전문화된 기능을 수행하도록 하는 단백질의 일부를 나타낸다. 대개 상기 전체 세포내 신호전달 도메인이 사용될 수 있고, 많은 경우에 전체 신호전달 도메인을 사용할 필요는 없다. 상기 세포내 신호전달 도메인의 절단된 (truncated) 부분이 사용되는 정도까지, 이러한 절단된 부분이 상기 이펙터 기능 신호를 전달하는 한 온전한 전장 길이의 신호전달 도메인 대신에 사용될 수 있다. 용어 세포내 신호전달 도메인은 그러므로 상기 이펙터 기능 신호를 전달하는데 충분한 세포내 신호전달 도메인의 임의의 절단된 부분을 포함하는 것을 의미한다.
본원에 개시된 조작된 TCRs에 사용하기 위한 세포내 신호전달 도메인의 예는 T 세포 수용체 (TCR) 및 항원 수용체 결합 후에 신호 전달을 개시하기 위해 협력하여 작용하는 보조-수용체 (co-receptors)의 세포질 서열 뿐만 아니라 동일한 기능적 능력을 갖는 상기 서열의 임의의 유도체 또는 변이체 및 임의의 합성 서열을 포함한다. 또한 본원에서 NK 신호전달 분자가 고려되었다. 그러므로, 예컨대, γ, δ, ε, ζ, 및 η, CD3 사슬과 같은 신호 전달에 관여하는 CD3 복합체를 구성하는 폴리펩티드가 본원에서 세포내 신호전달 도메인으로 사용이 고려되었다. 상기 TCR/CD3의 폴리펩티드 (T 세포의 주요 신호전달 수용체 복합체) 중에서, 특히 유망한 것은 제타 및 그의 에타 (eta) 이소형 (isoform) 사슬이고, 이는 호모- 또는 헤테로-S-S-연결된 이량체로서 나타나고, 리간드의 TCR 인식에 의해 유발된 세포 활성화 프로그램의 적어도 일부를 매개하는 것을 담당한다 (Weissman, A. et al. EMBO J. 8:3651-3656 (1989); Bauer, A. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:3842-3846 (1991)). 본원에서 사용하기 위한 세포내 신호전달 도메인의 부가의 예로는 MB1 사슬 (CD79A), B29, Fc RIII 및 Fc RI 등을 포함한다. 단백질을 활성화하는 패밀리의 다른 멤버의 세포내 신호전달 부분, 가령 FcγRIII 및 FcεRI가 또한 사용될 수 있다. 본원에 사용하기 위해 고려된 다양한 대안의 막횡단 및 세포내 도메인의 개시내용에 대해 Gross et al., FASEB J 6:3370, 1992; Stancovski, I. et al., J.Immunol. 151:6577, 1993; Moritz, D. et al., Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 91:4318, 1994; Hwu et al., Cancer Res. 55:3369, 1995; Weijtens, M. E. et al., J.Immunol. 157:836, 1996; and Hekele, A. et al., Int.J.Cancer 68:232, 1996을 참조한다. 부가의 예로는 IL-2 수용체 (IL-2R) p55 (.알파.) 또는 p75 (.베타.) 또는 .감마. 사슬의 어느 하나의 세포내 신호전달 도메인, 특히 T 세포 신호전달 및 NK 증식을 담당하는 p75 및 .감마. 서브유닛을 포함한다.
TCR 만으로 생성된 신호는 T 세포의 완전한 활성화에 불충분하고, 제2 또는 공자극 신호가 또한 필요하다는 것이 알려져 있다. 그러므로, T 세포 활성화는 세포질 신호전달 서열의 2개의 별개의 부류인: 상기 TCR (1차 세포질 신호전달 서열)을 통한 항원-의존적 1차 활성화를 개시하는 것 및 2차 또는 공자극 신호 (2차 세포질 신호전달 서열)를 제공하기 위한 항원-비의존적 방식으로 작용하는 것에 의해 매개된다고 할 수 있다.
1차 세포질 신호전달 서열은 자극 방식이나, 또는 저해 방식으로 TCR 복합체의 1차 활성화를 조절한다. 자극 방식으로 작용하는 1차 세포질 신호전달 서열은 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프 (motifs) 또는 ITAMs로 알려져 있는 신호전달 모티프를 포함할 수 있다.
본원에서 세포내 신호전달 도메인으로 특별히 사용되는 1차 세포질 신호전달 서열을 포함하는 ITAM의 예로는 TCR ζ, FcR γ, FcR β, CD3 γ, CD3 델타, CD3 엡실론, CD5, CD22, CD79a, CD79b, 및 CD66d로부터 유래된 것을 포함한다. 특정 특별한 구체예에서, 본원에서 사용된 조작된 TCR에서 세포질 신호전달 도메인은 CD3 제타로부터 유래된 세포질 신호전달 서열을 포함한다. 본원에서 유용한 제타 사슬 부분 서열은 세포내 도메인을 포함한다. 인간 CD3 제타 사슬의 아미노산 잔기 52-163에 이르는 상기 도메인은 표준 분자 생물학 기술을 사용하여 증폭될 수 있다.
일부 구체예에서, 상기 조작된 TCR의 세포질 도메인은 상기 CD3-제타 신호전달 도메인 자체를 포함하도록 디자인될 수 있거나 또는 본원에서 사용하기 위해 TCRs과 관련하여 유용한 임의의 다른 원하는 세포질 도메인(들)과 조합될 수 있다. 상기 "공자극 신호전달 영역" 또는 "공자극 도메인"은 공자극 분자의 세포내 도메인을 포함하는 조작된 TCR의 일부, 또는 그의 기능적 단편을 나타낸다. 그러므로, 본원에 개시된 조작된 TCRs의 세포질 도메인은 세포내 신호전달 도메인 및 공자극 도메인을 포함할 수 있다.
"공자극 리간드"는 T 세포에서 동족 공자극 분자에 특이적으로 결합하여, 예를 들면 펩티드가 로딩된 MHC 분자와 TCR/CD3 복합체의 결합에 의해 제공된 1차 신호 이외에, 증식, 활성화, 분화 등을 포함하지만, 이에 한정되는 않는 T 세포 반응을 매개하는 신호를 제공하는 항원 제시 세포 (예컨대, aAPC, 수지상 세포, B 세포 등) 상의 분자를 포함한다. 공자극 리간드는, 이에 한정되는 것은 아니지만, CD7, B7-1 (CD80), B7-2 (CD86), PD-L1, PD-L2, 4-1BBL, OX40L, 유도성 공자극 리간드 (ICOS-L), 세포간 부착 분자 (intercellular adhesion molecule: ICAM), CD30L, CD40, CD70, CD83, HLA-G, MICA, MICB, HVEM, 림프독소 (lymphotoxin) 베타 수용체, 3/TR6, ILT3, ILT4, HVEM, Toll 리간드 수용체에 결합하는 작용제 또는 항체 및 B7-H3과 특이적으로 결합하는 리간드를 포함할 수 있다. 공자극 리간드는 또한 특히 T 세포 상에 존재하는 공자극 분자와 특이적으로 결합하는 항체, 가령, 이에 한정되는 것은 아니지만, CD27, CD28, 4-1BB, OX40, CD30, CD40, PD-1, ICOS, 림프구 기능-관련된 항원-1 (LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, 및 CD83과 특이적으로 결합하는 리간드를 포괄한다.
공자극 분자는 항원 수용체 이외의 세포 표면 분자 또는 항원에 대한 림프구의 효율적인 반응을 필요로 하는 그의 리간드이다. 이러한 분자의 예로는 CD27, CD28, 4-1BB (CD137), OX40, CD30, CD40L, PD-1, DAP-10, ICOS, 림프구 기능-관련된 항원-1 (LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, 및 CD83과 특이적으로 결합된 리간드 등을 포함한다. 본원에 개시된 TCRs과 사용하기 위해 고려된 구체적으로 예시되는 공자극 도메인은 4-1BB 및 CD28로부터 유래되고, 그러나 다른 공자극 분자로부터 유래된 다른 공자극 도메인은 본 발명의 범위내에 있다.
본원에 개시된 조작된 TCRs의 세포질 도메인 내에 세포내 신호전달 서열 및 공자극 서열은 각 부분이 적절하게 신호하는 임의의 순수로 서로 연결될 수 있다. 특정 구체예에서, 상기 공자극 영역은, 존재하는 경우, TM 도메인의 세포질 측면 상에 있고, 신호전달 도메인이 뒤따른다 (예컨대 CD3 제타의 신호전달 도메인). 다른 구체예에서, 상기 순서는 역전되고, 상기 신호전달 부분 다음에 TM 도메인이 존재하고, 공자극 도메인이, 존재하는 경우, 뒤따른다. 선택적으로, 짧은 올리고- 또는 폴리펩티드 링커, 특정 구체예에서, 길이가 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 또는 15 아미노산이 결합 (linkage)을 형성할 수 있다. 글리신-세린 이중선 (doublet)은 특히 적합한 링커를 제공한다. 다양한 링커가 사용될 수 있고, 당분야의 통상의 지식을 가진 자에게 알려져 있다.
본원에서 언급된 바와 같이, 상기 조작된 TCRs은 또한, 일부 구체예에서, 숙주 세포 (예컨대, T 세포, NK 세포)의 표면에 고착시키기 위한 막횡단 (TM) 도메인을 포함한다. 상기 TM은 TCR 알파 사슬, TCR 베타 사슬, CD3 제타 사슬로부터 유래될 수 있거나 또는 또다른 막횡단 분자, 가령 CD28 또는 CD4로부터 유래될 수 있다. 당분야의 통상의 지식을 가진 자에 의해 인식되는 바와 같이, 상기 막에 상기 키메라 수용체를 고착시키는데 적당하게 기능하는 임의의 TM 도메인이 사용될 수 있다. 막횡단 도메인과 관련하여, 상기 키메라 TCR은 상기 키메라 TCR의 세포외 도메인에 융합되는 막횡단 도메인을 포함하도록 디자인될 수 있다. 일 구체예에서, 상기 키메라 TCR에서 도메인들 중 하나와 자연스럽게 결합하는 막횡단 도메인이 사용된다. 일부 예에서, 상기 막횡단 도메인은, 상기 수용체 복합체의 다른 멤버와의 상호작용을 최소화하기 위해 동일하거나 또는 상이한 표면 막 단백질들의 막횡단 도메인에 상기 도메인들의 결합을 피한 아미노산 치환에 의해 선별 또는 변형될 수 있다.
상기 막횡단 도메인은 천연 또는 합성 공급원으로부터 유래될 수 있다. 상기 공급원이 천연인 경우, 상기 도메인은 임의의 막-결합된 또는 막횡단 단백질로부터 유래될 수 있다. 본 발명에서 특별한 용도를 갖는 막횡단 영역은 상기 T-세포 수용체의 알파, 베타 또는 제타 사슬, CD28, CD3 엡실론, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, CD154로부터 유래될 수 있다 (즉, 상기의 막횡단 영역(들)을 적어도 포함할 수 있다). 대안으로서, 상기 막횡단 도메인은 합성일 수 있고, 상기 경우에, 이는 주로 소수성 잔기 가령 루신 및 발린을 포함할 수 있다. 특정 구체예에서, 페닐알라닌, 트립토판 및 발린의 삼중선 (triplet)이 합성 막횡단 도메인의 각 말단에서 발견될 것이다. 선택적으로, 특정 구체예에서 길이가 1 또는 2 내지 약 10, 11, 12, 13, 14, 또는 15 아미노산 사이의 짧은 링커는 상기 키메라 TCR의 막횡단 도메인과 상기 세포질 신호전달 도메인 사이에 결합을 형성할 수 있다. 글리신-세린 이중선은 특히 적합한 링커를 제공한다.
특정 구체예에서, 상기 키메라 TCR에서 막횡단 도메인은 CD8 막횡단 도메인이다. 일부 예에서, 본원에서 사용하기 위한 상기 키메라 TCR의 막횡단 도메인은 CD8 힌지 (hinge) 도메인을 포함한다. 특정 구체예에서, 상기 막횡단 도메인은 CD28 막횡단 도메인이고, 구체적으로 상기 공자극 영역이 CD28로부터 유래된 구체예에서, 이는 수행될 필요가 있는 증폭/클로닝 단계의 수를 최소화하는 것이 편의상의 문제이기 때문이다. 그러므로, 특정 구체예에서, 상기 TM 도메인은 상기 키메라 TCR의 공자극 또는 세포내 신호전달 도메인과 동일한 분자로부터 유래될 수 있다. 그러나, 이는 필수적인 것은 아니며, 상기 TM 도메인은, 이에 한정되는 것은 아니지만, CD8 및 CD3 제타 막횡단 도메인을 포함하는, 임의의 적합한 막횡단 단백질로부터 유래될 수 있다.
TCR 불변 도메인: 본 발명의 조작된 TCRs에서 사용하기 위한 불변 도메인은 TCR 알파 사슬 또는 TCR 베타 사슬로부터 유래될 수 있다. 이러한 불변 도메인이 당 분야에 알려져 있고, 공유 서열 데이터베이스로부터 이용가능하다.
특정 구체예에서, 하나 이상의 디술피드 결합은 본 발명의 조작된 TCRs에 포함된 불변 도메인 서열의 아미노산 잔기들을 연결할 수 있다. 일 구체예에서, 상기 디술피드 결합은, 베타 탄소 원자가 네이티브 TCRs에서 0.6 nm 미만으로 떨어져 있는 아미노산 잔기에 상응하는 시스테인 잔기들 사이에 존재한다. 예를 들면, 상기 디술피드 결합은 TRAC*01의 엑손 1의 Thr 48 및 TRBC1*01 또는 TRBC2*01의 엑손 1의 Ser 57 또는 그의 비-인간 등가물로 치환된 시스테인 잔기들 사이에 존재할 수 있다. 시스테인이 도입되어 디술피드 결합을 형성할 수 있는 다른 부위는 TCR .알파. 사슬에 대해 TRAC*01 및 TCR .베타. 사슬에 대해 TRBC1*01 또는 TRBC2*01의 엑손 1에서 하기의 잔기이다:
Figure pct00002
상기에 언급된 비-네이티브 디술피드 결합 이외에, 본 발명의 TCRs의 이량체 TCR 또는 scTCR은 네이티브 TCRs에서 디술피드 결합에 의해 연결된 것에 상응하는 잔기들 사이에 디술피드 결합을 포함할 수 있다.
가용성 TCR
일부 구체예에서, 상기 조작된 TCR은 가용성 TCR이다. 일반적으로, "가용성 TCRs"은 그의 막횡단 영역을 제거하기 위해 절단되어진 TCR 사슬을 포함한다. 예를 들면, WO 03/020763은 절단된 TCR 사슬의 결합을 용이하게 하기 위해 비-네이티브 디술피드 사슬간 결합을 갖는 가용성 TCRs의 제조 및 테스트를 개시하였다. 다른 가능한 적합한 가용성 TCR 디자인의 상세는, 사슬 결합을 용이하게 하기 위해 이종의 루신 지퍼를 그의 C-말단에 융합시킨 비-디술피드 연결된 절단 TCR 사슬의 생성을 개시하고 있는 WO 99/60120, 및 펩티드 링커를 통해 TCR Vβ 사슬에 공유적으로 연결된 TCR Vα를 포함하는 단일-사슬 가용성 TCRs의 생성을 개시하고 있는 WO 99/18129에서 찾을 수 있다. Boulter et al.은 또한 가용성의 기능적 및 안정한 TCR 헤테로이량체를 생성하는 방법을 개시하였다 (Boulter et al., Protein Eng 2003, 16:707-711 참조). 부가의 구체예에서, 본원에 개시된 가용성 TCRs은 키메라, 예컨대, 이종의 단백질, 가령 IL-2 또는 다른 시토킨, 항체의 Fc 도메인 등에 융합될 수 있다. 예시되는 가용성 TCR 융합 단백질은 예를 들면 Cancer Immunol Immunother. 2004 Apr;53(4):345-57; J Immunol. 2005 Apr 1;174(7):4381-8; Clin Immunol. 2006 Oct;121(1):29-39에 개시되어 있다.
조작된 TCR의 기능적 변이체 및 일부
본원에 개시된 TCRs의 기능적 변이체가 또한 고려되었다. 본원에서 사용되는 바와 같이 용어 "기능적 변이체 (functional variant)"는 모체 (parent) TCR에 대해 실질적으로 또는 상당한 서열 동일성 또는 유사성을 갖는 TCR을 나타내고, 상기 기능적 변이체는 변이체의 TCR의 생물학적 활성을 보유한다. 기능적 변이체는, 예를 들면, 모체 TCR이 항원 특이성을 가지거나 또는 모체 폴리펩티드 또는 단백질이 특이적으로 결합하는 NY-ESO-1 폴리펩티드/MHC 복합체에 특이적으로 결합하는 능력을, 상기 모체 TCR과 유사한 정도, 동일한 정도, 또는 더 높은 정도로, 보유하는 본원에 개시된 TCR의 변이체를 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 기능적 변이체는, 본원에 제공된 서열목록에 개시된 베타 사슬 가변 도메인 아미노산 서열과 같은, 모체 TCR의 베타 사슬 가변 도메인 아미노산 서열과 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 베타 사슬 가변 도메인을 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 기능적 변이체는, 서열번호: 1, 서열번호: 2 또는 서열번호: 3에 개시된 VβCDR3 아미노산 서열과 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 VβCDR3 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구체예에서, 상기 기능적 변이체는 본원에 제공된 서열목록에 개시된 알파 사슬 가변 도메인 아미노산 서열과 같은, 모체 TCR의 알파 사슬 가변 도메인 아미노산 서열과 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 알파 사슬 가변 도메인을 포함한다.
일부 구체예에서, 상기 기능적 변이체의 아미노산 서열은, 예를 들면, 적어도 하나의 보존적 아미노산 치환을 갖는 모체 TCR의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 보존적 아미노산 치환은 당분야에 알려져 있고, 특정 물리적 및/또는 화학적 특성을 갖는 하나의 아미노산을 동일한 화학적 또는 물리적 특성을 갖는 다른 아미노산으로 교환시키는 아미노산 치환을 포함한다. 예를 들면, 상기 보존적 아미노산 치환은 또다른 산성 아미노산으로 치환된 산성 아미노산 (예컨대, Asp 또는 Glu), 비극성 곁사슬을 갖는 또다른 아미노산으로 치환된 비극성 곁사슬을 갖는 아미노산 (예컨대, Ala, Gly, Val, Ile, Leu, Met, Phe, Pro, Trp, Val, 등), 또다른 염기성 아미노산으로 치환된 염기성 아미노산 (Lys, Arg, 등), 극성 곁사슬을 갖는 또다른 아미노산으로 치환된 극성 곁사슬을 갖는 아미노산 (Asn, Cys, Gln, Ser, Thr, Tyr, 등), 등일 수 있다.
대안으로 또는 부가로, 상기 기능적 변이체는 적어도 하나의 비-보존적 아미노산 치환을 갖는 모체 TCR의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 상기 경우에, 상기 비-보존적 아미노산 치환은 상기 기능적 변이체의 생물학적 활성을 방해 또는 저해하지 않는 것이 바람직하다. 바람직하게, 상기 비-보존적 아미노산 치환은 상기 기능적 변이체의 생물학적 활성을 증강시켜서, 상기 기능적 변이체의 생물학적 활성이 모체 TCR, 폴리펩티드, 또는 단백질과 비교하여 증가되었다.
상기 기능적 변이체의 아미노산 서열의 아미노산 치환(들)은 상기 아미노산 서열의 임의의 영역내에 존재할 수 있다. 예를 들면, 일부 구체예에서, 상기 아미노산 치환(들)은 상기 기능적 변이체의 가변 영역 또는 불변 영역을 코딩하는 아미노산 서열의 영역 내에 위치한다. 상기 아미노산 치환(들)이 상기 가변 영역을 코딩하는 아미노산 서열 (예컨대, VβCDR3 아미노산 서열, 가령 서열번호: 1)의 영역내에 위치하는 예에서, 상기 아미노산 치환(들)은, 상기 모체 TCR이 항원 특이성을 갖는 상기 펩티드-MHC 복합체에 결합하는 기능적 변이체의 역량을 현저하게 감소시키지 않는 것으로 이해된다.
상기 조작된 TCRs의 기능적 부분이 또한 제공된다. 일부 구체예에서, 상기 기능적 부분은 상기 모체 TCR의 인접 아미노산을 포함하는 임의의 부분을 포함할 수 있고, 단 상기 기능적 부분은 서열번호: 1에 개시된 아미노산 서열을 포함하는 Vβ 사슬의 일부를 포함한다. TCR과 관련하여 사용되는 경우 용어 "기능적 부분"은 본 발명의 TCR의 일부 또는 단편을 나타내고, 상기 일부 또는 단편은 TCR의 일부 (모체 TCR)의 생물학적 활성을 보유한다. 기능적 부분은, 예를 들면, 모체 TCR과 같이, NY-ESO-1 펩티드 - MHC 복합체에 특이적으로 결합하는 역량을 보유한 TCR의 일부를 포괄한다.
일부 구체예에서, 상기 기능적 부분은, 상기 TCR 부분의 생물학적 기능을 방해하지 않는, 상기 부분의 아미노- 또는 카르복시-말단, 또는 양 말단에서 부가의 아미노산을 포함한다.
본원에 개시된 TCRs (기능적 부분 및 기능적 변이체를 포함)은 선택적으로 하나 이상의 자연-발생 아미노산 대신에 합성 아미노산을 포함한다. 이러한 합성 아미노산이 당분야에 알려져 있으며, 예를 들면, 아미노시클로헥산 카르복실산, 노르루신, .알파.-아미노 n-데카노산, 호모세린, S-아세틸아미노메틸-시스테인, 트란스-3- 및 트란스-4-히드록시프롤린, 4-아미노페닐알라닌, 4-니트로페닐알라닌, 4-클로로페닐알라닌, 4-카르복시페닐알라닌, β-페닐세린 .베타.-히드록시페닐알라닌, 페닐글리신, α-나프틸알라닌, 시클로헥실알라닌, 시클로헥실글리신, 인돌린-2-카르복실산, 1,2,3,4-테트라히드로이소퀴놀린-3-카르복실산, 아미노말론산, 아미노말론산 모노아미드, N'-벤질-N'-메틸-리신, N',N'-디벤질-리신, 6-히드록시리신, 오르니틴, α-아미노시클로펜탄 카르복실산, α-아미노시클로헥산 카르복실산, α-아미노시클로헵탄 카르복실산, α-(2-아미노-2-노르보르난)-카르복실산, α,γ-디아미노부티르산, α,β-디아미노프로피온산, 호모페닐알라닌, 및 α-tert-부틸글리신을 포함한다.
본원에 개시된 TCRs (기능적 부분 및 기능적 변이체를 포함)은, 예컨대, 디술피드 브릿지를 통해 글리코실화, 아미드화, 카르복실화, 포스포릴화, 에스테르화, N-아실화, 사이클화 (cyclized)될 수 있거나, 또는 산 부가 염으로 변환되고 및/또는 선택적으로 이량체화 또는 다량체화, 또는 콘쥬게이트화 (conjugated)될 수 있다.
일부 구체예에서, NY-ESO-1/MHC 복합체에 특이적인 본원에 개시된 CDR3 서열을 포함하는 TCR의 존재를 식별하는 것이 바람직하다. 상기 TCR의 존재를 식별하는 방법은 딥 시퀀싱 전략 가령 Adaptive Biotechnologies (Seattle, WA)로부터 상업적으로 이용가능한 IMMUNOSEQTM를 포함한다. 또한 Nature, 515,568-571 (27 November 2014); Carreno et al., 2015 Science 348:803-808)을 참조한다. IMMUNOSEQ는 본원의 TCR CDR3 서열을 발견하기 위해 실시예 2 - 7에서 사용되었지만, 본원에 개시된 CDR3 서열의 존재를 검출하는 방법은 상기 방법에 한정되지 않는다. TCR CDR3 서열을 코딩하는 특정 뉴클레오티드 서열의 존재 또는 부재를 검출하는 임의의 기술이 본원에 사용되기 위해 고려되었다. 부가로, 본원에 개시된 VβCDR3 아미노산 서열을 갖는 공유 TCRs은 상기 목적을 위해 개발된 모노클로날 항체에 의한 면역분석에 의해 직접 검출될 수 있다. 사용될 수 있는 면역분석은, 이에 한정되는 것은 아니지만, 웨스턴 블롯 (western blots), 방사면역분석 (radioimmunoassays), ELISA, "샌드위치 (sandwich)" 면역분석, 면역침전 (immunoprecipitation) 분석, 침전소 (precipitin) 분석, 겔 투과 침전소 분석, 면역방사계수측정 (immunoradiometric) 분석, 형광 면역분석, 단백질 A, 면역분석, 및 보체-고정 (complement-fixation) 분석과 같은 기술을 사용하는 경쟁적 분석 시스템을 포함한다. 이러한 분석은 통상적이며, 당 분야에 알려져 있다 (예컨대, Ausubel et al, eds, 1994 Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, John Wiley & sons, Inc., New York). 부가로, Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and David Lane, 1988)에 개시된 것과 같은 통상의 교차-차단 분석 (cross-blocking assays)이 수행될 수 있다. 핵산 기반 분석 또는 단백질 기반 검출 분석은 본원에 개시된 VβCDR3 아미노산 서열을 포함하는 TCRs을 갖는 T 세포의 존재 또는 부재를 개체에서 결정하는데 사용될 수 있다.
핵산, 벡터 및 세포
본원에 개시된 조작된 TCRs (또는 그의 기능적 부분 및 기능적 변이체)을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산이 또한 고려되었다.
본원에서 사용되는 바와 같이 "핵산"은 "폴리뉴클레오티드", "올리고뉴클레오티드", 및 "핵산 분자"를 포함하고, 일반적으로 DNA 또는 RNA의 폴리머를 의미하고, 이는 단일-가닥 또는 이중-가닥일 수 있고, 합성되거나 또는 천연 공급원으로부터 입수 (예컨대, 단리 및/또는 정제)될 수 있고, 천연, 비-천연 또는 변경된 뉴클레오티드를 포함할 수 있고, 천연, 비-천연 또는 변경된 뉴클레오티드간 결합, 가령 포스포로아미데이트 결합 또는 포스포로티오에이트 결합을, 비변형된 올리고뉴클레오티드의 뉴클레오티드들 사이에서 발견되는 포스포디에스테르 대신에, 포함할 수 있다. 일반적으로 상기 핵산은 임의의 삽입, 결실, 역전 (inversions), 및/또는 치환을 포함하지 않는 것이 바람직하다. 그러나, 본원에서 토의되는 바와 같이 상기 핵산이 하나 이상의 삽입, 결실, 역전, 및/또는 치환을 포함하는 것이 일부 예에서 적합할 수 있다.
바람직하게, 본원에 개시된 핵산은 재조합이다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "재조합"은 (i) 살아있는 세포에서 복제할 수 있는 핵산 분자에 천연 또는 합성 핵산 세그먼트 (segments)를 연결하여 살아있는 세포 밖에서 제작되는 분자, 또는 (ii) 상기 (i)에서 개시된 것의 복제로부터 기인한 분자를 나타낸다. 본원에서 목적을 위해, 상기 복제는 인 비트로 복제 또는 인 비보 복제일 수 있다.
상기 핵산은 당 분야에 알려져 있거나 또는 상업적으로 이용할 수 있는 (예컨대, Genscript제, Thermo Fisher and similar companies) 절차를 사용하여 화학적 합성 및/또는 효소적 결찰 반응에 기반하여 제작될 수 있다. 예를 들면, Sambrook et al., supra, 및 상기 Ausubel et al.을 참조한다. 예를 들면, 핵산은 자연 발생하는 뉴클레오티드 또는 상기 분자의 생물학적 안정성을 증가시키거나 또는 혼성화 (hybridization) 시에 형성된 듀플렉스 (duplex) (예컨대, 포스포로티오에이트 유도체 및 아크리딘 치환된 뉴클레오티드)의 물리적 안정성을 증가시키도록 디자인된 다양하게 변형된 뉴클레오티드를 사용하여 화학적으로 합성될 수 있다. 상기 핵산을 생성하는데 사용될 수 있는 변형된 뉴클레오티드의 예로는, 이에 한정되는 것은 아니지만, 5-플루오로우라실, 5-브로모우라실, 5-클로로우라실, 5-아이오도우라실, 히포크산틴 (hypoxanthine), 크산틴, 4-아세틸시토신, 5-(카르복시히드록시메틸) 우라실, 5-카르복시메틸아미노메틸-2-티오우리딘, 5-카르복시메틸아미노메틸우라실, 디히드로우라실, 베타-D-갈락토실퀴에오신 (galactosylqueosine), 이노신 (inosine), N6-이소펜테닐아데닌, 1-메틸구아닌, 1-메틸이노신, 2,2-디메틸구아닌, 2-메틸아데닌, 2-메틸구아닌, 3-메틸시토신, 5-메틸시토신, N6-치환된 아데닌, 7-메틸구아닌, 5-메틸아미노메틸우라실, 5-메톡시아미노메틸-2-티오우라실, 베타-D-만노실퀴에오신, 5'-메톡시카르복시메틸우라실, 5-메톡시우라실, 2-메틸티오-N6-이소펜테닐아데닌, 우라실-5-옥시아세트산 (v), 와이부톡소신 (wybutoxosine), 슈도우라실 (pseudouracil), 퀴에오신, 2-티오시토신, 5-메틸-2-티오우라실, 2-티오우라실, 4-티오우라실, 5-메틸우라실, 우라실-5-옥시아세트산 메틸에스테르, 3-(3-아미노-3-N-2-카르복시프로필)우라실, 및 2,6-디아미노퓨린을 포함한다. 대안으로서, 본 발명의 핵산들 중 하나 이상은 회사, 가령 Macromolecular Resources (Fort Collins, Colo.) 및 Synthegen (Houston, Tex.)으로부터 구입될 수 있다.
상기 핵산은 상기 조작된 TCRs를 코딩하는 임의의 뉴클레오티드 서열, 폴리펩티드, 또는 단백질, 또는 그의 기능적 부분 또는 기능적 변이체를 포함할 수 있다.
본 개시내용은 또한 단리된 또는 정제된 핵산의 변이체를 제공하고, 상기 변이체 핵산은, 모체 TCR을 코딩하는 뉴클레오티드 서열과 적어도 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 특정 구체예에서, 본 개시내용은, 본원의 서열 목록에 제공된 뉴클레오티드 서열과 적어도 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 또는 정제된 핵산을 제공하고, 이러한 변이체 뉴클레오티드 서열은, 모체 TCR뿐만 아니라 적어도 그의 동족 MHC-펩티드 복합체 (예컨대, NY-ESO-1 펩티드/MHC 복합체)를 특이적으로 인식하는 기능적 TCR을 코딩한다.
본 개시내용은 또한 본원에 개시된 핵산의 뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열 또는 엄격한 조건하에 본원에 개시된 핵산의 뉴클레오티드 서열로 혼성화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 또는 정제된 핵산을 제공한다.
엄격한 조건하에 혼성화되는 뉴클레오티드 서열은 높은 엄격성 조건하에 혼성화되는 것이 바람직하다. "높은 엄격성 조건 (high stringency conditions)"은 상기 뉴클레오티드 서열이 표적 서열 (본원에 개시된 핵산의 뉴클레오티드 서열)로, 비-특이적 혼성화에서보다 검출가능하게 더 강한 양으로, 특이적으로 혼성화하는 것을 의미한다. 높은 엄격성 조건은, 정확한 상보적 서열, 또는 몇 개의 산란된 미스매치 (mismatches) 만을 포함하는 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드를, 상기 뉴클레오티드 서열을 매치하는 몇 개의 작은 영역 (예컨대, 3-10 염기)을 갖는 무작위 서열로부터 구별할 수 있는 조건을 포함한다. 상보성을 갖는 이러한 작은 영역은 14-17 또는 그 이상의 염기를 갖는 전장 보체보다 더 용이하게 용융되고, 높은 엄격성 혼성화는 이들을 더 용이하게 구별가능하게 한다. 상대적으로 높은 엄격성 조건은, 예를 들면 낮은 염 및/또는 높은 온도 조건을 포함하고, 가령 약 0.02-0.1 M NaCl 또는 동등물을, 약 50-70℃의 온도로 제공한다. 이러한 높은 엄격성 조건은, 뉴클레오티드 서열과 주형 또는 표적 가닥 사이의 미스매치를 거의 허용하지 않으며, 본원에 개시된 TCRs의 발현을 검출하는데 특히 적당하다. 일반적으로 상기 조건은 포름아미드의 증가하는 양의 첨가에 의해 더 엄격해 질 수 있다는 것이 인식된다.
특정 구체예에서, 본원에 개시된 핵산은 다양한 상이한 타입의 벡터로 혼입될 수 있다. 이와 관련하여, 본 개시내용은 본원에 개시된 핵산의 하나 이상을 포함하는 하나 이상의 재조합 발현 벡터를 제공한다. 본원에서 목적을 위하여, 용어 "재조합 발현 벡터"는 유전적으로-변형된 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 구조체를 의미하고, 이는 상기 구조체가 mRNA를 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 단백질, 폴리펩티드, 또는 펩티드를 포함하고, 상기 벡터는 상기 세포내에서 발현되는 mRNA, 단백질, 폴리펩티드, 또는 펩티드를 갖기에 충분한 조건하에 세포와 접촉할 때, 숙주 세포에 의해 mRNA, 단백질, 폴리펩티드, 또는 펩티드의 발현을 허용한다. 본원에 개시된 벡터는 전체적으로 자연-발생하는 것은 아니다. 그러나, 상기 벡터의 일부는 자연-발생할 수 있다. 본원에 개시된 재조합 발현 벡터는, 이에 한정되는 것은 아니지만, DNA 및 RNA를 포함하는 뉴클레오티드의 임의의 타입을 포함할 수 있고, 이는 단일-가닥 또는 이중-가닥일 수 있고, 합성 또는 천연 공급원으로부터 일부 입수할 수 있고, 천연, 비-천연 또는 변경된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 상기 재조합 발현 벡터는 자연-발생하는, 비-자연-발생하는 뉴클레오티드간 결합, 또는 상기 두 타입의 결합을 포함할 수 있다. 바람직하게, 상기 비-자연 발생하는 또는 변경된 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드간 결합은 상기 벡터의 전사 또는 복제를 방해하지 않는다.
본원에 개시된 재조합 발현 벡터는 임의의 적합한 재조합 발현 벡터일 수 있고, 임의의 적합한 숙주를 형질전환, 형질감염 또는 형질도입하는데 사용될 수 있다. 적합한 벡터는 증식 및 확장 또는 발현 또는 두 경우 모두를 위해 디자인된 것, 가령 플라스미드 및 바이러스를 포함한다. 상기 벡터는 pUC 시리즈 (Fermentas Life Sciences), pBluescript 시리즈 (Stratagene, LaJolla, Calif.), pET 시리즈 (Novagen, Madison, Wis.), pGEX 시리즈 (Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden), 및 pEX 시리즈 (Clontech, Palo Alto, Calif.) 및 기타 상업적으로 이용가능한 플라스미드 벡터로 구성된 그룹으로부터 선택될 수 있다. 박테리오파지 벡터, 가령 λG10, λGT11, λZapII (Stratagene), λEMBL4, 및 λNM1149가 또한 사용될 수 있다. 식물 발현 벡터의 예로는 pBI01, pBI101.2, pBI101.3, pBI121 및 pBIN19 (Clontech)를 포함한다. 동물 발현 벡터의 예로는 pEUK-Cl, pMAM 및 pMAMneo (Clontech)를 포함한다.
일부 구체예에서, 본원에서 사용하기 위한 벡터는 바이러스 벡터, 예컨대, 레트로바이러스 벡터, 가령 렌티바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 폭스바이러스 벡터, 박시니아 (vaccinia) 바이러스 벡터이다. "렌티바이러스"는 분할하는 (dividing) 및 비-분할하는 (non-dividing) 세포를 감염시킬 수 있는 레트로바이러스 속 (genus)을 지칭한다. 렌티바이러스의 몇가지 예로는 HIV (인간 면역결핍 바이러스: HIV 타입 1, 및 HIV 타입 2 포함); 말 전염성 빈혈 (equine infectious anemia) 바이러스; 고양이 면역결핍 바이러스 (feline immunodeficiency virus: FIV); 소 면역결핍 바이러스 (bovine immune deficiency virus: BIV); 및 원숭이 면역결핍 바이러스 (simian immunodeficiency virus: SIV)를 포함한다.
예시되는 렌티바이러스 벡터는, 이에 한정되는 것은 아니지만, HIV-1, HIV-2, FIV, 말 전염성 빈혈 바이러스, SIV, 및 메디/비스나 (maedi/visna) 바이러스로부터 유래된 벡터를 포함한다. 바이러스 벡터인, 레트로바이러스 및 렌티바이러스 바이러스 벡터를 사용하는 방법 및 TCRs 이식유전자를 포함하는 바이러스 입자로 포유동물 표적 세포를 형질도입하기 위해 세포를 패키징하는 방법은 당분야에 잘 알려져 있으며, 예를 들면, 미국특허 제8,119,772호; Walchli et al., 2011, PLoS One 6:327930; Zhao et al., J. Immunol., 2005, 174:4415-4423; Engels et al., 2003, Hum.Gene Ther. 14:1155-68; Frecha et al., 2010, Mol. Ther. 18:1748-57; Verhoeyen et al., 2009, Methods Mol. Biol. 506:97-114에 이전에 개시되었다. 레트로바이러스 및 렌티바이러스 벡터 구조체 및 발현 시스템은 또한 상업적으로 이용할 수 있다.
상기 재조합 발현 벡터는, 예를 들면 Current Protocols in Molecular Biology (2015 John Wiley & Sons, Inc) 또는 Sambrook et al., supra, 및 Ausubel et al., supra에 개시된 표준 재조합 DNA 기술을 사용하여 제조될 수 있다. 원핵 또는 진핵 숙주 세포에서 기능하는 복제 시스템을 포함하도록, 원형 또는 선형인, 발현 벡터의 구조체가 제조될 수 있다. 복제 시스템은, 예컨대, ColEl, 2μ 플라스미드, λ, SV40, 소 파필로마 바이러스 (bovine papilloma virus) 등으로부터 유래될 수 있다.
일부 구체예에서, 상기 재조합 발현 벡터는 조절 서열 (regulatory sequences), 가령 전사 및 번역 개시 및 종결 코돈을 포함하고, 이는 상기 벡터가 적합하게 도입되고, 상기 벡터가 DNA- 또는 RNA-기반인지를 고려한 숙주의 타입 (예컨대, 박테리아, 진균류, 식물, 또는 동물)에 특이적이다.
상기 재조합 발현 벡터는 하나 이상의 마커 (marker) 유전자를 포함할 수 있고, 이는 형질전환되거나 또는 형질감염된 숙주를 선별한다. 마커 유전자는 살생제 (biocide) 저항, 예컨대, 항생제, 중금속 등에 대한 저항, 원영양성 (prototrophy)을 제공하기 위해 영양요구성 (auxotrophic) 숙주에서 보충성 (complementation) 등을 포함한다. 본 발명의 발현 벡터에 대한 적합한 마커 유전자는, 예를 들면, 네오마이신 (neomycin)/G418 저항 유전자, 히그로마이신 (hygromycin) 저항 유전자, 히스티디놀 (histidinol) 저항 유전자, 테트라시클린 (tetracycline) 저항 유전자, 및 암피실린 (ampicillin) 저항 유전자를 포함한다.
상기 재조합 발현 벡터는 상기 조작된 TCR을 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 폴리펩티드, 또는 단백질 (그의 기능적 부분 및 기능적 변이체를 포함), 또는 기능적 TCR을 코딩하는 변이체 뉴클레오티드 서열, 또는 상기 변형된 TCR을 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 폴리펩티드, 또는 단백질에 상보적이거나 또는 혼성화된 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 (operably linked) 네이티브 또는 비-네이티브 프로모터를 포함할 수 있다. 상기 프로모터의 선별, 예컨대, 강 (strong), 약 (weak), 유도성, 조직-특이적 및 발달-특이적 프로모터의 선별은 당업자의 통상적인 기술내에 있다. 유사하게, 프로모터와 뉴클레오티드 서열의 조합이 또한 당업자의 통상적인 기술내에 있다. 상기 프로모터는 비-바이러스 프로모터 또는 바이러스 프로모터, 예컨대, 시토메갈로바이러스 (cytomegalovirus: CMV) 프로모터, SV40 프로모터, RSV 프로모터, EF1α 프로모터, 유비퀴틴 (ubiquitin) 프로모터, MHC 클래스 I 또는 II 프로모터, T 세포 특이적 프로모터, 시토킨 프로모터, 또는 쥐과 (murine) 줄기 세포 바이러스의 긴-말단 반복에서 발견되는 프로모터일 수 있다. 특정 구체예에서, 상기 프로모터는 합성 프로모터이다.
본원에서 토의된 바와 같이, 바이러스 벡터가 사용되는 구체예에서, 상기 바이러스 벡터 게놈은 표적 세포에서 발현되기에 바람직한 관심 서열을 포함한다. 레트로바이러스 벡터와 관련하여, 통상적으로, 관심 서열 (예컨대, 본원에 개시된 바와 같은 조작된 TCR을 코딩하는 핵산)은 5' LTR과 3' LTR 서열 (또는 특정 구체예에서 사용될 수 있는 바와 같이 일부 5' 또는 3' LTR 서열) 사이에 위치한다. 특정 구체예에서, 관심 서열은 다른 유전 요소, 예를 들면 프로모터 또는 인핸서를 포함하는 전사 조절 서열과, 특별한 방식으로 상기 관심 서열의 발현을 조절하기 위해서, 기능적 관계에 있다. 특정 예에서, 상기 유용한 전사 조절 서열은 활성과 관련하여, 시간적 (temporally) 및 공간적 (spatially)으로 고도로 조절되는 것이다. 상기 구성성분들의 발현을 조절하기 위해 사용될 수 있는 발현 조절 요소가 당분야에 알려져 있고, 이에 한정되는 것은 아니지만, 유도성 프로모터, 항시성 (constitutive) 프로모터, 분비 신호 (secretion signals), 인핸서 및 다른 조절 요소를 포함한다.
상기 관심 서열 및 임의의 다른 발현가능한 서열은 통상적으로 내부 프로모터/인핸서 조절 서열과 기능적 관계에 있다. "내부 (internal)" 프로모터/인핸서는 상기 바이러스 벡터 구조체에서 5' LTR과 3' LTR 서열 (또는 그의 일부 서열) 사이에 위치한 것이고, 상기 관심 서열에 작동가능하게 연결된다. 상기 내부 프로모터/인핸서는, 기능적 관계에 있는 핵산의 발현을 증가시키는 것으로 알려져 있는 임의의 프로모터, 인핸서 또는 프로모터/인핸서 조합일 수 있다. "기능적 관계 (functional relationship)" 및 "작동가능하게 연결된 (operably linked)"은, 제한 없이, 상기 프로모터 및/또는 인핸서가 적합한 분자와 접촉될 때 관심 서열이 발현될 수 있는 프로모터 및/또는 인핸서와 관련한 올바른 위치 및 배향으로 서열이 존재하는 것을 의미한다.
내부 프로모터/인핸서의 선택은 상기 관심 서열의 원하는 발현 패턴 및 공지된 프로모터/인핸서의 특이적 특성에 기반한다. 그러므로, 상기 내부 프로모터는 구성적으로 (constitutively) 활성일 수 있다. 사용될 수 있는 항시성 프로모터의 비-제한적인 예로는 유비퀴틴 (미국특허 제5,510,474호; WO 98/32869, 각각은 그 전문이 참조로 본원에 통합됨), CMV (Thomsen et al., PNAS 81:659, 1984; 미국특허 제5,168,062호, 각각은 그 전문이 참조로 본원에 통합됨), 베타-액틴 (Gunning et al. 1989 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:4831-4835, 이는 그 전문이 참조로 본원에 통합됨) 및 pgk (예를 들면, Adra et al. 1987 Gene 60:65-74; Singer-Sam et al. 1984 Gene 32:409-417; and Dobson et al. 1982 Nucleic Acids Res. 10:2635-2637, 상기 각각은 그 전문이 참조로 본원에 통합됨)에 대한 프로모터를 포함한다. 일부 구체예에서, 벡터 (예컨대, 슈도타입 (pseudotyped) 레트로바이러스 벡터 게놈)에 의해 코딩된 관심 서열 (예컨대, 본원에 개시된 조작된 TCRs)의 발현을 조절하는데 사용된 프로모터는 인트론-결핍 (intron-deficient) 프로모터이다. 일부 구체예에서, 인간 유비퀴틴-C (UbiC) 프로모터는 상기 바이러스 벡터 게놈에 의해 코딩된 TCRs의 발현을 조절하는데 사용된다. 다양한 구체예에서, 상기 UbiC 프로모터는 인트론을 제거하도록 변형되어지고, 즉 상기 프로모터는 인트론 결핍이다. 전장 UbiC 프로모터는 1250개의 뉴클레오티드이다. 상기 인트론은 412에서 시작하여, 끝까지 간다 (412-1250). 상기 영역은 이종 바이러스 게놈 전사물을 최소화하려는 목적을 위해 결실될 수 있다. 상기 HIV 바이러스 게놈은 그 안에 네이티브 인트론을 갖는다. 그러므로, UbiC 프로모터를 포함하는 렌티바이러스는 상기 렌티바이러스 게놈에서 총 2개의 인트론을 가질 수 있다. 상기 UbiC 인트론은 스플라이싱된 (spliced) 및 비스플라이싱된 (unspliced) 형태로 존재할 수 있다. 상기 UbiC 인트론의 결실은 이종 바이러스 전사물의 가능성을 제거하고, 전달된 슈도타입 렌티바이러스 입자에서 동질성 (homogeneity)을 보장한다.
대안으로서, 상기 프로모터는 조직 특이적 프로모터일 수 있다. 일부 바람직한 구체예에서, 상기 프로모터는 표적 세포-특이적 프로모터이다. 예를 들면, 상기 프로모터는 수지상 세포, T 세포, NK 세포로 발현되는, 이에 한정되는 것은 아니지만, IL-2, IL-2R, 인터페론 γ, MHC 클래스 I, MHC 클래스 II, CD3, CD11c, CD103, TLRs, DC-SIGN, BDCA-3, DEC-205, DCIR2, 만노스 수용체, 덱틴 (Dectin)-1, Clec9A를 포함하는 임의의 산물로부터 유래될 수 있다. 또한, 프로모터는 관심 서열의 유도성 발현을 허용하도록 선별될 수 있다. 유도성 발현을 위한 다수의 시스템이 당분야에 알려져 있고, 테트라시클린 반응성 시스템, lac 작동인자 (operator)-억제인자 (repressor) 시스템뿐만 아니라 열충격, 금속 이온, 가령 메탈로티오네인 (metallothionein) 프로모터, 인터페론, 히폭시아 (hypoxia), 스테로이드, 가령 프로게스테론 (progesterone) 또는 글루코코르티코이드 (glucocorticoid) 수용체 프로모터, 방사선을 포함하는 다양한 환경적 또는 생리학적 변화에 반응하는 프로모터, 가령 VEGF 프로모터를 포함한다. 프로모터들의 조합이 또한 관심 유전자의 원하는 발현을 수득하기 위해 사용될 수 있다. 통상의 기술을 갖는 당업자는 생물체 또는 관심 표적 세포에서 유전자의 원하는 발현 패턴에 기반한 프로모터를 선별할 수 있을 것이다.
상기 바이러스 게놈은 적어도 하나의 RNA 폴리머라제 II 또는 III 반응성 프로모터를 포함할 수 있다. 상기 프로모터는 상기 관심 서열에 작동가능하게 연결될 수 있고, 또한 종결 서열에 연결될 수 있다. 또한, 하나 초과의 RNA 폴리머라제 II 또는 III 프로모터가 통합될 수 있다. RNA 폴리머라제 II 및 III 프로모터는 당분야의 통상의 지식을 가진 자에게 잘 알려져 있다. RNA 폴리머라제 III 프로모터의 적합한 범위는, 예를 들면, Paule and White, Nucleic Acids Research., Vol. 28, pp 1283-1298 (2000)에서 찾을 수 있고, 이는 그 전문이 참조로 본원에 통합된다. RNA 폴리머라제 II 또는 III 프로모터는 또한 RNA 코딩 서열을 하류로 전사시키도록 RNA 폴리머라제 II 또는 III을 지향시킬 수 있는 임의의 합성 또는 조작된 DNA 단편을 포함한다. 또한, 상기 바이러스 벡터 게놈의 일부로 사용되는 RNA 폴리머라제 II 또는 III (Pol II 또는 III) 프로모터 또는 프로모터들은 유도성일 수 있다. 임의의 적합한 유도성 Pol II 또는 III 프로모터는 본 개시내용의 방법에 의해 사용될 수 있다. 특히 적합한 Pol II 또는 III 프로모터는 Ohkawa and Taira, Human Gene Therapy, Vol. 11, pp 577-585 (2000) 및 Meissner et al. Nucleic Acids Research, Vol. 29, pp 1672-1682 (2001)에서 제공된 테트라시클린 반응성 프로모터를 포함하고, 상기 각각은 그 전문이 참조로 본원에 통합된다.
내부 인핸서가 또한 관심 유전자의 발현을 증가시키기 위해 바이러스 구조체 내에 존재할 수 있다. 예를 들면, 상기 CMV 인핸서 (Boshart et al. Cell, 41:521, 1985; 이는 그 전문이 참조로 본원에 통합됨)가 사용될 수 있다. 바이러스 게놈, 가령 HIV, CMV, 및 포유동물 게놈에서 많은 인핸서가 동정 및 특징화되어 졌다 (GenBank 참조). 인핸서는 이종의 프로모터와 조합하여 사용될 수 있다. 당분야의 통상의 지식을 가진 자는 원하는 발현 패턴에 기반하여 적합한 인핸서를 선별할 수 있을 것이다.
상기 바이러스 벡터 게놈은 또한 부가의 유전 요소를 포함할 수 있다. 상기 구조체에 포함될 수 있는 요소의 타입은 임의의 방식으로 제한되지 않으며, 특별한 결과를 달성하도록 선택될 수 있다. 예를 들면, 표적 세포에서 바이러스 게놈의 핵 진입을 용이하게 하는 신호가 포함될 수 있다. 이러한 신호의 예로는 HIV-1 cPPT/CTS이다. 또한, 표적 세포에서 프로바이러스 (provirus) 통합 부위의 특징화를 용이하게 하는 요소가 포함될 수 있다. 예를 들면, tRNA 앰버 억제인자 서열 (amber suppressor sequence)이 상기 구조체에 포함될 수 있다. 예컨대, 닭 (chicken) β-글로빈 (globin)으로부터의 절연인자 (insulator) 서열이 또한 상기 바이러스 게놈 구조체에 포함될 수 있다. 이러한 요소들은 메틸화 및 이질염색질형성 (heterochromatinization) 효과에 기인하여 표적 세포에서 통합된 프로바이러스를 사이런싱 (silencing)하는 기회를 감소시킨다. 또한, 상기 절연인자는 크로모좀 상의 통합 부위에서 주변 DNA로부터 포지티브 또는 네가티브 위치 효과로부터 내부 인핸서, 프로모터 및 외인성 유전자를 차단할 수 있다. 또한, 상기 벡터 게놈는 관심 유전자의 발현을 증가시키도록 디자인된 하나 이상의 유전 요소를 포함할 수 있다. 예를 들면, 우드척 간염 바이러스 반응성 요소 (woodchuck hepatitis virus responsive element: WRE)를 상기 구조체에 넣을 수 있다 (Zufferey et al. 1999. J. Virol. 74:3668-3681; Deglon et al. 2000. Hum.Gene Ther. 11:179-190, 각각은 그 전문이 참조로 본원에 통합됨).
상기 바이러스 벡터 게놈은 통상적으로, 패키징 또는 프로듀서 세포주로 감염될 수 있는 플라스미드 형태로 제작될 수 있다. 상기 플라스미드는 일반적으로 박테리아에서 상기 플라스미드의 복제에 유용한 서열을 포함한다. 이러한 플라스미드가 당분야에 잘 알려져 있다. 또한, 복제의 원핵세포 기원을 포함하는 벡터는 또한 그의 발현이 약물 저항성과 같은 검출가능한 또는 선별가능한 마커를 전달하는 유전자를 포함할 수 있다. 통상적인 박테리아 약물 저항성 산물은 암피실린 또는 테트라시클린에 대한 저항성을 제공하는 것이다.
본 발명의 재조합 발현 벡터는 일시 발현, 안정한 발현, 또는 둘다를 위해 디자인될 수 있다. 또한, 상기 재조합 발현 벡터는 항시성 발현 또는 유도성 발현을 위해 생산될 수 있다.
또한, 상기 재조합 발현 벡터는 자살 (suicide) 유전자를 포함하도록 생산될 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 상기 용어 "자살 유전자"는 자살 유전자를 발현시키는 세포가 죽는 것을 유발하는 유전자를 지칭한다. 상기 자살 유전자는, 상기 유전자가 발현되는 세포에서, 작용제, 예컨대 약물에 대한 민감성을 제공하고, 상기 세포가 상기 작용제와 접촉하거나 또는 이에 노출될 때 세포가 죽도록 유발시키는 유전자일 수 있다. 자살 유전자는 당분야에 알려져 있고 (예를 들면, Suicide Gene Therapy: Methods and Reviews, Springer, Caroline J. (Cancer Research UK Centre for Cancer Therapeutics at the Institute of Cancer Research, Sutton, Surrey, UK), Humana Press, 2004 참조), 예를 들면, 헤르페스 단순 바이러스 (Herpes Simplex Virus: HSV) 티미딘 키나제 (thymidine kinase: TK) 유전자, 시토신 데아미나제 (daminase), 퓨린 뉴클레오시드 포스포릴라제, 및 니트로레덕타제 (nitroreductase)를 포함한다.
본원에 개시된 재조합 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포가 또한 제공된다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "숙주 세포"는 본 발명의 재조합 발현 벡터를 포함할 수 있는 임의의 타입의 세포를 지칭한다. 상기 숙주 세포는 진핵 세포, 예컨대, 식물, 동물, 진균류, 또는 조류 (algae)일 수 있거나, 또는 원핵 세포, 예컨대, 박테리아 또는 원생동물 (protozoa)일 수 있다. 상기 숙주 세포는 배양된 세포 또는 1차 세포일 수 있고, 즉 생물체, 예컨대 인간으로부터 직접 단리된 세포일 수 있다. 상기 숙주 세포는 부착 세포 (adherent cell) 또는 현탁된 세포 (suspended cell), 즉, 현탁액에서 성장한 세포일 수 있다. 적합한 숙주 세포는 당분야에 알려져 있고, 예를 들면, DH5α 이. 콜리 (E. coli) 세포, 차이니즈 햄스터 (Chinese hamster) 난소 세포, 원숭이 (monkey) VERO 세포, COS 세포, HEK293 세포, 293F, 293T 세포 등을 포함한다. 구체적으로, 본원에 개시된 TCRs의 전달을 위해 바이러스 입자를 생산하는 목적을 위해, 293F 및 293T 숙주 세포가 사용될 수 있다. 상기 재조합 발현 벡터를 증폭 및 복제하는 목적을 위해, 상기 숙주 세포는 원핵 세포, 예컨대, DH5α 세포일 수 있다. 재조합 변형된 TCR, 폴리펩티드, 또는 단백질을 생산하는 목적을 위해, 상기 숙주 세포는 포유동물 세포일 수 있다. 특정 구체예에서, 상기 숙주 세포는 인간 세포이다. 상기 숙주 세포는 임의의 세포 타입을 가질 수 있고, 임의의 타입의 조직으로부터 유래할 수 있고, 임의의 발생 단계를 가질 수 있다. 특정 구체예에서, 상기 숙주 세포는 말초 혈액 림프구 (peripheral blood lymphocyte: PBL)이다. 특정 구체예에서, 상기 숙주 세포는 T 세포이다.
일부 구체예에서, 본원에 개시된 벡터는 본원에 개시된 TCR (또는 기능적 변이체 또는 부분)을 코딩한다. 이와 관련하여, 상기 TCR이 헤테로이량체 TCR인 구체예에서, 상기 TCR 베타 사슬 및 상기 TCR 알파 사슬 둘 다는 동일한 벡터로부터 발현될 수 있거나 또는 기능적 이량체 TCR이 상기 세포의 표면에서 발현되도록 동일한 숙주 세포 내에서 다른 벡터로부터 발현될 수 있다. 상기 TCR이 단일 사슬 TCR인 다른 구체예에서, 본원에 개시된 벡터는 단일 사슬 TCR 또는 본원에 개시된 TCRs의 다른 형태를 코딩하는 핵산을 포함한다.
부가의 구체예에서, 본원에 개시된 벡터는 하나 초과의 산물을 코딩할 수 있다. 이와 관련하여, 전달되는 서열은 적어도 하나의 단백질, 적어도 하나의 siRNA, 적어도 하나의 미크로RNA, 적어도 하나의 dsRNA 또는 적어도 하나의 항-센스 RNA 분자 또는 그의 임의의 조합을 코딩하는 다수의 유전자를 코딩하는 관심있는 다른 핵산에 부가하여 본원에 개시된 바와 같은 TCR을 코딩하는 핵산을 포함할 수 있다. 예를 들면, 전달되는 서열은 하나 이상의 TCRs을 코딩하는 하나 이상의 유전자를 포함할 수 있다. 하나 이상의 TCRs은 단일 질병 또는 질환과 관련될 수 있거나, 또는 이들은 다수의 질병 및/또는 질환과 관련될 수 있다. 일부 예에서, 면역 조절 단백질을 코딩하는 유전자는 본원에 개시된 바와 같이 TCR을 코딩하는 유전자와 함께 포함될 수 있고, 상기 조합은 상기 면역 반응을 원하는 방향과 크기로 유도 및 조절할 수 있다. 다른 예에서, siRNA, 미크로RNA, dsRNA 또는 항-센스 RNA 분자를 코딩하는 서열이 본원에 개시된 바와 같이 TCR을 코딩하는 유전자에 의해 제작될 수 있고, 상기 조합은 상기 면역 반응의 범위를 조절할 수 있다. 산물은 상기 코딩 서열이 하나의 프로모터와 기능적 관계에 있는 개시 융합 산물로서 생산될 수 있다. 대안으로서, 상기 산물은 개별적으로 코딩될 수 있고, 각 코딩 서열은 프로모터와 기능적 관계에 있다. 상기 프로모터는 동일하거나 또는 상이할 수 있다.
일부 구체예에서, 벡터는 면역조절 분자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 예시되는 면역조절 분자는 GM-CSF, IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL-12, IL-15, IL-18 IL-21, IL-23, 인터페론 감마, TNFα, B7.1, B7.2, 4-1BB, CD40, CD40 리간드 (CD40L), 약물-유도성 CD40 (iCD40) 등, 또는 리간드, 또는 이에 결합하는 단일 사슬 항체를 포함한다. 상기 폴리뉴클레오티드는 통상적으로 숙주 세포에서 코딩 서열의 발현과 관련된 하나 이상의 조절 요소의 조절하에 있다.
특정 구체예에서, 본원에 개시된 벡터는 체크포인트 저해제를 발현할 수 있다. 상기 체크포인트 저해제는 본원에 개시된 TCRs와 동일한 벡터 또는 개별의 벡터로부터 발현될 수 있다. 면역 체크포인트는 자기-허용을 유지하고 및 면역 반응의 기간 및 진폭을 조절하는데 결정적인 면역계의 다양한 저해 경로를 지칭한다. 종양은, 구체적으로 종양 항원에 특이적인 T 세포에 대해, 면역 저항의 주요 기전으로 특정 면역-체크포인트 경로를 사용한다 (예컨대, Pardoll, 2012 Nature 12:252; Chen and Mellman 2013 Immunity 39:1 참조). 본 개시내용은 본원에 개시된 TCRs과 조합에서 본원에 개시된 발현 벡터로부터 발현될 수 있는 면역 체크포인트 저해제를 제공한다. 예시되는 체크포인트 저해제는, 면역 체크포인트 수용체 리간드에 결합 및 차단 또는 저해하는 면역 체크포인트 수용체 또는 항체, 또는 그의 항원-결합 단편에 결합 및 차단 또는 저해하는 항체, 또는 그의 항원-결합 단편을 포함한다. 차단 또는 저해를 목적으로 할 수 있는 예시되는 면역 체크포인트 분자는, 이에 한정되는 것은 아니지만, CTLA-4, 4-1BB (CD137), 4-1BBL (CD137L), PDL1, PDL2, PD1, B7-H3, B7-H4, BTLA, HVEM, TIM3, GAL9, LAG3, TIM3, B7H3, B7H4, VISTA, KIR, 2B4 (분자의 CD2 패밀리에 속하고, 모든 NK, γδ, 및 메모리 CD8+ (αβ) T 세포에서 발현됨), CD160 (또한, BY55라고 함) 및 CGEN-15049를 포함한다. 면역 체크포인트 저해제는 항체, 또는 그의 항원 결합 단편, 또는 다른 결합 단백질을 포함하고, 이는 CTLA-4, PDL1, PDL2, PD1, B7-H3, B7-H4, BTLA, HVEM, TIM3, GAL9, LAG3, TIM3, B7H3, B7H4, VISTA, KIR, 2B4, CD160 및 CGEN-15049의 하나 이상의 활성에 결합 및 차단 또는 저해한다. 예시되는 면역 체크포인트 저해제는 트레멜리무맙 (Tremelimumab) (CTLA-4 차단 항체), 항-OX40, PD-L1 모노클로날 항체 (항-B7-H1; MEDI4736), MK-3475 (PD-1 차단제), 니볼루맙 (Nivolumab) (항-PD1 항체), CT-011 (항-PD1 항체), BY55 모노클로날 항체, AMP224 (항-PDL1 항체), BMS-936559 (항-PDL1 항체), MPLDL3280A (항-PDL1 항체), MSB0010718C (항-PDL1 항체) 및 여보이 (Yervoy)/이필리무맙 (ipilimumab) (항-CTLA-4 체크포인트 저해제)을 포함한다.
본원의 TCRs을 발현하는 발현 벡터 (예컨대, 레트로바이러스 벡터 또는 렌티바이러스 벡터)는 한번에, 하나 초과, 예컨대, 2, 3, 또는 4개의, 관심 서열을 발현하도록 조작될 수 있다. 단일 벡터로부터 하나 초과의 서열을 동시에 발현시키는 몇가지 방법이 당분야에 알려져 있다. 예를 들면, 상기 벡터는 코딩 서열의 오픈 리딩 프레임 (open reading frames: ORFs)에 융합된 다수의 프로모터, 코딩 서열들 사이에 스플라이싱 신호의 삽입, 발현이 단일 프로모터에 의해 유도되는 관심 서열의 융합, 코딩 서열들 사이에 단백질분해 절단 부위의 삽입, 코딩 서열들 사이에 내부 리보좀 진입 부위 (internal ribosomal entry sites: IRESs)의 삽입, 코딩 서열들 사이에 이-방향성 (bi-directional) 프로모터의 삽입, 및/또는 "자기-분해 (self-cleaving)" 2A 펩티드를 포함할 수 있다. 멀티시스트로닉 (multicistronic) 발현 벡터에서 발현되는 각 구성성분은, 예를 들면 내부 리보좀 진입 부위 (IRES) 요소 또는 바이러스 2A 요소에 의해 분리되어서, 동일한 프로모터로부터 다양한 단백질을 개별적으로 발현시킬 수 있다. IRES 요소 및 2A 요소는 당분야에 알려져 있다 (미국특허 제4,937,190호; de Felipe et al. 2004. Traffic 5: 616-626, 각각은 그 전문이 참조로 본원에 통합됨). 일 구체예에서, 수족구 (foot-and-mouth) 질환 바이러스 (FMDV; F2A), 돼지 (porcine) 테스코바이러스 (teschovirus)-1 (P2A), 말 비염 (rhinitis) A 바이러스 (ERAV; E2A), 및 토세아 아시그나 (thosea asigna) 바이러스 (TaV; T2A) (Szymczak et al. 2004. Nat. Biotechnol. 22: 589-594, 이는 그 전문이 참조로 본원에 통합됨)로부터의 2A-유사 서열과 연결된 푸린 (furin) 절단 부위 서열 (RAKR)을 코딩하는 올리고뉴클레오티드 (Fang et al. 2005. Nat. Biotech 23: 584-590, 이는 그 전문이 참조로 본원에 통합됨)가 멀티시스트로닉 벡터에서 유전 요소를 분리하기 위해 사용된다. 특정 멀티시스트로닉 벡터의 효능이 표준 프로토콜을 사용하여 각 유전자의 발현을 검출함으로써 용이하게 테스트될 수 있다.
관심있는 둘 이상의 서열 (예컨대 TCR 알파 사슬 및 TCR 베타 사슬; 단일 사슬 TCR 및 면역조절 분자를 코딩하는 서열)의 발현이 또한 IRES (Internal Ribosome Entry Sites)를 사용하여 수행될 수 있다. IRES는 5' m7 G-캡 (cap) 구조 이외의 위치에서 진핵세포 리보좀이 mRNA를 진입 및 스캔할 수 있게 한다. 내부에, 예컨대, 제1 코딩 영역 (또는 시스트론)의 3'에 위치하는 경우, IRES는 동일한 전사물내에서 제2 코딩 영역을 번역할 수 있을 것이다. 상기 제2 코딩 영역은 IRES 이후에 처음 만나는 ATG에 의해 식별된다. 예시되는 IRES 요소는 바이러스 IRES 가령 피코르나바이러스 (picornavirus) IRES 및 카르디오바이러스 (cardiovirus) IRES (예컨대, 미국특허 제4,937,190호 참조) 및 5' UTRs에서 발견된 비-바이러스 IRES 요소 (예컨대, 면역글로불린 중쇄 결합 단백질 (BiP)을 코딩하는 전사물의 요소 (Macejak et al., Nature, 35390-4, 1991); 드로소필라 안테나페디아 (Drosophila Antennapedia) (Oh et al., Genes Dev. 6:1643-53, 1992) 및 울트라비토락스 (Ultrabithorax) (Ye et al., Mol . Cell Biol., 17:1714-21, 1997); 섬유아세포 성장 인자 2 (fibroblast growth factor 2) (Vagner et al., Mol. Cell Biol., 15:35-44, 1995); 개시 인자 (initiation factor) eIF4G (Gan et al., J. Biol . Chem . 273:5006-12, 1998); 원-종양유전자 (proto-oncogene) c-myc (Nanbru et al., J. Biol. Chem., 272:32061-6, 1995; Stoneley, Oncogene, 16:423-8, 1998); 및 혈관 내피 성장 인자 (vascular endothelial growth factor: VEGF) (Stein et al., Mol. Cell Biol., 18:3112-9, 1998)의 요소)를 포함한다.
관심있는 둘 이상의 서열의 발현은 또한 이-방향 프로모터, 즉 판독 방향이 서로로부터 멀어지고, 상기 프로모터 영역을 플랭킹 (flanking)하는 2개의 오픈 리딩 프레임이 전사되는 프로모터 영역 또는 2개의 백-투-백 (back-to-back) 클로닝된 프로모터를 사용하여 수행될 수 있다. 이러한 프로모터의 예로는 PDGF-A, 향신경성 (neurotropic) JC 바이러스, BRCA1, 트란스코발라민 (transcobalamin) II, 및 디펩티딜펩티다제 IV 프로모터를 포함한다.
렌티바이러스 입자의 생산
특정 구체예에서, 레트로바이러스 벡터는 T 세포를 형질도입하는데 사용되어 T 세포를 변형하여 본 발명의 TCRs, 및 본원에 개시된 바와 같은 관심있는 다른 서열을 발현한다. 당분야에 이미 알려져 있는 다양한 방법으로, 그의 게놈이 바이러스 벡터 게놈의 RNA 카피를 포함하는, 감염성 바이러스, 예컨대, 레트로바이러스 및 렌티바이러스, 입자를 생산하는데 사용될 수 있다. 일 방법에서, 상기 바이러스 벡터 게놈이 바이러스 게놈 RNA를 패키지하는데 필요한 모든 구성성분들을 포함하는 패키징 세포주로 도입되고, 상기 바이러스 벡터 게놈으로부터 바이러스 입자로 전사된다. 대안으로서, 상기 바이러스 벡터 게놈은 하나 이상의 관심 서열 이외에 바이러스 구성성분을 코딩하는 하나 이상의 유전자를 포함할 수 있다. 그러나, 상기 표적 세포에서 게놈의 복제를 방지하기 위해, 복제에 필요한 내인성 바이러스 유전자는 통상적으로 상기 패키징 세포주에서 제거되고 개별적으로 제공될 것이다.
일반적으로, 상기 레트로바이러스 벡터 입자는 상기 입자를 생성하는데 필요한 구성성분을 포함하는 하나 이상의 플라스미드 벡터로 형질감염된 세포주에 의해 생산된다. 상기 레트로바이러스 벡터 입자는 통상적으로 복제-가능 (replication-competent)하지 않으며, 즉 이들은 1 라운드의 감염만 할 수 있다. 가장 자주, 다수의 플라스미드 벡터는 벡터 입자를 생성하는 다양한 유전 구성성분을 분리하고, 다르게 복제 가능 바이러스를 생성할 수 있는 재조합 이벤트의 기회를 감소시키는데 주로 이용된다. 모든 레트로바이러스 구성성분을 갖는 단일 플라스미드 벡터를 그러나 원한다면 사용할 수 있다. 다수의 플라스미드 벡터를 사용하는 시스템의 일 예로서, 세포주는, LTRs, cis-작용 패키징 서열, 및 관심 서열(들)을 포함하고, 종종 이종 프로모터에 작동가능하게 연결된, 바이러스 벡터 게놈을 포함하는 적어도 하나의 플라스미드 (즉, 벡터 게놈 플라스미드), 바이러스 효소 및 구조 구성성분을 코딩하는 적어도 하나의 플라스미드 (즉, Gag 및 Pol과 같은 구성성분들을 코딩하는 패키징 플라스미드), 및 엔벨로프 당단백질 (예컨대, 레트로바이러스로부터 유래된 엔벨로프 단백질 또는 VSV G, Sindbis 엔벨로프, 홍역 바이러스 엔벨로프 등과 같은 다른 적합한 엔벨로프 당단백질)을 코딩하는 적어도 하나의 엔벨로프 (envelope) 플라스미드로 형질감염된다. 부가의 플라스미드, 예컨대, 본원에 개시된 바와 같고 및 당분야에 알려져 있는 Rev-발현 플라스미드와 같은 레트로바이러스 입자 생산을 증강시키기 위해 사용될 수 있다. 바이러스 입자는 세포막을 통해 발아되어 관심 서열을 포함하는 게놈 및 엔벨로프 당단백질을 포함하는 코어 (core)를 포함한다.
본 개시내용의 플라스미드 벡터에 의한 패키징 세포의 형질감염은 잘 알려져 있는 방법에 의해 수행될 수 있고, 사용되는 방법은 임의의 방법으로 제한되지 않는다. 다수의 비-바이러스 전달 시스템, 예를 들면 전기천공, 리포좀을 포함하는 리피드-기반 전달 시스템, "네이키드 (naked)" DNA의 전달 및 폴리시클로덱스트린 화합물을 사용한 전달, 가령 Schatzlein AG. (2001. Non-Viral Vectors in Cancer Gene Therapy: Principles and Progresses. Anticancer Drugs, 이는 그 전문이 참조로 본원에 통합됨)에 개시된 것이 당분야에 알려져 있다. 양이온성 리피드 또는 염 처리 방법이 통상적으로 사용되고, 예를 들면, Graham et al. (1973. Virol. 52:456; Wigler et al. (1979. Proc . Natl . Acad . Sci . USA 76:1373-76)을 참조하고, 상기 각각은 그 전문이 참조로 본원에 통합된다. 칼슘 포스페이트 침전 방법이 가장 자주 사용된다. 그러나, 핵 미세주입 및 박테리아 프로토플라스트 융합을 포함하는, 상기 벡터를 세포로 도입하는 다른 방법이 또한 사용될 수 있다.
상기 패키징 세포주는, 상기 바이러스 게놈 RNA의 레트로바이러스 (예컨대, 렌티바이러스) 벡터 입자로의 패키징을 위해 인 트란스 (in trans)로 요구되는, 바이러스 조절 및 구조 단백질을 포함하는 구성성분을 제공한다. 상기 패키징 세포주는 렌티바이러스 단백질을 발현하고, 기능적 렌티바이러스 벡터 입자를 생산할 수 있는 임의의 세포주일 수 있다. 몇가지 적합한 패키징 세포주는 293 (ATCC CCL X), 293T, HeLa (ATCC CCL 2), D17 (ATCC CCL 183), MDCK (ATCC CCL 34), BHK (ATCC CCL-10) 및 Cf2Th (ATCC CRL 1430) 세포를 포함한다. 상기 패키징 세포주는 상기 필요한 바이러스 단백질을 안정하게 발현할 수 있다. 이러한 패키징 세포주가 예를 들면, 미국특허 제6,218,181호에 개시되어 있고, 이는 그 전문이 참조로 본원에 통합된다. 대안으로서, 패키징 세포주는, 바이러스 벡터 게놈과 함께 하나 이상의 필요한 바이러스 단백질을 코딩하는 핵산 분자로 일시적으로 형질감염될 수 있다. 결과의 바이러스 입자가 수집되고, 표적 세포를 감염시키기 위해 사용된다. 엔벨로프 당단백질(들)을 코딩하는 유전자(들)이 대개 발현 벡터, 가령 pcDNA3 (Invitrogen, CA USA)로 클로닝된다. 진핵세포 발현 벡터가 당분야에 잘 알려져 있고, 다수의 상업적 공급원으로부터 이용가능하다. 패키징 세포, 가령 293T 세포는 그 후 관심 서열을 코딩하는 (통상적으로 항원을 코딩하는) 바이러스 벡터 게놈, 바이러스 팩킹 (packing) 구성성분을 코딩하는 적어도 하나의 플라스미드, 및 표적 분자의 발현을 위한 벡터에 의해 동시-형질감염된다. 상기 엔벨로프는 상기 패키징 세포의 막에서 발현되고, 상기 바이러스 벡터로 통합된다.
본원에서 제공된 목적에 있어서, 본원에서 TCRs가 T 세포 또는 NK 세포 또는 면역계의 다른 적합한 세포에서 발현될 수 있다. 상기 T 세포는 임의의 T 세포, 가령 배양된 T 세포, 예컨대, 1차 T 세포, 또는 배양된 T 세포주로부터의 T 세포, 예컨대, Jurkat, SupT1 등, 또는 포유동물에서 입수된 T 세포일 수 있다. 포유동물에서 입수한 경우, 상기 T 세포는, 이에 한정되는 것은 아니지만, 혈액, 말초 혈액 단핵 세포 (peripheral blood mononuclear cells: PBMCs), 말초 혈액 백혈구 (PBLs), 성분채집술 (apheresis) 시료, 골수, 림프절, 갑상샘, 또는 다른 조직 또는 체액을 포함하는 다수의 공급원으로부터 입수될 수 있다. T 세포는 또한 농축 또는 정제될 수 있다. 일부 구체예에서, 상기 T 세포는 인간 T 세포이다. 일부 구체예에서, 상기 T 세포는 인간으로부터 단리된 T 세포이다. 상기 T 세포는 임의 타입의 T 세포일 수 있고, 이에 한정되는 것은 아니지만, CD4+/CD8+ 이중 포지티브 T 세포, CD4+ 헬퍼 T 세포, 예컨대, Th1 및 Th2 세포, CD8+ T 세포 (예컨대, 세포독성 T 세포), 종양 침윤 세포 (TILs), 메모리 T 세포, 나이브 T 세포 등을 포함하는 임의의 발생 단계를 가질 수 있다.
본원에 개시된 적어도 하나의 세포를 포함하는 세포의 개체군이 본 개시내용에 또한 제공된다. 세포의 개체군은, 적어도 하나의 다른 세포 (예컨대, T 세포) 이외에, 개시된 재조합 발현 벡터의 어느 것을 포함하는 숙주 세포를 포함하는 이종 개체군일 수 있고, 이는 임의의 재조합 발현 벡터, T 세포 이외의 세포, 예컨대, B 세포, NK 세포, 마크로파지, 중성구, 적혈구, 간세포 (hepatocyte), 내피 세포, 상피 세포, 근육 세포, 뇌 세포 등을 포함하지 않는다. 대안으로서, 상기 세포의 개체군은 실질적으로 동종 개체군일 수 있고, 상기 개체군은 주로 재조합 발현 벡터를 포함하는 세포를 포함한다 (예컨대, 필수적으로 구성된다). 상기 개체군은 또한 세포의 클로날 개체군일 수 있고, 상기 개체군의 모든 세포는 재조합 발현 벡터를 포함하는 단일 세포의 클론이고, 상기 개체군의 모든 세포는 재조합 발현 벡터를 포함한다. 본 발명의 일 구체예에서, 상기 세포의 개체군은 본원에 개시된 바와 같은 재조합 발현 벡터를 포함하는 세포를 포함하는 클로날 개체군이다.
T 세포의 엑스 비보 유전 변형
상기에서 언급된 바와 같이, 특정 구체예에서, 엑스 비보에서 T 세포를 유전적으로 변형하기 위해 본원에 개시된 바이러스 벡터를 사용하는 것이 바람직할 수 있다. 이와 관련하여, T 세포의 공급원, 배양 및 T 세포의 증식이 개시되어 있다.
T 세포의 증식 및 유전 변형 전에, T 세포의 공급원은 피험체로부터 입수될 수 있다. T 세포는 말초 혈액 단핵 세포, 골수, 림프절 조직, 제대혈 (cord blood), 갑상샘 조직, 감염 부위로부터의 조직, 복수 (ascites), 가슴막 삼출액 (pleural effusion), 비장 조직, 및 종양을 포함하는 다수의 공급원으로부터 입수될 수 있다. 본 발명의 특정 구체예에서, 당분야에서 이용할 수 있는 T 세포주의 임의의 수가 사용될 수 있다. 본 발명의 특정 구체예에서, T 세포는 당분야의 통상의 지식을 가진 자에게 알려져 있는 임의의 기술, 가령 FICOLLTM 분리를 사용하여 피험체로부터 수집된 혈액 유닛으로부터 입수될 수 있다. 일 구체예에서, 개체의 순환하는 혈액으로부터의 세포가 성분채집술에 의해 입수된다. 상기 성분채집술 산물은 통상적으로 T 세포, 단핵구, 과립구, B 세포, 다른 핵화된 백혈구 세포, 적혈구 세포, 및 혈소판을 포함하는 림프구를 포함한다. 일 구체예에서, 성분채집술에 의해 수집된 세포가 세척되어 혈장 분획을 제거하고 후속 처리 단계를 위해 적합한 버퍼 또는 배지에 상기 세포를 넣을 수 있다. 본 발명의 일 구체예에서, 상기 세포는 포스페이트 완충된 식염수 (phosphate buffered saline: PBS)로 세척된다. 대안의 구체예에서, 상기 세척 용액은 칼슘이 결여되어 있고, 마그네슘이 결여되어 있을 수 있거나, 또는 특히 모든 2가 양이온이 결여되어 있을 수 있다. 다시, 놀랍게도, 칼슘 부재하에 초기 활성화 단계는 확대된 (magnified) 활성화를 유도한다. 당분야의 통상의 지식을 가진 자라면, 제조자의 지시에 따라 반-자동화된 "플로우-스로우 (flow-through)" 원심분리 (예를 들면, Cobe 2991 세포 프로세서, Baxter CytoMate, 또는 Haemonetics Cell Saver 5)를 사용하는 것과 같이 당 분야에 알려져 있는 방법에 의해 세척 단계가 수행될 수 있다는 것을 쉽게 알 수 있을 것이다. 세척 후에, 상기 세포는 다양한 생체적합성 버퍼, 가령 예를 들면, Ca2 +- 유리, Mg2 +-유리 PBS, PlasmaLyte A, 또는 버퍼를 갖거나 또는 갖지 않는 다른 식염수 용액에 재현탁될 수 있다. 대안으로서, 상기 성분채집술 시료의 바람직하지 않은 구성성분들이 제거될 수 있고 상기 세포가 배양 배지에 직접 재현탁될 수 있다.
또다른 구체예에서, T 세포는 적혈구 세포를 용균시키고, 예를 들면 PERCOLLTM 구배를 통한 원심분리 또는 카운터플로우 (counterflow) 원심 용출법 (centrifugal elutriation)에 의해 단핵구를 고갈시킴으로써 말초 혈액 림프구로부터 단리된다. T 세포의 특정 하위개체군 (subpopulation), 가령 CD3+, CD28+, CD4+, CD8+, CD45RA+, 및 CD45RO+ T 세포는 포지티브 또는 네가티브 선별 기술에 의해 더 단리될 수 있다. 예를 들면, 일 구체예에서, T 세포는 항-CD3/항-CD28 (즉, 3X28)-콘쥬게이트된 비드, 가령 DYNABEADSTM M-450 CD3/CD28 T와, 원하는 T 세포의 포지티브 선별을 위한 충분한 시간동안 인큐베이션에 의해 단리된다. 일 구체예에서, 상기 시간 기간은 약 30분이다. 부가의 구체예에서, 상기 시간 기간은 30분 내지 36시간 또는 그 이상의 범위이고, 그 사이에 있는 모든 정수 값을 포함한다. 부가의 구체예에서, 상기 시간 기간은 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6 시간이다. 더욱더 바람직한 구체예에서, 상기 시간 기간은 10 내지 24 시간이다. 일 바람직한 구체예에서, 상기 인큐베이션 시간 기간은 24시간이다. 백혈병을 앓는 환자로부터 T 세포의 단리를 위해, 더 긴 인큐베이션 시간, 가령 24시간을 사용하여 세포 수득율을 증가시킬 수 있다. 종양 조직 또는 면역-저하 (immune-compromised) 개체로부터 종양 침윤 림프구 (TIL)를 단리하는 것과 같이, 다른 세포 타입과 비교하여 T 세포가 적은 상황에서 T 세포를 단리하기 위해 더 긴 인큐베이션 시간이 사용될 수 있다. 또한, 더 긴 인큐베이션 시간을 사용하여, CD8+ T 세포의 캡쳐 효능을 증가시킬 수 있다. 그러므로, 시간을 간단히 단축 또는 연장시킴으로써, T 세포가 CD3/CD28 비드에 결합하도록 할 수 있고 및/또는 T 세포에 대한 비드의 비율을 증가 또는 감소시킴으로써 (본원에서 이후에 개시되는 바와 같이), T 세포의 하위개체군이 배양 개시에서 또는 과정 동안 다른 시점에서 우선적으로 선별될 수 있다. 부가로, 상기 비드 또는 다른 표면에서 항-CD3 및/또는 항-CD28 항체의 비율을 증가 또는 감소시킴으로써, T 세포의 하위개체군은 배양 개시 또는 다른 원하는 시점에서 우선적으로 선별될 수 있다. 당업자는 다수의 선별 라운드가 본 발명과 관련하여 또한 사용될 수 있다는 것을 알 수 있을 것이다. 특정 구체예에서, 상기 선별 절차를 수행하고, 활성 및 증식 과정에서 "선별되지 않은" 세포를 사용하는 것이 바람직할 수 있다. "선별되지 않은" 세포가 또한 추가의 선별 라운드로 처리될 수 있다.
네가티브 선별에 의한 T 세포 개체군의 농축은 네가티브 선별된 세포에 독특한 표면 마커와 관련된 항체의 조합에 의해 수행될 수 있다. 일 방법은 네가티브 선별된 세포에 존재하는 세포 표면 마커에 대한 모노클로날 항체의 칵테일 (cocktail)을 사용하는 유세포측정 또는 네가티브 마그네틱 면역흡착을 통한 세포 정렬 및/또는 선별이다. 예를 들면, 네가티브 선별에 의해 CD4+ 세포를 농축시키기 위해서, 모노클로날 항체 칵테일은 통상적으로 CD 14, CD20, CD11b, CD16, HLA-DR, 및 CD8에 대한 항체를 포함한다. 특정 구체예에서, 통상적으로 CD4+, CD25+, CD62Lhi, GITR+, 및 FoxP3+를 발현하는 조절 T 세포에 대한 농축 또는 포지티브 선별이 바람직할 수 있다. 대안으로서, 특정 구체예에서, T 조절 세포는 항-C25 콘쥬게이트된 비드 또는 다른 유사한 선별 방법에 의해 고갈된다.
포지티브 또는 네가티브 선별에 의해 세포의 원하는 개체군의 단리에 있어서, 세포 및 표면 (예컨대, 입자 가령 비드)의 농도는 가변될 수 있다. 특정 구체예에서, 세포 및 비드를 최대로 접촉시키기 위해, 비드 및 세포가 함께 혼합되는 부피를 상당히 감소시키는 (즉, 세포 농도를 증가시키는) 것이 바람직할 수 있다. 예를 들면, 일 구체예에서, 2십억 세포/ml의 농도가 사용된다. 일 구체예에서, 1,000,000,000 세포/ml의 농도가 사용된다. 부가의 구체예에서, 100,000,000 이상의 세포/ml이 사용된다. 부가의 구체예에서, 10,000,000, 15,000,000, 20,000,000, 25,000,000, 30,000,000, 35,000,000, 40,000,000, 45,000,000, 또는 50,000,000 세포/ml의 세포의 농도가 사용된다. 더 또다른 구체예에서, 75,000,000, 80,000,000, 85,000,000, 90,000,000, 95,000,000, 또는 100,000,000 세포/ml의 세포의 농도가 사용된다. 부가의 구체예에서, 125,000,000 또는 150,000,000 세포/ml의 농도가 사용될 수 있다. 고농도를 사용하여 세포 수득율, 세포 활성화 및 세포 증식의 증가를 유도할 수 있다. 또한, 높은 세포 농도의 사용은 관심 있는 표적 항원, 가령 CD28-네가티브 T 세포, 또는 많은 종양 세포가 존재하는 시료 (즉, 백혈병 환자의 혈액, 종양 조직 등)로부터 약하게 발현할 수 있는 세포를 더 효과적으로 캡쳐할 수 있다. 이러한 세포의 개체군은 치료적 가치를 가질 수 있고, 입수하는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들면, 고 농도의 세포를 사용하여, 통상적으로 더 약한 CD28 발현을 갖는 CD8+ T 세포를 더 효과적으로 선별할 수 있다.
특정 구체예에서, T 세포의 특정 서브-타입이 단리될 수 있고, 본원에 개시된 바와 같이 렌티바이러스 벡터 입자에 의해, 예를 들면, WO 2012/129514에 개시된 것과 같은 방법을 사용하여 유전적으로 변형될 수 있고, 이의 개시내용은 그 전문이 참조로 포함된다.
관련된 구체예에서, 더 낮은 농도의 세포를 사용하는 것이 바람직할 수 있다. T 세포 및 표면 (예컨대, 입자 가령 비드)의 혼합물을 상당히 희석시킴으로써, 상기 입자와 세포 사이의 상호작용이 최소화된다. 이는 상기 입자에 결합될 원하는 항원의 높은 양을 발현하는 세포를 선별한다. 예를 들면, CD4+ T 세포는 더 높은 수준의 CD28을 발현하고, CD8+ T 세포보다 희석 농도에서 더 효과적으로 캡쳐된다. 일 구체예에서, 사용된 세포의 농도는 5X106/ml이다. 다른 구체예에서, 사용된 농도는 약 1X105/ml 내지 1X106/ml, 및 그 사이의 임의의 정수 값일 수 있다.
다른 구체예에서, 상기 세포는 회전기 (rotator)에서 다양한 시간 동안 다양한 속도로 2-10℃ 또는 실온에서 인큐베이트될 수 있다.
자극을 위한 T 세포는 세척 단계 후에 또한 동결될 수 있다. 이론에 국한되지 않고, 동결 및 후속한 해동 단계는 과립구 제거 및 상기 세포 개체군에서 어느 정도의 단핵구를 제거하여 더 균일한 산물을 제공한다. 혈장 및 혈소판을 제거한 세척 단계 후에, 상기 세포가 동결 용액에 현탁될 수 있다. 많은 동결 용액 및 파라미터가 당분야에 알려져 있고, 본 문맥에서 사용될 수 있고, 일 방법은 20% DMSO 및 8% 인간 혈청 알부민을 포함하는 PBS, 또는 10% 덱스트란 40 및 5% 덱스트로스, 20% 인간 혈청 알부민 및 7.5% DMSO, 또는 31.25% Plasmalyte-A, 31.25% 덱스트로스 5%, 0.45% NaCl, 10% 덱스트란 40 및 5% 덱스트로스, 20% 인간 혈청 알부민, 및 7.5% DMSO를 포함하는 배양 배지, 또는 예를 들면, Hespan 및 PlasmaLyte A를 포함하는 다른 적합한 세포 동결 배지를 사용하는 것을 포함하고, 상기 세포는 그 후 -80℃로, 분당 1o의 속도로 동결되고, 액체 질소 저장 탱크의 증기 상에서 보관된다. 제어된 동결의 다른 방법 뿐만 아니라 -20℃ 또는 액체 질소에서 제어되지 않은 즉시 동결이 사용될 수 있다.
특정 구체예에서, 냉동보존된 세포가 본원에 개시된 바와 같이 해동 및 세척되고, 본 발명의 방법을 사용하여 활성화시키기 전에 실온에서 한 시간 동안 휴지시킨다.
또한 본 발명과 관련하여 본원에 개시된 바와 같이 증식된 세포를 필요로 할 수 있는 시기 이전에 피험체로부터 혈액 시료 또는 성분채집술 산물의 수집이 고려된다. 이와 같이, 증식되는 상기 세포의 공급원은 임의의 필요한 시점에서 수집될 수 있고, 원하는 세포, 가령 T 세포는 본원에 개시된 것과 같은 T 세포 요법으로부터 편익을 얻을 수 있는 임의의 질환 또는 상태를 위한 T 세포 요법에서 이후에 사용하기 위해 단리 및 동결될 수 있다. 일 구체예에서 혈액 시료 또는 성분채집술은 일반적으로 건강한 피험체로부터 채취된다. 특정 구체예에서, 혈액 시료 또는 성분채집술은, 질병으로 발전할 위험이 있지만, 아직 질병으로 발전되지 않은 일반적으로 건강한 피험체로부터 채취되고, 관심 세포가 이후 사용을 위해 단리 및 동결된다. 특정 구체예에서, 상기 T 세포가 이후에 증식, 동결 및 사용될 수 있다. 특정 구체예에서, 시료는 본원에 개시된 바와 같이 특정 질환의 진단 직후, 임의의 치료 전에 환자로부터 수집된다. 부가의 구체예에서, 상기 세포는, 이에 한정되는 것은 아니지만, 나탈리주맙 (natalizumab), 에팔리주맙 (efalizumab), 항바이러스제, 화학요법, 방사선, 면역억제제, 가령 시클로스포린 (cyclosporin), 아자티오프린 (azathioprine), 메토트렉세이트, 미코페놀레이트 (mycophenolate), 및 FK506, 항체, 또는 다른 면역제거제 (immunoablative agents) 가령 CAMPATH, 항-CD3 항체, 시톡산 (cytoxan), 플루다라빈 (fludarabine), 시클로스포린 (cyclosporin), FK506, 라파마이신 (rapamycin), 미코페놀산 (mycophenolic acid), 스테로이드, FR901228, 및 방사선 조사와 같은 작용제에 의한 치료를 포함하는 관련 치료 형태 전에 피험체로부터의 혈액 시료 또는 성분채집술로부터 단리된다. 상기 약물은 칼슘 의존성 포스파타제 칼시뉴린 (calcineurin) (시클로스포린 및 FK506)을 저해하거나 또는 성장 인자 유도된 신호전달 (라파마이신)에 중요한 p70S6 키나제를 저해한다 (Liu et al., Cell 66:807-815, 1991; Henderson et al., Immun 73:316-321, 1991; Bierer et al., Curr. Opin. Immun. 5:763-773, 1993). 부가의 구체예에서, 상기 세포가 환자를 위해 단리되고, 골수 또는 줄기 세포 이식 (transplantation), 플루다라빈 (fludarabine)과 같은 화학요법제를 사용하는 T 세포 제거 요법, 외부-빔 방사선 요법 (XRT), 시클로포스파미드, 또는 항체 가령 OKT3 또는 CAMPATH와 함께 (예컨대, 이전, 동시 또는 이후) 이후에 사용하기 위해 동결된다. 또다른 구체예에서, 상기 세포는 이전에 단리되고, 리툭산 (Rituxan)과 같은 CD20과 반응하는 작용제와 같은 B-세포 제거 요법 후의 치료를 위한 이후 사용을 위해 동결될 수 있다.
부가의 구체예에서, T 세포가 치료 직후에 환자로부터 입수된다. 이와 관련하여, 특정 암 치료, 구체적으로 환자가 통상적으로 치료로부터 회복될 수 있는 기간 동안 치료 직후 면역계에 손상을 주는 약물로 치료한 후에, 수득된 T 세포의 품질은 엑스 비보에서 증식하는 그의 역량이 최적 또는 향상되었음이 관찰되었다. 마찬가지로, 본원에 개시된 방법을 사용하는 엑스 비보 조작 이후에, 상기 세포는 향상된 생장 (engraftment) 및 인 비보 증식을 위해 바람직한 상태에 있을 수 있다. 그러므로, 본 발명의 문맥안에서 상기 회복 단계 동안 T 세포, 수지상 세포, 또는 조혈세포 계열 (hematopoietic lineage)의 다른 세포를 포함하는 혈액 세포를 수집하는 것이 고려된다. 또한, 특정 구체예에서, 이동 (mobilization) (예를 들면, GM-CSF에 의한 이동) 및 컨디셔닝 요법 (conditioning regimens)은 피험체에서 컨디션을 형성하는데 사용되고, 특정 세포 타입의 재증식 (repopulation), 재순환 (recirculation), 재생성 (regeneration), 및/또는 증식이, 특히 치료 이후 한정된 시간 윈도우 동안 유익하다. 예시되는 세포 타입은 T 세포, B 세포, 수지상 세포, 및 면역계의 다른 세포를 포함한다.
관심 서열을 엑스 비보에서 발현하기 위한 T 세포의 유전 변형 전 또는 후에, 상기 T 세포는 당분야에 알려져 있는 방법을 사용하여 일반적으로 활성화 및 증식될 수 있다. T 세포를 활성화 및 증식하는 예시되는 방법은, 예를 들면, 미국특허 제6,352,694호; 제6,534,055호; 제6,905,680호; 제6,692,964호; 제5,858,358호; 제6,887,466호; 제6,905,681호; 제7,144,575호; 제7,067,318호; 제7,172,869호; 제7,232,566호; 제7,175,843호; 제5,883,223호; 제6,905,874호; 제6,797,514호; 제6,867,041호; 및 공개된 출원 WO2012/129514 및 US20060121005에 개시된 바와 같고, 이들 개시내용은 그 전문이 참조로 본원에 통합된다.
특정 구체예에서, T 세포는 CD3/TCR 복합체 관련된 신호를 자극하는 작용제 및 T 세포의 표면에서 공자극 분자를 자극하는 리간드에 부착된 표면과 접촉에 의해 증식될 수 있다. 구체적으로, T 세포 개체군은 본원에 개시된 바와 같이, 가령 항-CD3 항체, 또는 그의 항원-결합 단편, 또는 표면에 고정된 항-CD2 항체와의 접촉, 또는 칼슘 이오노포어 (ionophore)와 함께 단백질 키나제 C 활성인자 (예컨대, 브리오스타틴 (bryostatin))와 접촉에 의해 자극될 수 있다. T 세포의 표면에서 부속 분자의 공-자극에 있어서, 상기 부속 분자에 결합하는 리간드가 사용된다. 예를 들면, T 세포의 개체군은 항-CD3 항체 및 항-CD28 항체와, 상기 T 세포의 증식을 자극하는데 적합한 조건하에 접촉될 수 있다. CD4+ T 세포 또는 CD8+ T 세포의 증식을 자극하기 위해서, 항-CD3 항체 및 항-CD28 항체. 항-CD28 항체의 예로는 9.3, B-T3, XR-CD28을 포함하고 (Diaclone, Besancon, France) 당분야에 통상적으로 알려진 다른 방법이 사용될 수 있다 (Berg et al., Transplant Proc. 30(8):3975-3977, 1998; Haanen et al., J. Exp. Med. 190(9):13191328, 1999; Garland et al., J. Immunol. Meth. 227(1-2):53-63, 1999).
특정 구체예에서, 상기 1차 활성화 신호는 항-CD3 항체 또는 그의 항원-결합 단편이고, 상기 공자극 신호를 제공하는 작용제는 항-CD28 항체 또는 그의 항원-결합 단편이고; 및 두 작용제는 동일한 비드에 동등한 분자량으로 동시-고정 (co-immobilized)된다.
특정 구체예에서 세포 대 입자의 비율은 1:100 내지 100:1의 범위 및 그 사이의 임의의 정수 값이고, 부가의 구체예에서, 상기 비율은 1:9 내지 9:1 및 그 사이의 임의의 정수 값을 포함하고, T 세포를 자극하기 위해서 또한 사용될 수 있다. T 세포 자극을 유도하는 항-CD3- 및 항-CD28-결합된 (coupled) 입자 대 T 세포의 비율은 상기에 언급된 바와 같이 다양할 수 있고, 그러나 특정 바람직한 값은 1:100, 1:50, 1:40, 1:30, 1:20, 1:10, 1:9, 1:8, 1:7, 1:6, 1:5, 1:4, 1:3, 1:2, 1:1, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1, 10:1, 및 15:1을 포함하고, 하나의 바람직한 비율은 적어도 1:1의 T 세포 당 입자이다. 일 구체예에서, 입자 대 세포의 비율은 1:1 또는 미만으로 사용된다. 일 특정 구체예에서, 바람직한 입자: 세포 비율은 1:5이다. 부가의 구체예에서, 입자 대 세포의 비율은 자극 일수에 따라 가변될 수 있다.
T 세포 배양을 위한 적합한 조건은, 증식 및 생존력을 위해 필요한 인자를 포함할 수 있고, 혈청 (예컨대, 우 태아 또는 인간 혈청), 인터류킨-2 (IL-2), 인슐린, IFN-.감마., IL-4, IL-7, GM-CSF, IL-10, IL-12, IL-15, TGF.베타., 및 TNF-.알파. 또는 당업자에게 알려져 있는 세포의 성장을 위한 임의의 다른 첨가제를 포함하는 적합한 배지 (예컨대, 최소 필수 배지 또는 RPMI Media 1640 또는, X-vivo 15, (Lonza))를 포함한다. 세포의 성장을 위한 다른 첨가제는, 이에 한정되는 것은 아니지만, 계면활성제, 플라스마네이트 (plasmanate), 및 환원제 가령 N-아세틸-시스테인 및 2-머캅토에탄올을 포함한다. 배지는 RPMI 1640, AIM-V, DMEM, MEM, α-MEM, F-12, X-Vivo 15, 및 X-Vivo 20 Optimizer를 포함하고, 아미노산, 소듐 피루베이트, 및 비타민을 첨가하고, 혈청-프리 (serum-free) 또는 적합한 양의 혈청 (또는 혈장) 또는 한정된 호르몬 세트가 보충되고, 및/또는 T 세포의 성장 및 증식을 위해 충분한 양의 시토킨(들)을 포함한다. 항생제, 예컨대, 페니실린 및 스트렙토마이신이 실험 배양물에만 포함되고, 피험체에게 주입되는 세포의 배양물에는 포함되지 않는다. 상기 표적 세포가 성장을 뒷받침하는데 필요한 조건, 예를 들면, 적합한 온도 (예컨대, 37℃) 및 대기 (예컨대, 공기 + 5% CO2) 하에 유지된다.
가변하는 자극 시간에 노출되어지는 T 세포는 다른 특성을 나타낼 수 있다. 예를 들면, 통상적인 혈액 또는 성분채집된 (apheresed) 말초 혈액 단핵 세포 산물은 세포독성 또는 억제인자 T 세포 개체군 (Tc, CD8+)보다 더 많은 헬퍼 T 세포 개체군 (TH, CD4+)을 갖는다. CD3 및 CD28 수용체를 자극하여 T 세포의 엑스 비보 증식은, 약 8-9일 전에 주로 TH 세포로 구성되는 T 세포의 개체군을 생산하고, 약 8-9일 후에, T 세포의 개체군은 점점 더 많은 TC 세포의 개체군을 포함한다. 따라서, 치료 목적에 따라서, 주로 TH 세포를 포함하는 T 세포 개체군을 피험체에게 주입하는 것이 유익할 수 있다. 유사하게, TC 세포의 항원-특이적 서브세트가 분리되어 지는 경우, 상기 서브세트를 더 큰 정도로 증식시키는 것이 유익할 수 있다.
또한, CD4 및 CD8 마커 이외에, 다른 표현형의 마커는 상당히 가변하지만, 그러나 대부분 세포 증식 과정의 코스동안 재현가능하다. 그러므로, 이러한 재현성은 특정 목적을 위해 활성화된 T 세포 산물을 맞춤화하는 역량을 가능하게 한다.
특정 구체예에서, 본 개시내용은 본원에 개시된 바와 같이 TCR을 안정하게 발현하도록 유전적으로 변형된 T 세포의 사용을 고려하였다. T 세포 발현 및 조작된 TCR은 본원에서 키메라 TCR 변형된 T 세포라고 한다. 바람직하게, 상기 세포는 그 표면에서 항체 결합 도메인을 안정하게 발현하도록 유전적으로 변형되어, MHC 비의존적인 신규한 항원 특이성을 전달할 수 있다.
변형된 T 세포를 포함하는 조성물 및 그의 투여
특정 구체예에서, 본 개시내용은 관심 이식유전자, 가령 본원에 개시된 조작된 TCRs을 발현하도록 본원에 개시된 렌티바이러스 벡터 입자를 사용하여 변형되어진 T 세포를 포함하는 조성물을 제공한다. 상기 조성물은 이후 본원에 개시되는 바와 같이 본 개시내용의 방법으로 피험체에게 투여될 수 있다.
본원에 개시된 바와 같은 변형된 T 세포를 포함하는 조성물은 알려진 기술에 따라 입양 면역요법을 위한 방법 및 조성물, 본 개시내용에 기반하여 당업자에게 알려져 있는 그의 변형에 사용될 수 있다. 예컨대, Gruenberg et al의 미국특허출원공보 제2003/0170238호를 참조하고; 또한 Rosenberg의 미국특허 제4,690,915호를 참조한다.
일부 구체예에서, 상기 세포는 먼저 그의 배양 배지로부터 이를 수확하고, 그 후 세척하고, 치료적-유효한 양으로 투여하기에 적합한 배지 및 컨테이너 시스템 ("약학적으로 허용가능한" 담체)에서 상기 세포를 농축하여 제제화된다. 적합한 인퓨젼 배지는 임의의 등장 배지 제제 (isotonic medium formulation), 전형적으로, 통상의 식염수, Normosol R (Abbott) 또는 Plasma-Lyte A (Baxter)일 수 있고, 또한 수중 5% 덱스트로스 또는 링거 락테이트 (Ringer's lactate)가 이용될 수 있다. 상기 인퓨젼 배지에 인간 혈청 알부민이 보충될 수 있다.
상기 조성물에서 세포의 치료적-유효한 양은 통상적으로 102 초과의 세포, 및 최대 106, 최대 및 108 또는 109 이하의 세포이고, 1010 이상의 세포일 수 있다. 상기 세포의 수는, 상기 조성물에 포함되는 세포의 타입에 따라 상기 조성물의 의도되는 최종 용도에 의존할 것이다. 예를 들면, 특정 항원에 특이적인 세포를 원한다면, 상기 개체군은 이러한 세포의 70% 초과, 일반적으로 80% 초과, 85% 및 90-95%를 포함할 것이다. 본원에 제공된 용도에 있어서, 상기 세포는 일반적으로 1 리터 이하의 부피, 500 ml 이하, 심지어 250 ml 또는 100 ml 이하의 부피로 존재한다. 그러므로, 상기 원하는 세포의 밀도는 통상적으로 106 초과의 세포/ml, 일반적으로 107 초과의 세포/ml, 일반적으로 108 세포/ml 또는 그 이상이다. 면역 세포의 임상적으로 관련된 수는, 누적하여 109, 1010 또는 1011 세포와 동일 또는 초과하는, 또는 당분야의 임상 전문의에 의해 결정되는 바와 같은 면역 세포의 적합한 수로 다수의 인퓨젼으로 분배될 수 있다.
진단 및 치료 방법
암 (예컨대, NY-ESO-1 암)을 치료하는 방법에서 사용하거나 또는 NY-ESO-1을 발현하는 암 세포의 증식을 저해하는데 사용하기 위한, 조작된 TCRs을 포함하는 조성물 (예컨대, 본원에 개시된 가용성 TCRs, 및 그의 융합 단백질 또는 키메라 단백질); 조작된 TCR을 코딩하는 서열을 포함하는 바이러스 벡터 입자를 포함하는 조성물; 또는 본원에 개시된 조작된 TCRs을 발현하는 세포, 구체적으로 T 세포를 포함하는 조성물이 본원에 또한 제공된다.
이와 관련하여, 치료적 조성물을 포유동물 피험체에게 투여하는 단계를 포함하는, 포유동물 피험체에서 NY-ESO-1 발현과 관련된 암을 치료하는 방법이 본원에 개시되었고, 상기 조성물은 (a) 본원에 개시된 바와 같은 조작된 TCR; (b) 본원에 개시된 조작된 TCR 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 단리된 세포; (c) MHC 분자와 관련하여 NY-ESO-1에 특이적인 가용성 TCR을 포함하는 가용성 TCR, 또는 키메라 또는 융합 폴리펩티드; (d) 조작된 TCR 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; (e) MHC 분자와 관련하여 NY-ESO-1에 특이적인 가용성 TCR을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; (f) NY-ESO-1/MHC 복합체에 특이적인 본원의 조작된 TCR 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 바이러스 벡터로 구성된 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 치료제를 포함하고; 상기 치료적 조성물은 상기 피험체에서 상기 암을 치료하는데 유효한 양으로 상기 피험체에게 투여된다. 본원에 개시된 암을 치료하는 방법 및 암의 증식을 저해하는 방법에 사용하기 위한 본원에 개시된 조작된 TCRs에서 사용하기 위한 예시되는 TCR 서열이 서열 목록에 제공되었고, 서열번호: 9에 제공된 베타 사슬 가변 영역 및 서열번호: 8에 제공된 알파 사슬 가변 영역을 포함한다.
이와 관련하여, 치료적 조성물을 포유동물 피험체에게 투여하는 단계를 포함하는, 포유동물 피험체에서 NY-ESO-1 발현과 관련된 암을 치료하는 방법이 본원에 개시되었고, 상기 조성물은 (a) NY-ESO-1에 특이적인 VβCDR3을 포함하는 조작된 TCR 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 단리된 세포로서, 상기 VβCDR3은 CASSLNRDXXXXF의 아미노산 서열 (서열번호: 1)을 포함하거나 또는 상기 V 베타 CDR3은 서열번호: 2 - 4에 개시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하거나; 또는 상기 베타 사슬 가변 영역은 서열번호: 9에 제공된 바와 같고 상기 알파 사슬 가변 영역은 서열번호: 8에 제공된 바와 같은 것인 단리된 세포; (b) MHC 분자와 관련하여 NY-ESO-1에 특이적인 Vβ 사슬 CDR3을 포함하는, 가용성 TCR, 또는 상기 가용성 TCR을 포함하는 키메라 또는 융합 폴리펩티드로서, 상기 Vβ CDR3은 CASSLNRDXXXXF의 아미노산 서열 (서열번호: 1)을 포함하거나 또는 상기 V 베타 CDR3은 서열번호: 2 - 4에 개시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 것인 가용성 TCR, 또는 상기 가용성 TCR을 포함하는 키메라 또는 융합 폴리펩티드; (c) NY-ESO-1에 특이적인 Vβ 사슬 CDR3을 포함하는 키메라 TCR 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드로서, 상기 Vβ CDR3은 CASSLNRDXXXXF의 아미노산 서열 (서열번호: 1)을 포함하거나 또는 상기 V 베타 CDR3은 서열번호: 2 - 4에 개시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 것인 폴리뉴클레오티드; (d) MHC 분자와 관련하여 NY-ESO-1에 특이적인 Vβ 사슬 CDR3을 포함하는 가용성 TCR을 코딩하는 폴리뉴클레오티드로서, 상기 Vβ CDR3은 CASSLNRDXXXXF의 아미노산 서열 (서열번호: 1)을 포함하거나 또는 상기 V 베타 CDR3은 서열번호: 2 - 4에 개시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 것인 폴리뉴클레오티드; (e) NY-ESO-1에 특이적인 Vβ 사슬 CDR3을 포함하는 키메라 TCR 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터; 및 (f) MHC 분자와 관련하여 NY-ESO-1에 특이적인 Vβ 사슬 CDR3을 포함하는 벡터로 구성된 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 치료제를 포함하고, 상기 치료적 조성물은 상기 피험체에서 상기 암을 치료하는데 유효한 양으로 상기 피험체에게 투여된다. 본원에 개시된 특정 구체예에서, 상기 조작된 TCR은 서열번호: 8 및 9에 각각 제공된 바와 같은 알파 사슬 가변 영역 및 베타 사슬 가변 영역을 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이 용어 "NY-ESO-1 암" 및 "NY-ESO-1을 발현하는 암 세포"는 NY-ESO-1 종양 항원을 발현하는 세포를 포함하는 종양을 지칭한다. 이러한 암은 당분야에 알려져 있고, 특정 암에서 NY-ESO-1의 발현은 당분야의 통상의 지식을 가진 자에 의해 결정될 수 있다. 일부 구체예에서, 상기 종양은 고형 종양이다. 예시되는 NY-ESO-1 암은, 이에 한정되는 것은 아니지만, 육종 (예컨대 연조직 육종), 흑색종, 림프종, 전립선암, 자궁암, 갑상샘암, 고환암, 신장암, 췌장암, 난소암, 식도암, 비-소-세포 폐암, 비-호지킨 림프종, NHL (DLCL), 다발 골수종, 간세포 암종, 두경부암, 위암, 자궁내막암, 신장암, 대장암, 담관암종, 유방암, 방광암, 신경모세포종 (neuroblastoma), 골수성 백혈병 및 급성 림프모구 백혈병을 포함한다.
치료적 조성물을 포유동물 피험체에게 투여하는 단계를 포함하는, 포유동물 피험체에서 NY-ESO-1을 발현하는 암 세포의 증식을 저해하는 방법이 본원에 개시되고, 상기 조성물은 (a) NY-ESO-1에 특이적인 Vβ 사슬 상보성 결정 영역 (CDR3)을 포함하는 키메라 TCR 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 단리된 세포로서, 상기 Vβ CDR3은 CASSLNRDXXXXF의 아미노산 서열 (서열번호: 1)을 포함하거나 또는 상기 V 베타 CDR3은 서열번호: 2 - 4에 개시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 것인 단리된 세포; (b) MHC 분자와 관련하여 NY-ESO-1에 특이적인 Vβ 사슬 CDR3을 포함하는 가용성 TCR로서, 상기 Vβ CDR3은 CASSLNRDXXXXF의 아미노산 서열 (서열번호: 1)을 포함하거나 또는 상기 V 베타 CDR3은 서열번호: 2 - 4에 개시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 것인 가용성 TCR; (c) NY-ESO-1에 특이적인 Vβ사슬 CDR3을 포함하는 키메라 TCR 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드로서, 상기 Vβ CDR3은 CASSLNRDXXXXF의 아미노산 서열 (서열번호: 1)을 포함하거나 또는 상기 V 베타 CDR3은 서열번호: 2 - 4에 개시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 것인 폴리뉴클레오티드; (d) MHC 분자와 관련하여 NY-ESO-1에 특이적인 Vβ 사슬 CDR3을 포함하는 가용성 TCR을 코딩하는 폴리뉴클레오티드로서, 상기 Vβ CDR3은 CASSLNRDXXXXF의 아미노산 서열 (서열번호: 1)을 포함하거나 또는 상기 V 베타 CDR3은 서열번호: 2 - 4에 개시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 것인 폴리뉴클레오티드; (e) NY-ESO-1에 특이적인 Vβ 사슬 CDR3을 포함하는 키메라 TCR 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터; 및 (f) MHC 분자와 관련하여 NY-ESO-1에 특이적인 Vβ 사슬 CDR3을 포함하는 벡터로 구성된 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 치료제를 포함하고, 상기 치료적 조성물은 상기 피험체에서 상기 암 세포의 증식을 저해하는데 유효한 양으로 상기 피험체에게 투여된다. 본원에 개시된 특정 구체예에서, 상기 조작된 TCR은 서열번호: 8 및 9에 각각 제공되는 바와 같은 알파 사슬 가변 영역 및 베타 사슬 가변 영역을 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이 "치료적으로 유효한 양" 또는 "유효한 양"은 치료적 또는 예방적 편익을 제공하는 양을 의미한다.
본원에 개시된 조성물과 같은 치료적 조성물에 의한 치료로부터 편익을 얻어 수 있는 피험체를 식별하는 방법이 또한 고려된다. 이와 관련하여, 상기 방법은 (a) NY-ESO-1 암 요법으로부터 편익을 얻을 수 있는 포유동물 피험체를 식별하는 단계로서, (i) NY-ESO-1에 특이적인 Vβ 사슬 CDR3을 포함하는 TCR 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드로서, 상기 Vβ 사슬은 CASSLNRDXXXXF의 아미노산 서열 (서열번호: 1)을 포함하거나 또는 상기 V 베타 CDR3은 서열번호: 2 - 4에 개시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 것인 폴리뉴클레오티드; 또는 (ii) NY-ESO-1에 특이적인 Vβ 사슬 CDR3을 포함하는 TCR 폴리펩티드로서, 상기 Vβ 사슬은 CASSLNRDXXXXF의 아미노산 서열 (서열번호: 1)을 포함하거나 또는 상기 V 베타 CDR3은 서열번호: 2 - 4에 개시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 것인 TCR 폴리펩티드의 존재를 상기 포유동물 피험체로부터의 시료에서 결정하는 단계를 포함하고, 상기 (i) 및/또는 (ii)의 존재는 상기 피험체가 NY-ESO-1 암 요법으로부터 편익을 얻을 수 있다는 것을 나타낸다.
부가의 구체예에서, 상기 치료로부터 편익을 얻을 수 있는 피험체로 식별되어진 피험체를 치료하는 방법이 또한 본원에 고려된다. 이와 관련하여, 상기 치료 방법은 (a) NY-ESO-1 암 요법으로부터 편익을 얻을 수 있는 포유동물 피험체를 식별하는 단계로서, (i) NY-ESO-1에 특이적인 Vβ 사슬 CDR3을 포함하는 TCR 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드로서, 상기 Vβ 사슬은 CASSLNRDXXXXF의 아미노산 서열 (서열번호: 1)을 포함하거나 또는 상기 V 베타 CDR3은 서열번호: 2 - 4에 개시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 것인 폴리뉴클레오티드; 또는 (ii) NY-ESO-1에 특이적인 Vβ 사슬 CDR3을 포함하는 TCR 폴리펩티드로서, 상기 Vβ 사슬은 CASSLNRDXXXXF의 아미노산 서열 (서열번호: 1)을 포함하거나 또는 상기 V 베타 CDR3은 서열번호: 2 - 4에 개시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 것인 TCR 폴리펩티드의 존재를 상기 포유동물 피험체로부터의 시료에서 결정하는 단계를 포함하고, 상기 (i) 및/또는 (ii)의 존재는 상기 피험체가 NY-ESO-1 암 요법에서 편익을 얻을 수 있다는 것을 나타내는 것인 단계; 및 (b) 상기 NY-ESO-1 암 요법을 상기 포유동물 피험체에게 투여하는 단계를 포함한다.
상기 Vβ 사슬은 CASSLNRDXXXXF의 아미노산 서열 (서열번호: 1)을 포함하거나 또는 상기 V 베타 CDR3은 서열번호: 2 - 4에 개시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는, NY-ESO-1에 특이적인 Vβ사슬 CDR3을 포함하는 TCR 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 존재는, 예를 들면, Adaptive Biotechnologies (Seattle, Washington)에서 상업적으로 이용할 수 있는 것 및 실시예 2-7에 개시된 것과 같은 딥 시퀀싱 방법에 의해 결정될 수 있다. multiplex PCR을 포함하는 다른 방법, 및 특정 뉴클레오티드 서열의 존재 또는 부재를 검출하는 당분야에 알려져 있는 다른 기술이 또한 이용될 수 있다. 또한, 상기 TCR 폴리펩티드는 상기 목적을 위해 개발된 적합한 사량체 (tetramer) 또는 모노클로날 항체에 의한 면역분석에 의해 직접 검출될 수 있다. 사용될 수 있는 면역분석은, 이에 한정되는 것은 아니지만, 웨스턴 블롯, 방사면역분석, ELISA, "샌드위치" 면역분석, 면역침전 분석, 침전소 분석, 겔 투과 침전소 분석, 면역방사계수측정 분석, 형광 면역분석, 단백질 A, 면역분석, 플라스몬 표면 소재 (plasmon surface residence) 및 보체-고정 분석 등과 같은 기술을 사용하는 경쟁적 분석 시스템 (competitive assay systems)을 포함한다. 이러한 분석은 통상적이며, 당 분야에 잘 알려져 있다 (예컨대, Ausubel et al, eds, 2015 Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, John Wiley & sons, Inc., New York). 부가로, Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and David Lane, 1988)에 개시된 것과 같은 통상의 교차-차단 분석이 수행될 수 있다. 핵산 기반 분석 또는 단백질 기반 분석은 진단적 클론형 (diagnostic clonotype)을 갖지 않는 개체로부터 높은 빈도로 본원에 개시된 CDR3 아미노산 서열을 갖는 Vβ 사슬을 포함하는 TCR을 갖는 개체를 구별할 수 있다.
본원에서 고려된 치료 방법은 임의의 NY-ESO-1 특이적 암 요법, 구체적으로 면역 요법을 포함한다. 일 구체예에서, 본원에 개시된 바와 같은 공유 TCRs을 발현하는 환자에 유용한 치료 방법은 미국특허 제9,044,420호에 개시된 것과 같다. 일부 구체예에서, 상기 NY-ESO-1 암 요법은 NY-ESO-1 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 피험체에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 벡터는 렌티바이러스 벡터이다. 일부 구체예에서, 상기 벡터는 NY-ESO-1 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 벡터는 NY-ESO-1 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
일부 구체예에서, 상기 NY-ESO-1 암 요법은 GLA를 포함하는 조성물의 유효한 양을 피험체에게 투여하는 단계를 포함하고, 상기 조성물은:
(a) 화학식 (I)의 GLA로서:
Figure pct00003
식 중에서: R1, R3, R5 및 R6은 C11-C20 알킬이고; 및 R2 및 R4는 C12-C20 알킬인 것인 GLA; 및
(b) 약학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 포함하고; 상기 조성물은 항원을 포함하지 않는다. 본원에 개시된 방법의 일 구체예에서, R1, R3, R5 및 R6은 운데실이고 및 R2 및 R4는 트리데실이다. 본원에 개시된 방법의 또다른 구체예에서, 상기 포유동물은 인간이다. 더 부가의 구체예에서, 상기 조성물은 수성 제제이고, 특정 구체예에서, 상기 조성물은 수중유형 에멀젼, 유중수형 에멀젼, 리포좀, 미셀라 제제 또는 미세입자의 형태이다.
미국특허공개 제2008/0131466호는 GLA 화합물에 대한 제제, 가령 수성 제제 (AF) 및 안정한 에멀젼 제제 (SE)를 제공하고, 상기 제제는 상기 화학식 (I)의 화합물에 사용될 수 있다.
본원에 개시된 바와 같은 GLA는 조성물에서 0.1-10 ㎍/투여량, 또는 0.1-20 ㎍/투여량, 0.1-30 ㎍/투여량, 0.1-40 ㎍/투여량, 또는 0.1-50 ㎍/투여량, 또는 1-20 ㎍/투여량, 또는 1-30 ㎍/투여량, 또는 1-40 ㎍/투여량, 또는 1-50 ㎍/투여량, 또는 0.2-5 ㎍/투여량의 양으로, 또는 0.5-2.5 ㎍/투여량의 양으로, 또는 0.5-8 ㎍/투여량 또는 0.5-15 ㎍/투여량의 양으로 존재한다. 투여량은, 예를 들면, 0.5 ㎍/투여량, 0.6 ㎍/투여량, 0.7 ㎍/투여량, 0.8 ㎍/투여량, 0.9 ㎍/투여량, 1.0 ㎍/투여량, 2.0 ㎍/투여량, 3.0 ㎍/투여량, 3.5 ㎍/투여량, 4.0 ㎍/투여량, 4.5 ㎍/투여량, 5.0 ㎍/투여량, 5.5 ㎍/투여량, 6.0 ㎍/투여량, 6.5 ㎍/투여량, 7.0 ㎍/투여량, 7.5 ㎍/투여량, 8.0 ㎍/투여량, 9.0 ㎍/투여량, 10.0 ㎍/투여량, 11.0 ㎍/투여량, 12.0 ㎍/투여량, 13.0 ㎍/투여량, 14.0 ㎍/투여량, 또는 15.0 ㎍/투여량일 수 있다. 투여량은 피험체의 체질량 (body mass), 체면적 (body area), 체중 (weight), 혈액 부피 (blood volume), 또는 전달 경로에 따라 조정될 수 있다. 일 구체예에서, 1 ml 중 2 ㎍, 3 ㎍, 4 ㎍, 5 ㎍, 6 ㎍, 7 ㎍, 8 ㎍, 9 ㎍, 10 ㎍, 11 ㎍, 또는 12 ㎍의 GLA가 종양내로 투여된다. 이와 관련하여, GLA의 1 mL 투여량은 동일한 양으로 종양의 여러 영역에 주사될 수 있다. 특정 구체예에서, GLA의 약 0.01 ㎍/kg 내지 약 100 mg/kg 체중이, 통상적으로 피내, 종양내, 피하, 근육내 또는 정맥내 경로로, 또는 다른 경로로 투여될 것이다. 특정 구체예에서, 상기 GLA의 투여량은 약 0.1 ㎍/kg 내지 약 1 mg/kg이고, 및 특정 구체예에서, 약 0.1 ㎍/kg, 0.2 ㎍/kg, 0.3 ㎍/kg, 0.4 ㎍/kg, 0.5 ㎍/kg, 0.6 ㎍/kg, 0.7 ㎍/kg, 0.8 ㎍/kg, 0.9 ㎍/kg, 1 ㎍/kg, 2 ㎍/kg, 3 ㎍/kg, 4 ㎍/kg, 5 ㎍/kg, 6 ㎍/kg, 7 ㎍/kg, 8 ㎍/kg, 9 ㎍/kg, 10 ㎍/kg 내지 약 200 ㎍/kg의 범위이다. 투여의 횟수 및 빈도는 숙주의 반응에 의존할 것이라는 것은 당업자에게 명백할 것이다. 본원에 개시된 바와 같이, 적절한 투여량은 환자의 (예를 들어, 인간) 상태, 즉 질환의 단계, 일반적인 건강 상태뿐만 아니라, 연령, 성별 및 체중, 및 의학 분야의 당업자에게 익숙한 다른 인자에 의존할 수 있다. 본원에서 언급된 바와 같이, 본원에 개시된 GLA 조성물은 항원을 포함하지 않는다.
렌티바이러스 입자의 전달
본원에 개시된 조작된 TCRs의 전달을 위한 바이러스 입자 (예컨대 레트로바이러스, 렌티바이러스 또는 다른 바이러스 입자)는, 상기 바이러스가 표적 세포, 예컨대, T 세포, NK 세포 또는 수지상 세포와 접촉하도록 하는 임의의 방법으로 표적 세포로 전달될 수 있고, 관심있는 폴리뉴클레오티드의 전달이 요구된다. 때로는 적합한 양의 바이러스가 인간 또는 다른 동물에 직접 (인 비보), 예컨대, 신체에 주사를 통해 도입될 것이다. 적합한 동물은, 이에 한정되지 않고, 말, 개, 고양이, 소, 돼지, 양, 토끼, 닭 또는 기타 조류를 포함한다. 바이러스 입자가 다수의 경로 가령 정맥내, 피내, 피하, 절내 (intranodal), 복강내 (intra-peritoneal cavity), 또는 점막으로 주사될 수 있다. 상기 바이러스는, 미국특허 제7,241,275호, 제7,115,108호, 제7,108,679호, 제7,083,599호, 제7,083,592호, 제7,047,070호, 제6,971,999호, 제6,808,506호, 제6,780,171호, 제6,776,776호, 제6,689,118호, 제6,670,349호, 제6,569,143호, 제6,494,865호, 제5,997,501호, 제5,848,991호, 제5,328,483호, 제5,279,552호, 제4,886,499호에 개시된 장치인 피하 주사 장치를 사용하여 전달될 수 있고, 상기 모두는 그 전문이 참조로 통합된다. 다른 주사 위치가 또한 적합하며, 가령 표적 세포를 포함하는 기관으로 직접 주사될 수 있다. 예를 들면, 림프절내 주사, 비장내 주사, 또는 골수내 주사가 바이러스를 상기 림프절, 비장 및 골수로 각각 전달하는데 사용될 수 있다. 특정 환경 및 표적 세포의 특성에 의존하여, 예를 들면 눈, 구강 또는 피부에서 상피 조직과의 직접 접촉, 또는 흡입을 포함하는 다른 수단을 통해 도입이 수행될 수 있다.
대안으로서, 표적 세포가 인 비트로에서, 가령 배양 플레이트에서 상기 바이러스에 제공되고, 이와 접촉된다. 상기 표적 세포는 통상적으로 건강한 피험체 또는 치료를 필요로 하거나 또는 항원에 대한 면역 반응을 자극시키는 것이 요구되는 피험체로부터 입수된 수지상 세포 또는 T 세포를 포함하는 세포의 개체군이다. 피험체로부터 세포를 입수하는 방법은 당분야에 잘 알려져 있고, 정맥절개술 (phlebotomy), 외과적 절제 (surgical excision), 및 생검을 포함한다. 인간 DCs는 또한, CD34α+ 인간 조혈 전구세포 (hematopoietic progenitors)를 입수하고 및 본원에 개시된 바와 같은 인 비트로 배양 방법을 사용하여 생성될 수 있다 (예컨대, Banchereau et al. Cell 106, 271-274 (2001), 그 전문이 참조로 통합됨).
상기 바이러스가 배지에 현탁되고, 배양 플레이트의 웰, 튜브 또는 다른 컨테이너로 첨가될 수 있다. 상기 바이러스를 포함하는 배지가 상기 세포를 플레이트하기 전에 또는 상기 세포가 플레이트되어진 후에 첨가될 수 있다. 세포는 통상적으로 적당한 양의 배지에서 인큐베이트되어서 생존력을 제공하고, 상기 배지에서 바이러스를 적합한 농도로 하여 상기 숙주 세포의 형질도입이 일어나도록 하였다. 상기 세포는 바람직하게 상기 바이러스와 충분한 시간 동안 인큐베이트되어서 상기 바이러스가 상기 세포를 감염시키도록 하였다. 바람직하게 상기 세포는 바이러스와 적어도 1시간, 적어도 5시간 또는 적어도 10시간 동안 인큐베이트되었다.
인 비보 및 인 비트로 전달에서, 원하는 표적 세포를 감염시키기에 충분한 수를 포함하는 바이러스 입자의 알리코트 (aliquot)가 사용될 수 있다. 상기 표적 세포가 배양되는 경우, 상기 바이러스 입자의 농도는 일반적으로 적어도 1 IU/μL, 더 바람직하게 적어도 10 IU/μL, 더욱 바람직하게 적어도 300 IU/μL, 더욱 바람직하게 적어도 1X104 IU/μL, 더욱 바람직하게 적어도 1X105 IU/μL, 더욱 바람직하게 적어도 1X106 IU/μL, 또는 더욱 바람직하게 적어도 1X107 IU/μL이다.
인 비트로에서 상기 바이러스로 감염시킨 후에, 표적 세포가 인간 또는 다른 동물로 도입 (또는 재도입)될 수 있다. 상기 세포는 피부, 피부하, 또는 말초 혈액 스트림으로 도입될 수 있다. 동물로 도입된 세포는 바람직하게, 유해 면역 반응을 피하기 위해, 상기 동물로부터 유래된 세포이다. 유사한 면역 배경을 갖는 공여체로부터 유래된 세포가 또한 사용될 수 있다. 또한 사용될 수 있는 다른 세포는 유해 면역 반응을 피하도록 디자인된 것을 포함한다.
표적 세포는, 예를 들면 관심 있는 서열 또는 유전자(들)의 통합, 전사 및/또는 발현, 통합된 유전자의 카피의 수, 및 통합 위치에 대해 분석될 수 있다. 이러한 분석은 임의의 시간에 수행될 수 있고, 당분야에 알려진 임의의 방법에 의해 수행될 수 있다.
바이러스, 또는 바이러스-감염된 T 세포가 투여된 피험체는 감염된 세포의 위치, 관심 있는 바이러스-전달된 폴리뉴클레오티드 또는 유전자의 발현, 면역 반응의 자극에 대해 분석될 수 있고, 당분야에 알려져 있는 임의의 방법에 의해 질병 또는 질환과 관련된 증상들이 모니터될 수 있다.
본원에 개시된 세포를 감염시키는 방법은 세포의 개체-특이적 특성에 의존하지 않는다. 결과적으로, 상기는 다양한 동물 종으로 용이하게 확장된다. 일부 예에서, 바이러스 입자는 인간 또는 인간 T 세포로 전달되고, 다른 예에서, 이들은 동물, 가령 마우스, 말, 개, 고양이, 또는 마우스 또는 조류로 전달된다. 본원에서 토의된 바와 같이, 상기 바이러스 벡터 게놈은 슈도타입 (pseudotyped)되어 표적 세포 특이성뿐만 아니라 넓은 숙주 범위로 부여된다. 당업자라면 또한 특정 동물 종에서 관심 서열의 목적하는 발현을 달성하기 위해 적절한 내부 프로모터 및 다른 요소를 알 수 있을 것이다. 그러므로, 당업자는 임의의 종으로부터 수지상 세포를 감염시키는 방법을 변형시킬 수 있을 것이다.
조합 요법
본원에 개시된 치료적 조성물은 또한 하나 이상의 다른 치료제의 투여와 동시에, 이전에, 또는 이후에 투여될 수 있다. 이러한 조합 요법은 본원에 개시된 치료적 조성물 및 하나 이상의 부가의 활성제를 포함하는 단일 약학적 투여량 제제의 투여, 뿐만 아니라 조성물 (예컨대, 본원에 개시된 바와 같은 조작된 TCR을 포함하는 조성물, 또는 본원에 개시된 바와 같은 조작된 TCR을 코딩하는 서열을 포함하는 렌티바이러스 벡터 입자를 포함하는 조성물, 또는 본원에 개시된 바와 같은 조작된 TCR을 발현하도록 변형된 단리된 T 세포를 포함하는 조성물) 및 각 활성제를 그 자신의 개별의 약학적 투여량 제제로의 투여를 포함한다. 예를 들면, 본원에 개시된 바와 같은 치료적 조성물 및 다른 활성제가 정제 또는 캡슐과 같은 단일 경구 투여량 조성물로서 함께, 또는 개별 경구 투여량 제제로 투여되는 각각의 작용제로, 상기 포유동물 피험체에게 투여될 수 있다. 유사하게, 본원에 개시된 조성물 (본원에 개시된 바와 같은 조작된 TCR을 코딩하는 서열을 포함하는 렌티바이러스 벡터 입자를 포함하는 조성물, 또는 이러한 입자로 엑스 비보에서 변형된 T 세포를 포함하는 조성물, 또는 조작된 TCR을 포함하는 조성물) 및 다른 활성제가 식염수 용액 또는 다른 생리학적으로 허용가능한 용액 중에 단일 비경구 투여량 조성물로 함께, 또는 개별의 비경구 투여량 제제로 투여되는, 각각의 작용제로, 상기 포유동물 피험체에게 투여될 수 있다. 개별의 투여량 제제가 사용되는 경우, 본원에 개시된 조성물 및 하나 이상의 부가의 활성제는 기본적으로 동일한 시간에, 즉 동시에, 또는 개별적으로 엇갈린 시간, 즉 순차로 및 임의의 순서로 투여될 수 있고; 조합 요법은 이러한 모든 요법을 포함하는 것으로 이해된다. 그러므로, 특정 구체예에서, 하나 이상의 다른 치료제와 조합하여, 본원에 개시된 하나 이상의 조성물의 투여가 또한 고려된다. 이러한 치료제는 암에 대한 표준 치료제로 당분야에서 허용될 수 있다. 고려된 예시되는 치료제는 시토킨, 성장 인자, 면역 체크포인트 저해제, 글루코피라노실 리피드 아쥬반트 (GLA)와 같은 TLR4를 포함하는 TLR 작용제 (예를 들면 US8273361, WO2008/153541 및 WO2009143457에 개시된 바와 같고, 그 개시내용은 그 전문이 참조로 본원에 통합됨), 스테로이드, NSAIDs, DMARDs, 항-염증제, 화학요법제, 방사선요법제, 또는 다른 활성제 및 보조제 (ancillary agent)를 포함한다.
특정 구체예에서, 본원에 개시된 치료적 조성물은 임의의 수의 면역 체크포인트 저해제와 함께 투여될 수 있다. 면역 체크포인트 저해제는, CTLA-4, PDL1, PDL2, PD1, B7-H3, B7-H4, BTLA, HVEM, TIM3, 및 GAL9의 하나 이상에 결합하고, 및 그의 활성을 차단 또는 저해하는 항체, 또는 그의 항원 결합 단편을 포함한다. 예시되는 면역 체크포인트 저해제는 트레멜리무맙 (Tremelimumab) (CTLA-4 차단 항체), 항-OX40, PD-L1 모노클로날 항체 (항-B7-H1; MEDI4736), 이필리무맙, MK-3475 (PD-1 차단제), 니볼루맘브 (Nivolumamb) (항-PD1 항체)를 포함한다.
특정 구체예에서, 본원에 개시된 조성물은 임의의 수의 화학요법제와 함께 투여될 수 있다. 화학요법제의 예로는 알킬화제 가령 티오테파 (thiotepa) 및 시클로포스파미드 (CYTOXANTM); 알킬 술포네이트 예를 들면, 부술판, 임프로술판 및 피포술판; 아지리딘 예를 들면, 벤조도파, 카르보쿠온 (carboquone), 메투레도파, 및 우레도파; 알트레타민, 트리에틸렌멜라민, 트리에틸렌포스포라미드, 트리에틸렌티오포스파오라미드 및 트리메틸롤로멜라민 (trimethylolomelamine)을 포함하는 에틸렌이민 및 메틸아멜라민; 질소 머스타드 (nitrogen mustard) 가령, 클로람부실, 클로르나파진, 콜로포스파미드, 에스트라무스틴, 이포스파미드, 메클로레타민, 메클로레타민 옥시드 히드로클로리드, 멜팔란, 노벰비킨, 페네스테린, 프레드니무스틴, 트로포스파미드, 우라실 머스타드; 니트로스우레아 (nitrosurea) 가령 카르무스틴, 클로로조토신, 포테무스틴, 로무스틴, 니무스틴, 라니무스틴; 항생제 가령 아클라시노미신 (aclacinomysin), 악티노미신, 아우트라미신 (authramycin), 아자세린, 블레오미신, 칵티노미신 (cactinomycin), 칼리케아미신, 카라비신, 카미노미신, 카르지노필린, 크로모미신, 닥티노미신, 다우노루비신, 데토루비신, 6-디아조-5-옥소-L-노르루신, 독소루비신, 에피루비신, 에소루비신, 이다루비신, 마르셀로미신 (marcellomycin), 미토미신, 미코페놀산, 노갈라미신, 올리보미신, 페플로미신, 포트피로미신, 푸로미신, 켈라미신 (quelamycin), 로도루비신, 스트렙토니그린, 스트렙토조신, 투베르시딘, 우베니멕스, 지노스타틴, 조루비신; 항-대사물질 가령 메토트렉세이트 및 5-플루오로우라실 (5-FU); 엽산 유사체 가령 데노프테린, 메토트렉세이트, 프테로프테린, 트리메트렉세이트; 퓨린 유사체 가령 플루다라빈, 6-메르캅토푸린, 티아미프린, 티오구아닌; 피리미딘 유사체 가령 안시타빈 (ancitabine), 아자시티딘, 6-아자우리딘, 카르모푸르, 시타라빈, 디데옥시우리딘, 독시플루리딘, 에노시타빈, 플록스우리딘 (floxuridine), 5-FU; 안드로겐 가령 칼루스테론, 드로모스타놀론 프로피오네이트, 에피티오스타놀, 메피티오스탄, 테스토락톤; 항-부신제 (anti-adrenals) 가령 아미노글루테티미드, 미토탄, 트릴로스탄; 엽산 보충제 (replenisher) 가령 프로리닌산 (frolinic acid); 아세글라톤; 알도포스파미드 글리코시드; 아미노레불린산 (aminolevulinic acid); 암사크린; 베스트라부실; 비산트렌; 에다트랙세이트; 디포파민; 데메콜신 (demecolcine); 디아지쿠온; 엘포르미틴; 엘립티늄 아세테이트; 에토글루시드; 갈륨 니트레이트; 히드록시우레아; 렌티난; 로니다민; 미토구아존; 미톡산트론; 모피다몰; 니트라크린; 펜토스타틴; 페나메트 (phenamet); 피라루비신; 포도필리닌산 (podophyllinic acid); 2-에틸히드라지드; 프로카르바진; PSK®; 라족산; 시조푸란; 스피로게르마늄; 테누아존산 (tenuazonic acid); 트리아지쿠온; 2, 2',2"-트리클로로트리에틸아민; 우레탄; 빈데신; 다카르바진; 만노무스틴; 미토브로니톨; 미톨락톨; 피포브로만; 가시토신; 아라비노시드 ("Ara-C"); 시클로포스파미드; 티오테파; 탁소이드, 예컨대, 파클리탁셀 (TAXOL®, Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.) 및 도세탁셀 (TAXOTERE®, Rhne-Poulenc Rorer, Antony, France); 클로람부실; 젬시타빈; 6-티오구아닌; 메르캅토퓨린; 메토트렉세이트; 플래티늄 유사체 예를 들면, 시스플라틴 및 카르보플라틴; 빈블라스틴; 플래티늄; 에토포시드 (VP-16); 이포스파미드; 미토미신 C; 미톡산트론; 빈크리스틴; 비노렐빈; 나벨빈 (navelbine); 노반트론; 테니포시드; 다우노미신; 아미노프테린; 젤로다 (xeloda); 이반드로네이트; CPT-11; 토포이소머라제 저해제 RFS 2000; 디플루오로메틸로미틴 (DMFO); 레티노산 유도체 가령 Targretin™ (벡사로텐), Panretin™ (알리트레티노인); ONTAK™ (데닐루킨 디프티톡스 (denileukin diftitox)); 에스페라미신; 카페시타빈; 및 상기 중 어느 것의 약학적으로 허용가능한 염, 산 또는 유도체를 포함한다. 또한 이 정의에 포함되는 것은 종양에 대해 호르몬 작용을 조절하거나 저해하기 위하여 작용하는, 가령 타목시펜, 랄록시펜, 아로마타제 저해 4(5)-이미다졸, 4-히드록시타목시펜, 트리옥시펜, 케옥시펜, LY117018, 오나프리스톤, 및 토레미펜 (Fareston)을 포함하는 항-에스트로겐; 및 플루타미드, 닐루타미드, 비칼루타미드, 루프롤리드, 및 고세렐린과 같은 항-안드로겐; 및 상기 중 어느 것의 약학적으로 허용가능한 염, 산 또는 유도체와 같은 항-호르몬제이다.
특정 구체예에서, 본 개시내용은 NY-ESO-1 발현과 관련된 암을 치료하는, 이의 진행을 저해하거나 또는 이를 예방하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 본원에 개시된 조작된 TCR, 본원에 개시된 조작된 TCR을 코딩하는 핵산을 포함하는 렌티바이러스 벡터, 또는 상기 입자로 엑스 비보에서 변형된 T 세포를 포함하는 조성물의 치료적으로 유효한 양을 NY-ESO-1 발현과 관련된 암에 걸린 포유동물 피험체에게 투여하는 단계, 및 그 후 수지상 세포를 표적으로 하여, 수지상 세포 백신화에 사용될 수 있는 엔벨로프를 포함하는 슈도타입 렌티바이러스 벡터 입자를 포함하는 조성물을 상기 환자에게 투여하는 단계를 포함한다 (예컨대, 미국특허 제8329162호; 제8372390호; 제8273345호; 제8187872호; 제8323662호 및 공개된 PCT 출원 WO2013/149167 참조). 상기 방식에서, 항원 특이적 T-세포는 본원에 개시된 렌티바이러스 벡터를 사용하여 인 비보 또는 엑스 비보 유전 변형을 통해 생성될 수 있고, 그 후 DC-트로픽 (tropic) 렌티바이러스 벡터를 사용하여, 수지상 세포의 활성 면역화를 통해 인 비보에서 부스트될 수 있다.
또다른 구체예에서, 본 개시내용은 NY-ESO-1 암을 치료하는, 이의 진행을 저해하는 또는 이를 예방하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 본원에 개시된 조작된 TCR을 포함하는 조성물, 본원에 개시된 조작된 TCR을 코딩하는 핵산을 포함하는 렌티바이러스 벡터를 포함하는 조성물, 또는 상기 입자로 엑스 비보에서 변형된 T 세포를 포함하는 조성물의 치료적으로 유효한 양을 NY-ESO-1 암에 걸린 포유동물 피험체에게 투여하는 단계, 및 그 후 항원을 갖거나 또는 갖지 않는, 글루코피라노실 리피드 A (GLA)와 같은 TLR4 작용제를 포함하는 조성물을 상기 환자에게 투여하여 면역 반응을 더 부스트시키는 단계를 포함한다 (예컨대, 미국특허 제8,273,361호 및 공개된 출원 WO2012/141984 및 US20120328655 참조). 상기 방식에서, 항원 특이적 T-세포는 본원에 개시된 렌티바이러스 벡터를 사용하여 인 비보 또는 엑스 비보 유전 변형을 통해 생성될 수 있고, 그 후 수지상 세포의 활성화를 통해 인 비보에서 부스트될 수 있다.
본 발명의 방법의 목적에 있어서, 상기 숙주 세포 또는 세포의 개체군이 상기 피험체에게 투여되고, 상기 세포는 상기 숙주에 대해 동종이형 (allogeneic) 또는 자가유래인 세포일 수 있다. 바람직하게, 상기 세포는 상기 피험체에 대해 자가유래인 것이다.
본원에서 언급된 피험체는 임의의 피험체일 수 있다. 바람직하게, 상기 피험체는 포유동물이다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "포유동물"은, 이에 한정되는 것은 아니지만, 쥐목 (order Rodentia)의 포유동물, 가령 마우스 및 햄스터, 및 토끼목 (order Logomorpha)의 포유동물, 가령 토끼를 포함하는 임의의 포유동물이다. 상기 포유동물은, 고양이과 (고양이) 및 개과 (개)를 포함하는 식육목 (order Carnivora)으로부터 유래되는 것이 바람직하다. 상기 포유동물은 소과 (소) 및 돼지과 (돼지)를 포함하는 소목 (order Artiodactyla) 또는 말과 (말)을 포함하는 말목 (order Perssodactyla)으로부터 유래되는 것이 더 바람직하다. 상기 포유동물은 영장류 (Primates), 세보이드 (Ceboids), 또는 시모이드 (Simoids) (원숭이) 목 또는 유인원 (Anthropoids) 목 (인간 및 유인원)을 갖는 것이 가장 바람직하다. 특히 바람직한 포유동물은 인간이다.
약학적 조성물 및 키트
본원에서 또한 (1) 본원에 개시된 바와 같은 조작된 TCR; (2) 조작된 TCR을 코딩하는 핵산을 포함하는 바이러스 입자; (3) 본원에 개시된 바와 같은 조작된 TCR을 발현하도록 변형된, T 세포 또는 NK 세포와 같은 면역 세포; (4) 본원에 개시된 바와 같은 조작된 TCR을 코딩하는 핵산의 하나 이상의 포함하는 약학적 조성물 및 키트가 고려된다. 일부 구체예에서, 본 개시내용은 본원에 개시된 조작된 TCR을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 렌티바이러스 벡터 입자 (또는 조작된 TCR을 발현하기위해 본원에 개시된 벡터 입자를 사용하여 변형되어진 T 세포)를 포함하는 조성물을 제공한다. 이러한 조성물은 본원에 이후에 개시되는 바와 같이 본 개시내용의 방법으로 피험체에게 투여될 수 있다.
본원에 개시된 바와 같이 변형된 T 세포를 포함하는 조성물은 알려진 기술, 또는 본 개시내용에 기반한 기술 분야의 당업자에게 명백한 그 변형에 따라 입양 면역요법을 위한 방법 및 조성물에서 이용될 수 있다. 예컨대, Gruenberg et al의 미국특허출원 공개 제2003/0170238호를 참조하고; 또한 Rosenberg의 미국특허 제4,690,915호를 참조하며, 그 개시내용은 그 전문이 참조로 본원에 통합된다.
일부 구체예에서, 상기 세포는 먼저 그들 배양 배지로부터 이를 수확하고, 그 후 세척하고, 치료적-유효한 양으로 투여하기에 적합한 배지 및 컨테이너 시스템 ("약학적으로 허용가능한" 담체)에서 상기 세포를 농축하여 제제화된다. 적합한 인퓨젼 배지는 임의의 등장 배지 제제, 전형적으로, 통상의 식염수, Normosol R (Abbott) 또는 Plasma-Lyte A (Baxter)일 수 있고, 또한 수중 5% 덱스트로스 또는 링거 락테이트 (Ringer's lactate)가 이용될 수 있다. 상기 인퓨젼 배지에 인간 혈청 알부민이 보충될 수 있다.
상기 조성물에서 세포의 치료적-유효한 양은 통상적으로 102 초과의 세포, 및 최대 106, 최대 및 108 또는 109 이하의 세포이고, 1010 이상의 세포일 수 있다. 상기 세포의 수는, 상기 조성물에 포함되는 세포의 타입에 따라 상기 조성물이 의도되는 최종 용도에 의존할 것이다. 예를 들면, 특정 항원에 특이적인 세포를 원한다면 상기 개체군은 상기 세포의 70% 초과, 일반적으로 80% 초과, 85% 및 90-95%를 포함할 것이다. 본원에 제공된 용도에 있어서, 상기 세포는 일반적으로 1 리터 이하의 부피, 500 ml 이하, 심지어 250 ml 또는 100 ml 이하의 부피로 존재한다. 그러므로, 상기 원하는 세포의 밀도는 통상적으로 106 초과의 세포/ml, 일반적으로 107 초과의 세포/ml, 일반적으로 108 세포/ml 또는 그 이상이다. 면역 세포의 임상적으로 관련된 수는, 누적하여 109, 1010 또는 1011 세포와 동일 또는 초과하는 다수의 인퓨젼으로 분배될 수 있다.
본원에 제공되는 약학적 조성물은 다양한 형태, 예컨대, 고체, 액체, 분말, 수성, 또는 동결건조 형태로 존재할 수 있다. 적합한 약학적 담체의 예가 당분야에 알려져 있다. 이러한 담체 및/또는 첨가제는 종래의 방법에 의해 제제화될 수 있고, 상기 피험체에게 적합한 투여량으로 투여될 수 있다. 안정화제 가령 리피드, 뉴클레아제 (nuclease) 저해제, 폴리머 및 킬레이트제는 체내에서 상기 조성물을 분해로부터 보존할 수 있다. 주사로 투여하는 것이 의도된 조성물에서, 하나 이상의 계면활성제, 보존제, 습윤제, 분산제, 현탁제, 버퍼, 안정화제 및 등장제가 포함될 수 있다.
본원에 개시된 바와 같은 조작된 TCRs, 또는 본원에 제공된 조작된 TCR을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 바이러스 벡터 입자는 키트로 패키징될 수 있다. 키트는 선택적으로 하나 이상의 구성성분들 가령 사용, 장치 및 부가의 시약을 위한 지침서, 및 상기 방법의 실시를 위한 구성성분들, 가령 튜브, 컨테이너, 및 시린지를 포함한다. 예시되는 키트는 상기 조작된 TCRs을 코딩하는 핵산, 상기 조작된 TCR 폴리펩티드, 또는 본원에 제공된 바이러스를 포함할 수 있고, 선택적으로 사용을 위한 지침서, 피험체에서 바이러스를 검출하기 위한 장치, 상기 조성물을 피험체에게 투여하기 위한 장치, 및 상기 조성물을 피험체에게 투여하기 위한 장치를 포함할 수 있다.
관심 유전자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 (예컨대, 조작된 TCR)를 포함하는 키트가 또한 본원에서 고려된다. 관심 서열을 코딩하는 바이러스 벡터 (예컨대, 조작된 TCR) 및 선택적으로, 면역 체크포인트 저해제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 키트가 또한 본원에서 고려된다.
본원에서 고려된 키트는 본원에 개시된 공유 TCR VβCDR3 서열의 하나 이상을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 존재를 검출하는 방법을 수행하기 위한 키트를 포함한다. 구체적으로, 이러한 진단 키트는 적합한 증폭 및 검출 프라이머 및 본원에 개시된 공유 TCR VβCDR3 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 검출하기 위한 딥 시퀀싱을 수행하기 위한 다른 관련된 시약의 세트를 포함할 수 있다. 부가의 구체예에서, 본원에 키트는, 항체 또는 다른 결합 분자와 같은 TCR VβCDR3을 포함하는 TCR 폴리펩티드를 검출하기 위한 시약을 포함할 수 있다. 진단 키트는 또한 공유 TCR VβCDR3 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 존재를 결정하거나 또는 본원에 개시된 공유 TCR VβCDR3s를 포함하는 TCR 폴리펩티드의 존재를 결정하는 지침서를 포함할 수 있다.
키트는 또한 지침서를 포함할 수 있다. 지침서는 통상적으로 상기 바이러스, 및 선택적으로 상기 키트에 포함되는 다른 구성성분, 및 상기 바이러스를 투여하기 위한, 상기 피험체의 적절한 상태, 적절한 투여량, 및 적절한 투여 방법을 결정하는 방법을 포함하는 투여 방법을 개시하는 유형의 표시를 포함한다. 지침서는 또한 치료 시간의 기간에 대해 상기 피험체를 모니터하기 위한 안내를 포함할 수 있다.
본원에 제공된 키트는 본원에 개시된 조성물을 피험체에게 투여하기 위한 장치를 포함할 수 있다. 약제 또는 백신을 투여하기 위한 당분야에 알려져 있는 다양한 장치가 본원에 제공된 키트에 포함될 수 있다. 예시되는 장치는, 이에 한정되는 것은 아니지만, 피하 주사바늘, 정맥 주사바늘, 카테터, 바늘-없는 (needle-less) 주사 장치, 흡입기, 및 액체 분배기, 예를 들면, 점안기 (eyedropper)를 포함한다. 통상적으로 상기 키트 중 바이러스를 투여하는 장치는 상기 키트 중 상기 바이러스와 양립가능할 것이고; 예를 들면, 고압 주사 장치와 같은 바늘-없는 주사 장치는 바이러스가 고압 주사에 의해 손상되지 않는 키트에 포함될 수 있지만, 통상적으로 바이러스가 고압 주사에 의해 손상되는 키트내에 포함되지 않는다.
본원에 제공된 키트는 화합물, 가령 T 세포 활성인자 또는 자극인자, 또는 TLR 작용제, 가령 TLR4 작용제 (예컨대, 미국특허 제8,273,361호 참조, 그 개시내용은 그 전문이 참조로 본원에 통합됨)를 피험체에게 투여하기 위한 장치를 포함할 수 있다. 피험체에게 약제를 투여하기 위한 당분야에 알려져 있는 다양한 장치가 본원에 제공된 키트에 포함될 수 있다. 예시되는 장치는 피하 주사바늘, 정맥 주사바늘, 카테터, 바늘-없는 주사 장치를 포함하고, 이에 한정되는 것은 아니지만, 피하 주사바늘, 정맥 주사바늘, 카테터, 바늘-없는 주사 장치, 흡입기, 및 액체 분배기, 예를 들면, 점안기를 포함한다. 통상적으로 상기 키트 중 화합물을 투여하는 장치는 상기 화합물을 투여하는 바람직한 방법과 양립가능할 것이다.
하기 실시예는 예시의 방법으로 제공되고, 한정의 방법으로 제공되지 않는다.
실시예
실시예 1: LV305에 의한 치료로 치료 후 NY-ESO-1 특이적 T 세포의 폴리클로날 친화도가 증가함
본 실시예는 LV305에 의한 치료로 ELISPOT에 의해 측정된 바와 같이 NY-ESO-1 종양 항원을 인식하는 폴리클로날 친화도 T 세포가 증가되었음을 입증하였다.
LV305에 대한 본 연구에서, 상기 환자에게, NY-ESO-1 종양 항원을 코딩하는 수지상 세포 트로픽 렌티벡터인, LV305를 3회 주사하였다. 백신화 전 (Tx-전) 및 백신화-후 (Tx-후) PBMC 시료에서 NY-ESO-1에 대한 T 세포 반응이 ELISPOT으로 측정되었고, 상기 세포는 NY-ESO-1 펩티드 믹스로 40시간 동안 자극되었고, IFN-γ를 분비하는 T 세포의 수는 항-IFN-γ 항체로 사전-코팅된 플레이트에서 스팟을 카운팅하여 측정되었다.
도 1에 개시된 바와 같이, Tx-후 T 세포는 Tx-전 T 세포보다, 테스트된 모든 NY-ESO-1 농도 (1670, 334, 60, 및 12nM)에서 NY-ESO-1 펩티드 믹스에 대해 더 높은 반응을 가졌다. 본 발명자가 테스트한 2개의 더 낮은 농도에서 (12 및 60 nM), Tx-전 시료에서 검출가능한 T 세포 반응이 없었지만, Tx-후 시료에서 상당한 T 세포 반응이 있었다. 상기 데이터는 LV305에 의한 치료로 NY-ESO-1에 대한 T 세포 반응이 증강되어서, 더 높은 친화도의 NY-ESO-1 특이적 T 세포를 유도하고, 이는 NY-ESO-1 펩티드의 낮은 농도에서 상기 항원을 인식하는 것이 입증되었다.
실시예 2: 종양 항원-특이적 TCR 서열은 Tx-전 PBMC와 비교하여 Tx-후 PBMC에서 증강되었음
본 실시예는 LV305에 의한 치료로 말초 혈액에서 NY-ESO-1 특이적 TCR 서열의 증강을 유도하는 것이 입증되었다.
본 연구에서, PBMC는 LV305 치료 전 및 LV305에 의한 3회의 백신화 후에 상기 환자로부터 수집되었다. Tx-전 종양 시료가 또한 상기 환자로부터 수집되었다. 상기 PBMC 및 종양 시료에서 DNA 추출을 수행하고, 후속하여 상기 T 세포 수용체 (TCR) 베타 사슬의 시퀀싱 분석을 수행하였다. Tx-전과 Tx-후 PBMC 사이의 서열 유사성이 산점도를 사용하여 분석되었다. 그 후 상기 종양 시료로부터의 TCR 서열은 또한 유사성에 대해 Tx-전 및 Tx-후 PBMC와 비교되었다. 상기 결과는 상기 종양 시료를 침윤하는 T 세포로부터의 TCR 서열이 Tx-전 PBMC와 비교하여 Tx-후 PBMC에서 증강되었음을 보여주었다.
실시예 3: NY-ESO-1 특이적 T 세포에 대해 고도로 증강된 올리고클로날 배양물이 Tx-후 PBMC로부터 확립되어짐
본 실시예는 NY-ESO-1 특이적 T 세포에 대해 고도로 증강된 올리고클로날 배양물이 Tx-후 PBMC로부터 확립되었음을 입증하였다. 상기 배양물은 LV305에 의한 백신화 후에 환자로부터 PBMC를 사용하여 시작되었다. 상기 PBMC가 IL-2 및 IL-7 (10 ng/mL)의 존재하에 NY-ESO-1 중첩 펩티드 (0.5 ug/mL, JPT Technologies, Berlin, Germany)를 갖는 OpTmizer T 세포 증식 배지 (Invitrogen, Carlsbad, CA)에서 배양되었다. 반복된 자극 및 장기간 배양 (>3 개월) 후에, 상기 PBMC 배양물은 NY-ESO-1 특이적 T 세포에 대해 고도로 농축되었다. 도 3에 개시된 바와 같이, 상기 농축된 T 세포는 NY-ESO-1 펩티드에 의한 자극 시에 다량의 IFN-γ를 분비하였다. TCR 시퀀싱 분석으로 상기 배양물은 모든 T 세포의 90% 이상을 차지하는 상위 6개의 클론만큼 매우 올리고클로날한 것으로 나타났다.
실시예 4: 올리고클로날 배양물에서 TCRβ CDR3 서열은 Tx-전 PBMC와 비교하여 Tx-후 PBMC에서 증강됨
본 실시예는 NY-ESO-1 자극된 올리고클로날 배양물 (PT151006 IVS3)로부터의 TCR 서열이 Tx-전 PBMC와 비교하여 Tx-후 PBMC에서 증강된 것을 입증하였다. Tx-전과 Tx-후 PBMC 사이의 서열 유사성이 산점도를 사용하여 분석되었다 (도 4). 그 후 PT151006 IVS3으로부터의 상위 6개의 TCR 서열이 또한 Tx-전 및 Tx-후 PBMC와 유사성에 대해 비교되었다. 상기 결과는 PT151006 IVS3으로부터의 TCR 서열이 Tx-전 PBMC와 비교하여 Tx-후 PBMC에서 농축된 것을 보여주었다.
실시예 5: PT151006 IVS3에서 20.5%의 빈도를 갖는 TCRβ CDR3 클론이 Tx-후 PBMC PT151016에서 검출될 수 있음
본 실시예는 PT151006 IVS3으로부터의 제2 주요 클론이 또한 Tx-후 PBMC PT151016에서 검출된 것이 입증되었다 (도 5). 주목할 것은, 2명의 환자는 다른 클래스 I HLA 배경을 가졌다 (표 4 참조). IVS3으로부터 제2 주요 클론 (20.5%의 빈도)의 TCRβ 사슬의 CDR3 서열은 CASSLNRDYGYTF (서열번호: 2)이다. 도 5에 개시된 바와 같이, 상기 아미노산 서열은 PT151016으로부터 Tx-후 PBMC에서 0.0003% 빈도로 검출되었고, PT151016으로부터의 Tx-전 PBMC에서 검출되지 않았다.
실시예 6: PT151006 IVS3에서 8.5%의 빈도를 갖는 TCRβ CDR3 클론이 Tx-후 PBMC PT151016에서 검출될 수 있음
본 실시예는 PT151006 IVS3으로부터 제5 주요 클론이 또한 Tx-후 PBMC PT151016에서 검출되는 것을 입증하였다. IVS3으로부터 제5 주요 클론 (빈도 8.5%)의 TCR베타 사슬의 CDR3 서열은 CASSLNRDQPQHF (서열번호: 3)이다. 도 6에 개시된 바와 같이, 상기 아미노산 서열은 PT151016으로부터 Tx-후 PBMC에서 0.0006% 빈도로 검출되었고, PT151016으로부터 Tx-전 PBMC에서 검출되지 않았다.
실시예 7: PT151006 IVS3에서 26.2%의 빈도를 갖는 TCRβ CDR3 클론이 Tx-후 PBMC PT151014에서 검출될 수 있음
본 실시예는 PT151006 IVS3의 주요 클론 (26.2% 빈도)이 또한 Tx-후 PBMC PT151014에서 검출되는 것을 입증하였다. 상기 클론의 CDR3 서열은 CASRLAGQETQYF (서열번호: 4)이다. 도 7에 개시된 바와 같이, 상기 아미노산 서열은 PT151014로부터 Tx-후 PBMC에서 0.000762% 빈도로 검출되었고, PT151014로부터 Tx-전 PBMC에서 검출되지 않았다.
실시예 8: 상위 6개의 TCRβ CDR3 클론 중 3개는 1명 초과의 환자들 사이에서 공유된 공유 클론임
본 실시예는 본 발명자가 발견한 3개의 공유 서열이 다른 HLA 배경을 갖는 다수의 환자들에서 발견되었고, LV305 요법 후에 시료채취된 PBMC에서 빈도가 증가함을 입증하였다.
TCRβ의 제1 공유 CDR3 서열은 CASSLNRDYGYTF (서열번호: 2)이다. 표 1에 개시된 바와 같이, 상기 서열은 PT151006으로부터 Tx-전 PBMC에서 0.001%로 검출되었고, 동일한 환자로부터 Tx-후 PBMC에서 0.003%로 증가되었다. 상기 서열은 PT151016으로부터 Tx-전 PBMC에서 검출가능하지 않았고 (0%), 동일한 환자로부터 Tx-후 PBMC에서 0.0003%로 검출될 수 있다. 상기 서열은 PT151050으로부터 Tx-전 PBMC에서 검출가능하지 않았고 (0%), 동일한 환자로부터 Tx-후 PBMC에서 0.0003%로 검출될 수 있다.
표 1: 8명의 환자에서 제1 공유 TCRβ CDR3 서열인, CASSLNRDYGYTF의 빈도
PT: 151006 151014 151016 151035 151039 151050 151119 151070
Tx-전 PBMC 0.001% 0% 0% 0% 0% 0% 0% 0%
Tx-후 PBMC 0.003% 0% 0.0003% 0% 0% 0.0003% 0% 0%
PT151006으로부터 IVS3 20.5%
표 1. 8명의 환자로부터 Tx-전 및 Tx-후 PBMC 시료에서 제1 공유 TCRβ CDR3 서열의 빈도. 상기 표는 LV305로 치료하기 전 또는 후에 수집된 다른 환자 PBMC 시료에서 CDR3 서열인, CASSLNRDYGYTF (서열번호: 2)의 빈도를 보여주었다. 예를 들면, 상기 서열은 PT151006으로부터 Tx-전 PBMC에서 0.001%로 검출되었고, 동일한 환자로부터 Tx-후 PBMC에서 0.003%로 증가되었다. 상기 서열은 PT151016으로부터 Tx-전 PBMC에서 검출가능하지 않았고 (0%), 동일한 환자로부터 Tx-후 PBMC에서 0.0003%로 검출될 수 있다. 상기 서열은 PT151050으로부터 Tx-전 PBMC에서 검출가능하지 않았고 (0%), 동일한 환자로부터 Tx-후 PBMC에서 0.0003%로 검출될 수 있다.
TCRβ의 제2 공유 CDR3 서열은 CASSLNRDQPQHF (서열번호: 3)이다. 표 2에 개시된 바와 같이, 상기 서열은 PT151006으로부터 Tx-전 PBMC에서 0.0058%로 검출되었고, 동일한 환자로부터 Tx-후 PBMC에서 0.017%로 증가되었다. 상기 서열은 또한 상기 환자로부터 Tx-전 종양 생검에서 검출될 수 있고 (0.06%) 및 TIL-PC12-04A1에서 동일한 환자로부터 종양 침윤 림프구 (TIL) 배양물에서 검출될 수 있다 (0.002%). 상기 서열은 PT151014로부터 Tx-전 PBMC에서 검출가능하지 않았고 (0%), 동일한 환자로부터 Tx-후 PBMC에서 0.000109%로 검출될 수 있다. 상기 서열은 PT151050으로부터 Tx-전 PBMC에서 검출가능하지 않았고 (0%), 동일한 환자로부터 Tx-후 PBMC에서 0.0012%로 검출될 수 있다. 전반적으로, 상기 TCR은 8명의 환자들 중 6명에서 검출가능했고, 5/8명 환자에서 Tx-후 시료에서 빈도가 증가하였고, 1/8 환자에서 감소하였다.
표 2: 8명의 환자에서 제2 공유 TCRβ CDR3 서열인, CASSLNRDQPQHF의 빈도
PT: 151006 151014 151016 151035 151039 151050 151119 151070
Tx-전 PBMC 0.0058% 0% 0% 0.001% 0% 0% 0% 0%
Tx-후 PBMC 0.017% 0.000109% 0.0012% 0% 0% 0.0006% 0.000893% 0%
PT151006으로부터 IVS3 8.5%
PT151006으로부터 TIL 0.002%
PT151006으로부터 고정된 종양 0.06%
표 2. 8명의 환자로부터 Tx-전 및 Tx-후 PBMC 시료에서 제2 공유 TCRβ CDR3 서열의 빈도. 상기 표는 LV305로 치료하기 전 또는 후에 수집된 다른 환자 PBMC 시료에서 CDR3 서열인, CASSLNRDQPQHF (서열번호: 3)의 빈도를 보여주었다. 예를 들면, 상기 서열은 PT151006으로부터 Tx-전 PBMC에서 0.0058%로 검출되었고, 동일한 환자로부터 Tx-후 PBMC에서 0.017%로 증가되었다. 상기 서열은 또한 상기 환자로부터 고정된 종양으로부터 검출될 수 있고 (0.06%), 상기 환자로부터 TIL 배양물에서 검출될 수 있다 (0.000647%). 상기 서열은 PT151016으로부터 Tx-전 PBMC에서 검출가능하지 않았고 (0%), 동일한 환자로부터 Tx-후 PBMC에서 0.0006%로 검출될 수 있다. 상기 서열은 PT151050으로부터 Tx-전 PBMC에서 검출가능하지 않았고 (0%), 동일한 환자로부터 Tx-후 PBMC에서 0.0012%로 검출될 수 있다.
TCRβ의 제3 공유 CDR3 서열은 CASRLAGQETQYF (서열번호: 4)이다. 표 3에 개시된 바와 같이, 상기 서열은 PT151006으로부터 Tx-전 PBMC에서 0%이고, 동일한 환자로부터 Tx-후 PBMC에서 0.000196%로 증가되었다. 상기 서열은 PT151-014로부터 Tx-전 PBMC에서 검출가능하지 않았고 (0%), 동일한 환자로부터 Tx-후 PBMC에서 0.000761%로 검출될 수 있다. 상기 서열은 또한 PT151050으로부터 Tx-전 PBMC에서 0.000274%로 검출되었다.
표 3: 8명의 환자에서 제3 공유 TCRβ CDR3 서열인, CASRLAGQETQYF의 빈도
PT: 151006 151014 151016 151035 151039 151050 151119 151070
Tx-전 PBMC 0% 0% 0% 0% 0% 0.000274% 0% 0%
Tx-후 PBMC 0.000196% 0.00076% 0% 0% 0% 0% 0% 0%
IVS3 PT151006 26%
표 3. 8명의 환자로부터 Tx-전 및 Tx-후 PBMC 시료에서 제3 공유 TCRβ CDR3 서열의 빈도. 상기 표는 LV305로 치료하기 전 또는 후에 수집된 다른 환자 PBMC 시료에서 CDR3 서열인, CASRLAGQETQYF (서열번호: 4)의 빈도를 보여주었다. 상기 서열은 PT151006 외에 PT151014 및 PT151050에서 검출될 수 있다.
8명의 환자들로부터 Tx-전 및 Tx-후 PBMC에서 3개의 식별된 공유 TCRs의 빈도는 도 8에 요약되었다.
실시예 9: 3개의 식별된 공유 TCRβ의 CDR3은 공유 TCR의 통상적인 특성을 가짐
본 실시예는 식별된 TCRβ CDR3 서열이 공유 TCRs의 통상적인 특성을 갖는 것을 입증하였다: (1) 상기는 다른 환자에서 다른 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩됨; (2) 상기는 상대적으로 짧은 CDR3 길이를 가짐; 및 (3) 상기는 상대적으로 제한된 비주형화된 뉴클레오티드 부가를 가짐. 상기 모든 특성은 공유 TCR 서열의 특징이다 (Venturi Nat Rev Immunol 2008).
TCR Vα 및 Vβ 유전자 세그먼트의 다양화 (diversification)는 (다른 V 유전자 세그먼트에서 코딩된) 다른 CDR1 및 CDR2 영역의 사용에 의존한다. CDR3은 체세포 재조합 이후에 상이한 V(D)J 생식세포 세그먼트의 병치 (juxtaposition)에 의해 형성되며, 상기 나이브 TCR 레퍼토리의 다양성은 V(D)J 유전자 재배열 동안 정확도의 결여 및 V(D)J 접합부에서 비-주형 코딩된 뉴클레오티드 (N)의 부가로 더 증가하였다 (Turner, et al, Nature Review Immunology 2006).
공유 TCRs가 생성되는 한가지 가능한 방법은 수렴 재조합을 이용하는 것이다. 즉, 많은 다른 V(D)J 재조합 이벤트는 동일한 뉴클레오티드 서열을 생산하기 위해 "수렴"되고, 많은 다른 뉴클레오티드 서열은 동일한 아미노산 서열을 코딩하기 위해 "수렴"된다 (Venturi, et al, Nature Review Immunology 2008). 도 9 및 도 12에 개시된 바와 같이, 본 발명자가 식별한 공유 TCR 서열은 다른 개체에서 다른 뉴클레오티드 서열을 갖는다.
개별 TCRs와 비교하여, 공유된 TCR CDR3 aa 서열은 약 하나의 aa 잔기 만큼 평균적으로 더 짧아지는 경향이 있고, 또한 VD 및 DJ 접합부에서 뉴클레오티드 (nt) 삽입 수가 현저히 감소하는 경향이 있음이 보고되었다 (Madi, et al, Genome Research, 2014). IVS3에서 TCRβ CDR3 길이 분포의 비교로, IVS3에서 T 세포 (도 10a, 검정색 막대)는 Tx-후 PBMC에서 자극되지 않은 T 세포보다 상대적으로 더 짧은 CDR3 영역을 갖는 것을 보였다 (도 10a, 빗금친 막대). 도 10b에서 개시된 바와 같이, 모두 3개의 공유 TCR은 동일한 CDR3 길이 (n=39 뉴클레오티드)를 갖는다. 상기 TCRs은 또한 접합부 영역에서 상대적으로 더 적은 비주형화된 (NT) 뉴클레오티드 (nc) 부가를 갖는다 (0 내지 2개의 뉴클레오티드 부가). 본 발명자가 식별한 공유 TCRs 중 하나인, CASRLAGQETQYF (서열번호: 4)는 N1 (VD) 삽입 부위에서 NT nc 부가가 없었고, N2 (DJ) 삽입 부위에서 nt 부가가 없었다. NT nc 부가의 더 짧은 길이 및 제한된 수의 표현형 특성은 상기 TCRβ CDR3 서열이 공유 TCR 서열이라는 결론을 뒷받침한다.
실시예 10: LV305로 치료된 환자에 대한 HLA 조직 타이핑 결과
환자 시료를 상업적인 HLA 조직 타이핑 서비스 (tissue typing service)로 보냈다. 결과를 하기 표 4에 요약하였고, 공유 TCR CDR3을 공유하는 환자들 사이에서 HLA-A 또는 HLA-B 대립유전자 (alleles)에서 중첩은 확인되지 않았다. HLA-DR, DP 또는 DQ 대립유전자는 또한 환자들 사이에서 상이했다.
LV305로 치료된 4명의 환자에 대한 HLA 조직 타이핑 결과
PT151006
HLA-A *02:01 *24:02
HLA-B *13:02P *35:01
HLA-C *04:01 *06:02
HLA-DRB1 *11:01 *13:01
HLA-DRB3 *02:02 -
HLA-DRB4 - -
HLA-DRB5 - -
HLA-DQB1 *03:01 *06:03P
HLA-DPB1 *04:01 -
HLA-DQA1 *01:03/10 *05:01:01G
HLA-DPA1 *01:03P -
PT151016
HLA-A *01:01 *29:02
HLA-B *40:01 *57:01
HLA-C *03:04 *06:02
HLA-DRB1 *04:01 *07:01P
HLA-DRB3 - -
HLA-DRB4 *01:01 *01:03
HLA-DRB5 - -
HLA-DQB1 *03:01 *03:03
HLA-DPB1 *04:01 *04:02
HLA-DQA1 *02:01 *03:01:01G
HLA-DPA1 *01:03P -
PT151014
HLA-A *02:01 *03:01
HLA-B *15:01 *40:01
HLA-C *03:04 -
HLA-DRB1 *04:01 *08:01
HLA-DRB3 - -
HLA-DRB4 *01:01 -
HLA-DRB5 - -
HLA-DQB1 *03:02 *04:02
HLA-DPB1 *02:01P *03:01:01G
HLA-DQA1 *03:01:01G *04:01:01G
HLA-DPA1 *01:03P -
PT151050
HLA-A *33:03 *74:01
HLA-B *39:10 *58:01
HLA-C *07:01 *12:03
HLA-DRB1 *01:02P *15:03P
HLA-DRB3 - -
HLA-DRB4 - -
HLA-DRB5 *01:01P -
HLA-DQB1 *05:01 *06:02
HLA-DPB1 상기 시료에 대해 HLA-DPB 타입이 수득될 수 없다. rPCR-SSOP로부터 프로브 반응성은 임의의 개시된 HLA-DPB 대립유전자(들)과 상관관계가 없다. 상기 시료에 대해 HLA-DPB 타입이 수득될 수 없다. rPCR-SSOP로부터 프로브 반응성은 임의의 개시된 HLA-DPB 대립유전자(들)과 상관관계가 없다.
HLA-DQA1 *01:01 *01:02
HLA-DPA1 *01:03P *02:01P
실시예 11: LV305로 치료된 환자로부터 공유 TCRs의 TCRA 및 TCRB 가변 영역의 시퀀싱
5'-RLM-RACE (Ambion, Austin,TX)가 TCR 클로닝을 위해 사용되었다. 상기 방법은 가변 도메인 서열의 사전 지식 없이 TCR을 식별하는 것을 가능하게 한다. 요컨대, Trizol
Figure pct00004
추출을 사용하여 NY-ESO-1 특이적 T 세포로부터 RNA가 단리되었다. 그 후 정제된 RNA가 데포스포릴화 (dephosphorylated)되었고, 담배산 피로포스파타제 (Tobacco Acid Pyrophosphatase)를 사용하여 탈-캡핑화 (de-capped)되었고, 5' 어댑터 (adapter)에 결찰되었다. 그 후 제조사의 지시에 따라 M-MLV 리버스 트란스크립타제 (Ambion, Austin, TX)를 사용하여 무작위 디카머 (decamers)에 의해 RNA로부터 cDNA가 제조되었다. 상기 cDNA가 그후 PCR에서 사용되었다. 상기 PCR은 5' 어댑터 및 TCRα 또는 TCRβ의 불변 영역에 어닐링된 프라이머에 의해 수행되었다 (예시되는 프라이머 및 서열 가령 pCa1 및 pCb1은 Walchli, et al, (2011) A Practical Approach to T-Cell Receptor Cloning and Expression. PLoS ONE 6(11): e27930에 의한 공유에 열거되었지만, 클로닝 목적을 위해 제한 부위를 부가하도록 변형되었음). 앰플리콘 (amplicons)은 그 후 소화되고, 겔 정제되고, PCR 프라이머로 혼입된 제한 부위를 사용하여 제조된 벡터로 클로닝되었다. 콜로니를 함유하는 아가 (agar) 플레이트가 그 후 클로닝된 TCR mRNA의 시퀀싱을 위해 보냈다.
151개의 클론이 TCRβ에 대한 2회의 개별 PCR 라운드로부터 시퀀싱되었다. 2개의 다른 TCRβ 가변 영역 서열이 높은 빈도로 발견되었고, 이중 하나는 이전에 식별되고, 서열번호: 4로 제공된 공유 Vβ CDR3 서열을 포함하였다. 서열번호: 4의 공유 VβCDR3을 포함하는 전장 TCRβ 가변 영역 서열은 서열번호: 9에 제공되었고, 도 11에 개시되었다. 다른 TCRβ 가변 영역 서열은 서열번호: 16에 제공되었고, 도 13에 개시되었다 (상기 서열에 주석을 달 수 있고, 상기 TCR의 다른 영역들은 IMGT 데이터베이스 웹사이트에 개시된 것과 같은 표준 방법을 사용하여 식별됨). 2회의 개별의 PCR 라운드로부터 거의 100개의 클론이 TCR 알파에 대해 시퀀싱되었다. 단일 TCRα 사슬 가변 영역이 식별되었고, 서열번호: 8에 제공되었고, 도 11에 개시되었다. TCRα 서열의 BLAST 검색은 알려져 있는 NY-ESO-1 특이적 TCRα 서열과의 상동성을 나타내었다 (PDB:2BNQ_D; Boulter et al., Protein Eng. (2003) 16 (9): 707-711; Chen, J.L. et al. (2000) J. Immunol., 165, 948-955 참조). 서열번호: 9의 TCRβ 서열을 사용한 유사한 검색에서 알려져 있는 매치가 확인되지 않았다.
실시예 12: 공유 TCRs을 갖는 NY-ESO-1 특이적 T 세포는 G100으로 치료 후에 종양으로 침윤함
본 실시예는 LV305 면역요법 시험에서 육종 환자로부터 원래 식별되어진 공유 TCRβ CDR3 서열이 G100, 안정한 에멀젼의 글루코피라노실 리피드 아쥬반트 (GLA-SE)의 종양내 주사를 사용하여 2회의 다른 임상 시험으로부터 환자들에서 검출될 수 있다는 것을 입증하였다. 제1 G100 시험 (NCT02035657)은 메르켈 세포 암종 (Merkel Cell Carcinoma: MCC)을 갖는 환자에서 GLA-SE의 개념-증명 시험 (proof-of-concept trial)이다. 제2 G100 시험 (NCT02180698)은, 전이성 또는 수술로 제거할 수 없는 연조직 육종을 가진 환자를 치료하는 TLR4 작용제 GLA-SE 및 방사선 요법이다. 상기 종양 부위 및 배액 림프절에서 생검을 G100의 투여 전 및 투여 후에 채취하였다. DNA가 생검 조직 및 말초 혈액으로부터 추출되었고, TCRβ CDR3 영역의 딥 시퀀싱은 T 세포 레퍼토리의 다양성을 평가하기 위해 수행되었다. 예기치 않게, LV305 환자 PT151006으로부터 식별된 몇 개의 공유 TCRs가 또한 메르켈 세포 암종 (MCC) 및 육종을 가진 환자로부터 검출되었고, 이들은 방사선과 조합된 종양내 G100 치료에 의한 국부 면역 조절을 받았다. 표 5 내지 표 7은 한 명의 MCC 환자 및 2명의 육종 환자에서 G100-전 및 G100-후 PBMC 및 생검 시료에서 3개의 공유 TCRs의 빈도를 열거하였다. 제1 공유 TCRβ CDR3인, CASSLNRDYGYTF (서열번호: 2)는 MCC 환자 G2 및 육종 환자 P13에서 검출가능했다. 제2 공유 TCRβ CDR3인, CASSLNRDQPQHF (서열번호: 3)는 MCC 환자 G2 및 육종 환자 P12에서 검출가능했다. 제3 공유 TCRβ CDR3인, CASRLAGQETQYF (서열번호: 4)는 MCC 환자 G2에서 검출가능했다.
표 5: G100 환자에서 제1 공유 TCRβ CDR3 서열인, CASSLNRDYGYTF의 빈도
환자 G100-MCC-G2 G100-육종-P12 G100-육종-P13
G2-PBMC G2-생검 P12-PBMC P12-생검 P13-PBMC P13-생검
G100-전 0% 0% 0% 0% 0.000069% 0%
G100-후 0% 0.000442% 0% 0% 0% 0
표 5: G100 환자에서 제1 공유 TCRβ CDR3 서열인, CASSLNRDYGYTF (서열번호: 2)의 빈도. 한 명의 G100-MCC 환자 (G100-MCC-G2) 및 2명의 G100-육종 환자 (G100-육종-P12 및 G100-육종-P13)에서 G100-전 또는 G100-후 PBMC 및 종양 생검에서 공유 TCR의 존재 (빈도)가 개시됨. 상기 서열은 환자 G2로부터 Tx-후 생검에서 0.000442%로 검출되었지만, Tx-전 생검 또는 PBMC 시료에서 검출가능하지 않았다.
표 6: G100 환자에서 제2 공유 TCRβ CDR3 서열인, CASSLNRDQPQHF의 빈도
환자 G100-MCC-G2 G100-육종-P12 G100-육종-P13
G2-PBMC G2-생검 P12-PBMC P12-생검 P13-PBMC P13-생검
G100-전 0.000421% 0% 0.000154% 0% 0% 0%
G100-후 0% 0% 0% 0% 0% 0%
표 6: G100 환자에서 제2 공유 TCR TCRβ CDR3 서열인, CASSLNRDQPQHF의 빈도. 한 명의 G100-MCC 환자 (G100-MCC-G2) 및 2명의 G100-육종 환자 (G100-육종-P12 및 G100-육종-P13)에서 G100-전 또는 G100-후 PBMC 및 종양 생검에서 공유 TCR의 존재 (빈도)가 개시됨. 상기 서열은 G2 및 P12로부터 Tx-전 PBMC에서 검출되었다.
표 7: G100 환자에서 제3 공유 TCRβ CDR3 서열인, CASRLAGQETQYF의 빈도
환자 G100-MCC-G2 G100-육종-P12 G100-육종-P13
G2-PBMC G2-생검 P12-PBMC P12-생검 P13-PBMC P13-생검
G100-전 0% 0% 0% 0% 0% 0%
G100-후 0% 0.000442% 0% 0% 0% 0%
표 7: G100 환자에서 제3 공유 TCR TCRB CDR3 서열인, CASRLAGQETQYF의 빈도. 한 명의 G100-MCC 환자 (G100-MCC-G2) 및 2명의 G100-육종 환자 (G100-육종-P12 및 G100-육종-P13)에서 G100-전 또는 G100-후 PBMC 및 종양 생검에서 공유 TCR의 존재 (빈도)가 개시됨. 상기 서열은 환자 G2로부터 Tx-후 생검에서 0.000442%로 검출되었고, Tx-전 생검 또는 PBMC 시료에서 검출가능하지 않았다.
G2는 종양내 G100 치료 후에 완전한 반응을 갖는 NY-ESO-1 발현 종양을 갖는 MCC 환자이다. 도 14에 개시된 바와 같이, 상기 환자로부터의 G100-전 생검은 NY-ESO-1 발현을 보였고, 이는 G100-후 생검에서 대략 3배까지 감소되었고, 이는 G100-후 치료에서 시토케라틴 (CK20) 포지티브 종양 세포의 사라짐과 일치한다 (데이터는 개시하지 않음). 도 15에 개시된 바와 같이, G100-전 생검에서 검출되지 않은 2개의 공유 TCRβ CDR3은 G100-후 생검에서 검출가능하게 되었다. 상기 데이터는 G100에 의한 종양 미세환경의 조절이 말초 혈액으로부터의 종양으로 공유 TCRs을 갖는 항원-특이적 T 세포를 유도할 수 있음을 시사하였다. 이러한 발견은 NY-ESO-1 특이적 면역요법에 대한 바이오마커로서 공유 TCRβ 서열의 추가의 탐색을 뒷받침한다.
실시예 13: LV305 임상 시험으로부터의 환자에서 식별된 공유 TCRβ CDR3 서열은 또한 C131 임상 시험으로부터의 환자에서 검출될 수 있음
본 실시예는 LV305 시험으로부터의 환자인 PT151006 (NCT02122861)으로부터 식별된 3개의 공유 TCRβ CDR3 서열이 또한 다른 임상 시험인 C131 (NCT02387125)로부터의 환자에서 검출될 수 있다는 것을 입증하였다.
C131은, NY-ESO-1을 발현하는 국소 진행성, 재발된, 또는 전이 암을 가진 환자에서 CMB305 (순차적으로 투여된 LV305 및 G305 (G305는 TLR4 작용제인 글루코피라노실 리피드 A (GLA)로 불리는 합성 소분자로 제제화된 재조합 NY-ESO-1 단백질로 구성되고, 항원-특이적 CD4 "헬퍼" T 세포의 유도를 통한 CTL 반응을 부스트하도록 디자인됨)의 임상 1b 안전성 연구에 있다. 본 발명자들은 PT151006으로부터 식별된 공유 서열을 사용하여 13명의 C131 환자로부터 TCRβ CDR3 레퍼토리를 조사하였다. 표 8에 개시된 바와 같이, 제1 공유 TCRβ CDR3 서열인, CASSLNRDYGYTF (서열번호: 2)는 13명의 C131 환자 중 3명에서 검출되었고; 표 9에서 개시된 바와 같이, 제2 공유 TCRβ CDR3 서열인, CASSLNRDQPQHF (서열번호: 3)는 13명의 C131 환자 중 6명에서 검출되었고; 표 10에서 개시된 바와 같이, 제3 공유 TCRβ CDR3 서열인, CASRLAGQETQYF (서열번호: 4)는 또한 13명의 C131 환자 중 6명에서 검출되었다. 상기 데이터는 PT151006으로부터의 CDR3 서열은 다른 시험으로부터의 환자들에서 공유되었음을 보여주었다. 4명의 환자에서, 상기 공유 TCR이 CMB305 요법의 투여 후에 검출되었고, 따라서 상기 요법에 의해 유도될 가능성이 있다.
Figure pct00005
표 8. C131 시험에서 13명의 환자로부터 Tx-전 및 Tx-후 PBMC 시료에서 제1 공유 TCRβ CDR3 서열의 빈도. 상기 표는 CMB305에 의한 치료 전 또는 후에 수집된 13명의 환자의 PBMC 시료에서 CDR3 서열인, CASSLNRDYGYTF (서열번호: 2)의 빈도를 나타내었다. 상기 서열은 13명의 환자 중 3명에서 검출될 수 있다.
Figure pct00006
표 9. C131 시험에서 13명의 환자로부터 Tx-전 및 Tx-후 PBMC 시료에서 제2 공유 TCRβ CDR3 서열의 빈도. 상기 표는 CMB305에 의한 치료 전 또는 후에 수집된 13명의 환자의 PBMC 시료에서 CDR3 서열인, CASSLNRDQPQHF (서열번호: 3)의 빈도를 나타내었다. 상기 서열은 13명의 환자 중 6명에서 검출될 수 있다.
Figure pct00007
표 10. C131 시험에서 13명의 환자로부터 Tx-전 및 Tx-후 PBMC 시료에서 제3 공유 TCRβ CDR3 서열의 빈도. 상기 표는 CMB305에 의한 치료 전 또는 후에 수집된 13명의 환자의 PBMC 시료에서 CDR3 서열인, CASRLAGQETQYF (서열번호: 4)의 빈도를 나타내었다. 상기 서열은 13명의 환자 중 6명에서 검출될 수 있다.
실시예 14: LV305 임상 시험으로부터 식별된 3개의 공유 TCRβ의 CDR3은 항-CTLA-4 시험으로부터의 환자에서 검출될 수 있음
본 실시예는 LV305 시험으로부터 식별된 공유 TCRβ CDR3 서열이 트레멜리무맙 (tremelimumab)과 항-CTLA4 mAb 요법을 받은 환자에서 검출될 수 있다는 것을 입증하였다 (Robert, et al, Clin Can Res, 2014).
트레멜리무맙에 의한 본 시험에서, PBMC는 기준선 및 트레멜리무맙을 투여하고 30 내지 60일에 수집되었다. 차-세대 시퀀싱 (Next-generation sequencing)은 TCRβ의 CDR3 영역을 연구하는데 사용되었다. 21명의 환자로부터의 시퀀싱 데이터는 Adaptive ImmunoSEQ Analyzer 소프트웨어를 통해 접근가능한 온-라인 데이터베이스에 보관되었다. PT151006-IVS3으로부터의 CDR3 서열과 항-CTLA4 요법을 받은 21명의 환자들의 서열을 비교하는 데이터베이스 질의는, PT151006으로부터 식별된 3개의 공유 서열이 또한 CTLA4 요법에서 이들 환자들에서 검출될 수 있다는 것을 보여주었다 (도 16).
증가된 TCR V-베타 CDR3 풍도 (richness) 및 Shannon 지수 다양성 (index diversity)이 CTLA4 차단 요법을 받은 환자에서 관찰되었다 (Robert, et al, Clin Can Res, 2014). 공유 TCR의 빈도와 관련하여, 상기 빈도가 항-CTLA4 요법 후에 증가하거나 또는 감소하는 지에 대한 분명한 추세는 없었고, 환자마다 다르게 나타났다. 주목할 것은, CTLA4 시험으로부터 반응이 완료된 (CR) 3명의 환자들 중 한명에서 (GA18), 모두 3개의 공유 서열이 Tx-후 PBMC에서 검출되었고, Tx-전 PBMC에서는 어느 누구도 검출되지 않았다. 치료 반응을 위한 바이오마커로서 상기 공유 CDR3 서열의 잠재적인 용도가 추가로 조사될 필요가 있다.
실시예 15: 동일하거나 또는 상이한 환자에서 동일한 CDR3에 대한 상이한 TCRB V 용법
본 실시예는 동일한 CDR3 영역이 다른 환자, 또는 심지어 동일한 환자에서 다른 TCRβ V 유전자와 쌍을 이룰 수 있음을 입증하였다.
도 17은 딥 시퀀싱 분석에 의해 동일한 CDR3과 관련이 있다고 검출된 상이한 TCRβ V 유전자 사용을 열거하였다. CASSLNRDQPQHF (서열번호: 3)는 제2 공유 CDR3이고, 이는 PT151006 및 PT151119에서 검출되었다. 상기 CDR3은 주로 PT151006에서 TCRβ V07-07을 사용한다. 이는 또한 PT151006에서 TCRβ V07-08, TCRβ V07-06, TCRβ V07-09, TCRβ V07-02, TCRβ V07-03, 및 TCRβ V07-04를 사용한다. PT151119에서, TCRβ V07-08 만이 상기 CDR3에 대해 사용된다. 이는 상이한 TCRβ V-유전자 패밀리가 동일한 CDR3에 대해 다른 환자들에 의해 사용될 수 있고, 상이한 TCRβ V-유전자는 또한 동일한 CDR3에 대해 동일한 환자 내에서 사용될 수 있다는 것을 보여주었다. 주목할 것은, J 유전자 사용 (TCRβ J01-05)은 두 환자 모두에서 동일하다.
도 19는 다른 시험들로부터의 환자에서 TCRβ의 뉴클레오티드, CDR3 아미노산 서열, 및 V 유전자 및 J 유전자를 열거하였다. PT151006은 LV305 임상 시험으로부터 유래하고; C131-001 및 C131-013은 CMB305 시험으로부터 유래하고; G2-C1W4B는 G100 시험으로부터 유래한다. 상기 도에서 데이터는 상이한 시험들로부터의 환자는 동일한 CDR3 아미노산 서열을 갖지만, 다른 뉴클레오티드 서열 및 다른 TCRβ V-유전자 사용을 갖는 것이 입증되었다. 환자 C131-013의 경우에, 다른 TCRβ V-유전자 사용을 갖는, 동일한 CDR3인, CASSLNRDQPQHF (서열번호: 3)를 코딩하는 3개의 다른 뉴클레오티드 서열이 발견되었다. 이는 도 17 및 도 18에서 개시된 것과 같이, PT151006에 대한 관찰과 유사하다.
실시예 16: 공유 CDR3은 NY-ESO-1 특이적 CD4 T 세포로부터 식별됨
본 실시예는 공유 TCRβ CDR3을 식별하는데 사용되는 인 비트로 생성된 세포 배양물이 CD4 T 세포로 구성되었음을 보여주었다.
PT151006-IVS3 T 세포 배양물의 표현형을 특성화하기 위해서, 본 발명자들은 정상 공여체로부터의 배양되지 않은 PBMC와 배양된 세포를 나란히 염색하였다. 상기 세포는 형광색소 (fluorochrome)-콘쥬게이트된 모노클로날 항체를 사용하여 T 세포 마커 (CD3, CD4, 및 CD8) 및 NK 세포 마커 (CD56)에 대한 모노클로날 항체로 염색되었고, 그 후 BD LSRII 유세포 분석기에서 분석되었다. 데이터 분석은 FlowJo 소프트웨어를 사용하여 수행되었다. 도 20에서 개시된 바와 같이, 상기 림프구 개체군은 먼저 FSC/SSC 플롯에서 게이트되었고, 그 후 CD4 T 세포가 CD3+CD4+ 림프구로서 게이트되었고, CD8 T 세포가 CD3+CD8+ 림프구로서 게이트되었다. 상기 NK 세포가 CD3-CD56+ 림프구로 게이트되었다. 상기 대조군 공여체 PBMC는 건강한 공여체 PBMC에서 정상적으로 관찰되는 바와 같이, CD4, CD8 T 세포 및 NK 세포의 예상 백분율을 갖는다. 대조적으로, PT151006-IVS3으로부터의 배양된 세포는 NK 세포 및 CD8 T 세포의 결여를 보였고, 오직 CD4 T 세포만을 포함하였다. 상기 데이터는 PT151006으로부터 배양된 NY-ESO-1 특이적 T 세포주는 CD4 T 세포이고, 상기 공유 TCRs는 CD4 TCRs인 것으로 보여주었다.
전술된 여러 구체예가 추가의 구체예를 제공하기 위하여 조합될 수 있다. 본 명세서에 언급된 및/또는 출원 데이터 시트 (Application Data Sheet)에 열거된 모든 미국 특허, 미국 특허공개공보, 미국 특허출원, 외국 특허, 외국 특허출원 및 비-특허 문헌은 그의 전문이 참조로 본원에 포함된다. 추가의 구체예를 제공하기 위해 여러 특허, 출원, 및 문헌의 개념을 이용하는데 필요할 경우, 구체예의 양상이 변형될 수 있다.
전술한 상세한 개시내용의 관점에서 구체예에 대하여 이들 및 다른 변화가 가해질 수 있다. 통상적으로, 하기 청구범위에서, 사용된 용어는 청구범위를 명세서에 개시된 특정 구체예로 한정하는 것으로 해석되어서는 안되고, 청구범위는 청구항에 부여되는 등가물의 완전한 범위와 함께 모든 가능한 구체예를 포함하는 것으로 해석되어야 한다. 따라서, 청구범위는 개시내용에 의해 한정되지 않는다.
SEQUENCE LISTING <110> IMMUNE DESIGN CORP. <120> NY-ESO-1 SPECIFIC TCRS AND METHODS OF USE THEREOF <130> 31943/49487A <150> US 62/216,099 <151> 2015-09-09 <150> US 62/377,276 <151> 2016-08-19 <160> 26 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Public TCR CDR3 consensus sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(12) <223> Xaa is any amino acid <400> 1 Cys Ala Ser Ser Leu Asn Arg Asp Xaa Xaa Xaa Xaa Phe 1 5 10 <210> 2 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Cys Ala Ser Ser Leu Asn Arg Asp Tyr Gly Tyr Thr Phe 1 5 10 <210> 3 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Cys Ala Ser Ser Leu Asn Arg Asp Gln Pro Gln His Phe 1 5 10 <210> 4 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Cys Ala Ser Arg Leu Ala Gly Gln Glu Thr Gln Tyr Phe 1 5 10 <210> 5 <211> 87 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 5 aagatccagc gcacacagca ggaggactcc gccgtgtatc tctgtgccag cagcttgaac 60 agggactatg gctacacctt cggttcg 87 <210> 6 <211> 87 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 6 acgattcagc gcacagagca gcgggactca gccatgtatc gctgtgctag cagcttgaac 60 agggaccagc cccagcattt tggtgat 87 <210> 7 <211> 87 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 7 attctggagt ccgccagcac caaccagaca tctatgtacc tctgtgccag cagactagcg 60 ggacaagaga cccagtactt cgggcca 87 <210> 8 <211> 200 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Met Glu Thr Leu Leu Gly Leu Leu Ile Leu Trp Leu Gln Leu Gln Trp 1 5 10 15 Val Ser Ser Lys Gln Glu Val Thr Gln Ile Pro Ala Ala Leu Ser Val 20 25 30 Pro Glu Gly Glu Asn Leu Val Leu Asn Cys Ser Phe Thr Asp Ser Ala 35 40 45 Ile Tyr Asn Leu Gln Trp Phe Arg Gln Asp Pro Gly Lys Gly Leu Thr 50 55 60 Ser Leu Leu Leu Ile Gln Ser Ser Gln Arg Glu Gln Thr Ser Gly Arg 65 70 75 80 Leu Asn Ala Ser Leu Asp Lys Ser Ser Gly Arg Ser Thr Leu Tyr Ile 85 90 95 Ala Ala Ser Gln Pro Gly Asp Ser Ala Thr Tyr Leu Cys Ala Val Val 100 105 110 Gly Gly Ser Tyr Ile Pro Thr Phe Gly Arg Gly Thr Ser Leu Ile Val 115 120 125 His Pro Tyr Ile Gln Lys Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu Arg Asp 130 135 140 Ser Lys Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser 145 150 155 160 Gln Thr Asn Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr Asp 165 170 175 Lys Thr Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser Ala 180 185 190 Val Ala Trp Ser Asn Lys Ser Asp 195 200 <210> 9 <211> 117 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9 Asp Val Lys Val Thr Gln Ser Ser Arg Tyr Leu Val Lys Arg Thr Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Phe Leu Glu Cys Val Gln Asp Met Asp His Glu Asn Met 20 25 30 Phe Trp Tyr Arg Gln Asp Pro Gly Leu Gly Leu Arg Leu Ile Tyr Phe 35 40 45 Ser Tyr Asp Val Lys Met Lys Glu Lys Gly Asp Ile Pro Glu Gly Tyr 50 55 60 Ser Val Ser Arg Glu Lys Lys Glu Arg Phe Ser Leu Ile Leu Glu Ser 65 70 75 80 Ala Ser Thr Asn Gln Thr Ser Met Tyr Leu Cys Ala Ser Arg Leu Ala 85 90 95 Gly Gln Glu Thr Gln Tyr Phe Gly Pro Gly Thr Arg Leu Leu Val Leu 100 105 110 Glu Asp Leu Lys Asn 115 <210> 10 <211> 87 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 10 aagatccagc cctcagaacc cagggactca gctgtgtact tctgtgccag cagtttgaac 60 cgggactatg gctacacctt cggttcg 87 <210> 11 <211> 87 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 11 aagatccagc gcacagagcg gggggactca gccgtgtatc tctgtgccag cagcttaaac 60 agggactatg gctacacctt cggttcg 87 <210> 12 <211> 87 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 12 gagatccagc gcacagagca gggggactcg gccatgtatc tctgtgccag cagcttaaac 60 cgggaccagc cccagcattt tggtgat 87 <210> 13 <211> 87 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 13 aatgtgaacg ccttggagct ggacgactcg gccctgtatc tctgtgccag cagcttgaat 60 cgtgatcagc cccagcattt tggtgat 87 <210> 14 <211> 87 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 14 aggctggagt tggctgctcc ctcccagaca tctgtgtact tctgtgccag cagactagcg 60 gggcaagaga cccagtactt cgggcca 87 <210> 15 <211> 87 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 15 aatgtgagca ccttggagct gggggactcg gccctttatc tttgcgccag cagactagcg 60 gggcaagaga cccagtactt cgggcca 87 <210> 16 <211> 170 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 16 Met Glu Ala Val Val Thr Thr Leu Pro Arg Glu Gly Gly Val Arg Pro 1 5 10 15 Ser Arg Lys Met Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Gly Pro Gly Ser Gly 20 25 30 Leu Gly Ala Val Val Ser Gln His Pro Ser Trp Val Ile Cys Lys Ser 35 40 45 Gly Thr Ser Val Lys Ile Glu Cys Arg Ser Leu Asp Phe Gln Ala Thr 50 55 60 Thr Met Phe Trp Tyr Arg Gln Phe Pro Lys Gln Ser Leu Met Leu Met 65 70 75 80 Ala Thr Ser Asn Glu Gly Ser Lys Ala Thr Tyr Glu Gln Gly Val Glu 85 90 95 Lys Asp Lys Phe Leu Ile Asn His Ala Ser Leu Thr Leu Ser Thr Leu 100 105 110 Thr Val Thr Ser Ala His Pro Glu Asp Ser Ser Phe Tyr Ile Cys Ser 115 120 125 Ala Arg Lys Gly Leu Ala Gly Arg Glu Thr Gln Tyr Phe Gly Pro Gly 130 135 140 Thr Arg Leu Leu Val Leu Glu Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro Glu 145 150 155 160 Val Ala Val Phe Glu Pro Ser Glu Ala Glu 165 170 <210> 17 <211> 87 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 17 aagatccggt ccacaaagct ggaggactca gccatgtact tctgtgccag cagtctaaac 60 agggactatg gctacacctt cggttcg 87 <210> 18 <211> 87 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 18 attctggagt ccgccagcac caaccagaca tctatgtacc tctgtgccag cagtttaaac 60 cgggattatg gctacacctt cggttcg 87 <210> 19 <211> 87 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 19 aatgtgaacg ccttggagct ggaggactcg gccctgtatc tctgtgccag cagcttgaac 60 agggatcagc cccagcattt tggtgat 87 <210> 20 <211> 87 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 20 aacatgagct ccttggagct gggggactca gccctgtact tctgtgccag cagcttgaac 60 agggatcagc cccagcattt tggtgat 87 <210> 21 <211> 87 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 21 aatgtgaacg ccttgttgct gggggactcg gccctgtatc tctgtgccag cagcttgaac 60 agggatcagc cccagcattt tggtgat 87 <210> 22 <211> 87 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 22 aggctggagt tggctgctcc ctcccagaca tctgtgtact tctgtgccag cagacttgcg 60 ggccaagaga cccagtactt cgggcca 87 <210> 23 <211> 87 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 23 accctggagt ctgccaggcc ctcacatacc tctcagtacc tctgtgccag cagactagcg 60 ggacaggaga cccagtactt cgggcca 87 <210> 24 <211> 39 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 24 tgtgctagca gcttgaacag ggaccagccc cagcatttt 39 <210> 25 <211> 39 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 25 tgtgccagca gcttaaacag ggaccagccc cagcatttt 39 <210> 26 <211> 39 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 26 tgtgccagca gcttaaacag ggaccagccc cagcatttt 39

Claims (48)

  1. 키메라 헤테로이량체 (chimeric heterodimeric) T 세포 수용체 (T cell receptor: TCR) 폴리펩티드로서:
    a. TCR 베타 사슬 가변 영역, TCR 베타 사슬 불변 영역, 및 선택적으로 막횡단 도메인 및 세포질 신호전달 도메인을 포함하는 제1 폴리펩티드;
    b. TCR 알파 사슬 가변 영역, TCR 알파 사슬 불변 영역, 및 선택적으로 막횡단 도메인 및 세포질 신호전달 도메인을 포함하는 제2 폴리펩티드를 포함하고;
    상기 헤테로이량체 TCR은 NY-ESO-1/MHC 복합체에 특이적으로 결합하고, 상기 TCR 베타 사슬 가변 영역은 서열번호: 9에 개시된 TCR 베타 사슬 가변 영역 아미노산 서열을 포함하고; 상기 TCR 알파 사슬 가변 영역은 서열번호: 8에 개시된 동족 (cognate) TCR 알파 사슬 가변 영역 아미노산 서열을 포함하고; 상기 제1 폴리펩티드 및 상기 제2 폴리펩티드 사이에 적어도 하나의 디술피드 결합이 존재하는 것인 키메라 헤테로이량체 T 세포 수용체 (TCR) 폴리펩티드.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 TCR 베타 사슬 가변 영역 CDR3은 아미노산 서열 CASRLAGQETQYF (서열번호: 4)를 포함하는 것인 키메라 헤테로이량체 TCR.
  3. 청구항 1에 있어서, 가용성이고, 상기 제1 폴리펩티드 및 상기 제2 폴리펩티드는 상기 막횡단 도메인 및 상기 세포질 신호전달 도메인을 포함하지 않는 것인 키메라 헤테로이량체 TCR.
  4. 청구항 1의 키메라 헤테로이량체 TCR을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산.
  5. 청구항 4의 핵산을 포함하는 발현 벡터.
  6. 청구항 5에 있어서, 레트로바이러스 벡터 (retroviral vector)인 것인 발현 벡터.
  7. 청구항 5에 있어서, 렌티바이러스 벡터 (lentiviral vector)인 것인 발현 벡터.
  8. 청구항 4의 핵산 또는 청구항 5의 벡터를 포함하는 단리된 세포.
  9. 청구항 8에 있어서, T 세포인 것인 세포.
  10. 청구항 1의 키메라 헤테로이량체 TCR, 청구항 5의 벡터, 청구항 4의 핵산 또는 청구항 9의 단리된 세포를 포함하는 약학적 조성물.
  11. TCR 베타 사슬 가변 영역, TCR 알파 사슬 가변 영역, 불변 영역 및 선택적으로 막횡단 도메인 및 세포질 신호전달 도메인을 포함하는 단일 사슬 TCR로서, 상기 TCR 베타 사슬 가변 영역 CDR3은 CASSLNRDYGYTF (서열번호: 2), CASSLNRDQPQHF (서열번호: 3) 및 CASRLAGQETQYF (서열번호: 4)로 구성된 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하고; 상기 단일 사슬 TCR은 NY-ESO-1/MHC 복합체에 특이적인 것인 단일 사슬 TCR.
  12. 청구항 11에 있어서, 상기 TCR 베타 사슬 가변 영역은 서열번호: 9에 개시된 TCR 베타 사슬 가변 영역 아미노산 서열을 포함하고; 상기 TCR 알파 사슬 가변 영역은 서열번호: 8에 개시된 동족 TCR 알파 사슬 가변 영역 아미노산 서열을 포함하는 것인 단일 사슬 TCR.
  13. 청구항 11에 있어서, 가용성 단일 사슬 TCR이고; 상기 단일 사슬 TCR은 막횡단 도메인 및 세포질 신호전달 도메인을 포함하지 않는 것인 단일 사슬 TCR.
  14. 청구항 11 내지 14 중 어느 한 항의 단일 사슬 TCR을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산.
  15. 청구항 14의 핵산을 포함하는 발현 벡터.
  16. 청구항 15에 있어서, 레트로바이러스 벡터인 것인 발현 벡터.
  17. 청구항 15에 있어서, 렌티바이러스 벡터인 것인 발현 벡터.
  18. 청구항 14의 핵산 또는 청구항 16의 벡터를 포함하는 단리된 세포.
  19. 청구항 18에 있어서, T 세포인 것인 세포.
  20. 청구항 11의 단일 사슬 TCR, 청구항 15의 벡터, 청구항 15의 핵산 또는 청구항 20의 세포를 포함하는 약학적 조성물.
  21. 치료적 조성물을 포유동물 피험체에게 투여하는 단계를 포함하는, 포유동물 피험체에서 NY-ESO-1 암을 치료하는 방법으로서, 상기 조성물은 청구항 9의 단리된 세포 및 청구항 19의 단리된 세포로부터 선택된 하나 이상의 치료제를 포함하고; 상기 치료적 조성물은 상기 피험체에서 상기 암을 치료하는데 유효한 양으로 투여되는 것인 방법.
  22. 청구항 9의 단리된 세포 또는 청구항 19의 단리된 세포로부터 선택된 요법을 포유동물 피험체에게 투여하는 단계를 포함하는, 포유동물 피험체에서 NY-ESO-1을 발현하는 암 세포의 증식을 저해하는 방법으로서; 상기 치료적 조성물은 상기 피험체에서 NY-ESO-1을 발현하는 암 세포의 증식을 저해하는데 유효한 양으로 투여되는 것인 방법.
  23. 암을 치료하는 방법으로서:
    (a) NY-ESO-1 암 요법으로부터 편익 (benefit)을 얻을 수 있는 포유동물 피험체를 식별하는 (identifying) 단계로서,
    (i) NY-ESO-1에 특이적인 TCR 베타 사슬 가변 영역 상보성 결정 영역 3 (VβCDR3)을 포함하는 TCR 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드로서, 상기 VβCDR3은 CASSLNRDXXXXF (서열번호: 1); 또는 CASRLAGQETQYF (서열번호: 4); 또는 둘 다의 아미노산 서열을 포함하는 것인 폴리뉴클레오티드; 또는
    (ii) NY-ESO-1에 특이적인 VβCDR3을 포함하는 TCR 폴리펩티드로서, 상기 VβCDR3은 CASSLNRDXXXXF (서열번호: 1); 또는 CASRLAGQETQYF (서열번호: 4), 또는 둘 다의 아미노산 서열을 포함하는 것인 TCR 폴리펩티드의 존재를 상기 포유동물 피험체로부터의 시료에서 결정하는 단계를 포함하고, 상기 (i) 및/또는 (ii)의 존재는 상기 피험체가 NY-ESO-1 암 요법으로부터 편익을 얻을 수 있다는 것을 나타내는 것인 단계; 및
    (b) 상기 NY-ESO-1 암 요법을 상기 포유동물 피험체에게 투여하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  24. 청구항 23에 있어서, 상기 VβCDR3은 CASSLNRDYGYTF (서열번호: 2), CASSLNRDQPQHF (서열번호: 3) 및 CASRLAGQETQYF (서열번호: 4), 또는 상기의 하나 이상의 임의의 조합으로 구성된 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
  25. 청구항 23에 있어서, 상기 NY-ESO-1 암 요법은 NY-ESO-1 폴리펩티드를 코딩하는 벡터를 투여하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  26. 청구항 23에 있어서, 상기 벡터는 레트로바이러스 벡터를 표적으로 하는 수지상 세포를 포함하는 것인 방법.
  27. 청구항 23에 있어서, 아쥬반트 (adjuvant)를 상기 피험체에게 투여하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
  28. 청구항 27에 있어서, 상기 아쥬반트는 글루코피라노실 리피드 A (glucopyranosyl lipid A: GLA)인 것인 방법.
  29. 청구항 28에 있어서, GLA는 안정한 수중유형 에멀젼에서 제제화 (formulated)되는 것인 방법.
  30. 청구항 24에 있어서, 상기 벡터는 렌티바이러스 벡터인 것인 방법.
  31. 청구항 23에 있어서, 상기 NY-ESO-1 암 요법은 GLA를 포함하는 조성물을 상기 피험체에게 투여하는 단계를 포함하고, 상기 조성물은:
    (a) 하기 화학식의 GLA로서:
    Figure pct00008

    식 중에서:
    R1, R3, R5 및 R6은 C11-C20 알킬이고; 및
    R2 및 R4는 C12-C20 알킬인 것인 GLA; 및
    (b) 약학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 포함하고;
    상기 조성물은 항원을 포함하지 않는 것인 방법.
  32. 청구항 31에 있어서, 상기 R1, R3, R5 및 R6은 운데실이고, R2 및 R4는 트리데실인 것인 방법.
  33. 청구항 31에 있어서, 상기 포유동물은 인간인 것인 방법.
  34. 청구항 31에 있어서, 상기 조성물은 수성 제제 (formulation)인 것인 방법.
  35. 청구항 31에 있어서, 상기 조성물은 수중유형 에멀젼, 유중수형 에멀젼, 리포좀, 미셀라 (micellar) 제제, 또는 미세입자 (microparticle)의 형태인 것인 방법.
  36. 청구항 21 내지 35 중 어느 항에 있어서, 상기 암은 고형 종양을 포함하는 것인 방법.
  37. 청구항 21 내지 36 중 어느 한 항에 있어서, 상기 암은 육종, 전립선암, 자궁암, 갑상샘암, 고환암, 신장암, 췌장암, 난소암, 식도암, 비-소-세포 폐암, 비-호지킨 (non-Hodgkin's) 림프종, 다발 골수종, 흑색종, 간세포 (hepatocellular) 암종, 두경부암, 위암, 자궁내막암 (endometrial cancer), 대장암 (colorectal cancer), 담관암종 (cholangiocarcinoma), 유방암, 방광암, 골수성 백혈병 및 급성 림프모구 백혈병으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 것인 방법.
  38. 청구항 31에 있어서, 상기 조성물은 피하, 피내, 근육내, 종양내, 또는 정맥내 주사로 투여되는 것인 방법.
  39. 청구항 21 내지 38 중 어느 항에 있어서, 상기 조성물은 하나 이상의 추가의 치료제 또는 치료법과 함께 투여되는 것인 방법.
  40. 청구항 39에 있어서, 상기 치료제는 면역 체크포인트 저해제 (immune checkpoint inhibitor)인 것인 방법.
  41. 청구항 39에 있어서, 상기 치료제는 공자극 경로 (costimulatory pathway)를 활성화하는 항체인 것인 방법.
  42. 청구항 41에 있어서, 상기 항체는 항-CD40 항체인 것인 방법.
  43. 청구항 39에 있어서, 상기 치료제는 암 치료제인 것인 방법.
  44. 청구항 43에 있어서, 상기 암 치료제는 탁소텔 (taxotere), 카르보플라틴 (carboplatin), 트라스투주맙 (trastuzumab), 에피루비신 (epirubicin), 시클로포스파미드 (cyclophosphamide), 시스플라틴 (cisplatin), 도세탁셀 (docetaxel), 독소루비신 (doxorubicin), 에토포시드 (etoposide), 5-FU, 겜시타빈 (gemcitabine), 메토트렉세이트 (methotrexate), 및 파클리탁셀 (paclitaxel), 미톡산트론 (mitoxantrone), 에포틸론 (epothilone) B, 표피-성장 인자 수용체 (epidermal-growth factor receptor: EGFR)-표적 모노클로날 항체 7A7.27, 보리노스타트 (vorinostat), 로미뎁신 (romidepsin), 도코사헥사에노산, 보르테조밉 (bortezomib), 시코닌 (shikonin) 및 항암 바이러스 (oncolytic virus)로 구성된 그룹으로부터 선택되는 것인 방법.
  45. 청구항 39에 있어서, 상기 하나 이상의 추가의 치료적 치료법은 방사선 요법인 것인 방법.
  46. NY-ESO-1 암 요법으로부터 편익을 얻을 수 있는 포유동물 피험체를 식별하는 방법으로서:
    (a) 상기 포유동물 피험체로부터의 시료에서
    (i) NY-ESO-1에 특이적인 VβCDR3을 포함하는 TCR 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드로서, 상기 VβCDR3은 CASSLNRDXXXXF (서열번호: 1) 또는 CASRLAGQETQYF (서열번호: 4); 또는 둘 다의 아미노산 서열을 포함하는 것인 폴리뉴클레오티드; 또는
    (ii) NY-ESO-1에 특이적인 VβCDR3을 포함하는 TCR 폴리펩티드로서, 상기 VβCDR3은 CASSLNRDXXXXF (서열번호: 1) 또는 CASRLAGQETQYF (서열번호: 4); 또는 둘 다의 아미노산 서열을 포함하는 TCR 폴리펩티드의 존재를 결정하는 단계를 포함하고,
    상기 (i) 및/또는 (ii)의 존재는 상기 피험체가 NY-ESO-1 암 요법으로부터 편익을 얻을 수 있다는 것을 나타내는 것인 방법.
  47. 청구항 46에 있어서, 상기 VβCDR3은 CASSLNRDYGYTF (서열번호: 2), CASSLNRDQPQHF (서열번호: 3) 및 CASRLAGQETQYF (서열번호: 4), 또는 상기의 하나 이상의 임의의 조합으로 구성된 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
  48. MHC 복합체와 관련하여 세포 또는 조직 상에 제시되는 NY-ESO-1 펩티드 항원을 포함하는 세포 또는 조직을 검출하는 방법으로서, 상기 방법은: a) 상기 제시된 NY-ESO-1 펩티드 항원과 청구항 3 또는 청구항 13의 적어도 하나의 가용성 TCR 분자 또는 그의 기능적 단편에 특정 결합 복합체를 형성하는 조건하에 상기 가용성 TCR 또는 단편과 상기 세포 또는 조직을 접촉시키는 단계, b) 상기 제시된 펩티드 항원에 결합되지 않은 임의의 가용성 TCR 분자 또는 단편을 제거하기에 적합한 조건하에 상기 세포 또는 조직을 세척하는 단계; 및 c) 상기 제시된 펩티드 항원을 포함하는 세포 또는 조직을 나타내는 것으로서 상기 특정 결합 복합체를 검출하는 단계를 포함하는 것인 방법.
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