CN105349503A - 一种羰基还原酶AcCR及其编码基因与应用 - Google Patents

一种羰基还原酶AcCR及其编码基因与应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种羰基还原酶AcCR及其编码基因与应用。所述的羰基还原酶AcCR，其氨基酸序列如SEQ？ID？NO.1所示。编码上述羰基还原酶AcCR的基因，其核苷酸序列如SEQ？ID？NO.2所示。该羰基还原酶AcCR来源于醋酸杆菌XZY003，可催化13种羰基化合物生成相应的单一对映体的手性醇。所述的羰基还原酶AcCR与葡萄糖脱氢酶GDH共表达于原核表达***或真核表达***中既实现了利用羰基还原酶进行生物催化转化的生物反应过程，又实现了辅酶的原位再生，极大地降低了生产成本，且得到产物的光学纯度高，反应过程高效，且条件温和。

Description

一种羰基还原酶AcCR及其编码基因与应用
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种羰基还原酶AcCR及其编码基因与应用。
背景技术
光学纯的手性醇及其衍生物是合成手性药物、功能材料及手性农药的重要砌块。据估计，全球手性醇砌块的销量额高达数百亿美元。由于这些手性醇砌块在手性药物合成中的重要性及巨大的商业价值，其合成技术的开发已然成为全球各大制药公司发展战略的制高点。目前，手性醇砌块的合成主要有化学和生物两种方法。传统的化学方法存在反应条件苛刻(高温高压)，催化剂昂贵(贵金属)、产品光学纯度不高及环境污染等问题，因此，亟待研究开发相对绿色的途径来弥补传统化学方法的不足，生物催化便是一种优良的选择。生物催化因其具有高的立体选择性、温和的反应条件、环境友好等优点，特别是近年来酶分子改造技术(生物信息学、基因工程、蛋白质工程)的飞速发展，已经使其成为可持续发展过程中拓展传统化学合成的重要方法。生物催化获得手性醇的方法又分为对手性醇外消旋体的拆分和直接还原潜手性酮生成对映体纯的手性醇。生物催化生成手性醇的催化剂主要是氧化还原酶和各种生物细胞。能催化拆分外消旋体醇和不对称还原潜手性酮的微生物细胞种类繁多，包括细菌、放线菌、霉菌、酵母菌等。然而，大多数微生物细胞催化潜手性酮不对称还原过程遵循Prelog规则，其产物的构型可用Prelog规则进行预测。因此，特别需要遵循反-Prelog规则的酶或微生物细胞来催化不对称还原潜手性酮生成相应单一构型的手性醇。
本课题组前期的研究中，从“中华开菲尔”菌粒中成功分离纯化得到一株新型醋酸杆菌Acetobactersp.CCTCCM209061，该菌株能够遵循反-Prelog规则催化一系列羰基化合物不对称还原。显然，该新菌株在遵循反-Prelog规则催化手性醇不对称合成方面具有明显的优势，表现出巨大的应用潜力。但是，该菌株仍存在一些问题，如，酶活不高，酶系复杂，存在副反应，培养基成本较高等等。另外，野生型菌株的产酶量往往比较低，从而限制其催化反应的底物浓度、反应初速度和产率等的提高。遵循反-Prelog规则催化潜手性酮还原的微生物已然很少，而在这些微生物中又有相当一部分微生物对于潜手性酮的还原活性不高，底物谱窄、产率低或是选择性不高等。具有高活性和良好选择性的微生物菌株更是难得。因此，这个菌株中的起关键作用的羰基还原酶(醇脱氢酶)则具有重要的研究及应用价值。
微生物细胞催化潜手性酮还原成单一对映体醇过程中起主要作用的微生物细胞中的氧化还原酶，其中的羰基还原酶(醇脱氢酶)是重要的立体选择性催化剂之一，能将潜手性的底物转化成具有手性的重要医药中间体，因此在不对称合成的反应中起着举足重轻的作用。对于活性全细胞催化反应而言，因活性细胞中存在许多竞争性的氧化还原酶，这些酶有可能将底物转化成不需要的产物，降低了底物的选择性。使其当前存在着反应的时空产率低，副反应较多和在某些情况下反应的立体选择性不高的问题。
发明内容
为了克服现有技术的不足和缺点，本发明的首要目的在于提供一种羰基还原酶AcCR。
本发明的另一目的在于提供编码上述羰基还原酶AcCR的基因。
本发明的再一目的在于提供上述羰基还原酶AcCR的应用。
本发明的第四个目的在于提供一种上述羰基还原酶AcCR和葡萄糖脱氢酶GDH共表达的重组菌，该菌株可以实现羰基还原酶AcCR的可溶性表达。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种羰基还原酶AcCR，其氨基酸序列如下所示：
MARVAGKVAIVSGAANGIGKAAAQLLAKEGAKVVIGDLKEEDGQKAVAEIKAAGGEAAFVKLNVTDEAAWKAAIEQTLKLYGRLDIAVNNAGIAYSGSVESTSLEDWRRVQSINLDGVFLGTQVAIEAMKKSGGGSIVNLSSIEGLIGDPMLAAYNASKGGVRLFTKSAALHCAKSGYKIRVNSVHPGYIWTPMVAGLTKEDAAARQKLVDLHPIGHLGEPNDIAYGILYLASDESKFVTGIELVMDGRSTAQ；
编码上述羰基还原酶AcCR的基因，其核苷酸序列如下所示：
ATGGCACGTGTAGCAGGCAAGGTTGCCATTGTTTCTGGGGCCGCTAATGGCATTGGCAAGGCAGCCGCACAGCTTTTGGCCAAGGAAGGCGCAAAAGTTGTTATTGGTGATTTAAAAGAAGAAGATGGGCAGAAAGCTGTTGCAGAAATTAAGGCAGCAGGTGGTGAAGCCGCATTTGTCAAACTGAATGTAACAGATGAGGCTGCATGGAAAGCCGCTATTGAGCAAACGCTTAAGCTTTATGGGCGGCTGGATATTGCAGTGAACAATGCAGGCATTGCGTATTCTGGCAGTGTAGAAAGCACATCTCTGGAAGATTGGCGGCGCGTTCAGTCTATCAATCTGGATGGCGTGTTTTTGGGCACACAGGTGGCTATTGAGGCCATGAAGAAGTCGGGCGGTGGATCCATTGTCAATCTGTCTTCCATTGAAGGACTGATTGGGGACCCAATGTTGGCCGCCTATAACGCCAGTAAAGGTGGGGTAAGGCTGTTTACAAAATCTGCGGCCCTACATTGCGCCAAATCTGGATACAAAATTCGGGTAAACTCAGTGCATCCCGGCTATATCTGGACACCTATGGTGGCCGGTTTAACAAAGGAAGATGCTGCTGCACGCCAAAAGCTGGTGGATCTGCACCCCATTGGCCACTTGGGTGAGCCCAACGATATTGCTTACGGTATTTTGTATCTTGCCTCTGATGAATCCAAGTTTGTTACAGGGATCGAACTGGTCATGGATGGGAGGTCAACAGCACAATGA；
所述的羰基还原酶AcCR在制备手性醇及其衍生物中的应用；
一种含有羰基还原酶AcCR基因的重组载体，是通过将GST标签、编码上述羰基还原酶AcCR的基因的核苷酸序列与载体连接得到的；
一种表达羰基还原酶AcCR的重组基因工程菌，是将上述含有羰基还原酶AcCR基因的重组载体转化到大肠杆菌表达菌株中得到；
所述的大肠杆菌表达菌株优选为BL21(DE3)pLysS；
一种含有羰基还原酶AcCR基因和葡萄糖脱氢酶GDH基因的重组载体，是通过将GST标签、编码上述羰基还原酶AcCR的基因的核苷酸序列和编码葡萄糖脱氢酶GDH的基因的核苷酸序列与载体连接得到的；
所述的载体优选为pETDuet-1；
所述的含有羰基还原酶AcCR基因和葡萄糖脱氢酶GDH基因的重组载体的制备方法，包含如下步骤：
(1)以醋酸杆菌菌株XZY003(Acetobactersp.XZY003，保藏号：CCTCCM209061)的基因组DNA为模板，根据编码上述羰基还原酶AcCR的基因的核苷酸序列设计引物，PCR扩增得到羰基还原酶AcCR基因(accr)；将扩增产物与载体pGEX-2T连接，得到重组载体pGEX-accr；将羰基还原酶AcCR基因克隆到pGEX-2T载体上的目的是为了得到有助于增加蛋白可溶性表达的GST标签；
(2)以重组载体pGEX-accr为模板，设计引物，PCR扩增得到带有GST标签的羰基还原酶AcCR基因(gaccr)，并将其连接到共表达载体pETDuet-1上，得到重组表达载体pETDuet-gaccr；
(3)以枯草芽孢杆菌Bacillussubtilis168的基因组DNA为模板，设计引物，PCR扩增得到葡萄糖脱氢酶GDH基因(gdh)，并将其连接到步骤(2)制得的重组质粒载体pETDuet-gaccr上，得到含有羰基还原酶AcCR基因和葡萄糖脱氢酶GDH基因的重组载体(pETDUet-gaccr-gdh)；
步骤(1)中所述的引物如下所示，其中酶切位点分别为AvaI和EcoRI(下划线)：
引物1：5'-TCCCCCGGGAATGGCACGTGTAGCAGGCAAGGTT-3'；
引物2：5'-CCGGAATTCCTCATTGTGCTGTTGACCTCCCATCCAT-3'；
步骤(2)中所述的引物如下所示，其中酶切位点分别为PstI和SalI(下划线)：
引物3：5'-TGCACTGCAGATGTCCCCTATACTAGGTTATTGGG-3'；
引物4：5'-GCGTCGACTCATTGTGCTGTTGACCTCCCATCCAT-3'；
步骤(3)中所述的引物如下所示，其中酶切位点分别为BglII和XhoI(下划线)：
引物5：5'-GAAGATCTCATGTATCCGGATTTAAAAGGAAAAGTCGTCG-3'；
引物6：5'-CCGCTCGAGTTAACCGCGGCCTGCCTGGAAT-3'；
一种羰基还原酶AcCR与葡萄糖脱氢酶GDH共表达的重组基因工程菌，是将上述含有羰基还原酶AcCR基因和葡萄糖脱氢酶GDH基因的重组载体转化到原核表达***或真核表达***中得到；
所述的原核表达***优选为大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)pLysS；
上述羰基还原酶AcCR与葡萄糖脱氢酶GDH共表达的重组基因工程菌在催化不对称还原潜手性羰基化合物制备手性醇及其衍生物中的应用；
一种微生物细胞催化剂，包含上述羰基还原酶AcCR与葡萄糖脱氢酶GDH共表达的重组基因工程菌；
所述的微生物细胞催化剂的制备方法，包含如下步骤：
将上述羰基还原酶AcCR与葡萄糖脱氢酶GDH共表达的重组基因工程菌培养至OD600＝1.0～1.2，然后在20～22℃的条件下，加入终浓度为0.4～0.5mmol/L的IPTG进行诱导15～18h后，离心收集菌体，得到微生物细胞催化剂；
所述的微生物细胞催化剂可以用于催化羰基化合物生成相应的单一对映体的手性醇；
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
(1)本发明提供了一种来源于醋酸杆菌XZY003的羰基还原酶AcCR，该羰基还原酶为膜蛋白，可催化13种羰基化合物生成相应的单一对映体的手性醇。
(2)本发明针对于目前微生物细胞催化羰基化合物生成相应的单一对映体的手性醇存在的问题，采用来源于醋酸杆菌XZY003的羰基还原酶AcCR与葡萄糖脱氢酶GDH共表达的方式，制备微生物细胞催化剂，既实现了利用羰基还原酶进行生物催化转化的生物反应过程，又实现了辅酶的原位再生，该方法采用全细胞催化，具有高效的辅酶再生循环***，从而提高重组的基因工程菌的催化效率，不需要添加昂贵的辅酶，极大地降低了生产成本，且得到产物的光学纯度高，反应过程高效，且条件温和。
附图说明
图1是重组共表达载体pETDuet-gaccr-gdh的构建过程图。
图2是重组大肠杆菌BL21(DE3)pLysS(pETDuet-gaccr-gdh)催化羰基化合物不对称还原反应的过程图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
醋酸杆菌菌株XZY003(Acetobactersp.XZY003，保藏号：CCTCCM209061)已在中国专利“醋酸杆菌及应用其生产对映体纯(R)-有机硅醇的方法”(申请号：200910146261.3)中公开；
培养该菌株的培养基为葡萄糖8.3g/L，果糖2.5g/L，大豆蛋白胨83.9g/L，初始pH5.7。具体见参考文献(OptimizationofcultureconditionstoproducehighyieldsofactiveAcetobacterspCCTCCM209061cellsforanti-Prelogreductionofprochiralketones)
实施例1羰基还原酶AcCR基因accr的获得
醋酸杆菌XZY003在温度为30℃，转速为100rpm的条件下震荡培养24h；然后菌体离心(4℃，9000rpm)5min，收集菌体，用质量百分比为0.85％的生理盐水洗涤3次，以除掉残留的培养基，然后用上海捷瑞生物工程有限公司的细菌基因组提取试剂盒提取醋酸杆菌XZY003的基因组DNA，具体方法参见试剂盒提供的方法。以提取的醋酸杆菌XZY003的基因组DNA为模板，设计引物1(5'-TCCCCCGGGAATGGCACGTGTAGCAGGCAAGGTT-3')和引物2(5'-CCGGAATTCCTCATTGTGCTGTTGACCTCCCATCCAT-3')为扩增上下游引物，其中酶切位点分别为AvaI和EcoRI(下划线)；PCR扩增得到目的片段羰基还原酶AcCR基因accr。其中，PCR扩增所用的酶试剂盒为东洋纺的KOD酶；PCR反应体系(25μL)为：KODFXbuffer12.5μL；2mMdNTP5μL；引物10.75μL；引物20.75μL；模板DNA1μL；ddH2O5μL；PCR反应条件为：94℃2min；98℃15s，60℃30s，68℃40s，30个循环；68℃7min；将PCR扩增产物进行回收(采用上海捷瑞生物工程有限公司的胶回收试剂盒)并测序分析，得到一段长度为762bp的序列见SEQIDNO.2，为羰基还原酶AcCR基因accr，该序列编码253个氨基酸，见SEQIDNO.1。
实施例2葡萄糖脱氢酶基因gdh的获得
葡萄糖脱氢酶的基因来源于枯草芽孢杆菌Bacillussubtilis168(购自广东微生物菌种保藏中心)，培养基配方和培养条件按菌种保藏中心提供的方法，枯草芽孢杆菌基因组DNA的提取按上海捷瑞生物工程有限公司的细菌基因组提取试剂盒提取。以枯草芽孢杆菌Bacillussubtilis168的基因组DNA为模板，设计引物5(5'-GAAGATCTCATGTATCCGGATTTAAAAGGAAAAGTCGTCG-3')和引物6(5'-CCGCTCGAGTTAACCGCGGCCTGCCTGGAAT-3')分别为上下游引物，其中，酶切位点分别为BglII，XhoI(下划线)；PCR扩增得到目的片段葡萄糖脱氢酶GDH基因gdh。PCR反应体系(25μL)为：KODFXbuffer12.5μL；2mMdNTP5μL；引物50.75μL；引物60.75μL；模板DNA1μL；ddH2O5μL；PCR反应条件为：94℃2min；98℃15s，60℃30s，68℃40s，30个循环；68℃7min；将PCR的扩增产物进行回收(采用上海捷瑞生物工程有限公司的胶回收试剂盒)，进行测序分析，得到一段长度为786bp的序列，为葡萄糖脱氢酶GDH基因gdh。
实施例3重组载体pGEX-accr的构建
(1)将实施例1中得到的羰基还原酶AcCR基因accr片段(回收产物)和质粒pGEX-2T(购自广州齐云生物技术有限公司)分别进行双酶切；其中，基因片段酶切体系体系(30μL)为：ddH2O15μL；buffer3μL；基因片段10μL；AvaI+EcoRI各1μL；质粒pGEX-2T酶切体系(20μL)为：ddH2O6～14μL；buffer2μL；载体2～10μL；AvaI+EcoRI各1μL；酶切条件为：37℃酶切30min；
(2)将步骤(1)酶切后的产物分别进行回收，回收方法及步骤参见上海捷瑞生物工程有限公司的PCR产物回收试剂盒。将回收产物进行连接，连接体系(20μL)为：载体5μL；基因片段10μL；10×T4buffer2μL；T4DNAligase1μL；ddH2O2μL；连接条件为：22℃连接30min；
(3)将步骤(2)得到的连接产物转化大肠杆菌DH5α，转化步骤如下：将10μL连接产物与100μL大肠杆菌DH5α感受态细胞混合，冰浴30min，42℃热激90s，冰浴2min，加入890μLLB培养基，37℃，200rpm，摇床培养1h后，取100μL培养液，涂布氨苄抗性平板(含100μg/mL氨苄青霉素钠)，37℃，过夜培养，挑取阳性转化子进行测序检测验证，保存阳性转化子，然后抽提质粒，获得重组载体pGEX-accr。
(4)将步骤(3)得到的重组载体转化表达宿主BL21(DE3)pLysS(购自广州齐云生物技术有限公司)中，得到菌株BL21(DE3)pLysS(pGEX-accr)，然后液体培养该菌株OD600＝1.2，在20℃的条件下，加入终浓度为0.4mmol/L的IPTG进行诱导15～18h，然后收集菌体，进行SDS-PAGE确定重组AcCR成功表达，测定酶活为304.9U/g-dw，获得可溶性表达的羰基还原酶AcCR。
实施例4重组大肠杆菌BL21(DE3)pLysS(pETDuet-gaccr-gdh)的构建
以实施例3中得到的重组质粒pGEX-accr为模板，设计引物3(5'-TGCACTGCAGATGTCCCCTATACTAGGTTATTGGG-3')和引物4(5'-GCGTCGACTCATTGTGCTGTTGACCTCCCATCCAT-3')，进行PCR扩增，得到带有GST标签基因的羰基还原酶AcCR基因gaccr，其中，PCR反应体系和条件参见实施例1；将上述PCR扩增产物与共表达质粒PETDuet-1(购自上海捷瑞生物技术有限公司)分别进行双酶切，所用酶为Fermentas的快切酶FastDigestFastDigest所用的酶切体系和条件参见实施例3；将酶切产物进行回收，回收产物进行连接，连接体系和条件参见实施例3；将连接产物转化大肠杆菌DH5α，转化步骤如下：将10μL连接产物与100μL大肠杆菌DH5α感受态细胞混合，冰浴30min，42℃热激90s，冰浴2min，加入890μLLB培养基，37℃，200rpm，摇床培养1h后，取100μL培养液，涂布氨苄抗性平板(含100μg/mL氨苄青霉素钠)，37℃，过夜培养，挑取阳性转化子进行测序验证，保存阳性转化子，然后抽提质粒，获得重组表达载体pETDuet-gaccr，以备构建共表达载体pETDuet-gaccr-gdh(图1)；
将实施例2得到的带有BglII，XhoI酶切位点的葡萄糖脱氢酶GDH基因gdh片段和重组表达载体pETDuet-gaccr分别进行双酶切，所用内切酶为Fermentas的快切酶FastDigestFastDigest所用的酶切体系及条件参见实施例3；将酶切产物进行回收，回收产物进行连接，连接体系及条件参见实施例3；将连接产物转化大肠杆菌DH5α，转化步骤如上所述；提取测序正确的重组载体pETDuet-gaccr-gdh，将其转化表达宿主BL21(DE3)pLysS(购自广州齐云生物技术有限公司)中，得到的菌株即为所要构建的重组大肠杆菌BL21(DE3)pLysS(pETDuet-gaccr-gdh)。
实施例5重组大肠杆菌BL21(DE3)pLysS(pETDuet-gaccr-gdh)在不对称还原潜手性羰基化合物制备光学活性醇中的应用
(1)将实施例4获得的重组表达菌株BL21(DE3)pLysS(pETDuet-gaccr-gdh)在37℃，200rpm的条件下培养至菌液浓度OD600＝1.2，然后降温至20℃，加入终浓度为0.4mmol/L的IPTG进行诱导15～18h后，4℃，9000rpm离心5min收集菌体，得到微生物细胞催化剂(湿菌体)；
(2)在10mL的具塞三角瓶中分别加入4mL柠檬酸盐缓冲液(100mM，pH5.5)，缓冲液中含有终浓度为50mM葡萄糖和终浓度为15mg/mL微生物细胞催化剂，置于气浴恒温振荡器中(30℃)孵育10min，加入终浓度为5mM的溶解于DMSO中的羰基化合物，开启反应，定时取样，用100μL(2×50μL)乙酸乙酯(含内标物5mM正十二烷)萃取残留产物和产物，用旋涡混合仪振荡萃取5min，离心(12000rpm)5min后，取上清供气相色谱(GC)检测。重组菌BL21(DE3)pLysS(pETDuet-gaccr-gdh)应用于不对称催化转化潜手性羰基化合物的催化效果见附件表1和图2。
表1重组大肠杆菌BL21(DE3)pLysS(pETDuet-gaccr-gdh)的催化效果
对比实施例
(1)以醋酸杆菌XZY003基因组为模板，设计引物7(5'-CATGCCATGGATATGGCACGTGTAGCAGGCAAGGTT-3')和
引物8：5'-CCGCTCGAGTCATTGTGCTGTTGACCTCCCATCCAT-3'，其中酶切位点分别为NcoI和XhoI(下划线)；PCR扩增得到目的片段羰基还原酶AcCR基因accr；将PCR扩增产物进行回收，并与载体pET22b+分别进行双酶切(NcoI和XhoI)，酶切后的产物回收并进行连接；具体方法参见实施例1；
(2)以醋酸杆菌XZY003基因组为模板，设计引物9(5'-CATGCCATGGCGATGGCACGTGTAGCAGGCAAGGTT-3')和引物10(5'-CCGGAATTCGGTCATTGTGCTGTTGACCTCCCATCCAT-3')；其中酶切位点分别为NcoI和EcoRI；将PCR扩增产物进行回收，并与载体pET30b+分别进行双酶切(NcoI和EcoRI)，酶切后的产物回收并进行连接；具体方法参见实施例1；
(3)以醋酸杆菌XZY003基因组为模板，设计引物11(5'-TGCACTGCAGATGGCACGTGTAGCAGGCAAGGTT-3')和引物4(5'-GCGTCGACTCATTGTGCTGTTGACCTCCCATCCAT-3')，其中酶切位点分别为PstI和SalI；将PCR扩增产物进行回收，并与载体pETDuet-1分别进行双酶切(PstI和SalI)，酶切后的产物回收并进行连接；具体方法参见实施例1；
(4)将步骤(1)、(2)和(3)得到的连接产物分别转化大肠杆菌DH5α，转化步骤如下：将10μL连接产物与100μL大肠杆菌DH5α感受态细胞混合，冰浴30min，42℃热激90s，冰浴2min，加入890μLLB培养基，37℃，200rpm，摇床培养1h后，取100μL培养液，涂布氨苄抗性平板(含100μg/mL氨苄青霉素钠)或卡纳抗性平板(含50μg/mL卡那霉素)，37℃，过夜培养，挑取阳性转化子进行测序检测验证，保存阳性转化子，然后抽提质粒，获得重组载体pET22b+-accr、pET30b+-accr和pETDuet-accr。
(5)将步骤(4)得到的重组载体转化表达宿主BL21(DE3)pLysS(购自广州齐云生物技术有限公司)中，得到菌株BL21(DE3)pLysS(pET22b+-accrr)、BL21(DE3)pLysS(pET30b+-accr)和BL21(DE3)pLysS(pETDuet-accr)。然后参照实施例3对上述菌株进行诱导培养，收集菌体并用缓冲液重悬菌体，进行SDS-PAE，发现AcCR在以上三种重组菌中均有表达，但均没有检测到酶活，将菌体在冰浴中超声破碎至溶液澄清，收集上清和沉淀分别进行SDS-PAGE，发现表达的AcCR均在沉淀中，上述三种菌株诱导表达的AcCR是没有活性的包涵体，都没有实现AcCR的可溶性表达。
以上结果说明，本发明提供的来源于醋酸杆菌XZY003的羰基还原酶AcCR属于一种膜蛋白很难实现可溶性表达，外加GST标签，使其实现了可溶性表达。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种羰基还原酶AcCR，其特征在于：其氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。
2.编码权利要求1所述的羰基还原酶AcCR的基因，其特征在于：其核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。
3.权利要求1所述的羰基还原酶AcCR在制备手性醇及其衍生物中的应用。
4.一种含有羰基还原酶AcCR基因的重组载体，其特征在于：是通过将GST标签、权利要求2中所述的核苷酸序列与载体连接得到的。
5.一种含有羰基还原酶AcCR基因和葡萄糖脱氢酶GDH基因的重组载体，其特征在于：是通过将GST标签、权利要求2中所述的核苷酸序列和编码葡萄糖脱氢酶GDH的基因的核苷酸序列与载体连接得到的。
6.根据权利要求5所述的含有羰基还原酶AcCR基因和葡萄糖脱氢酶GDH基因的重组载体，其特征在于：
所述的载体为pETDuet-1。
7.权利要求5或6所述的含有羰基还原酶AcCR基因和葡萄糖脱氢酶GDH基因的重组载体的制备方法，包含如下步骤：
(1)以醋酸杆菌菌株XZY003的基因组DNA为模板，根据权利要求2所述的核苷酸序列设计引物，PCR扩增得到羰基还原酶AcCR基因；将扩增产物与载体pGEX-2T连接，得到重组载体pGEX-accr；
(2)以重组载体pGEX-accr为模板，设计引物，PCR扩增得到带有GST标签的羰基还原酶AcCR基因，并将其连接到共表达载体pETDuet-1上，得到重组表达载体pETDuet-gaccr；
(3)以枯草芽孢杆菌Bacillussubtilis168的基因组DNA为模板，设计引物，PCR扩增得到葡萄糖脱氢酶GDH基因，并将其连接到步骤(2)制得的重组质粒载体pETDuet-gaccr上，得到含有羰基还原酶AcCR基因和葡萄糖脱氢酶GDH基因的重组载体。
8.一种羰基还原酶AcCR与葡萄糖脱氢酶GDH共表达的重组基因工程菌，其特征在于：是将权利要求5或6所述的含有羰基还原酶AcCR基因和葡萄糖脱氢酶GDH基因的重组载体转化到原核表达***或真核表达***中得到。
9.根据权利要求7所述的羰基还原酶AcCR与葡萄糖脱氢酶GDH共表达的重组基因工程菌，其特征在于：
所述的原核表达***为大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)pLysS。
10.权利要求8或9所述的羰基还原酶AcCR与葡萄糖脱氢酶GDH共表达的重组基因工程菌在催化不对称还原潜手性羰基化合物制备手性醇及其衍生物中的应用。
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