KR100710536B1 - 미생물 균주를 이용한 (Ｓ)-1-(ο-불화페닐)에탄올의제조방법 - Google Patents

미생물 균주를 이용한 (Ｓ)-1-(ο-불화페닐)에탄올의제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 알코올 탈수소화효소(Alcohol dehydrogenase) 및 카보닐기 환원효소(Carbonyl reductase)를 생산하는 균주를 이용한 (S)-1-(o-불화페닐)에탄올{(S)-1-(o-Fluorophenyl)ethanol} 제조방법에 관한 것으로, 좀 더 상세하게는 완충용액하에서, 알코올 탈수소화효소 및 카보닐기 환원효소를 생산하는 미생물 균주, 2-불화아세토페논 및 환원력을 제공하는 물질을 반응시키는, 미생물 균주를 이용한 (S)-1-(o-불화페닐)에탄올의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법은 성장 및 배양이 용이하며, 값비싼 조효소가 필요없는 미생물을 이용하여 단시간내에 별도의 부가적인 장치없이 2-불화아세토페논을 99% 이상 환원시켜 광학순도 99% 이상의 (S)-1-(o-불화페닐)에탄올을 제조할 수 있다.
미생물, 탈수소화, 환원효소, 불화페닐, 불화아세토페논, 환원력

Description

미생물 균주를 이용한 (Ｓ)-1-(ο-불화페닐)에탄올의 제조방법{Method for preparing (S)-1-(o-Fluorophenyl)ethanol using Microbial strains}
도 1은 본 발명에 따른 미생물을 이용하여 2-불화아세토페논이 (S)-1-(o-불화페닐)에탄올로 전환되는 과정에 대한 모식도이다.
본 발명은 미생물 균주를 이용한 (S)-1-(o-불화페닐)에탄올의 제조방법에 관한 것으로, 좀 더 상세하게는 알코올 탈수소화효소 및 카보닐기 환원효소를 생산하는 미생물 균주를 이용하여 2-불화아세토페논(2-Fluoroacetophenone)의 케톤기를 광학선택적으로 환원시켜 99% 이상의 매우 높은 광학순도를 가지며, 생산이 용이하고 경제적으로 저렴하여 산업적으로 적용이 용이한 (S)-1-(o-불화페닐)에탄올을 제조하는 방법에 관한 것이다.
현재 광학순도(Enantiomeric purity)가 높은 화합물에 대한 요구는 지속적으로 증가하고 있다. 키랄형의 화학물질(chiral chemical)중에서 광학적으로 순수한 알코올류는 천연물, 의약, 농업용 화학물질의 합성에 필요한 전구물질(precusor)로 특히 중요한데, 이는 알코올기를 염화물(chloride), 아민류(amines), 아지드(azide) 화합물, 불화물(fluoride)등과 같은 여러 기능기로 전환하여 다른 화합물질의 중간물질(building block)로 활용할 수 있기 때문이다(Nakamura K. & Matsuda T., J. Org. Chem., 63, 8957-8964, 1998).
일반적으로 광학 활성이 있는 알코올류를 제조하는 방법 중에서 가장 간단한 방법의 하나는 알코올 탈수소화효소나 카보닐기 환원효소와 같은 생촉매(biocatalysts)나 유기금속 화합물을 포함하고 있는 키랄형의 리간드(ligand)를 이용하여 대응하는 케톤기를 비대칭적으로 환원시키는 것이다.
현재까지 (S)-1-(o-불화페닐)에탄올을 제조하는 방법에 대한 연구는 전구물질로 2-불화스티렌(2-Fluorostyrene)이나 2-불화아세토페논을 이용하는 2가지 방법이 보고되어 있다.
먼저, 2-불화스티렌을 이용하여 (S)-1-(o-불화페닐)에탄올을 제조하는 방법은 광학 선택성이 있는 키랄형의 유기촉매를 리간드로 활용하는데 이에 대한 3가지 선행기술이 보고되어 있다.
사쿠라바(Sakuraba) 등은 염화팔라듐과 키랄형의 (S)-N-술포닐아미노포스핀의 혼합물(PdCl2[(S)-N-sulfonylaminophosphine])을 이용하여 2-불화스티렌을 비대칭 규화수소반응(Asymmetric hydrosilylation)시켜 1-(o-불화)-1-삼염화규소화에탄(1-(o-Fluoro)-1-trichlorosilylethane)을 만든뒤 여기에 에탄올과 트리에틸아민을 첨가하여 1-(o-불화)-1-삼에톡시에탄(1-(o-Fluoro)-1-triethoxyethane)을 만들 고 다시 30% 과산화수소를 첨가하여 (S)-1-(o-불화페닐)에탄올을 합성하였다 (Sakuraba S., et al., Chem. Pharm. Bull., 43(6) 927-934, 1995). 그러나 (S)-1-(o-불화페닐)에탄올로의 전환율은 58.0%이고 광학순도는 51.1%로 산업적으로 활용하기에는 광학순도가 매우 낮은 편이다.
앙리(Henri) 등은 로듐(Rhodium)과 1,1-(2-디아릴포스피노-1-나프틸)이소퀴놀린(1,1-(2-diarylphosphino-1-naphthyl)isoquinoline)의 복합체를 사용하여 2-불화아세토페논으로부터 (S)-1-(o-불화페닐)에탄올을 제조하였는데 전환율은 92%이고 광학순도는 72%를 나타내었다(Henri D., et al., Chemistry-European Journal, 5(4), 1320-1330, 1999).
데마이(Demay) 등은 (R,R)-1,2-비스(디-2-퓨릴포스파닐)시클로헥산 ((R,R)- 1,2-bis(di-2-furylphosphanyl)cyclohexane)과 [Rh(cod)2] BF4의 혼합물에 카테콜보레인(catecholborane)을 첨가하여 2-불화스티렌을 광학활성형의 (S)-1-(o-불화페닐)에탄올로 전환하였는데 전환율은 84%이고 광학순도는 82%를 나타내었다(Demay S., et al., Angew. Chem. Int. Ed., 40(7), 1235-1238, 2001).
2-불화스티렌을 이용하여 (S)-1-(o-불화페닐)에탄올을 합성하는 방법 외에 2-불화아세토페논을 이용하여 (S)-1-(o-불화페닐)에탄올을 제조하는 방법은 2-불화아세토페논의 케톤기를 광학선택적으로 환원하여 (S)-1-(o-불화페닐)에탄올을 제조하는 방법인데 이는 다시 크게 두 가지로 구별된다. 한가지는 금속을 포함하는 키랄형의 유기촉매를 사용하여 비대칭 수소화반응(asymmetric hydrogenation)시켜 2- 불화아세토페논의 케톤기를 광학선택적으로 환원하는 것이며, 다른 하나의 방법은 미생물을 이용하여 광학 선택적으로 환원시키는 것이다.
현재까지 알려진 비대칭 수소화반응은 2-불화아세토페논의 케톤기를 리튬 (Lithium, Li), 루비듐(Rubidium, Rb), 로듐(Rhodium, Rh), 이리듐(Iridium, Ir)과 같은 금속촉매를 분자내에 포함하고 자체적으로 키랄구조를 갖는 유기화합물 복합체를 리간드로 이용하여 2-불화아세토페논의 케톤기를 환원시켜 광학활성을 갖는 (S)-1-(o-불화페닐)에탄올로 제조하는 방법을 사용하고 있다.
마이어(Meier) 등은 (S)-5,5-디페닐-2-부틸-3,4-프로판-1,3,2-옥사자보로리딘, 카테콜보레인(catecholborane) 및 보란-디메틸설피드 복합체(borane- dimethylsulfide complex)를 사용하여 2-불화아세토페논으로부터 (R)-1-(o-불화페닐)에탄올을 제조하였는데, 73%의 전환율과 최대 95%의 광학순도를 보였다(Meier C. & Laux W.H.G., Tetrahedron, 52(2) 589-598, 1996).
시바(Seebach) 등은 동량의 LiAlH4, 에탄올 및 TADDOL ((4R,5R)-2,2- Dimethyl-tetraphenyl-1,3-dioxolane-4,5-dimethanol)의 혼합물을 이용하여 2-불화아세토페논으로부터 (S)-1-(o-불화페닐)에탄올을 제조하였는데 전환율이 49%이고, 광학순도는 98%를 나타내었다. 그러나 반응 초기 온도가 -78℃이고 4시간동안 실온으로 상승시켜야 하는 등 온도조절이 절대적으로 중요하여 온도에 따라 전환율 및 광학순도가 상당히 변화하였다(Seebach D., et al., Croatica Chemica Acta, 69(2) 459-484, 1996).
오쿠마(Ohkuma) 등은 trans-RuCl2(xylbinap)(1,2-diamine)과 KOC(CH3)3 를 사용하여 2-불화아세토페논으로부터 (S)-1-(o-불화페닐)에탄올을 제조하였는데, 전환율은 100%이고 광학순도는 96%를 나타내었다(Ohkuma T., et al., J. Am. Chem. Soc., 120, 13529-13530, 1998).
리(Li) 등은 NH2Et2{Ru2Cl5[(S)-tol-BINAP]2}을 이용하여 2-불화아세토페논으로부터 (S)-1-(o-불화페닐)에탄올을 제조하였는데 전환율은 27%로 낮았지만 광학순도는 99%이상의 높은 수준을 나타내었다(Li R.X., et al., Journal of Molecular catalysis A:Chemical, 159, 179-184, 2000).
상기와 같이 금속촉매를 사용하여 높은 전환율 또는 높은 광학순도를 보이는 공정이 많이 알려져 있지만, 전환율 및 광학순도 모두 높은 활성을 보이는 공정은 알려져 있지 않으며, 모두 키랄형의 리간드를 이용해야 하는 단점이 있다. 키랄형의 리간드는 제조도 쉽지 않고 고가이며 재활용이 쉽지 않기 때문에 산업화에 어려움이 있다. 또한 고순도의 수소를 사용해야 하는 문제점도 있다(Li R.X., et al., Journal of Molecular catalysis A:Chemical, 159, 179-184, 2000).
상기와 같은 문제점은 생산이 수월하고 저렴한 미생물을 이용하므로써 쉽게 극복할 수 있다. 현재까지 연구가 진행된 미생물 및 효소를 이용한 (S)-1-(o-불화페닐)에탄올의 제조는 2-불화아세토페논의 케톤기를 알코올 탈수소화효소나 카보닐기 환원효소를 사용하여 광학선택으로 환원하여 이루어진다.
나카무라(Nakamura) 등은 지오트리컴 캔디덤(Geotrichum candidum) IFO 4597 의 아세톤 분말상태로 조정제된 알코올 탈수소화효소(Crude alcohol dehydrogenase)를 이용하여 2-불화아세토페논을 (S)-1-(o-불화페닐)에탄올로 환원시켰는데, 전환율은 99%이상이며 광학순도 또한 99%이상의 높은 수준을 보였다(Nakamura K. & Matsuda T., J. Org. Chem., 63, 8957-8964, 1998). 그러나 상기 반응에는 조효소로서 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드(NAD)를 첨가해야 하는데, 이 조효소는 수용성으로 반응이 끝난 뒤 회수가 어려울 뿐 아니라 매우 고가이므로 상기 균주를 이용하여 산업적으로 적합한 (S)-1-(o-불화페닐)에탄올 생산공정을 확립하기는 어렵다.
마쯔다(Matsuda) 등은 지오트리컴 캔디덤 IFO 5767의 전체세포를 촉매로 사용하여 초임계 이산화탄소(supercritical CO2)의 존재하에 2-불화아세토페논의 (S)-1-(o-불화페닐)에탄올로의 환원반응을 시도하였다. 이들은 세포를 물에 현탁하여 25%(W/V)의 세포 현탁액을 만들고 이를 고분자인 BL-100에 고정한 뒤 스테인레스 반응 용기에 충진하고 기질인 2-불화아세토페논을 0.017 mmol 첨가하고 반응을 실시하여 12시간 뒤에 81%의 전환율로 99% 이상의 광학순도를 갖는 (S)-1-(o-불화페닐)에탄올을 제조하였다(Matsuda T., et al., Chem. Commun.(Cambridges), 15, 1367-1368, 2000). 상기 반응은 전체 세포를 사용하여 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드와 같은 조효소가 필요하지 않고 환경친화적인 초임계 이산화탄소를 사용하여 99% 이상의 광학순도를 갖는 (S)-1-(o-불화페닐)에탄올을 제조한 장점은 있으나, 고압 반응에 필요한 장치가 요구되고 세포현탁액의 농도가 25%(W/V)로 매우 높은 반면 반응에 사용된 기질농도는 0.017mmol로 매우 낮아 이를 이용하여 산업적으로 생산하기에는 역부족이다.
나카무라(Nakamura) 등은 기존에 사용된 지오트리컴 캔디덤 균주외에 남조류(Cyanobacterium)인 시네코커스 종(Synechococcus sp.) PCC 7942에 1000 lux의 빛을 조사하고 3일동안 반응하여 2-불화아세토페논의 환원반응을 시도한 결과 전환율 28%, 광학순도 100%의 (S)-1-(o-불화페닐)에탄올로 전환되는 것을 확인하였다(Nakamura K., et al., Tetrahedron Letters, 41, 6799-6802, 2000). 상기 반응은 탄소원으로 이산화탄소, 에너지원으로 빛을 이용한 장점이 있으나 반응시간에 비해 전환율이 낮고 세균 또는 효모에 비해 성장이 느려 균주 배양이 어렵고 반응기내로의 빛의 투과문제 등으로 산업적인 적용에 어려움이 있다.
전술한 바와 같이, 상기 (S)-1-(o-불화페닐)에탄올을 제조하는 방법은 키랄형의 유기촉매를 이용하는 방법 및 미생물을 촉매로 이용한 두 가지의 방법이 있다.
전자는 다시 2-불화스티렌을 전구물질로 사용하고 유기촉매를 이용하여 광학선택성을 도입하는 방법과 2-불화아세토페논을 전구물질로 사용하여 광학선택적으로 환원하는 경우로 나눌 수 있다. 그러나, 2-불화스티렌을 전구물질로 사용하는 경우는 대체적으로 낮은 광학순도를 나타내며 또한 2-불화아세토페논의 환원반응에 필요한 키랄형의 유기촉매를 리간드로 사용하게 되는데 키랄형의 리간드는 제조도 쉽지 않고 고가이며 재활용이 쉽지 않아 산업화에 어려움이 있다.
미생물을 촉매로 하는 경우에는 키랄형의 유기촉매를 사용하는 방법에 비해 저렴하고 생산이 수월하다는 장점이 있다. 그러나 현재 연구되어 있는 미생물을 이용한 (S)-1-(o-불화페닐)에탄올 제조 방법은 고가의 재사용이 힘든 조효소를 필요하거나(Nakamura K. & Matsuda T., J. Org. Chem., 63, 8957-8964, 1998), 고압반응을 수행하기 위한 장치가 필요하고 고농도의 미생물을 통해 매우 낮은 농도의 기질만을 전환하거나(Matsuda T., et al., Chem. Commun.(Cambridges), 15, 1367-1368, 2000), 반응시간이 긴 반면 전환율이 낮고 배양이 쉽지 않은(Nakamura K. et al., Tetrahedron Letters, 41, 6799-6802, 2000) 단점이 있어 높은 수율 및 광학순도를 갖는 (S)-1-(o-불화페닐)에탄올의 산업적인 생산에 어려움이 있다.
이에 본 발명에서는 상술한 문제를 해결하기 위해 광범위한 연구를 수행한 결과 캔디다 파라실로시스(Candida parapsilosis) ATCC 22019를 포함하는 알코올 탈수소화효소 및 카보닐기 환원효소를 생산하는 미생물 균주를 이용하여 2-불화아세토페논의 케톤기를 광학선택적으로 환원시켜 99% 이상의 매우 높은 광학순도를 갖는 (S)-1-(o-불화페닐)에탄올을 제조하였으며, 본 발명은 이에 기초하여 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 분리 정제된 효소가 아닌 미생물 균주 전체를 통한 반응으로 조효소가 필요없고, 일정범위의 pH 및 온도에서 손상이 없으며, 상온 상압에서 반응이 가능하여 추가적인 장치가 필요 없고, 배양이 용이하여 대량생산에 적합한 미생물 균주를 이용하여 높은 전환율 및 99% 이상의 광학순도를 갖는 (S)-1-(o-불화페닐)에탄올을 제조하는 방법을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 (S)-1-(o-불화페닐)에탄올을 제조하는 방법은 완충용액하에서, 알코올 탈수소화효소 및 카보닐기 환원효소를 생산하는 미생물 균주, 2-불화아세토페논 및 환원력을 제공하는 물질을 반응시키는 것으로 구성된다.
이하 본 발명을 좀 더 구체적으로 설명하면 다음과 같다.
전술한 바와 같이, 본 발명은 알코올 탈수소화효소 및 카보닐기 환원효소를 생산하는 균주를 이용한 (S)-1-(o-불화페닐)에탄올의 제조방법에 관한 것으로, 현재까지 2-불화아세토페논의 케톤기를 광학선택적으로 환원하는 활성이 발표되지 않은 캔디다 파라실로시스(Candida parapsilosis) ATCC 22019 등을 포함하는 미생물 균주를 이용하여 종래의 방법들에 비해 매우 경제적이고, 생산이 용이한 새로운 공정을 제공하고, 특히 2-불화아세토페논의 케톤기를 광학선택적으로 환원시켜 99% 이상의 매우 높은 광학순도를 갖는 (S)-1-(o-불화페닐)에탄올을 제공한다.
본 발명에서 사용한 반응기질인 2-불화아세토페논을 알코올 탈수소화효소 및 카보닐기 환원효소를 생산하는 미생물 균주 및 환원력을 제공하는 물질의 존재하에 인산나트륨과 같은 완충용액 중에서 반응시키면 광학활성을 갖는 (S)-1-(o-불화페닐)에탄올이 생성된다.
상기 반응생성물은 가스크로마토그래피(GC)를 이용하여 정량한다. 분석조건으로 실리카를 충진시킨 캐필러리 컬럼을 115℃에서 등온, 등압시키고 캐리어가스로는 헬륨가스를 분당 1㎖의 속도로 흘리고 250℃에서 불꽃이온화 검출기(Flame Ionization Detector, FID))를 사용하여 검출한다. 2-불화아세토페논은 6.9분, (R)-1-(o-불화페닐)에탄올은 14.8분, (S)-1-(o-불화페닐)에탄올은 16.1분에서 검출되었다.
본 발명에 따르면, 상기 미생물 균주는 미국의 미생물 균주 분양 기관인 ATCC(American type culture collection)로부터 쉽게 분양을 받을 수 있는 캔디다 파라실로시스 ATCC 22019 균주가 바람직하며, 상기 균주를 이용한 2-불화아세토페논의 광학선택적 환원반응은 알려져 있지 않다. 또한 한국미생물보존센터(Korean Culture Center of Microorganisms, KCCM)로부터 분양받은 로도코커스 에리트로폴리스(Rhodococcus erythropolis) KCCM 40452, 캔디다 파라실로시스 ATCC 20179, 또는 유전자은행(Korean Collection for Type Cultures, KCTC)으로부터 분양받은 로도토룰라 무실라지노사(Rhodotorula mucilaginosa) KCTC 7117 등도 2-불화아세토페논을 광학선택적으로 환원하는 반응을 수행하지만, 아직까지 보고되어 있지 않다.
한편, 본 발명에 사용되는 상기 환원력을 제공하는 물질은 이소프로판올, 메탄올, 에탄올, 1-프로판올, 1-부탄올, 2-부탄올, 2-펜탄올, 2-헥산올, 2-헵탄올, 2-옥탄올, 시클로 펜탄올, 또는 시클로 헥산올 등의 알코올류와 포도당, 또는 글리세롤 등의 물질을 사용할 수 있고, 바람직하게는 이소프로판올이다.
본 발명에 따른 반응의 모식도를 도 1에 나타내었다.
본 발명에 있어서, 상기 반응의 반응시간은 8 내지 48시간이 바람직하고, 8시간 미만이면 전환율이 낮고, 48시간을 초과하면 광학 순도가 낮아질 가능성이 있다. 균체의 농도는 0.5∼10%(w/v)가 바람직한데, 0.5% 미만이면 반응시간이 오래 걸리며, 10%를 초과하면 경제성이 떨어지는 단점이 있다.
본 발명에 사용되는 반응물인 2-불화아세토페논의 농도는 10∼500mM이며, 10mM 미만이면 농도가 낮아 경제성이 적으며, 500mM을 초과하면 전환율이 감소하는 단점이 있다. 상기 반응물 대비 이소프로판올의 당량비율은 1∼20이 바람직하며, 상기 당량비가 1 미만이면 전환율이 높지 않고, 20을 초과하면 반응이 진행하지 않는다.
상기 완충용액은 인산나트륨이 바람직하고, 상기 완충용액의 pH는 3∼12가 완충용액의 완충능을 조절하기 쉽다는 면에서 바람직하다. 또한, 반응온도 25∼50℃의 조건에서 실시하는 것이 경제적인 면에서 바람직하다.
이하 실시예를 통해 본 발명을 구체적으로 설명하지만, 이에 본 발명의 범주가 한정되는 것은 아니다.
실시예 1
반응시간에 따른 이소프로판올에 의한 2-불화아세토페논의 환원
실리콘/테프론 고무마개로 공기의 흐름을 차단시킨 15㎖의 바이알에 최종 반응 부피의 1 %(w/v)인 캔디다 파라실로시스 ATCC 22019 균체를 50㎎ 정량하여 첨가한 후 반응기질인 2-불화아세토페논 50 mM, 환원력으로 이소프로판올을 기질 대비 5 당량인 250 mM을 주입하고 최종 부피가 5㎖가 되도록 50 mM의 인산나트륨 완충용액(pH 7.0)을 첨가하여 교반조에서 30℃로 반응시켰다. 반응이 진행된 후 4시간마다 바이알에서 일정량의 반응물을 회수하여 원심분리기를 통해 균주 및 불용성 생 성물을 분리하여 제거한 뒤, 상등액을 동량의 초산 에틸로 3회 추출하고 감압을 통해 초산 에틸을 제거하고 건조시킨 뒤 이를 헥산에 녹여 분석하였으며, 분석전에 일정량의 황산 마그네슘을 사용하여 수분을 제거시킨 후 휴렛 패카드사의 가스크로마토그래피(제품 모델 6890)를 이용하여 정량하였다.
가스크로마토그래피의 분석조건은 다음과 같다.
실리카를 충진시킨 캐필러리 컬럼(capillary column)(Beta Dex 120, 30m X 0.25 mM X 0.25㎛, Supelco사 제품)을 115℃에서 등온등압시키고 캐리어가스인 헬륨가스를 분당 1㎖의 속도로 흘리고 250℃에서 불꽃 이온 검출기를 사용하여 검출하였다.
분석결과는 전환율(M/M, %)과 광학순도(%)로 나타내었다.
반응물과 생성물 각각의 표준시료를 사용하여 가스크로마토그래피 분석결과와 몰농도와의 관계를 방정식으로 표현한 표준곡선을 작성하고 이를 통해 정량하였다.
전환율은 반응물인 2-불화아세토페논의 농도 대비 생성된 (S)-1-(o-불화페닐)에탄올의 농도의 백분율로 나타내었고, 광학순도는 하기 수학식 1을 사용하여 계산하였다.
Figure 112002043040805-pat00001
상기 조건으로 반응시간에 따른 (S)-1-(o-불화페닐)에탄올로의 전환율(%) 및 반응생성물의 광학순도(%)를 측정하여 하기 표 1에 나타내었다.
실험은 재현성 확인을 위해 3번 실시하고 이의 평균값을 기재하였다.
각 실험에서 동일한 조건하의 반응 결과가 차이를 보일 수 있는데 이는 반응시마다 균체의 활성 차이에 기인한 것으로 보이며, 각 조건의 변화에 따라 기본 반응을 중심으로 상대적인 차이를 보기 위하여 모든 반응에서 반복되는 기본 반응을 삽입시켰다. 실시예 1, 3, 9, 및 16이 이에 해당되는 기본 반응이다.
반응시간에 따른 (S)-1-(o-불화페닐)에탄올로의 전환율(%) 및 광학순도(%)
반응시간 (시간) 전환율 (%) 광학순도 (%)
8 72.5 99.1
16 77.8 99.8
24 83.6 99.7
32 79.7 99.6
40 88.6 99.8
48 99.6 99.6
실시예 2∼6
실시예 1의 조건 중 기질 및 이소프로판올의 농도는 동일하게 유지하고, 캔디다 파라실로시스 ATCC 22019 균체의 농도를 0.5 내지 10%(w/v)로 조절하면서 최종부피가 5㎖가 되도록 50mM 인산 나트륨 완충용액(pH 7.0)을 첨가하여 24시간 동안 반응시킨 후, 반응물을 회수하여 실시예 1의 방법에 따라 분석하였다. 결과는 하기 표 2에 나타내었다. 실험은 재현성 확인을 위해 3번 실시하고 이의 평균값을 기재하였다.
균체의 농도(%)에 따른 (S)-1-(o-불화페닐)에탄올로의 전환율(%) 및 광학순도(%)
실시예 균체농도 (%) 전환율 (%) 광학순도 (%)
2 0.5 73.4 99.3
3 1 88.8 99.3
4 2 96.6 99.1
5 5 99.2 99.4
6 10 99.4 99.5
실시예 7∼13
캔디다 파라실로시스 ATCC 22019 균체의 농도가 실시예 1과 동일한 조건하에서 기질의 농도를 10mM 내지 1000mM로 조절하고 각각의 기질 농도에 대한 이소프로판올의 농도는 5배 당량을 유지하면서 최종부피가 5㎖가 되도록 50mM 인산 나트륨 완충용액(pH 7.0)을 첨가하여 24시간 동안 반응시킨 후, 반응물을 회수하여 실시예 1의 방법에 따라 분석하였다. 결과는 하기 표 3에 나타내었다. 실험은 재현성 확인을 위해 3번 실시하고 이의 평균값을 기재하였다.
기질의 농도(mM)에 따른 (S)-1-(o-불화페닐)에탄올로의 전환율(%) 및 광학순도(%)
실시예 기질농도 (mM) 전환율 (%) 광학순도(%)
7 10 96.7 99.1
8 20 98.4 99.6
9 50 99.2 99.4
10 100 82.3 99.5
11 200 58.2 99.4
12 500 13.4 99.5
13 1000 0.67 99.6
실시예 14∼19
캔디다 파라실로시스 ATCC 22019 균체 및 기질의 농도는 실시예 1과 동일한 조건하에서, 기질에 대한 이소프로판올의 당량비를 1배∼50배까지로 조절하면서 최종부피가 5㎖가 되도록 50mM 인산 나트륨 완충용액(pH 7.0)을 첨가하여 24시간 동안 반응시킨 후, 반응물을 회수하여 실시예 1의 방법에 따라 분석하였다. 결과는 하기 표 5에 나타내었다.
실험은 재현성 확인을 위해 3번 실시하고 이의 평균값을 표시하였다.
이소프로판올의 기질에 대한 당량비(eq.)에 따른 (S)-1-(o-불화페닐)에탄올로의 전환율(%) 및 광학순도(%)
실시예 이소프로판올/기질 당량비 (eq.) 전환율 (%) 광학순도 (%)
14 1 72.0 99.4
15 2 80.8 99.2
16 5 86.9 99.1
17 10 81.0 99.2
18 20 72.7 99.4
19 50 7.7 99.6
실시예 20∼32
캔디다 파라실로시스 ATCC 22019 균체, 기질, 및 이소프로판올의 농도는 실시예 1과 동일한 조건하에서 최종부피가 5㎖가 되도록 pH를 1∼13으로 다양하게 변화시킨 50mM 인산 나트륨 완충용액을 첨가하여 24시간 동안 반응시킨 후, 반응물을 회수하여 실시예 1의 방법에 따라 분석하였다. 결과는 하기 표 5에 나타내었다. 실험은 재현성 확인을 위해 3번 실시하고 이의 평균값을 기재하였다.
완충용액의 pH 변화에 따른 (S)-1-(o-불화페닐)에탄올로의 전환율(%) 및 광학순도(%)
실시예 완충용액의 pH 전환율 (%) 광학순도(%)
20 1 4.1 98.1
21 2 4.6 98.0
22 3 31.4 99.4
23 4 61.2 99.5
24 5 62.9 99.5
25 6 69.7 99.6
26 7 85.5 99.7
27 8 82.9 99.7
28 9 69.2 98.9
29 10 57.2 95.5
30 11 33.1 94.0
31 12 10.1 98.5
32 13 1.1 95.3
실시예 33∼35
캔디다 파라실로시스 ATCC 22019 균체, 기질, 이소프로판올의 농도 및 50 mM 인산 나트륨 완충용액(pH 7.0)의 부피는 실시예 1과 동일한 조건하에서 최종부피가 5㎖가 되도록 유지시키고 교반조의 온도를 25∼50℃로 24시간동안 반응시킨 후, 반응물을 회수하여 실시예 1의 방법에 따라 분석하였다. 결과는 하기 표 6에 나타내었다. 실험은 재현성 확인을 위해 3번 실시하고 이의 평균값을 기재하였다.
반응온도(℃)에 따른 (S)-1-(o-불화페닐)에탄올로의 전환율(%) 및 광학순도(%)
실시예 반응온도 (℃) 전환율 (%) 광학순도 (%)
33 25 93.8 99.1
34 40 68.8 99.4
35 50 55.3 99.1
실시예 36∼46
캔디다 파라실로시스 ATCC 22019 균체 및 기질의 농도는 실시예 1과 동일한 조건하에서, 환원력을 제공하는 물질로 이소프로판올 대신 다른 알코올류를 5당량인 250mM을 첨가하고 최종부피가 5㎖가 되도록 50mM의 인산 나트륨 완충용액(pH 7.0)을 첨가하여 교반조의 온도를 30℃로 유지시켜 24시간동안 반응시킨 후, 반응물을 회수하여 실시예 1의 방법에 따라 분석하였다. 결과는 하기 표 7에 나타내었다. 실험은 재현성 확인을 위해 3번 실시하고 이의 평균값을 기재하였다.
알코올의 종류에 따른 (S)-1-(o-불화페닐)에탄올로의 전환율(%) 및 광학순도(%)
실시예 알코올의 종류 전환율 (%) 광학순도 (%)
36 메탄올 11.3 97.7
37 에탄올 18.9 98.8
38 n-프로판올 13.7 99.1
39 n-부탄올 4.3 97.4
40 2-부탄올 77.9 99.5
41 2-펜탄올 58.1 98.7
42 2-헥산올 31.2 99.0
43 2-헵탄올 44.3 99.3
44 2-옥탄올 42.8 99.0
45 시클로펜탄올 42.7 99.0
46 시클로헥산올 11.3 97.9
실시예 47∼48
캔디다 파라실로시스 ATCC 22019 균체, 기질의 농도는 실시예 1과 동일한 조건하에서 환원력을 제공하는 물질로 알코올류 대신 포도당 또는 글리세롤 250mg을 첨가하고 최종부피가 5㎖가 되도록 50 mM의 인산 나트륨 완충용액(pH 7.0)을 첨가하여 교반조의 온도를 30℃로 유지시켜 5일동안 반응시킨 후, 반응물을 회수하여 실시예 1의 방법에 따라 분석하였다. 결과는 하기 표 8에 나타내었다. 실험은 재현성 확인을 위해 3번 실시하고 이의 평균값을 기재하였다.
환원력 제공 물질에 따른 (S)-1-(o-불화페닐)에탄올로의 전환율(%) 및 광학순도(%)
실시예 환원력 제공 물질 전환율 (%) 광학순도 (%)
47 포도당 75.9 98.7
48 글리세롤 54.1 98.5
실시예 49∼51
기질 및 이소프로판올의 농도는 실시예 1과 동일한 조건하에서 캔디다 파라실로시스 ATCC 22019 균체 대신 로도코커스 에리트로폴리스(Rhodococcus erythropolis) KCCM 40452, 캔디다 파라실로시스 ATCC 20179, 로도토룰라 무실라지노사(Rhodotorula mucilaginosa) KCTC 7117로 변화시킨 뒤 최종부피가 5㎖가 되도록 50mM 인산 나트륨 완충용액(pH 7.0)을 첨가하여 교반조를 사용하여 30℃에서 24시간 동안 반응시킨 후, 반응물을 회수하여 실시예 1의 방법에 따라 분석하였다. 결과는 하기 표 9에 나타내었다. 실험은 재현성 확인을 위해 3번 실시하고 이의 평균값을 기재하였다.
균체의 종류에 따른 (S)-1-(o-불화페닐)에탄올로의 전환율(%) 및 광학순도(%)
실시예 미생물의 종류 환원력 전환율(%) 광학순도(%) 생성물의 절대배열
49 로도코커스 에리트로폴리스 KCCM 40452 이소프로판올 8.3 83.9 S
50 캔디다 파라실로시스 ATCC 20179 이소프로판올 76.0 99.5 S
51 로도톨루라 무실라지노사 KCTC 7117 이소프로판올 20.4 97.8 S
실시예 52∼54
기질의 농도는 실시예 1과 동일한 조건하에서 캔디다 파라실로시스 ATCC 22019 균체를 로도코커스 에리트로폴리스 KCCM 40452, 캔디다 파라실로시스 ATCC 20179, 로도토룰라 무실라지노사 KCTC 7117로 변화시키고 환원력을 제공하는 물질을 이소프로판올 대신 포도당을 250mg을 정량하여 첨가하고 최종부피가 5 ㎖가 되도록 50 mM 인산 나트륨 완충용액(pH 7.0)을 첨가하여 교반조를 사용하여 30℃에서 5일 동안 반응시킨 후, 반응물을 회수하여 실시예 1의 방법에 따라 분석하였다. 결과는 하기 표 10에 나타내었다. 실험은 재현성 확인을 위해 3번 실시하고 이의 평균값을 기재하였다.
포도당을 사용한 실험에서 균체의 종류에 따른 (S)-1-(o-불화페닐)에탄올로의 전환율(%) 및 광학순도(%)
실시예 미생물의 종류 환원력 전환율 (%) 광학순도 (%) 생성물의 절대배열
52 로도코커스 에리트로폴리스 KCCM 40452 포도당 32.9 93.8 S
53 캔디다 파라실로시스 ATCC 20179 포도당 65.2 96.2 S
54 로도톨루라 무실라지노사 KCTC 7117 포도닻 79.6 98.6 S
전술한 바와 같이, 본 발명의 방법은 출발물질인 2-불화아세토페논을 광학선택적으로 환원시킬 수 있는 알코올 탈수소화효소 및 카보닐기 환원효소를 생산하는 미생물 균주와 환원력을 제공하는 물질을 이용하여 종래의 방법에 비해 매우 경제적이고 생산이 용이한 공정을 통해 99% 이상의 광학순도를 갖는 (S)-1-(o-불화페닐)에탄올을 제조할 수 있다.

Claims (8)

  1. 완충용액하에서, 알코올 탈수소화효소 및 카보닐기 환원효소를 생산하는 미생물 균주인 캔디다 파라실로시스(Candida parapsilosis) ATCC 22019, 로도코커스 에리트로폴리스(Rhodococcus erythropolis) KCCM 40452, 캔디다 파라실로시스(Candida parapsilosis) ATCC 20179 또는 로도토룰라 무실라지노사(Rhodotorula mucilaginosa) KCTC 7117, 2-불화아세토페논 및 환원력을 제공하는 물질을 반응시키는 것을 특징으로 하는 미생물 균주를 이용한 (S)-1-(o-불화페닐)에탄올의 제조방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 완충용액은 인산나트륨이고, pH를 3 내지 12로 유지하는 것을 특징으로 하는 (S)-1-(o-불화페닐)에탄올의 제조방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 반응은 25 내지 50℃에서 8 내지 48시간 동안 수행되는 것을 특징으로 하는 (S)-1-(o-불화페닐)에탄올의 제조방법.
  4. 삭제
  5. 제1항에 있어서, 상기 미생물 균주의 농도는 0.5 내지 10%(w/v)인 것을 특징으로 하는 (S)-1-(o-불화페닐)에탄올의 제조방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 2-불화아세토페논의 농도는 10 내지 500mM인 것을 특징으로 하는 (S)-1-(o-불화페닐)에탄올의 제조방법.
  7. 제1항에 있어서, 상기 환원력을 제공하는 물질은 이소프로판올, 메탄올, 에탄올, 1-프로판올, 1-부탄올, 2-부탄올, 2-펜탄올, 2-헥산올, 2-헵탄올, 2-옥탄올, 시클로펜탄올, 시클로헥산올, 포도당 또는 글리세롤인 것을 특징으로 하는 (S)-1-(o-불화페닐)에탄올의 제조방법.
  8. 제1항에 있어서, 상기 2-불화아세토페논에 대한 상기 환원력을 제공하는 물질의 농도 당량비는 1 내지 50인 것을 특징으로 하는 (S)-1-(o-불화페닐)에탄올의 제조방법.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
J. Org. Chem., Vol. 63(10) : 8957-8964 *
Tetrahedron Letters, Vol. 36(2) : 265-266 *
Tetrahedron Letters, Vol. 41(35) : 6799-6802 *

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* Cited by examiner, † Cited by third party
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