KR100708794B1 - 박테리아로부터 유래한 피루베이트 데카르복실라제(ｐｄｃ) 유전자의 클로닝 및 서열분석, 및 그의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 향상된 데카르복실라제 활성, 기질 친화도, 열안정성 및 다른 pH에서의 활성을 갖는 피루베이트 데카르복실라제 효소를 코딩하는 단리된 핵산 분자를 제공한다. 본 발명의 핵산은 또한 다양한 숙주 세포에서 높은 수준의 발현을 가능하게 하는 코돈 이용도를 갖는다. 따라서, 본 발명은 그러한 핵산 분자를 포함하는 재조합 발현 벡터, 이 발현 벡터를 포함하는 재조합 숙주 세포, 다른 에탄올 생산성 효소를 더 포함하는 숙주 세포, 및 그러한 숙주 세포를 이용하여 유용한 기질 (예를 들어, 아세트알데히드 및 에탄올)을 생산하는 방법을 제공한다.

피루베이트 데카르복실라제, 핵산, 코돈 이용도, 재조합 발현 벡터, 재조합 숙주 세포, 아세트알데히드, 에탄올

Description

박테리아로부터 유래한 피루베이트 데카르복실라제 (ＰＤＣ) 유전자의 클로닝 및 서열분석, 및 그의 용도 {Cloning and Sequencing of Pyruvate Decarboxylase (PDC) Genes from Bacteria and Uses Therefor}

<관련 정보>

본 출원은 미국 가출원 제60/288,638호 (발명의 명칭: High-Level Production of Active Sarcina ventriculi Pyruvate Decarboxylase in Recombinant Bacillus megaterium), 미국 가출원 제60/288,671호 (발명의 명칭: Cloning, Expression, and Characterization of Pyruvate Decarboxylase from the Acid-Tolerant, Anaerobic Gram-Positive Bacterium Sarcina ventriculi Goodsir), 미국 가출원 제60/288,698호 (발명의 명칭: Acetobacter pasteurianus Pyruvate Decarboxylase: Biochemical, Genetic, and Physiological Properties) 미국 가출원 제60/288,622호 (발명의 명칭: Biochemical and Biophysical Characterization of Pyruvate Decarboxylase from the Acetic Acid Bacterium Acetobacter pasteurianus) 및 미국 가출원 제60/288,699호 (발명의 명칭: Pyruvate Decarboxylase: A Key Enzyme for the Oxidative Metabolism of Lactic Acid by Acetobacter pasteurianus) (상기 모든 출원은 2001년 5월 4일자로 출원되었으며, 이 거명을 통해 그 전문이 본원에 참고로 포함됨)를 우선권으로 주장한다. 본 명 세서 전반에 걸쳐 인용된 모든 특허, 특허 출원 및 참고문헌의 내용은 그 전문이 본원에 참고로 포함된다.

<정부 후원 연구>

본 연구는 국립 재생 에너지 실험실의 미국 부서 (U.S. Department of Energy's National Renewable Energy Laboratory (ZDH-9-29009-04)), 에너지 생명과학 프로그램 (Energy Biosciences Program (FG02-96ER20222)) 및 플로리다주 농업 실험 관청 (Florida Agricultural Experiment Station)의 보조금에 의해 부분적으로 지원받았다.

석유계 자동차 연료를 식물로부터 수득한 재생 연료로 대체하면 많은 환경적 및 사회적 유익함이 초래될 것이다 (Lynd et al., (1991) Science 251:1318-1323; Olson et al., (1996) Enzyme Microb. Technol. 18:1-17; Wyman et al., (1995) Amer. Chem. Soc. Symp. 618:272-290). 매년 미국은 1조 2000억 갤론이 넘는 자동차 연료를 소비하고 있으며, 이는 수입된 석유의 총량과 대략 동일하다. 재생 대체 연료로서의 에탄올의 개발은 수입된 오일에 대한 미국의 의존성을 없애주고 환경을 개선시키며 새로운 고용을 창출하는 잠재력을 갖는다 (Sheehan, (1994) ACS Symposium Series No. 566, ACS Press, pp 1-53).

이론적으로는 자동차 연료용으로 수입된 오일의 문제점이 매우 간단해 보인다. 한정된 자원인 석유를 사용하는 것 대신, 재생가능한 자원인 에탄올은 식물의 발효에 의해 효율적으로 생산될 수 있다. 사실상, 브라질에서는 20년이 넘는 기간 동안 에탄올 생산의 가능성과 에탄올을 1차적 자동차 연료로서 사용할 수 있음을 입증하였다. 이와 유사하게, 미국은 매년 12억 갤론이 넘는 연료 에탄올을 생산하고 있다. 현재, 연료 에탄올은 사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae) 또는 자이모모나스 모빌리스 (Zymomonas mobilis) (제트. 모빌리스 (Z. mobilis))를 이용하여 옥수수 전분 또는 등나무 시럽으로부터 생산한다. 그러나, 상기 당 공급원 둘 다는 석유계 자동차 연료의 대체를 실현하는 데 필요한 양을 공급하지 못한다. 또한, 등나무 당과 옥수수 전분 둘 다는 비교적 비싼 출발 물질이며, 식품으로서의 용도와 경쟁 관계에 있다.

더욱이, 상기 당 기질은 식물의 전체 탄수화물 중 일부만을 차지한다. 사실상, 식물의 탄수화물 대부분은 셀룰로스, 헤미셀룰로스, 펙틴 및 리그닌을 함유하는 복합 구조의 중합체인 리그노셀룰로스 형태이다. 리그노셀룰로스는, 예를 들어 식물의 줄기, 잎, 외피, 껍질 및 열매에서 발견된다. 상기 중합체를 가수분해시키면, 글루코스, 크실로스, 만노스, 갈락토스 및 아라비노스를 포함하는 천연 당의 혼합물이 생성된다. 상기 모든 당을 에탄올로 신속하고 효율적으로 대사시키는 천연 생물체는 알려져 있지 않다.

그럼에도 불구하고, 이러한 기질 공급원을 찾으려는 노력의 일환으로, 걸프 오일 컴퍼니 (Gulf Oil Company)는 동시 당화 및 발효 (simultaneous saccharification and fermentation; SSF)라 불리우는 효모-기재의 공정을 이용하여 셀룰로스로부터 에탄올을 생산하는 방법을 개발하였다 (Gauss et al. (1976) 미국 특허 제3,990,944호). 진균류 셀룰라제 제제 및 효모를 단일 용기 중의 셀룰로 스 기질 슬러리에 첨가하였다. 에탄올은 셀룰로스 가수분해와 동시에 생산되었다. 그러나, 걸프 오일 컴퍼니의 SSF 공정은 몇몇 단점을 가지고 있다. 예를 들어, 효모의 세포 주기 시간이 비교적 길고 (24 내지 36시간), 복합 당을 발효시킬 수 없다. 또한, 진균류 셀룰라제는 상당량 첨가되어야 하기 때문에, 대규모 생물에탄올 공정에 사용하기에는 너무 값이 비싸다 (Himmel et al., (1997) Amer. Chem. Soc. pp. 2-45; Ingram et al., (1987) Appl. Environ. Microbiol. 53:2420-2425; Okamoto et al., (1994) Appl. Microbiol. Biotechnol. 42:563-568; Philippidis, G., (1994) Amer. Chem. Soc. pp. 188-217; Saito et al., (1990) J. Ferment. Bioeng. 69:282-286; Sheehan, J., (1994) Amer. Chem. Soc. pp 1-52; Su et al., (1993) Biotechnol. Lett. 15:979-984).

더욱이, 다른 생물체를 사용하여 에탄올을 생산하는 것은 어려운데, 이는 에탄올을 발효시키는 데 있어서의 핵심 효소인 피루베이트 데카르복실라제 (PDC)가 식물, 효모 및 진균류에서만 통상적으로 존재하고 박테리아에서는 거의 발견되지 않으며 동물에는 존재하지 않기 때문이다 (9, 25).

<발명의 개요>

에탄올 발효를 위한 저비용의 효소적 방법을 개발하는 것은 기질 이용의 효율 및 발효 공정의 경제성을 향상시키는 데 있어 매우 큰 잠재력을 갖는다. 따라서, 효소를 개발하는 것, 그리고 유리하게는 복합 당의 효율적인 해중합 (depolymerization)에 사용될 수 있고 이후에 상기 당을 알콜로 신속하게 발효시킬 수 있는 그러한 효소를 생산하는 생물촉매를 개발하는 것은 매우 유익할 것이다.

그람-음성 및 그람-양성 박테리아와 같은 특정 미생물은, 예를 들어 셀룰로스 및 헤미셀룰로스의 해중합을 통한 발효가능한 당의 생산, 당의 피루베이트로의 전환, 기질 피루베이트의 아세트알데히드로의 전환, 및 최후로는 기질 아세트알데히드의 에탄올로의 전환을 촉매할 수 있는 다수의 발효 효소를 생산한다. 그러나, 그러한 생물체가 필수적인 모든 효소를 가장 바람직한 양으로 생산하는 경우는 거의 없다.

따라서, 본 발명은 소정 범위의 생물체에서 높은 수준으로 발현될 수 있는 피루베이트 데카르복실라제를 코딩하는 유전자를 제공한다. 따라서, 특정 생물체에서 발현시키거나, 에탄올 발효에 필요한 나머지 핵심 효소들을 생산하는 생물체와 함께 배양할 때, 우수한 양의 에탄올 생산을 달성할 수 있다. 피루베이트 데카르복실라제 (PDC) 효소는, 단독으로 또는 알콜 데히드로게나제 (ADH)와 함께 원하는 활성의 혼합물을 지닌 조 추출물로서 사용될 수도, 또는 정제된 조성물로서 사용될 수도 있다.

더욱이, 생물촉매, 유리하게는 재조합 박테리아, 보다 유리하게는 에탄올 생산성 박테리아는 당(들)을 발효시키기에 충분한 양의 상기 효소 활성을 하나 이상 발현하도록 조작될 수 있다. 그러한 생물촉매는 복합 당의 효율적인 분해, 및 그 이후의 동시 당화 및 발효 (SSF)로 공지된 공정에 의한 알콜로의 발효에 적합하다.

본 발명은, 적어도 부분적으로는 박테리아에서 에탄올 발효의 핵심 효소-코딩 유전자를 발견한 것에 기초한다. 구체적으로는, 자이모박터 팔매 (Zymobacter palmae), 아세토박터 파스퇴리아누스 (Acetobacter pasteurianus) 및 사르시나 벤 트리쿨리 (Sarcina ventriculi)의 pdc 유전자를 찾아냈다. 이들 유전자는 우수한 피루베이트 데카르복실라제 활성, (예를 들어, 피루베이트에 대한) 기질 친화도, 및 열안정성을 가지며, 다른 pH에서 보다 우수한 활성을 나타내는 피루베이트 데카르복실라제 효소를 코딩하는 것으로 측정되었다. 또한, 본 발명의 pdc 유전자는 소정 범위의 생물체에서 높은 발현을 제공하는 코돈 이용도를 갖는다.

따라서, 한 측면에서 본 발명은 피루베이트 데카르복실라제 폴리펩티드 (PDC) 또는 그의 생물학적 활성 부분을 코딩하는 단리된 핵산 분자, 및 PDC-코딩 핵산 검출용 프라이머 또는 혼성화 프로브로서 적합한 핵산 단편을 제공한다.

한 실시양태에서, 본 발명의 피루베이트 데카르복실라제 핵산 (pdc) 분자는 서열 1, 서열 3 또는 서열 5에 나타낸 뉴클레오티드 서열 또는 그의 상보체와 약 50％ 이상, 60％ 이상, 70％ 이상, 75％ 이상, 80％ 이상, 81％ 이상, 82％ 이상, 83％ 이상, 84％ 이상, 85％ 이상, 86％ 이상, 87％ 이상, 88％ 이상, 89％ 이상, 90％ 이상, 91％ 이상, 92％ 이상, 93％ 이상, 94％ 이상, 95％ 이상, 96％ 이상, 97％ 이상, 98％ 이상, 또는 그 이상의 동일성 (예를 들어, 뉴클레오티드 서열 전체 길이에 대해 비교할 때)을 갖는다.

구체적인 실시양태에서, 단리된 핵산 분자는 서열 1, 서열 3 또는 서열 5에 나타낸 뉴클레오티드 서열, 또는 그의 상보체를 포함한다.

다른 실시양태에서, pdc 핵산 분자는 서열 2, 서열 4 또는 서열 6의 아미노산 서열과 충분히 상동성인 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 구체적인 실시양태에서, pdc 핵산 분자는 서열 2, 서열 4 또는 서 열 6에 나타낸 아미노산 서열과 약 50％ 이상, 60％ 이상, 70％ 이상, 75％ 이상, 80％ 이상, 81％ 이상, 82％ 이상, 83％ 이상, 84％ 이상, 85％ 이상, 86％ 이상, 87％ 이상, 88％ 이상, 89％ 이상, 90％ 이상, 91％ 이상, 92％ 이상, 93％ 이상, 94％ 이상, 95％ 이상, 96％ 이상, 97％ 이상, 98％ 이상, 또는 그 이상의 동일성 (예를 들어, 아미노산 서열 전체 길이에 대해 비교할 때)을 갖는 (PDC) 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.

한 구체적인 실시양태에서, 단리된 핵산 분자는 서열 2의 아미노산 서열을 갖는 자이모박터 팔매 (Zymobacter palmae)의 피루베이트 데카르복실라제 효소의 아미노산 서열을 코딩한다.

다른 구체적인 실시양태에서, 단리된 핵산 분자는 서열 4의 아미노산 서열을 갖는 아세토박터 파스퇴리아누스 (Acetobacter pasteurianus)의 피루베이트 데카르복실라제 효소의 아미노산 서열을 코딩한다.

다른 구체적인 실시양태에서, 단리된 핵산 분자는 서열 6의 아미노산 서열을 갖는 사르시나 벤트리쿨리 (Sarcina ventriculi)의 피루베이트 데카르복실라제 효소의 아미노산 서열을 코딩한다.

다른 구체적인 실시양태에서, 핵산 분자는 길이가 약 1600개 뉴클레오티드 이상이며, (본원에 기재된 바와 같은) 피루베이트 데카르복실라제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩한다.

보다 구체적인 실시양태에서, 본 발명은 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (American Type Culture Collection)에 기탁 번호 ATCC PTA-4254로서 기탁된, 자이 모박터 팔매 (Zymobacter palmae)로부터 유래한 pdc 유전자를 코딩하는 플라스미드 pJAM3440을 제공한다. 관련 실시양태에서, 본 발명은 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션에 기탁 번호 ATCC PTA-4252로서 기탁된, 아세토박터 파스퇴리아누스 (Acetobacter pasteurianus)로부터 유래한 pdc 유전자를 코딩하는 플라스미드 pJAM304를 제공한다. 다른 관련 실시양태에서, 본 발명은 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션에 기탁 번호 ATCC PTA-4253으로서 기탁된, 사르시나 벤트리쿨리 (Sarcina ventriculi)로부터 유래한 pdc 유전자를 코딩하는 플라스미드 pJAM419를 제공한다.

본 발명의 다른 실시양태는, 피루베이트 데카르복실라제 (PDC)가 아닌 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자에 비해 피루베이트 데카르복실라제 핵산 분자 (즉, pdc 유전자)를 특이적으로 검출하는 핵산 분자, 유리하게는 피루베이트 데카르복실라제 핵산 분자를 특징으로 한다. 예를 들어, 한 실시양태에서 그러한 핵산 분자는 길이가 약 50개, 60개, 70개, 80개, 90개, 100개, 150개, 200개, 300개, 400개, 500개, 500-1000개, 1000-1500개, 1500-2000개 뉴클레오티드 또는 그 이상이고(이거나), 서열 1, 서열 3 또는 서열 5에 나타낸 뉴클레오티드 서열 또는 그의 상보체를 포함하는 핵산 분자와 엄격한 조건 하에서 혼성화된다. 핵산 분자는 뉴클레오티드 길이의 수치에 있어, 상기 기재된 수들 중 하나를 하한으로서 갖고 다른 수를 상한으로서 갖는 소정 범위 내의 길이, 예를 들어 길이가 60-80개, 300-1000개 또는 150-400개 뉴클레오티드인 분자일 수 있음을 이해해야 한다.

구체적인 실시양태에서, 핵산 분자는 길이가 15개 (예를 들어, 인접함) 뉴클레오티드 이상이며, 서열 1, 서열 3 또는 서열 5의 뉴클레오티드 서열과 엄격한 조 건 하에서 혼성화된다. 따라서, 본 발명은 상기 핵산을 이용한 본 발명 pdc 핵산의 존재 검출 방법을 제공한다.

다른 구체적인 실시양태에서, 핵산 분자는 서열 2, 서열 4 또는 서열 6의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드의 자연 발생 대립유전자 변이체를 코딩하며, 여기서 상기 핵산 분자는 각각 서열 1, 서열 3 또는 서열 5를 포함하는 핵산 분자와 엄격한 조건 하에서 혼성화된다.

다른 실시양태에서, 본 발명의 핵산 분자는 벡터 내에 있으며, 이종 폴리펩티드를 코딩하는 부가의 핵산 서열 및(또는) 대리 (surrogate) 프로모터와 작동가능하게 연결될 수 있다.

구체적인 실시양태에서, 본 발명은 본 발명의 핵산 분자 (예를 들어, 벡터 내에 함유되거나 숙주 세포의 게놈 내에 안정하게 통합됨)를 함유하는 숙주 세포를 제공한다.

한 구체적인 실시양태에서, 숙주 세포는 자이모박터 팔매 (Zymobacter palmae), 아세토박터 파스퇴리아누스 (Acetobacter pasteurianus) 및 사르시나 벤트리쿨리 (Sarcina ventriculi)와 같은 박테리아 세포로부터 유래한 피루베이트 데카르복실라제를 코딩하는 이종 핵산 서열 (예를 들어, 서열 1, 서열 3 또는 서열 5에 제시된 바와 같음)을 포함한다.

다른 실시양태에서, pdc 유전자를 함유하는 숙주 세포는 에탄올 생산성 (예를 들어, 자연적으로 에탄올을 생산함)일 수 있고(있거나), 알콜 데히드로게나제, 글루카나제, 세크레타제 또는 이들의 조합을 코딩하는 에탄올 생산성 유전자(들)을 더 포함할 수 있다. 관련 실시양태에서, 숙주 세포는 당으로부터 알콜을 발효시키는 데 적합하다. 구체적인 실시양태에서, 숙주 세포는 서열 2, 서열 4 또는 서열 6에 나타낸 PDC를 코딩하는 이종 핵산을 포함하는 재조합 에탄올 생산성 숙주 세포이다. 이종 핵산은 외생성 대리 프로모터의 조절 하에 있을 수 있다.

상기 숙주 세포는 그람-음성 박테리아 세포 또는 그람-양성 박테리아 세포일 수 있다.

본 발명의 그람-음성 숙주 세포는, 예를 들어 글루코노박터 (Gluconobacter), 리조비움 (Rhizobium), 브라디리조비움 (Bradyrhizobium), 알칼리게네스 (Alcaligenes), 로도박터 (Rhodobacter), 로도코커스 (Rhodococcus), 아조스피릴룸 (Azospirillum), 로도스피릴룸 (Rhodospirillum), 스핑고모나스 (Sphingomonas), 부르콜데리아 (Burkholderia), 데술포모나스 (Desulfomonas), 게오스피릴룸 (Geospirillum), 숙시노모나스 (Succinomonas), 에어로모나스 (Aeromonas), 쉬와넬라 (Shewanella), 할로크로마티움 (Halochromatium), 시트로박터 (Citrobacter), 에세리치아 (Escherichia), 클레브시엘라 (Klebsiella), 자이모모나스 (Zymomonas), 자이모박터 (Zymobacter) 또는 아세토박터 (Acetobacter)일 수 있다.

본 발명의 그람-양성 숙주 세포는, 예를 들어 피브로박터 (Fibrobacter), 아시도박터 (Acidobacter), 박테로이데스 (Bacteroides), 스핑고박테리움 (Sphingobacterium), 악티노마이세스 (Actinomyces), 코리네박테리움 (Corynebacterium), 노카르디아 (Nocardia), 로도코커스 (Rhodococcus), 프로피오 니박테리움 (Propionibacterium), 비피도박테리움 (Bifidobacterium), 바실러스 (Bacillus), 게오바실러스 (Geobacillus), 패니바실러스 (Paenibacillus), 술포바실러스 (Sulfobacillus), 클로스트리디움 (Clostridium), 안에어로박터 (Anaerobacter), 유박테리움 (Eubacterium), 스트렙토코커스 (Streptococcus), 락토바실러스 (Lactobacillus), 류코노스톡 (Leuconostoc), 엔테로코커스 (Enterococcus), 락토코커스 (Lactococcus), 써모비피다 (Thermobifida), 셀룰로모나스 (Cellulomonas) 또는 사르시나 (Sarcina)일 수 있다.

다른 측면에서, 본 발명은 서열 2, 서열 4 또는 서열 6에 나타낸 아미노산 서열과 약 50％ 이상, 60％ 이상, 70％ 이상, 75％ 이상, 80％ 이상, 81％ 이상, 82％ 이상, 83％ 이상, 84％ 이상, 85％ 이상, 86％ 이상, 87％ 이상, 88％ 이상, 89％ 이상, 90％ 이상, 91％ 이상, 92％ 이상, 93％ 이상, 94％ 이상, 95％ 이상, 96％ 이상, 97％ 이상, 98％ 이상, 또는 그 이상의 동일성 (예를 들어, 아미노산 서열 전체 길이에 대해 비교할 때)을 갖는 단리된 폴리펩티드를 제공한다.

한 실시양태에서, 본 발명의 단리된 폴리펩티드는 서열 2, 서열 4 또는 서열 6의 아미노산 서열을 갖는다.

관련 실시양태에서, 단리된 폴리펩티드는 피루베이트 데카르복실라제 활성을 갖는다. 본 발명의 피루베이트 데카르복실라제는 향상된 활성 (예를 들어, 피루베이트 데카르복실라제 활성)에 대해서 뿐만 아니라, 예를 들어 향상된 코돈 이용도 (codon usage), 기질 (예를 들어, 피루베이트) 친화도, 열 안정성 및(또는) 특정 pH에서의 활성에 대해서 선별될 수 있다. 본 발명의 그러한 피루베이트 데카르복 실라제는 변이되거나 키메라 폴리펩티드를 형성함으로써, 상기 언급한 임의의 특성을 달성할 수 있다. 또한, 상기 폴리펩티드는 이종 아미노산, 예를 들어 정제 또는 검출을 위한 면역태그 (immunotag)를 더 포함할 수 있다.

다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 폴리펩티드 (또는 그의 단편), 예를 들어 서열 2, 서열 4 또는 서열 6에 나타낸 피루베이트 데카르복실라제 효소에 선택적으로 결합하는 항체를 제공한다. 따라서, 본 발명은 그러한 항체를 사용하여 본 발명의 피루베이트 데카르복실라제를 검출하는 방법을 제공한다.

다른 측면에서, 본 발명은 상기 본 발명의 핵산들 중 하나를 숙주 세포에서 적합한 배양 조건 하에 발현시킴으로써, 본 발명의 피루베이트 데카르복실라제를 생산하는 방법을 제공한다. 상기 핵산은 변화되거나 돌연변이화되어 핵산의 코돈 이용도 또는 코딩된 산물의 데카르복실라제 활성 (예를 들어, 열 안정성, 기질 친화도, 또는 다양한 pH에서의 활성)이 향상될 수 있다.

다른 측면에서, 본 발명은 상기 언급한 숙주 세포를, 피루베이트로부터 아세트알데히드가 생산되기에 충분한 양으로 피루베이트 데카르복실라제가 발현되는 조건 하에서 배양함으로써 아세트알데히드를 생산하는 방법을 제공한다. 관련 실시양태에서, 아세트알데히드의 생산 방법은 상기 숙주 세포로부터 수득한 세포 용균액을, 피루베이트로부터 아세트알데히드가 생산되는 조건 하에 접촉시킴으로써 수행된다. 따라서, 본 발명은 향상된 데카르복실라제 활성을 갖고, 또한 예를 들어 열 안정성, 다양한 pH에서의 활성, 및(또는) 우수한 기질 친화도를 갖는 효소 추출물을 제공한다.

다른 측면에서, 본 발명은 상기 숙주 세포를, 1차 발효 산물로서 에탄올이 생산되기에 충분한 양으로 피루베이트 데카르복실라제 및 알콜 데히드로게나제가 발현되는 조건 하에서 배양함으로써 에탄올을 생산하는 방법을 제공한다.

다른 측면에서, 본 발명은 피루베이트 데카르복실라제의 아미노산 서열을 서열 2, 서열 4 또는 서열 6의 아미노산 서열과 비교하고; 서열 2, 서열 4 또는 서열 6의 상응하는 아미노산과 동일성을 갖도록 상기 피루베이트 데카르복실라제의 아미노산 잔기 1개 이상을 변화시켜, 피루베이트 데카르복실라제의 활성 향상을 달성함으로써, 향상된 데카르복실라제 활성 (예를 들어, 피루베이트에 대한 향상된 친화도, 열 안정성, 다른 pH에서의 활성)을 갖는 피루베이트 데카르복실라제 효소를 선별하는 방법을 제공한다.

관련 실시양태에서, 본 발명은 피루베이트 데카르복실라제를 코딩하는 핵산 서열을 서열 1, 서열 3 또는 서열 5의 핵산 서열과 비교하고; 서열 1, 서열 3 또는 서열 5의 상응하는 코돈과 동일성을 갖도록 상기 피루베이트 데카르복실라제 효소를 코딩하는 핵산의 코돈 1개 이상을 변화시켜, 숙주 세포에서 피루베이트 데카르복실라제 효소를 코딩하는 상기 변화된 핵산의 발현 향상을 달성함으로써, 수용 숙주 세포에서의 발현을 위한 피루베이트 데카르복실라제 효소를 선별하는 방법을 제공한다.

다른 관련 실시양태에서, 본 발명은 피루베이트 데카르복실라제를 코딩하는 핵산 서열을 수용 숙주 세포의 코돈 이용도와 비교하고; 수용 숙주 세포의 코돈 이용도와 상응하도록 피루베이트 데카르복실라제 효소를 코딩하는 핵산의 코돈 1개 이상을 변화시켜, 숙주 세포에서 피루베이트 데카르복실라제 효소를 코딩하는 변화된 핵산의 발현 향상을 달성함으로써, 수용 숙주 세포에서 발현이 향상된 피루베이트 데카르복실라제 효소를 선별하는 방법을 제공한다.

또다른 관련 실시양태에서, 본 발명은 피루베이트 데카르복실라제를 코딩하는 핵산 서열을 수용 숙주 세포의 코돈 이용도와 비교하고; 피루베이트 데카르복실라제 효소를 코딩하는 상기 핵산의 코돈에 상응하는 1개 이상의 tRNA가 재조합에 의해 생성되도록 수용 숙주 세포를 변화시켜, 변화된 숙주 세포에서 피루베이트 데카르복실라제 효소를 코딩하는 핵산의 발현 향상을 달성함으로써, 수용 숙주 세포에서 발현이 향상된 피루베이트 데카르복실라제 효소를 선별하는 방법을 제공한다.

본 발명의 다른 특징 및 이점은 하기 상세한 설명 및 청구의 범위로부터 분명해질 것이다.

도 1은 자이모박터 팔매 (Zymobacter palmae) pdc 유전자의 개략도이다. 플라스미드 pJAM3400은 평활말단화되어 플라스미드 벡터 pLITMUS28로 라이게이션된 제트. 팔매 (Z. palmae) 게놈 DNA의 6-kb BamHI 단편을 가지고 있다. 나머지 플라스미드는 pJAM3400으로부터 유래하였으며, pdc 유전자를 포함하는 2.9-kb 영역의 DNA 서열 분석에 사용되었다. 플라스미드 pJAM3440을 사용하여 재조합 이. 콜라이 (E. coli)에서 제트. 팔매 (Z. palmae) PDC 폴리펩티드를 생산하였다. 화살표는 pdc 유전자의 전사 방향을 나타낸다.

도 2는 아세토박터 파스퇴리아누스 (Acetobacter pasteurianus) pdc 유전자 의 개략도이다. 플라스미드 pJAM301은 플라스미드 벡터 pLITMUS28의 XhoI 부위에 라이게이션된 에이. 파스퇴리아누스 (A. pasteurianus) 게놈 DNA의 6,337 bp AatII 단편을 가지고 있다. AatII 및 XhoI에 의해 생성된 3'- 및 5'-돌출부 (overhang)을 벤트 (Vent) DNA 중합효소로 평활말단화시켜 라이게이션하였다. 나머지 플라스미드는 pJAM301로부터 유래하였으며, DNA 서열 분석에 사용되었다. 플라스미드 pJAM304를 사용하여 재조합 이. 콜라이 (E. coli)에서 에이. 파스퇴리아누스 (A. pasteurianus) PDC 단백질을 생산하였다. 화살표는 추정 ORF의 전사 및 번역 방향을 나타낸다.

도 3은 에스. 벤트리쿨리 (S. ventriculi) pdc 유전자, pdc 좌위를 서열분석하고 특성화하기 위해 제조된 다양한 플라스미드, 및 pdc 오픈 리딩 프레임 (open reading frame)을 포함하고 박테리아에서 높은 수준의 pdc 유전자 발현에 적합한 플라스미드 pJAM413, pJAM419 및 pJAM418의 개략도이다.

도 4는 자이모박터 팔매 (Zymobacter palmae)의 pdc 유전자 및 유전자 산물에 대한 핵산 서열 (서열 1) 및 아미노산 서열 (서열 2)을 나타낸다.

도 5는 아세토박터 파스퇴리아누스 (Acetobacter pasteurianus)의 pdc 유전자 및 유전자 산물에 대한 핵산 서열 (서열 3) 및 아미노산 서열 (서열 4)을 나타낸다. 추정 프로모터는 -35 및 -10 위치의 프로모터 컨센서스 (consensus) 서열로서 PDC에 대한 추정 서열의 바로 아래 이중선으로 밑줄을 그어 표시하였으며, pdc의 핵산 서열에서 대문자로 표시하였다. DNA 서열 위쪽의 화살표는 전사 개시 부위를 나타낸다. 별표는 전사 정지 코돈을 나타낸다. DNA 서열 아래쪽의 화살표는 σ-독립성 전사 종결을 촉진하는 스템-루프 (stem-loop) 구조를 나타낸다.

도 6은 사르시나 벤트리쿨리 (Sarcina ventriculi)의 pdc 유전자 및 유전자 산물에 대한 핵산 서열 (서열 5) 및 아미노산 서열 (서열 6)을 나타낸다.

도 7은 상이한 박테리아 PDC 효소의 열안정성을 나타내는 그래프이다. '재조합' Zmo (●), Zpa (■), Apa (○) 및 Sve (□) PDC 폴리펩티드를 50 mM 시트르산나트륨 완충액 (pH 5.0) 중에서 1 mM TPP 및 1 mM MgCl₂와 함께 지정된 온도에서 30분 동안 미리 인큐베이션시키고, 0℃로 냉각시킨 후, 동일한 완충액 중의 25℃에서 잔류 활성에 대해 분석하였다. 100％는 0℃에서 미리 인큐베이션시킨 후의 활성이다. SvePDC는 재조합 이. 콜라이 (E. coli) BL21-CodonPlus-RIL (pJAM419)로부터 정제하였다.

도 8은 박테리아 PDC 효소의 활성에 대한 pH의 영향을 나타내는 그래프이다. '재조합' ZpaPDC (●) 및 ApaPDC (■). '천연' ZpaPDC (○) 및 ApaPDC (□). 활성은 50 mM 시트르산나트륨 완충액 (pH 4.0 내지 5.0) 및 50 mM 인산나트륨 완충액 (pH 5.5 내지 pH 8.0) 중의 25℃에서 측정하였다. 100％는 최적 pH에서의 활성이다.

도 9는 선택된 PDC 폴리펩티드, 즉 제트. 모빌리스 (Z. mobilis) (서열 8), 에이. 파스퇴리아누스 (A. pasteurianus) (서열 4), 에스. 벤트리쿨리 (S. ventriculi) (서열 6), 제트. 마이즈 (Z. mays) (서열 9) 및 에스. 세레비지애 (S. cerevisiae) (서열 10)와 정렬된 제트. 팔매 (Z. palmae) (서열 2)의 추정 PDC 폴 리펩티드의 다중 아미노산 서열 정렬을 나타낸다. 기능적으로 보존된 아미노산 잔기 (검정색으로 강조됨) 및 반-보존적인 아미노산 잔기 (회색으로 강조됨). 갭 (gap)이 정렬에 도입되었다 (--). 효모 및 제트. 모빌리스 (Z. mobilis) PDC 폴리펩티드의 Mg²⁺ 및 TPP 결합 부위에서 0.4 nm 이내의 잔기 (*). 피루바미드 (pyruvamide)와 수소 결합을 형성하는 효모 PDC1 잔기 (■). 이중선 밑줄이 그어진 잔기는 TPP-의존성 효소들 사이에서 보존된 것이다. 약어 및 진뱅크 (GenBank) 또는 스위스프롯 (SwissProt) 허가번호: Zpa = 제트. 팔매 (Z. palmae), AF474145; Apa = 에이. 파스퇴리아누스 (A. pasteurianus), AR368435; Sce = 사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae), P06169; Sve = 사르시나 벤트리쿨리 (Sarcina ventriculi), AF354297; Zma = 제아 마이즈 (Zea mays), P28516; Zmo = 자이모모나스 모빌리스 (Zymomonas mobilis), P06672.

본 발명의 전체 범위를 분명히 이해하기 위해, 하기 정의를 제시한다.

I. 정의

본원에 사용된 용어 "알콜 데히드로게나제"는 아세트알데히드를 알콜로, 유리하게는 에탄올로 전환시킬 수 있는 효소를 총괄하는 것이다.

용어 "키메라"는 돌연변이체 또는 변화된 PDC를 포함하는 것으로, 유전공학 등을 이용하여 다른 PDC로부터 유래한 전체 도메인이 특정 PDC의 상응하는 도메인을 사용하여 조작 (융합, 교환)된 것이다.

용어 "코돈 이용도"는 수용 숙주 생물체 (또는 그의 무세포 추출물)에서 발현을 고려중인 당해 핵산을, 상기 핵산을 상응하는 폴리펩티드로 번역하기 위해 숙주 생물체가 (유리하게는 충분한 양으로) 필요로 하는 특정 코돈의 발생율 또는 "이용도"에 대해 분석하는 것을 총괄하는 것이다. 이러한 관찰에 기초하여, 수용 숙주는 임의의 필수 코돈을 재조합에 의해 보충받을 수 있다. 별법으로, 우수한 코돈 이용도를 갖는 다른 숙주를 선택할 수도 있고, (예를 들어, 침묵 (silent) 돌연변이의 도입에 의해) 제한 코돈을 더 이상 포함하지 않도록 핵산을 변화시킬 수도 있다.

용어 "데카르복실라제 활성"은 특정 폴리펩티드가 피루베이트를 아세트알데히드로 효소적으로 전환시키는 능력을 총괄하는 것이다. 통상적으로, 선택된 폴리펩티드의 활성은, 예를 들어 효소의 우수한 기질 친화도, 열안정성, 다른 pH에서의 안정성, 또는 상기 항목의 조합을 포함하는, 생산된 폴리펩티드와 관련된 전반적인 효소 활성을 포함한다.

용어 "~로부터 유래한"은 지정된 공급원으로부터의 폴리펩티드 세그먼트의 (전체적 또는 부분적) 단리를 총괄하는 것이다. 상기 용어는, 예를 들어 직접 클로닝, PCR 증폭, 또는 지정된 폴리뉴클레오티드 공급원과 관련된 서열로부터의 또는 이에 기초한 인공 합성을 총괄하는 것이다.

용어 "에탄올 생산성 (ethanologenic)"은 미생물이 탄수화물로부터 1차 발효 산물로서 에탄올을 생산하는 능력을 총괄하는 것이다. 상기 용어는 자연 발생의 에탄올 생산성 생물체, 자연 발생의 또는 돌연변이 유도된 에탄올 생산성 생물체, 및 유전자 변형된 에탄올 생산성 생물체를 총괄하는 것이다.

용어 "발효시키는" 및 "발효"는 탄수화물로부터 (특히, 발효의 1차 산물로서) 에탄올이 생성되는 효소적 과정 (예를 들어 세포성 또는 무세포성, 예를 들어 용균액 또는 정제된 폴리펩티드 혼합물)을 총괄하는 것이다.

용어 "에탄올생산과 관련된 유전자"는 특정 세포에 에탄올생산 특성을 부여할 수 있는 임의 유전자, 또는 세포의 에탄올생산에 대한 임의 측면 (예를 들어, 기질 흡수, 기질 가공, 에탄올 내성 등)을 향상시킬 수 있는 임의 유전자를 총괄하는 것이다. 에탄올생산과 관련된 유전자의 예로는 알콜 데히드로게나제, 피루베이트 데카르복실라제, 분비 폴리펩티드(들) 및 다당류가 있으며, 이들 유전자 또는 이들의 상동체는 임의의 적당한 생물체로부터 유래할 수 있다.

용어 "글루카나제"는 셀룰로스, 헤미셀룰로스 및 펙틴을 포함하는 복합 탄수화물 (또한 본원에서 복합 당으로도 언급됨), 예를 들어 셀룰로올리고당류 및 리그노셀룰로스를 비롯한 임의의 결합된 당 잔기 (예를 들어 이당류, 삼당류, 올리고당류)의 분해 또는 해중합을 촉매할 수 있는 폴리펩티드를 총괄하는 것이다. 상기 용어는 글루카나제, 유리하게는 엔도글루카나제 포함할 뿐만 아니라, 엑소글루카나제, β-갈락토시다제, 셀로비오히드롤라제, 엔도-1,4-β-크실로시다제, α-글루쿠로니다제, α-L-아라비노푸라노시다제, 아세틸에스테라제, 아세틸크실란에스테라제, α-아밀라제, β-아밀라제, 글루코아밀라제, 풀루라나제, β-글루카나제, 헤미셀룰라제, 아라비노시다제, 만난아제, 펙틴 히드롤라제, 펙테이트 리아제, 또는 이들 셀룰라제들의 임의 조합과 같은 셀룰라제를 총괄하는 것이다.

용어 "그람-음성 박테리아 세포"는 상기 용어에 대해 당업계에서 인식하고 있는 바를 총괄하는 것이다. 통상적으로, 그람-음성 박테리아에는 글루코노박터 (Gluconobacter), 리조비움 (Rhizobium), 브라디리조비움 (Bradyrhizobium), 알칼리게네스 (Alcaligenes), 로도박터 (Rhodobacter), 로도코커스 (Rhodococcus), 아조스피릴룸 (Azospirillum), 로도스피릴룸 (Rhodospirillum), 스핑고모나스 (Sphingomonas), 부르콜데리아 (Burkholderia), 데술포모나스 (Desulfomonas), 게오스피릴룸 (Geospirillum), 숙시노모나스 (Succinomonas), 에어로모나스 (Aeromonas), 쉬와넬라 (Shewanella), 할로크로마티움 (Halochromatium), 시트로박터 (Citrobacter), 에세리치아 (Escherichia), 클레브시엘라 (Klebsiella), 자이모모나스 (Zymomonas) (예를 들어, 자이모모나스 모빌리스 (Zymomonas mobilis)), 자이모박터 (Zymobacter) (예를 들어, 자이모박터 팔매 (Zymobacter palmae)) 및 아세토박터 (Acetobacter) (예를 들어, 아세토박터 파스퇴리아누스 (Acetobacter pasteurianus))가 포함된다.

용어 "그람-양성 박테리아"는 상기 용어에 대해 당업계에서 인식하고 있는 바를 총괄하는 것이다. 통상적으로, 그람-양성 박테리아에는 피브로박터 (Fibrobacter), 아시도박터 (Acidobacter), 박테로이데스 (Bacteroides), 스핑고박테리움 (Sphingobacterium), 악티노마이세스 (Actinomyces), 코리네박테리움 (Corynebacterium), 노카르디아 (Nocardia), 로도코커스 (Rhodococcus), 프로피오니박테리움 (Propionibacterium), 비피도박테리움 (Bifidobacterium), 바실러스 (Bacillus), 게오바실러스 (Geobacillus), 패니바실러스 (Paenibacillus), 술포바 실러스 (Sulfobacillus), 클로스트리디움 (Clostridium), 안에어로박터 (Anaerobacter), 유박테리움 (Eubacterium), 스트렙토코커스 (Streptococcus), 락토바실러스 (Lactobacillus), 류코노스톡 (Leuconostoc), 엔테로코커스 (Enterococcus), 락토코커스 (Lactococcus), 써모비피다 (Thermobifida), 셀룰로모나스 (Cellulomonas) 및 사르시나 (Sarcina) (예를 들어, 사르시나 벤트리쿨리 (Sarcina ventriculi))가 포함된다.

용어 "이종 폴리펩티드"는 진핵생물, 원핵생물, 바이러스와 같은 임의의 공급원으로부터 유래한 이종 핵산, 또는 합성 핵산 단편에 의해 코딩될 수 있는 폴리펩티드 또는 그의 단편을 총괄하는 것이다.

용어 "상동성인"은, 제1 및 제2 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열이 공통적인 구조 도메인 및(또는) 공통적인 기능 활성을 공유하도록 제1 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열이 제2 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열과 충분한 개수의 또는 최소 개수의 동일하거나 균등한 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드 (예를 들어, 유사한 측쇄를 갖는 아미노산)를 함유하는 것을 총괄하는 것이다.

용어 "숙주 세포" 및 "재조합 숙주 세포"는, 예를 들어 형질감염될 수 있는 이종 폴리뉴클레오티드 서열을 혼입시킬 수 있는, 유전자 조작에 적합한 세포를 총괄하는 것이다. 상기 세포는 미생물일 수도, 또는 동물 세포 또는 식물 세포와 같은 고등 진핵 세포일 수도 있다. 상기 용어는 최초 형질감염된 세포의 자손을 총괄하는 것이다. 특히, 용어 "재조합 숙주 세포"는 바람직한 특정 성질을 갖도록 이미 선별 또는 조작된 세포, 및 본 발명의 조성물 및 방법을 이용한 추가 변형에 적합한 세포를 총괄하는 것이다.

용어 "단리된 폴리펩티드" (예를 들어, 단리되거나 정제된 생합성 효소)는 폴리펩티드가 유래한 미생물로부터의 세포성 물질 또는 기타 오염 폴리펩티드가 실질적으로 없는 것이거나, 또는 화학적으로 합성되는 경우에 화합물 전구체 또는 기타 화합물이 실질적으로 없는 것이다.

용어 "핵산"은 폴리펩티드를 코딩하는 오픈 리딩 프레임을 포함하며, 추가로 비-코딩 조절 서열 및 인트론을 포함할 수 있는 폴리뉴클레오티드와 같은 핵산 분자를 총괄하는 것이다. 또한, 상기 용어는 기능적 좌위에 매핑되는 하나 이상의 유전자를 총괄하는 것이다. 또한, 상기 용어는 선별 목적을 위한 특이적 유전자를 총괄하는 것이다. 유전자는 숙주 세포에 대해 내생성일 수도, 또는 에피좀으로 유지되는 플라스미드 또는 게놈 내로 안정하게 통합된 플라스미드 (또는 그의 단편)로서 숙주 세포에 재조합에 의해 도입될 수도 있다. 한 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드 세그먼트의 유전자는 탄수화물의 에탄올로의 생물전환 중 적어도 한 단계에 관여한다. 따라서, 상기 용어는 피루베이트 데카르복실라제, 알콜 데히드로게나제, 분비 폴리펩티드(들) 또는 폴리사카라제 (예를 들어, 글루카나제), 또는 이들의 조합과 같은 폴리펩티드를 코딩하는 임의 유전자를 총괄하는 것이다.

어구 "돌연변이체 핵산 분자" 또는 "돌연변이체 유전자"는, 돌연변이체에 의해 코딩될 수 있는 폴리펩티드가 야생형 핵산 분자 또는 유전자에 의해 코딩되는 폴리펩티드와 다른 활성을 나타내도록, 하나 이상의 변화 (예를 들어, 치환, 삽입, 결실)를 포함하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 핵산 분자 또는 유전자를 총괄하는 것 이다.

어구 "작동가능하게 연결된"은 당해 핵산 분자 또는 유전자의 뉴클레오티드 서열이 뉴클레오티드 서열의 발현 (예를 들어, 증진된, 증가된, 구성적, 기본적, 감쇠된, 감소된 또는 억제된 발현), 유리하게는 (예를 들어, 재조합 핵산 분자가 본원에 정의된 재조합 벡터에 포함되어 미생물 내로 도입될 때) 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 유전자 산물의 발현을 가능하게 하는 방식으로 조절 서열(들)과 연결된 것을 의미한다.

용어 "pH"는 당업계에서 인식하고 있는 의미를 총괄하는 것이다. 통상적으로, 본 발명의 피루베이트 데카르복실라제 효소는 약 4 내지 약 8의 pH, 보다 구체적으로는 약 5 내지 약 7의 pH, 보다 더 구체적으로는 약 5.5 내지 약 6.0의 pH에서 데카르복실라제 활성을 나타낸다.

용어 "피루베이트 데카르복실라제"는 피루베이트를 아세트알데히드로 탈카르복시화시킬 수 있는 본원 기재의 효소를 총괄하는 것이다. 통상적으로, 용어는 "pdc"는 피루베이트 데카르복실라제 유전자를 지칭하고, 용어 "PDC"는 pdc 유전자의 산물, 즉 피루베이트 데카르복실라제 폴리펩티드 또는 효소를 지칭한다.

용어 "재조합 핵산 분자" 재조합 핵산 분자가 유래한 천연 핵산 분자와 뉴클레오티드 서열이 달라지도록 (예를 들어, 뉴클레오티드 1개 이상의 부가, 결실 또는 치환에 의해) 변화, 변형 또는 조작된 핵산 분자 (예를 들어, DNA 분자)를 포함한다. 유리하게는, 재조합 핵산 분자 (예를 들어, 재조합 DNA 분자)는 본 발명의 조절 서열과 작동가능하게 연결된 단리된 핵산 분자 또는 유전자 (예를 들어, 단리 된 pdc 유전자)를 포함한다.

용어 "세크레타제"는, 단독으로 또는 다른 폴리펩티드들과 함께 세포의 세포내 공간으로부터 세포외 환경으로의 또다른 폴리펩티드의 수송을 용이하게 하는 임의의 폴리펩티드를 총괄하는 것이다. 한 실시양태에서, 분비 폴리펩티드(들)은 그람-음성 또는 그람-양성 숙주 세포에 분비 활성을 부여하기에 충분한 모든 필수 분비 폴리펩티드를 포함한다.

용어 "동시 당화 및 발효" 또는 "SSF"는 복합 당의 동시 분해 또는 해중합, 및 상기 당 잔기의 아세트알데히드로의 생물전환, 그리고 바람직하게는 그 이후의 발효에 의한 에탄올로의 생물전환을 위해 하나 이상의 재조합 숙주 (또는 정제되거나 정제되지 않은 추출물을 비롯한 그의 추출물, 및 경우에 따라 1종 이상의 상이한 공급원으로부터 유래한 다른 효소 첨가물)를 사용하는 것을 총괄하는 것이다.

용어 "기질 친화도"는 기질에 대한 효소의 결합 반응속도, 예를 들어 효소 피루베이트 데카르복실라제의 그 기질인 피루베이트 (또는 그의 유사체)에 대한 K_M을 총괄하는 것이다. 통상적으로, 본 발명의 피루베이트 데카르복실라제 효소는 (예를 들어, 피루베이트에 대한) 기질 친화도가 약 0.1 내지 약 1의 K_M, 보다 구체적으로는 약 0.1 내지 약 0.5의 K_M, 보다 더 구체적으로는 약 0.2 내지 약 0.4의 K_M이다.

용어 "당"은 당 분자(들)을 포함하는 임의의 탄수화물 공급원을 총괄하는 것이다. 그러한 당은 해중합, 및 (경우에 따라) 그 이후의 아세트알데히드로의 생물 전환 및 그 이후의 본 발명의 생성물 및 방법에 따른 발효에 의한 에탄올로의 생물전환을 위한 당의 잠재적 공급원이다.

용어 "대리 프로모터"는 목적 유전자 (예를 들어, 피루베이트 데카르복실라제 유전자)의 전사를 조절할 수 있는 (자연계에서는 전사를 조절하지 않음) 폴리뉴클레오티드 세그먼트를 총괄하는 것이다. 한 실시양태에서, 대리 프로모터의 전사 조절은 목적 유전자의 발현 증가를 초래한다. 다른 실시양태에서, 대리 프로모터는 목적 유전자의 5'에 위치한다. 또한, 대리 프로모터는 천연 프로모터를 대체하여 사용될 수도, 또는 천연 프로모터에 부가하여 사용될 수도 있다. 대리 프로모터는 이 프로모터가 사용되는 숙주에 대해 내생성일 수도 있고, 또는 숙주 세포 내로 도입된 이종 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, 대리 프로모터가 사용되는 숙주에 대해 외생성임)일 수도 있다. 박테리아에서 사용하기 적합한 다른 프로모터로는, 예를 들어 lacZ, T7 및 SP6 (예를 들어, 오수벨 (Ausubel) 등의 하기 문헌 참조)가 있다.

용어 "열 안정성" 및 "열안정성"은 상호 교환하여 사용되며, 특정 반응 (예를 들어, 피루베이트의 아세트알데히드로의 전환)을 약 20℃ 이상에서, 유리하게는 약 25℃ 내지 35℃에서, 보다 유리하게는 약 37℃ 이상에서, 구체적으로는 약 50℃ 이상에서, 예를 들어 약 60℃ 이상에서 촉매할 수 있는 효소의 능력 (예를 들어, 세포에서 발현되거나, 세포 추출물에 존재하거나, 세포 용균액에 존재하거나, 또는 정제된 형태이거나 정제되지 않은 형태이거나 무관함)을 총괄하는 것이다.

II. 단리된 핵산 분자 및 유전자

본 발명은 피루베이트 데카르복실라제 ( p yruvate d e c arboxylase) 폴리펩티드 효소 (PDC)를 코딩하는 피루베이트 데카르복실라제 유전자 (pdc)를 포함하는 핵산 분자를 특징으로 하며, 여기서 상기 핵산은 그람-음성 및 그람-양성 박테리아, 예를 들어 그람-음성 박테리아인 자이모박터 팔매 (Zymobacter palmae), 아세토박터 파스퇴리아누스 (Acetobacter pasteurianus) 및 그람-양성 박테리아인 사르시나 벤트리쿨리 (Sarcina ventriculi)로부터 단리된 것이다. 또한, 본 발명은 상기 언급한 피루베이트 데카르복실라제 유전자 (즉, pdc)들 중 어느 하나를 포함하면서, 조절 영역 (예를 들어, 프로모터(들) 및 리보솜 결합 부위(들)) 및 에탄올생산에 관여하는 기타 관련 유전자들 (예를 들어, 알콜 데히드로게나제 (adh))을 포함하는 다른 인접 영역들도 포함하는 단리된 게놈 핵산을 특징으로 한다.

핵산 분자로는 DNA 분자 (예를 들어, 선형 DNA, 환형 DNA, cDNA 또는 염색체 DNA) 및 RNA 분자 (예를 들어, tRNA, rRNA, mRNA), 및 뉴클레오티드 유사체를 사용하여 생성된 DNA 또는 RNA의 유사체가 있다. 핵산 분자는 단일-가닥 또는 이중-가닥일 수 있지만, 유리하게는 이중-가닥 DNA이다. 본 발명의 단리된 핵산 분자는, 자연 상태에서는 상기 핵산이 유래한 생물체의 염색체 DNA에서 인접해 있는 핵산 분자의 서열 (즉, 상기 핵산 분자의 5' 및 3' 말단에 위치한 서열들)이 없는 핵산 분자를 포함한다. 다양한 실시양태에서, 단리된 핵산 분자는 자연 상태에서 당해 핵산이 유래한 생물체의 염색체 DNA에서 인접해 있는 약 10 kb 미만, 5 kb 미만, 4 kb 미만, 3 kb 미만, 2 kb 미만, 1 kb 미만, 0.5 kb 미만, 0.1 kb 미만, 50 bp 미만, 25 bp 미만 또는 10 bp 미만의 뉴클레오티드 서열을 함유할 수 있다. 더욱이, "단리된" 핵산 분자, 예를 들어 cDNA는 재조합 기술에 의해 제조시 다른 세포성 물질들이 실질적으로 없거나, 또는 화학적으로 합성시 화합물 전구체 또는 기타 화합물이 실질적으로 없을 수 있다.

본원에 개시된 (그리고, 관습에 의해 이탤릭체로 기재된) pdc 유전자는, 예를 들어 생물체에서 유전자간 (intergenic) DNA (즉, 자연 상태에서는 생물체의 염색체 DNA에서 유전자에 인접하고(하거나) 유전자들을 분리시키는 개재 또는 스페이서 DNA)에 의해 다른 유전자(들)로부터 분리되어 있는 폴리펩티드-코딩 핵산 분자 또는 RNA-코딩 핵산 분자와 같은 핵산 분자 (예, DNA 분자 또는 그의 세그먼트)를 포함한다. 유전자는 효소 또는 다른 폴리펩티드 분자의 합성을 지시할 수 있고 (예를 들어, 폴리펩티드를 코딩하는 인접 오픈 리딩 프레임 (ORF)과 같은 코딩 서열을 포함할 수 있음), 또는 그 자체로 생물체에서 기능할 수 있다. 생물체 내의 유전자는 본원에 정의된 바와 같이 오페론에 클러스터링될 수 있으며, 여기서 상기 오페론은 유전자간 DNA에 의해 다른 유전자 및(또는) 오페론으로부터 분리되어 있다. 오페론 내에 함유된 개별 유전자는 개별 유전자들 사이에 유전자간 DNA없이 중복될 수도 있다.

본원에 기재된 단리된 유전자는, 당해 유전자가 유래한 생물체의 염색체 DNA에서 그 유전자에 인접한 서열이 실질적으로 없는 (즉, 구조 유전자 등에 인접한 제2 또는 별도의 폴리펩티드 또는 RNA 분자를 코딩하는 인접 코딩 서열이 없음) 유전자를 포함하며, 임의로는 프로모터 서열 및(또는) 종결자 서열과 같은 5' 및 3' 조절 서열을 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 단리된 유전자는 우선적으로 폴리 펩티드에 대한 코딩 서열 (예를 들어, PDC 폴리펩티드를 코딩하는 서열)을 포함한다.

다른 실시양태에서, 단리된 유전자는 폴리펩티드 (예를 들어, PDC 폴리펩티드)에 대한 코딩 서열, 및 유전자가 유래한 생물체의 염색체 DNA로부터의 인접 5' 및(또는) 3' 조절 서열 (예를 들어, 인접한 5' 및(또는) 3' pdc 조절 서열)을 포함한다. 유리하게는, 단리된 유전자는 자연 상태에서 유전자가 유래한 생물체의 염색체 DNA에서 인접해 있는 약 10 kb 미만, 5 kb 미만, 4 kb 미만, 3 kb 미만, 2 kb 미만, 1 kb 미만, 0.5 kb 미만, 0.1 kb 미만, 50 bp 미만, 25 bp 미만 또는 10 bp 미만의 뉴클레오티드 서열을 함유한다.

한 측면에서 본 발명은, 유리하게는 그람-양성 또는 그람-음성 박테리아로부터 유래한 단리된 pdc 핵산 서열 또는 유전자, 단리된 알콜 데히드로게나제 (adh) 핵산 서열 또는 유전자를 특징으로 한다. 유리하게는, pdc 핵산 또는 유전자가 글루코노박터 (Gluconobacter), 리조비움 (Rhizobium), 브라디리조비움 (Bradyrhizobium), 알칼리게네스 (Alcaligenes), 로도박터 (Rhodobacter), 로도코커스 (Rhodococcus), 아조스피릴룸 (Azospirillum), 로도스피릴룸 (Rhodospirillum), 스핑고모나스 (Sphingomonas), 부르콜데리아 (Burkholderia), 데술포모나스 (Desulfomonas), 게오스피릴룸 (Geospirillum), 숙시노모나스 (Succinomonas), 에어로모나스 (Aeromonas), 쉬와넬라 (Shewanella), 할로크로마티움 (Halochromatium), 시트로박터 (Citrobacter), 에세리치아 (Escherichia), 클레브시엘라 (Klebsiella), 자이모모나스 (Zymomonas) (예를 들어, 자이모모나스 모빌 리스 (Zymomonas mobilis)), 자이모박터 (Zymobacter) (예를 들어, 자이모박터 팔매 (Zymobacter palmae)) 및 아세토박터 (Acetobacter) (예를 들어, 아세토박터 파스퇴리아누스 (Acetobacter pasteurianus))로 구성된 군으로부터 선택된 그람-음성 미생물로부터 유래한다.

다른 실시양태에서, pdc 핵산 또는 유전자는 피브로박터 (Fibrobacter), 아시도박터 (Acidobacter), 박테로이데스 (Bacteroides), 스핑고박테리움 (Sphingobacterium), 악티노마이세스 (Actinomyces), 코리네박테리움 (Corynebacterium), 노카르디아 (Nocardia), 로도코커스 (Rhodococcus), 프로피오니박테리움 (Propionibacterium), 비피도박테리움 (Bifidobacterium), 바실러스 (Bacillus), 게오바실러스 (Geobacillus), 패니바실러스 (Paenibacillus), 술포바실러스 (Sulfobacillus), 클로스트리디움 (Clostridium), 안에어로박터 (Anaerobacter), 유박테리움 (Eubacterium), 스트렙토코커스 (Streptococcus), 락토바실러스 (Lactobacillus), 류코노스톡 (Leuconostoc), 엔테로코커스 (Enterococcus), 락토코커스 (Lactococcus), 써모비피다 (Thermobifida), 셀룰로모나스 (Cellulomonas) 및 사르시나 (Sarcina) (예를 들어, 사르시나 벤트리쿨리 (Sarcina ventriculi))로 구성된 군으로부터 선택된 그람-양성 미생물로부터 유래한다.

한 실시양태에서, pdc 핵산 또는 유전자는 그람-음성 박테리아인 자이모박터 팔매 (Zymobacter palmae)로부터 유래한다.

다른 실시양태에서, pdc 핵산 또는 유전자는 그람-음성 박테리아인 아세토박 터 파스퇴리아누스 (Acetobacter pasteurianus)로부터 유래한다.

또다른 실시양태에서, pdc 핵산 또는 유전자는 그람-양성 박테리아인 사르시나 벤트리쿨리 (Sarcina ventriculi)로부터 유래한다.

다른 실시양태에서, 본 발명의 단리된 핵산 분자는 서열 1, 서열 3 또는 서열 5로서 기재된 뉴클레오티드 서열과 약 60-65％ 이상, 유리하게는 약 70-75％ 이상, 보다 바람직하게는 약 80-85％ 이상, 보다 더 유리하게는 약 90-95％ 이상 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함한다.

다른 실시양태에서, 단리된 핵산 분자는 서열 1, 서열 3 또는 서열 5로서 기재된 뉴클레오티드 서열을 갖는 핵산 분자와 엄격한 조건 하에서 혼성화된다. 그러한 엄격한 조건은 당업자에게 공지되어 있으며, 문헌 [Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley ＆ Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6]에서 찾아볼 수 있다. 엄격한 혼성화 조건 (예를 들어, 높은 엄격 조건)의 구체적이고 비제한적인 예로는, 6X 염화나트륨/시트르산나트륨 (SSC)에서 약 45℃로 혼성화시킨 후, 0.2X SSC, 0.1％ SDS에서 50 내지 65℃로 1회 이상 세척하는 것이 있다. 유리하게는, 서열 1, 서열 3 또는 서열 5의 서열과 엄격한 조건 하에서 혼성화되는 본 발명의 단리된 핵산 분자는 자연 발생의 핵산 분자에 상응한다. 통상적으로, 자연 발생의 핵산 분자는 자연계에서 나타나는 뉴클레오티드 서열을 갖는 RNA 또는 DNA 분자를 포함한다.

본 발명의 단리된 핵산 분자 (즉, 서열 1, 서열 3 또는 서열 5의 뉴클레오티드 서열을 갖는 핵산 분자)는 표준 분자생물학 기술 및 본원에 제공된 서열 정보를 이용하여 단리할 수 있다. 예를 들어, 핵산 분자는 표준 혼성화 및 클로닝 기술 (예를 들어, 문헌 [Sambrook, J., Fritsh, E. F., and Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd, ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989] 참조)을 이용하여 단리될 수도, 또는 서열 1, 서열 3 또는 서열 5의 서열에 기초하여 디자인된 합성 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용한 중합효소 연쇄반응에 의해 단리될 수도 있다. 본 발명의 핵산은, 주형으로서의 cDNA, mRNA 또는 별법으로 게놈 DNA와 적당한 올리고뉴클레오티드 프라이머를 표준 PCR 증폭 기술에 따라 사용하여 증폭시킬 수 있다. 다른 실시양태에서, 본 발명의 단리된 핵산 분자는 서열 1, 서열 3 또는 서열 5에 나타낸 뉴클레오티드 서열의 상보체인 핵산 서열을 포함한다.

부가의 pdc 핵산 서열로는 서열 1, 서열 3 또는 서열 5의 뉴클레오티드 서열을 포함하며, 서열 2, 서열 4 또는 서열 6에 기재된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드의 상동체를 코딩 (예를 들어, 서열 2, 서열 4 또는 서열 6에 기재된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드와 30％ 이상, 40％ 이상, 50％ 이상, 60％ 이상, 70％ 이상, 80％ 이상, 90％ 이상, 95％ 이상, 또는 그 이상의 동일성을 갖는 폴리펩티드를 코딩함)하는 서열; 서열 1, 서열 3 또는 서열 5의 뉴클레오티드 서열을 갖는 핵산 분자의 전부 또는 일부와, 또는 서열 2, 서열 4 또는 서열 6의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자의 전부 또는 일부와 엄격한 조건 하에서 혼성화되는 서열; 또는 본원에 기재된 pdc 뉴클레오티스 서열에 대한 상보체가 있다.

또다른 실시양태에서, 단리된 pdc 핵산 분자 또는 유전자는 서열 2, 서열 4 또는 서열 6의 아미노산 서열을 갖는 PDC 폴리펩티드의 상동체를 코딩한다. 통상적으로, 용어 "상동체"는, 본원에 기재된 야생형 폴리펩티드 또는 폴리펩티드의 아미노산 서열과 약 30-35％ 이상, 유리하게는 약 35-40％ 이상, 보다 유리하게는 약 40-50％ 이상, 보다 더 유리하게는 약 60％ 이상, 70％ 이상, 80％ 이상, 90％ 이상 또는 그 이상의 동일성을 공유하며, 상기 야생형 폴리펩티드 또는 폴리펩티드와 실질적으로 균등한 기능적 또는 생물학적 활성을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 예를 들어, PDC 상동체는 서열 2, 서열 4 또는 서열 6에 기재된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드와 약 30-35％ 이상, 유리하게는 약 35-40％ 이상, 보다 유리하게는 약 40-50％ 이상, 보다 더 유리하게는 약 60％ 이상, 70％ 이상, 80％ 이상, 90％ 이상 또는 그 이상의 동일성을 공유하며, 서열 2, 서열 4 또는 서열 6에 기재된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드와 실질적으로 균등한 기능적 또는 생물학적 활성 (예를 들어, 실질적으로 균등한 피루베이트 데카르복실라제 활성)을 갖는다 (즉, 기능적 등가물임).

한 실시양태에서, 단리된 pdc 핵산 분자 또는 유전자는 서열 2, 서열 4 또는 서열 6 중 어느 하나에 기재된 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.

다른 실시양태에서, 단리된 pdc 핵산 분자는 서열 1, 서열 3 또는 서열 5에 기재된 뉴클레오티드 서열을 갖는 핵산 분자의 전부 또는 일부와 혼성화되거나, 또는 서열 2, 서열 4 또는 서열 6 중 어느 하나의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 핵산 분자의 전부 또는 일부와 혼성화된다.

그러한 혼성화 조건은 당업자에게 공지되어 있으며, 문헌 [Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al., eds., John Wiley ＆ Sons, Inc. (1995)]의 제2장, 제4장 및 제6장에서 찾아볼 수 있다. 부가의 엄격한 조건은 문헌 [Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook et al., Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY (1989)]의 제7장, 제9장 및 제11장에서 찾아볼 수 있다. 엄격한 혼성화 조건의 구체적이고 비제한적인 예로는, 4X 염화나트륨/시트르산나트륨 (SSC)에서 약 65 내지 70℃로 (또는 4X SSC와 50％ 포름아미드에서 42 내지 50℃로) 혼성화시킨 후, 1X SSC에서 약 65 내지 70℃로 1회 이상 세척하는 것이 있다. 높은 엄격 혼성화 조건의 구체적이고 비제한적인 예로는, 1X SSC에서 약 65 내지 70℃로 (또는 1X SSC와 50％ 포름아미드에서 42 내지 50℃로) 혼성화시킨 후, 0.3X SSC에서 약 65 내지 70℃로 1회 이상 세척하는 것이 있다. 감소된 엄격 혼성화 조건의 구체적이고 비제한적인 예로는, 4X SSC에서 약 50 내지 60℃로 (또는, 별법으로 6X SSC와 50％ 포름아미드에서 약 40 내지 45℃로) 혼성화시킨 후, 2X SSC에서 약 50 내지 60℃로 1회 이상 세척하는 것이 있다. 상기 언급한 값들 사이의 범위, 예를 들어 65 내지 70℃ 또는 42 내지 50℃도 본 발명의 범위에 포함되는 것이다. 혼성화 및 세척 완충액에 있어서, SSPE (1X SSPE는 0.15 M NaCl, 10 mM NaH₂PO₄ 및 1.25 mM EDTA, pH 7.4임)가 SSC (1X SSC는 0.15 M NaCl 및 15 mM 시트르산나트륨임)를 대체할 수 있으며; 세척은 혼성화가 완료된 후 각각 15분 동안 수행된다. 길이가 50 염기쌍 미만일 것으로 생각되는 하이브리드 (hybrid)에 대한 혼성화 온도는 하이브리드의 융점 (T_m)보다 5 내지 10℃ 낮아야 하며, 여기서 T_m은 하기 식에 따라 결정한다. 길이가 18 염기쌍 미만인 하이브리드의 경우, T_m(℃) = 2(A + T 염기의 수) + 4(G + C 염기의 수). 길이가 18 내지 49 염기쌍인 하이브리드의 경우, T_m(℃) = 81.5 + 16.6(log₁₀[Na⁺]) + 0.41(％G+C) - (600/N)이며, 여기서 N은 하이브리드의 염기 수이고, [Na⁺]는 혼성화 완충액 중의 나트륨 이온 농도이다 (1X SSC의 [Na⁺] = 0.165 M).

당업자는, 부가의 시약이 혼성화 및(또는) 세척 완충액에 첨가되어 핵산 분자의 막 (예를 들어, 니트로셀룰로스 막 또는 나일론 막)에 대한 비특이적 혼성화를 감소시킬 수 있으며, 그러한 시약의 예로는 블로킹제 (예를 들어, BSA, 또는 연어 또는 청어의 정자 담체 DNA), 계면활성제 (예를 들어, SDS), 킬레이트화제 (예를 들어, EDTA), 피콜 (Ficoll) 및 PVP 등이 있음을 알 것이다. 특히 나일론 막을 사용하는 경우, 엄격한 혼성화 조건의 부가적이고 비제한적인 예로는 0.25-0.5 M NaH₂PO₄, 7％ SDS에서 65℃로 혼성화시킨 후, 0.02 M NaH₂PO₄, 1％ SDS에서 65℃로 (예를 들어, 문헌 [Church and Gilbert (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:1991-1995] 참조) (또는, 별법으로 0.2 SSC, 1％ SDS)에서 1회 이상 세척하는 것이 있다. 다른 실시양태에서, 단리된 핵산 분자는 본원에 기재된 pdc 뉴클레오티드 서열에 대해 상보체인 (예를 들어, 서열 1, 서열 3 또는 서열 5에 기재된 뉴 클레오티드 서열의 완전한 상보체인) 뉴클레오티드 서열을 포함한다.

본 발명의 또다른 실시양태는 돌연변이체 또는 키메라 pdc 핵산 분자 또는 유전자를 특징으로 한다. 통상적으로, 본원에 기재된 돌연변이체 핵산 분자 또는 돌연변이체 유전자에는, 돌연변이체에 의해 코딩될 수 있는 폴리펩티드가 야생형 핵산 분자 또는 유전자에 의해 코딩되는 폴리펩티드와 다른 활성을 나타내도록, 하나 이상의 변화 (예를 들어, 치환, 삽입, 결실)를 포함하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 핵산 분자 또는 유전자가 포함된다. 통상적으로, 키메라 pdc는 특정 PDC의 상응하는 도메인을 사용하여 조작 (융합, 교환)된 다른 PDC로부터의 전체 도메인을 포함한다. 유리하게는, 돌연변이체 핵산 분자 또는 돌연변이체 유전자 (예를 들어, 돌연변이체 pdc 유전자)는 향상된 활성, 예를 들어 향상된 데카르복실라제 활성 (예를 들어, 피루베이트 등에 대한 기질 치환도), 열안정성, 다른 pH에서의 활성, 또는 코돈 이용도 (예를 들어, 수용 숙주 세포에서의 발현 향상을 위함)를 갖는 PDC 폴리펩티드를 코딩한다.

III. 재조합 핵산 분자 및 벡터

또한, 본 발명은 본원에 기재된 핵산 분자 및(또는) 유전자 (예를 들어, 단리된 핵산 분자 및(또는) 유전자), 유리하게는 pdc 유전자, 보다 유리하게는 그람-음성 또는 그람-양성 박테리아로부터 유래한 pdc 유전자를 포함하는 재조합 핵산 분자 (예를 들어, 재조합 DNA 분자)를 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 본원에 기재된 핵산 분자 (예를 들어, 단리된 또는 재조합 핵산 분자 및(또는) 유전자)를 포함하는 벡터 (예를 들어, 재조합 벡터)를 특징으 로 한다. 구체적으로, 재조합 벡터는 본원에 기재된 박테리아 유전자 산물, 유리하게는 pdc 유전자 산물, 보다 유리하게는 그람-음성 또는 그람-양성 박테리아의 pdc 유전자 산물, 보다 더 유리하게는 자이모박터 팔매 (Zymobacter palmae), 아세토박터 파스퇴리아누스 (Acetobacter pasteurianus) 또는 사르시나 벤트리쿨리 (Sarcina ventriculi)로부터 유래한 pdc 유전자 산물을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 특징이 있다.

재조합 벡터 (예를 들어, 플라스미드, 파지, 파지미드, 바이러스, 코스미드 또는 다른 정제된 핵산 벡터)는, 이 재조합 벡터가 유래한 천연 핵산 분자에 포함된 핵산 서열보다 많거나, 적거나 또는 이와 다르게 핵산 서열을 함유하도록 변화, 변형 또는 조작될 수 있다.

유리하게는, 재조합 벡터는 pdc 유전자를 포함하거나, 또는 본원에 정의된 프로모터 서열, 종결자 서열 및(또는) 인공 리보솜 결합 부위 (RBS)와 같은 조절 서열과 작동가능하게 연결된 상기 pdc 유전자를 포함하는 재조합 핵산 분자를 포함한다.

통상적으로, pdc 유전자는 뉴클레오티드 서열의 발현 (예를 들어, 증진된, 증가된, 구성적, 기본적, 감쇠된 또는 억제된 발현), 유리하게는 (예를 들어, 재조합 핵산 분자가 본원에 정의된 재조합 벡터에 포함되어 미생물 내로 도입될 때) 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 유전자 산물의 발현을 가능하게 하는 방식으로 조절 서열(들)과 작동가능하게 연결되어 있다.

조절 서열은 다른 핵산 서열의 발현에 영향을 미치는 (예를 들어, 변화시키 거나 조절하는) 핵산 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 조절 서열은 이 조절 서열 및 목적 유전자가 자연계에서 보여지는 것과 같이 상기 조절 서열 및 목적 유전자에 대해 관찰된 대로 특정 목적 유전자에 대해 유사하거나 동일한 위치 및(또는) 방향으로, 예를 들어 천연 위치 및(또는) 방향으로 재조합 핵산 분자 또는 재조합 벡터에 포함된다. 예를 들어, 목적 유전자는 천연 생물체에서 상기 목적 유전자를 포함하거나 그 유전자에 인접한 조절 서열과 작동가능하게 연결된 (예를 들어, "천연" 프로모터와 같은 "천연" 조절 서열과 작동가능하게 연결된) 재조합 핵산 분자 또는 재조합 벡터에 포함될 수 있다. 별법으로, 목적 유전자는 천연 생물체에서 다른 (예를 들어, 상이한) 유전자를 포함하거나 그 유전자에 인접한 조절 서열과 작동가능하게 연결된 재조합 핵산 분자 또는 재조합 벡터에 포함될 수 있다. 별법으로, 목적 유전자는 다른 생물체로부터 유래한 조절 서열과 작동가능하게 연결된 재조합 핵산 분자 또는 재조합 벡터에 포함될 수 있다. 예를 들어, 다른 미생물로부터 유래한 조절 서열 (예를 들어, 다른 박테리아 조절 서열 및 박테리오파지 조절 서열 등)이 특정한 목적 유전자와 작동가능하게 연결될 수 있다.

한 실시양태에서, 조절 서열은 천연 상태가 아닌, 또는 자연 발생적인 것이 아닌 서열 (예를 들어, 화학적으로 합성된 서열을 비롯하여, 변형, 돌연변이화, 치환, 유도체화, 결실된 서열)이다. 유리한 조절 서열로는 프로모터, 인핸서, 종결 신호, 항-종결 신호 및 기타 발현 조절 요소 (예를 들어, 억제인자 또는 유도인자가 결합하는 서열, 및(또는) 전사된 mRNA 등에서 전사 및(또는) 번역 조절 폴리펩티드의 결합 부위)가 있다. 그러한 조절 서열은, 예를 들어 문헌 [Sambrook, J., Fritsh, E. F., and Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd, ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989]에 기재되어 있다. 조절 서열에는 미생물에서 뉴클레오티드 서열의 구성적 발현을 지시하는 서열 (예를 들어, 구성적 프로모터 및 강력한 구성적 프로모터); 미생물에서 유도가능한 발현을 지시하는 서열 (예를 들어, 유도가능한 프로모터, 예컨대 크실로스 유도가능 프로모터); 및 미생물에서 뉴클레오티드 서열의 발현을 감쇠시키거나 억제하는 서열 (예를 들어, 감쇠 신호 또는 억제인자 서열)이 포함된다. 또한, 조절 서열을 제거하거나 결실시킴으로써 목적 유전자의 발현을 조절하는 것도 본 발명의 범위 내에 있다. 예를 들어, 전사의 부정적 조절에 관여하는 서열을 제거하여 목적 유전자의 발현을 증진시킬 수 있다.

한 실시양태에서, 본 발명의 재조합 핵산 분자 또는 재조합 벡터는 프로모터 또는 프로모터 서열과 작동가능하게 연결된, 하나 이상의 박테리아 pdc 유전자 산물을 코딩하는 핵산 서열 또는 유전자를 포함한다. 본 발명의 유리한 프로모터로는 천연 프로모터, 대리 프로모터 및(또는) 박테리오파지 프로모터가 있다. 한 실시양태에서, 프로모터는 일상적인 (housekeeping) 생화학적 유전자와 연관된 프로모터이거나, 또는 에탄올생산 경로와 연관된 프로모터이다. 다른 실시양태에서, 프로모터는 박테리오파지 프로모터이다. 다른 프로모터로는 tef (번역 신장 인자 (TEF) 프로모터) 및 pyc (피루베이트 카르복실라제 (PYC) 프로모터)가 있으며, 이들은 바실러스 (Bacillus) (예를 들어, 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis))에서 높은 수준의 발현을 촉진한다. 그람 양성 미생물에서 사용하기 위한 부가의 유리한 프로모터로는, 예를 들어 amyE 프로모터 또는 파지 SP02 프로모터가 있으나, 이것으로 한정되지는 않는다. 그람 음성 미생물에서 사용하기 위한 부가의 유리한 프로모터로는, 예를 들어 tac, trp, tet, trp-tet, lpp, lac , lpp-lac, lacIq, T7, T5, T3, gal, trc, ara, SP6, λ-P _R 또는 λ-P _L 이 있으나, 이것으로 한정되지는 않는다.

다른 실시양태에서, 본 발명의 재조합 핵산 분자 또는 재조합 벡터에는 종결인자 서열 또는 종결인자 서열들 (예를 들어, 전사 종결인자 서열)이 포함된다. 통상적으로, 종결인자 서열은 유전자의 전사를 종결시키는 조절 서열을 가리킨다. 종결인자 서열 (또는 탠덤 전사 종결인자)는 또한 뉴클레아제 등으로부터 mRNA를 안정화시킬 수 있다 (예를 들어, mRNA에 구조를 부여함으로써).

또다른 실시양태에서, 본 발명의 재조합 핵산 분자 또는 재조합 벡터에는 상기 서열을 함유하는 벡터를 검출할 수 있게 해주는 서열 (즉, 검출가능하고(하거나) 선별가능한 마커)이 포함되며, 그 예로는 영양요구성 돌연변이를 극복하는 서열, 예컨대 ura3 또는 ilvE, 형광 마커, 및(또는) 발색성 마커 (예를 들어, lacZ/β-갈락토시다제), 및(또는) 항생물질 내성 유전자 (예를 들어, bla 또는 tet)가 있다.

본 발명의 임의 pdc 유전자는 하나 이상의 에탄올 생산성 유전자 (예를 들어, 알콜 데히드로게나제 (즉, adh)) 및(또는) 당의 발효 또는 발효 이후 당의 분해에 적합한 유전자를 포함하는 벡터 내에 도입될 수 있다 (예를 들어, 미국 특허 제5,821,093호, 제5,482,846호, 제5,424,202호, 제5,028,539호, 제5,000,000호, 제5,487,989호, 제5,554,520호 및 제5,162,516호의 실시예 8 및 9 참조). 그러한 2개 이상의 유전자는 개별적인 조절 인자 (예를 들어, 프로모터), 공통의 조절 인자(들), 천연 조절 인자(들) 또는 이들의 조합을 이용하여 독립적으로 발현될 수 있다.

IV. 단리된 폴리펩티드

본 발명의 다른 측면은 단리된 폴리펩티드 (예를 들어, 단리된 에탄올 생산성 유전자, 예컨대 피루베이트 데카르복실라제 (PDC))를 특징으로 한다. 한 실시양태에서, PDC 폴리펩티드는 재조합 DNA 기술에 의해 생산되며, 표준 폴리펩티드 정제 기술을 이용한 적당한 정제 계획에 의해 본 발명의 미생물로부터 단리될 수 있다. 다른 실시양태에서, 폴리펩티드는 표준 펩티드 합성 기술을 이용하여 화학적으로 합성된다.

단리된 또는 정제된 폴리펩티드 (예를 들어, 단리된 또는 정제된 PDC)는 폴리펩티드가 유래한 미생물로부터의 세포성 물질 또는 기타 오염 폴리펩티드가 실질적으로 없는 것이거나, 또는 화학적으로 합성되는 경우에 화합물 전구체 또는 기타 화합물이 실질적으로 없는 것이다. 한 실시양태에서, 단리된 또는 정제된 폴리펩티드는 약 30％ (건중량 기준) 미만의 오염 폴리펩티드 또는 화합물을 갖고, 보다 유리하게는 약 20％ 미만의 오염 폴리펩티드 또는 화합물을 갖고, 보다 더 유리하게는 약 10％ 미만의 오염 폴리펩티드 또는 화합물을 가지며, 가장 유리하게는 약 5％ 미만의 오염 폴리펩티드 또는 화합물을 갖는다.

한 실시양태에서, PDC 폴리펩티드 또는 유전자 산물은 그람-양성 또는 그람-음성 박테리아로부터 유래한 것이다. 유리하게는, PDC 폴리펩티드 또는 유전자 산물은 글루코노박터 (Gluconobacter), 리조비움 (Rhizobium), 브라디리조비움 (Bradyrhizobium), 알칼리게네스 (Alcaligenes), 로도박터 (Rhodobacter), 로도코커스 (Rhodococcus), 아조스피릴룸 (Azospirillum), 로도스피릴룸 (Rhodospirillum), 스핑고모나스 (Sphingomonas), 부르콜데리아 (Burkholderia), 데술포모나스 (Desulfomonas), 게오스피릴룸 (Geospirillum), 숙시노모나스 (Succinomonas), 에어로모나스 (Aeromonas), 쉬와넬라 (Shewanella), 할로크로마티움 (Halochromatium), 시트로박터 (Citrobacter), 에세리치아 (Escherichia), 클레브시엘라 (Klebsiella), 자이모모나스 (Zymomonas) (예를 들어, 자이모모나스 모빌리스 (Zymomonas mobilis)), 자이모박터 (Zymobacter) (예를 들어, 자이모박터 팔매 (Zymobacter palmae)) 및 아세토박터 (Acetobacter) (예를 들어, 아세토박터 파스퇴리아누스 (Acetobacter pasteurianus))로 구성된 군으로부터 선택된 그람-음성 미생물로부터 유래한 것이다.

다른 실시양태에서, PDC 폴리펩티드 또는 유전자 산물은 피브로박터 (Fibrobacter), 아시도박터 (Acidobacter), 박테로이데스 (Bacteroides), 스핑고박테리움 (Sphingobacterium), 악티노마이세스 (Actinomyces), 코리네박테리움 (Corynebacterium), 노카르디아 (Nocardia), 로도코커스 (Rhodococcus), 프로피오니박테리움 (Propionibacterium), 비피도박테리움 (Bifidobacterium), 바실러스 (Bacillus), 게오바실러스 (Geobacillus), 패니바실러스 (Paenibacillus), 술포바 실러스 (Sulfobacillus), 클로스트리디움 (Clostridium), 안에어로박터 (Anaerobacter), 유박테리움 (Eubacterium), 스트렙토코커스 (Streptococcus), 락토바실러스 (Lactobacillus), 류코노스톡 (Leuconostoc), 엔테로코커스 (Enterococcus), 락토코커스 (Lactococcus), 써모비피다 (Thermobifida), 셀룰로모나스 (Cellulomonas) 및 사르시나 (Sarcina) (예를 들어, 사르시나 벤트리쿨리 (Sarcina ventriculi))로 구성된 군으로부터 선택된 그람-양성 미생물로부터 유래한 것이다. 유리하게는, 유전자 산물이 그람-음성 박테리아인 자이모박터 팔매 (Zymobacter palmae), 아세토박터 파스퇴리아누스 (Acetobacter pasteurianus), 및 그람-양성 박테리아인 사르시나 벤트리쿨리 (Sarcina ventriculi)로 구성된 군으로부터 선택된 미생물로부터 유래한 것이다.

자연 발생의 유전자에 의해 코딩되는, 자이모박터 팔매 (Zymobacter palmae), 아세토박터 파스퇴리아누스 (Acetobacter pasteurianus) 또는 사르시나 벤트리쿨리 (Sarcina ventriculi)로부터 유래한 폴리펩티드 또는 유전자 산물인 PDC 폴리펩티드 또는 유전자 산물도 본 발명의 범위 내에 포함된다. 또한, 자연 발생의 박테리아 유전자 및(또는) 자이모박터 팔매 (Zymobacter palmae), 아세토박터 파스퇴리아누스 (Acetobacter pasteurianus) 또는 사르시나 벤트리쿨리 (Sarcina ventriculi) 유전자 (예를 들어, pdc)와는 다른 박테리아로부터 유래한 폴리펩티드 또는 유전자 산물, 예를 들어 돌연변이화, 삽입 또는 결실된 핵산이지만 본 발명의 자연 발생 유전자 산물 (예를 들어, 피루베이트 데카르복실라제 활성을 포함)과 실질적으로 유사한 폴리펩티드를 코딩하는 유전자의 산물도 본 발명의 범위 내에 포함된다.

예를 들어 당업자는, 유전자 코드의 다의성 (degeneracy)으로 인해 자연 발생의 유전자에 의해 코딩되는 것과 동일한 아미노산을 코딩하는 핵산으로 돌연변이화 (예를 들어, 치환)시킬 수 있음을 이해할 것이다. 이는 특정 생물체에서 발현될 핵산의 코돈 이용도를 향상시키기 위해 바람직할 수 있다. 더욱이, 당업자는 보존적 아미노산 치환을 코딩하는 핵산으로 돌연변이화 (예를 들어, 치환)시킬 수 있음을 이해할 것이다. 또한, 당업자는 자연 발생의 유전자 산물에 비해 실질적으로 유전자 산물의 기능 (예를 들어, 데카르복실라제 활성)에 영향을 미치지 않으면서 특정한 정도로 아미노산을 치환, 부가 또는 결실시킬 수 있음을 이해할 것이며, 이러한 각각의 경우는 본 발명의 범위 내에 포함된다. 데카르복실라제 활성 및, 예를 들어 효소/기질 친화도, 효소의 열안정성 및(또는) 다양한 pH에서의 효소 활성은 본원에 기재된 분석법을 이용하여 용이하게 측정할 수 있다.

한 실시양태에서, 본 발명의 단리된 폴리펩티드 (예를 들어, 단리된 PDC 폴리펩티드와 같은 단리된 피루베이트 데카르복실라제 효소)는 서열 2, 서열 4, 서열 6 또는 서열 8에 나타낸 아미노산 서열을 갖는다. 다른 실시양태에서, 본 발명의 단리된 폴리펩티드는 서열 2, 서열 4, 서열 6 또는 서열 8에 기재된 하나 이상의 폴리펩티드에 대한 상동체이다 (예를 들어, 서열 2, 서열 4, 서열 6 또는 서열 8의 아미노산 서열과 약 30-40％ 이상, 유리하게는 약 40-50％ 이상, 보다 유리하게는 약 50-60％ 이상, 보다 더 유리하게는 약 60-70％ 이상, 70-80％ 이상, 80-90％ 이상, 90-95％ 이상 또는 그 이상의 동일하며, 각각 서열 2, 서열 4, 서열 6 또는 서 열 8의 아미노산에 의해 코딩되는 폴리펩티와 실질적으로 유사한 활성을 지님).

2개의 아미노산 서열 또는 2개의 핵산 서열의 동일성 비율을 결정하기 위해, 서열들을 최적 비교 목적으로 (예를 들어, 제2 아미노산 또는 핵산 서열과의 최적 정렬을 위해 제1 아미노산 또는 핵산 서열에 갭 (gap)을 도입할 수 있음) 정렬한다. 제1 서열의 소정 위치에 제2 서열의 상응하는 위치와 동일한 아미노산 또는 뉴클레오티드가 나타나면, 이들 분자는 그 위치에서 동일한 것이다. 2개 서열들 사이의 동일성 비율은 그 서열들이 공유하는 동일한 위치들의 개수에 대한 함수 (유리하게는 최적 정렬을 생성하기 위해 필요한 상기 갭의 개수 및 갭의 크기를 고려함)이다 (즉, 동일성 (％) = 동일한 위치의 개수/위치의 총 개수 ×100).

2개의 서열 사이의 서열 비교 및 동일성 비율 결정은 수학적 연산법을 이용하여 달성할 수 있다. 서열 비교에 이용되는 수학적 연산법의 구체적이고 비제한적인 예로는 문헌 [Karlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-77]에서와 같이 변형된 카를린 및 알츠컬의 연산법 (Karlin and Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-68)이 있다. 이러한 연산법은 문헌 [Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10]의 NBLAST 및 XBLAST 프로그램 (버전 2.0)에 포함되어 있다. BLAST 뉴클레오티드 검색은 NBLAST 프로그램, 스코어 = 100, 워드길이 = 12으로 수행하여, 본 발명의 핵산 분자와 상동성인 뉴클레오티드 서열을 수득할 수 있다. BLAST 폴리펩티드 검색은 XBLAST 프로그램, 스코어 = 50, 워드길이 = 3으로 수행하여, 본 발명의 폴리펩티드 분자와 상동성인 아미노산 서열을 수득할 수 있다. 비교 목적의 갭허용 (gapped) 정렬을 수득하기 위해, 갭허용 BLAST를 문헌 [Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Research 25(17):3389-3402]에 기재된 바와 같이 이용할 수 있다. BLAST 및 갭허용 BLAST 프로그램을 이용할 때, 관련 프로그램 (예를 들어, XBLAST 및 NBLAST)의 디폴드 파라미터를 이용할 수 있다 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov 참조). 서열 비교에 이용하기 위한 수학적 연산법의 구체적이고 비제한적인 다른 예로는 마이어스 및 밀러의 연산법 (Myers and Miller (1988) Comput Appl Biosci. 4:11-17)이 있다. 그러한 연산법은 GENESTREAM 네트워크 서버 (IGH Montpellier, FRANCE) 또는 ISREC 서버 등에서 입수가능한 ALIGN 프로그램에 포함되어 있다. 아미노산 서열 비교를 위해 ALIGN 프로그램을 이용하는 경우, PAM120 중량 잔기 표, 갭 길이 패널티 12, 및 갭 패널티 4를 이용할 수 있다.

다른 실시양태에서, 2개의 아미노산 서열 사이의 동일성 비율은 Blossom 62 매트릭스 또는 PAM250 매트릭스, 갭 중량 12, 10, 8, 6 또는 4, 및 길이 중량 2, 3 또는 4를 이용한 GCG 소프트웨어 패키지의 GAP 프로그램을 이용하여 결정할 수 있다. 또다른 실시양태에서, 2개의 핵산 서열 사이의 상동성 비율은 갭 중량 50 및 길이 중량 3을 이용한 GCG 소프트웨어 패키지의 GAP 프로그램 (http://www.gcg.com에서 입수가능함)을 이용하여 결정할 수 있다.

상기 단리된 PDC 폴리펩티드에 기초하여, 본원에 기재된 표준 기술을 이용하여 PDC 폴리펩티드 또는 그의 일부에 대한 면역특이적 항체를 생성할 수 있다.

V. 사용 방법

아세트알데히드의 생산 방법

원하는 산물로서 아세트알데히드를 청결하고 효율적으로 생산하는 것은 공업 분야 및 산업 분야에 널리 알려져 있다. 예를 들어, 아세트알데히드는 아세트산, 향미료, 식품, 음료수, 향수, 플라스틱 또는 아닐린 염료의 생산, 합성 고무 제조, 거울의 은 도금, 젤라틴 섬유 경화, 및 실험실 연구에 사용된다. 또한, 아세트알데히드는 발효 등을 통한 에탄올 생산에 있어서의 기질로서 작용한다.

따라서, 본 발명은 본 발명의 PDC 효소를 사용하여 기질 (예를 들어, 피루베이트 또는 피루베이트 유사체)을 아세트알데히드로 전환시키는 방법을 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 본원에 기재된 pdc 유전자 및 유전자 산물 (PDC)을 발현하는 미생물 (예를 들어, 재조합 미생물)을 이용하여 피루베이트로부터 아세트알데히드를 생산하는 방법을 제공한다. 또한, 상기 방법은 아세트알데히드 또는 그의 유사체로 전환 또는 탈카르복시화될 수 있는 피루베이트 또는 그의 전환가능한 유사체를 생산하는 생물학적 과정 (예를 들어, 형질전환 또는 전환)을 포함한다.

본 발명의 방법은 본 발명의 pdc 유전자 및 유전자 산물, 및 임의로는 하나 이상의 에탄올 생산성 유전자를 발현하는 미생물을, 아세트알데히드 (또는 그의 유사체)가 생산되는 조건 하에서 당, 피루베이트로 전환될 수 있는 탄소 골격, 피루베이트, 또는 이들의 유사체와 접촉시키는 것을 포함한다.

본 발명의 다른 실시양태에서, 상기 언급한 미생물은 상기 전환 반응을 수행하기 위한 효소 용균액으로 가공될 수도 있다. 또다른 실시양태에서, pdc 유전자 산물은 전환 반응을 수행하기 위해 본원에 기재된 바와 같이 정제된다.

전환 반응에 사용되는 미생물(들) 및(또는) 효소들 (예를 들어, 용균액 형 태, 부분 정제된 형태, 또는 정제된 형태)은 이들이 의도한 기능 (예를 들어, 아세트알데히드와 같은 원하는 화합물의 생산)을 수행할 수 있는 형태이다. 미생물은 전세포일 수도, 또는 원하는 최종 결과를 얻기 위해 필수적인 세포 부분들만으로 이루어진 것일 수도 있다. 미생물은 현탁 (예를 들어, 완충 용액 또는 배지와 같은 적당한 용액 중에), 세정 (예를 들어, 미생물 배양용 배지가 없도록 세정), 아세톤-건조, 고정화 (예를 들어, 폴리아크릴아미드 겔 또는 k-카라게닌을 사용하거나, 비드 및 매트릭스 등의 합성 지지체 상에), 고정, 가교결합, 또는 투과성화 (예를 들어, 기질, 중간체 또는 생성물과 같은 화합물이 보다 용이하게 투과될 수 있는 투과막 및(또는) 투과벽을 지님)될 수 있다.

또한, 정제되거나 정제되지 않은 PDC 효소 (단독, 또는 다른 에탄올 생산성 효소(들)과 함께)는 전환 반응에 사용될 수도 있다. 효소는 자신의 의도된 기능 (예를 들어, 아세트알데히드와 같은 원하는 화합물을 수득하거나, 필수 에탄올 생산성 유전자 산물의 존재시에 에탄올을 수득함)을 수행할 수 있는 형태이다. 예를 들어, 효소는 유리 형태 또는 고정화된 형태일 수 있다.

에탄올 생산 방법

본 발명의 한 실시양태에서, 상기 언급한 속성을 갖는 숙주 세포는 또한 에탄올 생산성이다. 따라서, 본 발명은 그러한 숙주 세포 (또는 그로부터 유래한 추출물/효소)를 사용한 에탄올 생산 방법을 제공한다. 또한, 숙주 세포는 복합 당류를 단당류로 상승작용적으로 분해 또는 해중합시키는 데 이용될 수도 있다. 그 후, 상기 세포는 발효에 의해 보다 단순한 당을 에탄올로 이화시킬 수 있다. 복합 당류를 보다 작은 당 잔기로 해중합시키는 과정을 수반하는 상기 과정과 그 이후의 발효를 동시 당화 및 발효 (SSF)라고 지칭한다.

통상적으로, 발효 조건은 생산자 숙주 세포 균주의 최상 생장 반응속도를 촉진하기 위한 최적 pH 및 온도를 제공하고, 배양액에 의해 생산되는 효소의 이화 조건을 제공하도록 선택된다 (Doran et al., (1993) Biotechnol. Progress. 9:533-538). 예를 들어, P2 균주와 같은 클레브시엘라 (Klebsiella)의 경우, 최적 조건은 35 내지 37℃의 온도 및 5.0 내지 5.4의 pH가 되도록 결정된다. 이러한 조건 하에서는, 외부에서 첨가된 진균류 엔도글루카나제 및 엑소글루카나제 조차도 매우 안정하여 장시간 동안 지속적으로 기능을 발휘한다. 다른 조건들은 실시예에 논의되어 있다. 더욱이, 당업자는 당업계 공지의 기술을 이용한 일상적인 실험만으로도 본 발명의 주어진 발효 조건을 최적화시킬 수 있음을 알 것이다. 예를 들어, 이 거명을 통해 본원에 참고로 포함되는 미국 특허 제5,424,202호 및 제5,916,787호를 참조할 수 있다.

본 발명은 하기 실시예에 의해 추가로 예시되며, 하기 실시예는 본 발명을 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.

실시예 전반에 걸쳐, 달리 언급하지 않는 한 하기 재료 및 방법을 이용하였다. 약어는 하기와 같다: PDC = 피루베이트 데카르복실라제; ADH = 알콜 데히드로게나제; SDS-PAGE = 나트륨 도데실 술페이트-폴리아크릴아미드 겔 전기영동; TPP = 티아민 디포스페이트; PCMS = 파라-클로로머큐리페닐-술폰산; PCMB = 파라-클로로 머큐리벤조산; DTT = 디티오트레이톨; Apa = 아세토박터 파스퇴리아누스 (Acetobacter pasteurianus); Sve = 사르시나 벤트리쿨리 (Sarcina ventriculi); Zpa = 자이모박터 팔매 (Zymobacter palmae); Zmo = 제트. 모빌리스 (Z. mobilis).

재료 및 방법

균주 및 배지 - 제트. 팔매 (Z. palmae) 균주 T109 (IAM 14233, ATCC 51623)를 ATCC 1956 MY 배지 (1 리터 당 10 g 효모 추출물, 20 g 말토스, 2 g KH₂PO₄ 및 5 g NaCl)에서 26℃ (200 rpm)로 배양하였다. 에이. 파스퇴리아누스 (A. pasteurianus) 균주 NCIB8618 (ATCC 12874)을, 기존에 알려진 (3, 13) 2 부피/부피％ D-L-락테이트가 보충된 최소 배지 (pH 5.0 내지 5.5)에서 1 리터 당 1 부피/부피％의 소포제를 첨가하여 25℃로 통기 배양하였다. 이. 콜라이 (E. coli) 균주 ER1648 F^- fhuA2Δ(lacZ) r1 supE44 trp31 mcrA1272::Tn10(Tet^r ) his-1 rpsL104 (Str^r)xyl-7 mtl-2 metB1 Δ(mcrC-mrr)102::Tn10(Tet^r) (New England Biolabs, Beverly, MA), DH5α F^- recA1 endA1 hsdR17(r_k ^- m_k ⁺) supE44 thi-1 gyrA relA1 (Life Technologies, Rockville, MD), BL21-CodonPlus-RIL F^- ompT hsdS(r_B ^- m_B ^-) dcm ⁺ Tet^r galλ (DE3) endA Hte [argU ileY leuW Cam^r] (이. 콜라이 (E.coli) B 균주) (Stratagene, LaJolla, CA) 및 로세타 (Rosetta) (DE3) F^- ompT hsdS _B (r_B ^-M_B ^-) gal dcm lacY1 (pRARE) (Novagen, Madison, WI)를 재조합 DNA 실험에 사용하였다. 이. 콜라이 (E. coli) 균주들은 루리아-베르타니 (LB) 배지에서 37℃ (200 rpm)로 배양하였다. 배지에 2 중량/부피％ 글루코스, 및 앰피실린 (리터 당 100 mg), 카나마이신 (리터 당 100 mg) 및 클로람페니콜 (리터 당 30 mg)을 비롯한 항생물질을 필요에 따라 보충하였다.

DNA 단리 및 클로닝 - 바이오라드사 (BioRad; Hercules, CA)에서 시판하는 퀀텀 프렙 플라스미드 미니프렙 킷트 (Quantum Prep Plasmid Miniprep Kit)를 이용하여 플라스미드 DNA를 단리하였다. 퀴아젠사 (Qiagen; Valencia, CA)에서 시판하는 퀴아퀵 겔 추출 킷트 (QIAquick gel extraction kit)를 이용하여, 1X TAE 완충액 (40 mM Tris 아세테이트, 2 mM EDTA, pH 8.5)으로 0.8％ 시켐 (SeaKem) GTG 아가로스 (FMC Bioproducts, Rockland, ME) 겔로부터 DNA 단편을 용출하였다. 게놈 DNA는 하우드 및 커팅 (Harwood and Cutting)의 문헌 (17)에 기재된 방법을 이용하여 단리하였다.

제트. 팔매 ( Z. palmae )의 DNA 및 폴리펩티드 서열 분석 - 생어 (Sanger)의 디데옥시 방법 (42)으로 LICOR 서열분석기 (DNA Sequencing Facility, Department of Microbiology and Cell Science, University of Florida)를 이용하여 플라스미드를 서열분석하였다. Genpro 5.0 (Hoefer Scientific, San Francisco, CA), ClustalW 버전 1.81 (46), Treeview 버전 1.5 (39) 및 MultiAln (12)을 이용하여 DNA 및 폴리펩티드 서열을 정렬 및 비교하였다. 추정 아미노산 서열을, BLAST 네트워크 서버를 이용하는 국립 생명공학 정보 센터 (National Center for Biotechnology Information; Bethesda, MD)의 진뱅크, EMBL 및 스위스프롯에서 유래한 폴리펩티드 서열과 비교하였다.

PDC 폴리펩티드의 정제 - PDC 정제는 표 2에 제시된 바와 같이 수행하였다. 모든 절차는 실온에서 수행하였으며, 모든 정제 완충액은 달리 지시되지 않는 한 1 mM TPP 및 1 mM MgCl₂를 함유하였다. 에스. 벤트리쿨리 (S. ventriculi) PDC는 기존에 알려진 바와 같이 (45) 재조합 이. 콜라이 (E. coli) BL21-CodonPlus-RIL (pJAM419) 및 로세타 (DE3)(pRARE, pJAM419)로부터 정제하였다. 제트. 모빌리스 (Z. mobilis) PDC는, 제트. 모빌리스 (Z. mobilis) PDC의 경우에 0.22 내지 0.32 M NaCl에서 Q-세파로스 (Q-Sepharose)로부터 용출한 것을 제외하고는 하기 기재되는 제트. 팔매 (Z. palmae) PDC의 경우와 같이 열처리, Q-세파로스 및 슈퍼덱스 (Superdex) 200 절차를 이용하여 재조합 이. 콜라이 (E. coli) DH5α (pLOI276) (11)로부터 정제하였다.

(i) 제트. 팔매 (Z. palmae) PDC의 정제 - 제트. 팔매 (Z. palmae) 및 이. 콜라이 (E. coli) DH5α (pJAM3440) 세포를 정지기까지 배양하여 10,000 X g (10분, 4℃)로 원심분리하여 수확하였다. 세포 (습윤 중량 12 내지 15 g)를, 1 mM TPP 및 1 mM MgCl₂를 함유하는 6배 부피의 50 mM 인산나트륨 완충액 (pH 6.5) (완충액 A) 중에 재현탁하고, 1 평방인치 당 20,000 lb로 냉각 프렌치 프레서 셀 (French pressure cell)을 통과시켰다. 16,000 X g (20분, 4℃)로 원심분리하여 세포 잔해를 제거하였다. 세포 용균액을 60℃로 30분 동안 가열하고, 얼음 상에서 15분 동안 냉각시킨 후, 16,000 X g (4℃에서 30분)로 원심분리하여 변성된 폴리펩티드를 제거하였다. 50 mM 완충액 A로 평형화된 하이로드 (HiLoad) Q-세파로스 26/10 컬럼 (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ)에 상층액을 로딩하였다. 컬럼을 50 mM 완충액 A 200 ml로 세척하고, 4.0 ml/분의 유속으로 400 ml의 선형 0-1 M NaCl 구배를 적용하였다. PDC 활성의 피크는 0.4 내지 0.5 M NaCl에서 용출되었으며, 이를 수집하였다. 150 mM NaCl 및 10％ 글리세롤을 함유하는 50 mM 완충액 A로 평형화된 슈퍼덱스 200 10/30 컬럼 (Amersham Pharmacia Biotech) 상에 0.2 ml/분의 유속으로 분취액 (0.5 ml)을 주입하여, 이. 콜라이 (E. coli)로부터의 재조합 제트. 팔매 (Z. palmae) PDC를 균일하게 정제하였다.

제트. 팔매 (Z. palmae)로부터 "천연" PDC를 정제하는 것은 추가의 단계를 필요로 하였다. 열처리된 용균액을, 10 mM 완충액 A로 평형화된 히드록시아파타이트 CHT5-1 컬럼 (BioRad)에 로딩하였다. 컬럼을 10 mM 완충액 A 30 ml로 세척하고, 0.5 ml/분의 유속으로 30 ml의 선형 10 mM-1 M 인산나트륨 구배를 적용하였다. PDC 활성의 피크는 0.45 내지 0.5 M 인산나트륨에서 용출되었으며, 이를 수집하였다. 상기 설명한 바와 같이 슈퍼덱스 200 10/30 컬럼을 이용하여 분취액을 추가로 정제하였다. 고형 황산암모늄을 합해진 활성 분획에 1 M이 되도록 첨가한 후, 1 M 황산암모늄을 함유하는 50 mM 완충액 A로 평형화된 페닐 세파로스 6 패스트 플로우 (Phenyl Sepharose 6 Fast Flow; low sub) 컬럼 (Amersham Pharmacia Biotech)에 로딩하였다. 15 ml 세척 후, 컬럼을 0.5 ml/분의 유속으로 15 ml의 1-0 M 황산암모늄 감소 구배를 적용하였다. "천연" PDC 활성의 피크는 0.55 내지 0.3 M의 염에 서 용출되었다.

(ii) 에이. 파스퇴리아누스 (A. pasteurianus) PDC의 정제 - 제트. 팔매 (Z. palmae) PDC에 대해 기재된 방법을 하기와 같이 변형하여, 열처리, Q-세파로스, 슈퍼덱스 200 및 히드록시아파타이트를 이용하여 에이. 파스퇴리아누스 (A. pasteurianus) 및 이. 콜라이 (E. coli) ER1648(pJAM304)로부터 PDC를 정제하였다. 세포를 1 평방인치 당 30,000 lb로 프렌치 프레서 셀을 통과시켰다. Q-세파로스 컬럼으로부터 0.17 내지 0.26 M에서 용출된 PDC 활성을 수집하여, PEG8000에 대해 투석시킨 후, 슈퍼덱스 200 컬럼에 로딩하였다.

제트. 팔매 (Z. palmae) 및 에이. 파스퇴리아누스 (A. pasteurianus) PDC는 10％ 글리세롤 중에서 활성 손실없이 액체 질소 하에 1개월까지 보관되었다. 에스. 벤트리쿨리 (S. ventriculi) 및 제트. 모빌리스 (Z. mobilis) PDC는 4℃에 보관되었다.

PDC 정량 및 효소 활성 분석 - 폴리펩티드 농도는, 소 혈청 알부민을 표준으로 하여 브래드포드 (Bradford) 시약을 이용하여 측정하였다 (BioRad). PDC 활성은 제빵용 효모의 알콜 데히드로게나제 (ADH) (Sigma- Aldrich, St. Louis, MO)를 사용하여 기존에 알려진 바와 같이 (11) 커플링 분석법으로 측정하였다. 반응 혼합물은 50 mM 시트르산나트륨 (pH 5.0) 중에 0.15 mM NADH, 5 mM MgCl₂, 0.1 mM TPP, 5 mM 피루베이트 및 10 U ADH를 함유하였으며, 달리 지시하지 않는 한 25℃에서 측정하였다. 1 유닛의 효소 활성은, 1분에 1 μmol의 아세트알데히드를 생성하 는 효소의 양으로서 정의된다.

PDC 폴리펩티드의 분자량 및 아미노산 서열 결정 - 서브유닛 분자량 및 효소 순도는 12％ 폴리아크릴아미드 겔을 이용하여 나트륨 도데실 술페이트-폴리아크릴아미드 겔 전기영동을 한 후, 이를 쿠마시 블루 (Coomassie blue) R-250으로 염색하여 측정하였다 (26). SDS-PAGE의 분자량 표준은 하기와 같았다: 포스포릴라제 b (97.4 kDa), 혈청 알부민 (66.2 kDa), 오브알부민 (45 kDa), 탄산 무수화효소 (31 kDa), 트립신 억제제 (21.5 kDa) 및 리소자임 (14.4 kDa). 천연 분자량 측정을 위해, 150 mM NaCl이 함유된 50 mM 인산나트륨 완충액 (pH 6.5)으로 평형화된 슈퍼덱스 200 10/30 컬럼에 샘플을 로딩하였다. 분자량 표준에는 혈청 알부민 (66 kDa), 알콜 데히드로게나제 (150 kDa), α-아밀라제 (200 kDa), 아포페리틴 (apoferritin) (443 kDa) 및 티로글로불린 (thyroglobulin) (669 kDa)이 포함되었다.

정제된 PDC 폴리펩티드의 N-말단 서열은 SDS-PAGE 후에 폴리펩티드를 폴리비닐리덴 디플루오라이드 막 (PVDF-PLUS; Micron Separations Inc., Westborough, MA)에 전기블롯팅하여 결정하였다. 서열은 플로리다 대학 생명공학 연구 제휴 센터의 폴리펩티드 화학 코어 퍼실러티 (Polypeptide Chemistry Core Facility of the University of Florida Interdisciplinary Center for Biotechnology Research)에서 자동화 에드만 (Edman) 분해에 의해 결정하였다.

아포효소 (apoenzyme) 제조 - 정제된 PDC (0.5 ml 당 0.75 mg)을 1.5 ml의 50 mM 인산나트륨 완충액 (pH 9.0)으로 희석하고, 센트리콘 (Centricon) YM30 농축 기 (Millipore, Bedford, MA)를 이용하여 즉시 8배로 농축하였다. 부피를 0.5 ml로 조정한 후, 폴리펩티드를 25℃에서 45분 동안 인큐베이션시켰다. 10％ 글리세롤 및 150 mM NaCl이 함유된 50 mM 인산나트륨 완충액 (pH 9.0)으로 평형화된 슈퍼덱스 200 10/30 컬럼에 로딩하여 미결합 보조인자들로부터 PDC를 정제하였다. 용출 직후, 아포효소를 50 mM 시트르산나트륨 완충액 (pH 5.0) 중에 5배로 희석하고, 4℃에 보관한 후, 16시간 내에 재구성 분석법에 사용하였다. 15％ NaOH 중의 K₃Fe(CN)₆을 이용하여 티크롬 (thichrome) 디포스페이트로 산화시킨 후, 형광에 의해 TPP를 측정하였다. 여기 및 방출 파장은 각각 375 nm 및 430 nm였다. 재구성을 위해, 아포효소 (755 ng)을 1 mM TPP 및(또는) 1 mM MgCl₂가 함유된 50 mM 시트르산나트륨 완충액 (pH 5.0) 1 ml 중에 희석하였다. 동일한 완충액 중에서 혼합물을 PDC 활성에 대해 분석하였다.

재료 - 생화학 물질은 시그마-알드리치사 (Sigma-Aldrich)에서 구입하였다. 기타 분석 등급의 유기 및 무기 화합물은 피셔 사이언티픽사 (Fisher Scientific; Atlanta, GA)에서 구입하였다. 제한 엔도뉴클레아제 및 DNA-수식 효소들은 뉴 잉글랜드 바이로랩스사 (New England BioLabs)에서 구입하였다. 디옥시제닌-11-dUTP (11개 원자의 스페이서에 의해 디옥시제닌에 커플링된 2'-데옥시우리딘-5'-트리포스페이트), 디옥시제닌에 대한 항체와 접합된 알칼리성 포스파타제, 및 콜로니 혼성화 및 플라크 혼성화용 나일론 막은 로슈 몰리큘라 바이오케미칼즈사 (Roche Molecular Biochemicals)에서 구입하였다. 서던 (Southern) 혼성화용 (+)하전 나 일론 막은 앰비온사 (Ambion; Austin, TX)에서 구입하였다.

<실시예 1>

그람-음성 박테리아인 자이모박터 팔매 (Zymobacter palmae)로부터 PDC 유전자의 동정 및 특성화

본 실시예에서는 그람-음성 박테리아인 제트. 팔매 (Z. palmae)로부터 PDC 유전자를 동정하고 특성화하는 것에 대해 기재한다.

요컨대, 정제된 단백질의 N-말단 서열에 기초한 다의성 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용하여, 자이모박터 팔매 (Zymobacter palmae)의 게놈 라이브러리로부터 피루베이트 데카르복실라제 (pdc) 오페론을 단리하였다 (도 1). 이 단편의 PstI에서 BamHI까지의 1.7 kb 서브클론 (pJAM3440)은 재조합 이. 콜라이 (E. coli)에서 PDC 활성에 필요한 것으로 밝혀졌다. DNA 서열에 기초하여, 추정 PDC 폴리펩티드를 코딩하는 1668 bp의 ORF (55 몰％ G+C 함량)가 이 영역에서 동정되었다 (도 1). 통상의 샤인-달가노 (Shine-Dalgarno) 서열 (GGAGG)은 번역 출발 코돈 (ATG)의 10 bp 상류에 있었다. 또한, 추정의 -35 및 -10 프로모터 (TTcACt-N₁₇-atTAAT; 여기서 N은 임의의 뉴클레오티드이며, 대문자는 박테리아의 프로모터 컨센선스와 매치됨)는 출발 코돈의 16 내지 44 bp 상류에 위치했다 (18). 번역 정지 코돈의 하류 (21 bp)에는 2개의 스템-루프 (stem-loop) 구조를 형성할 것으로 예상되는 62 bp가 있었고, 그 뒤쪽에 16 bp의 AT-풍부 영역이 있었는데, 이는 ρ-독립성 전사 종결부와 일치한다 (18). 제트. 모빌리스 (Z. mobilis), 에스. 벤트리쿨리 (S. ventriculi) 및 에이. 파스퇴리아누스 (A. pasteurianus)로부터의 유전자를 비롯한 4개의 모든 박테리아 pdc 유전자는 단일 시스트론 (monocistronic) 오페론으로부터 독립적으로 전사되는 것으로 예상되었다 (11, 40, 45).

제트. 팔매 (Z. palmae)의 추정 PDC 폴리펩티드 (ZpaPDC)는 556개의 아미노산 (N-말단 메티오닌 포함)을 함유하였으며, 무수 분자량이 60,113 Da이었다 (도 4). 이는 552개 내지 568개의 아미노산 및 59,830 내지 61,809 Da 범위의 다른 3종의 박테리아 PDC와 유사하다. 진뱅크 허가번호 AF474145가 제트. 팔매 (Z. palmae) 서열에 부여되었다.

<실시예 2>

그람-음성 박테리아인 아세토박터 파스퇴리아누스 (Acetobacter pasteurianus)로부터 PDC 유전자의 동정 및 특성화

본 실시예에서는 그람-음성 박테리아인 아세토박터 파스퇴리아누스 (Acetobacter pasteurianus)로부터 PDC 유전자를 동정하고 특성화하는 것에 대해 기재한다.

요컨대, 하우드 (Harwood) 등의 문헌 (17)에 기재된 방법을 이용하여 에이. 파스퇴리아누스 (A. pasteurianus)의 세포로부터 염색체 DNA를 단리하였다. 서던 분석을 위해, 게놈 DNA (레인 당 1 내지 2 ㎍)를 제한효소 (AatII, BamHI, ClaI, EcoRI 및 HincII)로 절단하고, 겔 전기영동 (0.8％ 아가로스)에 의해 분리한 후, 하향 모세관 작용에 의해 (+)하전 나일론 막에 옮겼다. 1％ 블로킹 시약, 0.1％ N-라우로일사르코신 및 0.02％ 나트륨 도데실 술페이트 (SDS)를 함유하는 5X SSC (1X SSC는 0.15 M NaCl 및 0.015 M 시트르산나트륨임) 중에서 60℃로 2시간 동안 막을 평형화시켰다. 무작위 (random) 프라이머를 사용하고 제트. 모빌리스 (Z. mobilis) pdc 유전자의 0.7 kb KpnI 단편을 주형으로 사용하여, 프로브를 디옥시제닌-11-dUTP로 표지하였다. 표지된 프로브 (1 ng/ml)를 첨가한 후, 막을 60℃에서 14시간 동안 인큐베이션시키고, 2X SSC 및 0.1％ SDS를 함유하는 용액으로 2회 세척 (1회 세척 당 5분)한 후, 0.5X SSC 및 0.1％ SDS를 함유하는 용액으로 2회 세척 (60℃에서 1회 세척 당 15분)하였다. 신호는 X-선 필름을 이용한 화학발광에 의해 가시화하였다.

에이. 파스퇴리아누스 (A. pasteurianus) 염색체 DNA의 5 내지 7 kb AatII 단편을 이용하여 서브-게놈 라이브러리를 생성하였다. 돌출부를 벤트 DNA 중합효소로 평활말단으로 전환시켜, pLITMUS28의 평활화 (벤트 DNA 중합효소) 및 탈인산화 (송아지 장 알칼리성 포스파타제)된 XhoI 부위에 라이게이션시켰다. 형질전환 후, 재조합체를 서던 분석과 유사한 조건을 이용하여 스크리닝함으로써, 전장의 pdc 및 aldI 유전자를 함유하는 플라스미드 pJAM301을 단리하였다 (도 2).

이어서, pJAM301의 에이. 파스퇴리아누스 (A. pasteurianus) DNA 단편 (4.2 kb)을 서브클로닝 (도 2)하고, LICOR 서열분석기 (DNA Sequencing Facility, Department of Microbiology and Cell Science, University of Florida)를 이용하여 생어 디데옥시 방법 (42)으로 서열분석하였다. 이 서열에 진뱅크 허가번호 AF368435가 부여되었다.

Genepro 5.0 (Riverside Scientific, Seattle, WA), ClustalW 버전 1.81 (Thompson et al., 1994), Treeview 버전 1.5 (Page, 1996) 및 MultiAln (Corpet, 1988)을 이용하여 DNA 및(또는) 폴리펩티드 서열을 정렬 및 비교하였다. 추정 아미노산 서열을, BLAST 네트워크 서버를 이용하는 국립 생명공학 정보 센터 (National Center for Biotechnology Information; Bethesda, MD)의 진뱅크, EMBL 및 스위스프롯에서 입수가능한 폴리펩티드 서열과 비교하였다.

제트. 모빌리스 (Z. mobilis)로부터 유래한 피루베이트 데카르복실라제 (pdc) 유전자의 단편을 DNA-혼성화 프로브로서 사용하여, 에이. 파스퇴리아누스 (A. pasteurianus) 게놈 DNA로부터 G+C 함량이 58.5％인 6,337 bp AatII 단편을 단리하였다 (도 2). DNA 서열의 블라스트 분석에 기초하여, pdc 유전자를 동정하였다. 이 유전자는 pI 계산치가 5.49이고 무수 분자량이 58,873 Da인 548개 아미노산 (N-말단의 포르밀-메티오닌 포함)의 폴리펩티드를 코딩하는 것으로 예측되었다 (도 5). pdc 유전자의 코돈 이용도를, 다른 2종의 박테리아인 제트. 모빌리스 (Z. mobilis) (11, 34, Reynen and Sahm, J Bacteriol. 170:3310-3313 (1988)) 및 에스. 벤트리쿨리 (S. ventriculi) 뿐만 아니라, 이. 콜라이 (E. coli) K-12 게놈과 비교하였다 (표 1). 에이. 파스퇴리아누스 (A. pasteurianus) pdc 유전자의 높은 G+C 함량 (60.4％)과 일치하게, Glu, His 및 Tyr에 대한 것을 제외하고는 코돈의 세번째 위치의 염기에는 C 및(또는) G가 우선적이었다 (표 1). 이는 G+C 함량이 낮아 코돈 이용도가 상이한 제트. 모빌리스 (Z. mobilis) (52.4％) 및 에스. 벤트리쿨리 (S. ventriculi) (30.9％)의 pdc 유전자와 대조적이었다.

에이. 파스퇴리아누스 (A. pasteurianus) pdc 유전자의 5'-말단 분석 결과, 통상의 샤인-달가노 서열이 예상 번역 출발 코돈인 GTG의 상류 8 bp에 위치함이 밝혀졌다. 또한, pdc 유전자의 상류 72 내지 101 bp는 σ⁷⁰-의존성 프로모터에 대한 유박테리아의 -35 및 -10 컨센서스 서열과 높은 동일성을 나타냈다. pdc 번역 정지 코돈의 바로 하류 (17 bp)는 일련의 예상 헤어핀 (hairpin) 루프 구조로 이루어져 있고 그 뒤쪽에 AT-풍부 영역이 있으며, 이는 pdc 전사의 ρ-독립성 종결을 나타낸다. 따라서, 에이. 파스퇴리아누스 (A. pasteurianus) pdc 유전자는 제트. 모빌리스 (Z. mobilis) (11) 및 에스. 벤트리쿨리 (S. ventriculi) pdc 유전자와 유사하게 단일 시스트론 오페론으로서 전사되는 것으로 결정되었다.

pdc로부터 다양하게 전사되는, aldI이라 명명된 오픈 리딩 프레임 (ORF)을 비롯한 추가의 ORF를 pdc 유전자 영역에서 동정하였다 (도 2). 추정의 aldI 유전자는 분자량 계산치가 38,108 Da이고 pI 계산치가 6.32인 357개 아미노산 (N-말단의 포르밀-메티오닌 포함)의 폴리펩티드를 코딩하는 것으로 예측되었다. 추정 폴리펩티드 서열 (AldI)은 Zn²⁺- 및 NAD⁺-의존성 중간-쇄 ADH 족 (클래스 III)의 구성원 (가장 두드러지게는 글루타티온-의존성 포름알데히드 데히드로게나제 (GSH-FDH); Jornvall et al., Eur. J. Biochem 167:195-201 (1987))과 매우 유사하였다. GSH-FDH 활성에 중요한 구조적 (C-92, C-95, C-98 및 C-106) 및 촉매적 (C-40, H-62 및 C-169) 아연 이온 둘 다에 대한 예상 리간드인 아미노산 잔기들은 보존적이었다. 로스만 폴드 (Rossman fold) 컨센서스 서열 (잔기 194-GLGGIG-199)도 존재하였으며, AldI이 NAD(P)⁺와 결합할 수 있음이 밝혀졌다. 예상 에이. 파스퇴리아누 스 (A. pasteurianus) AldI 폴리펩티드는 아세토박터 (Acetobacter)에서의 에탄올 산화에 필수적인 막-결합 ALD 또는 ADH 효소의 서브유닛 3개와 거의 동일성이 없었다 (Thurner et al., 1997; Kondo and Horinouchi, J Bacteriol. 177:5048-5055 (1997)). 그 대신, 이 예상 폴리펩티드는 GSH-FDH 폴리펩티드와 밀접한 진화적 연관성이 있는 것으로 결정되었다. 가장 두드러지게는, α-프로테오박테리아, 시아노박테리아인 아나바에나 아졸라 (Anabaena azolla)로부터의 GSH-FDH 효소, 및 보다 낮은 정도로는 β- 및 γ-프로테오박테리아로부터의 효소와 함께 aldI 클러스터에 의해 코딩되는 에이. 파스퇴리아누스 (A. pasteurianus) 폴리펩티드는 아스트산 박테리아의 분류학적 분류와 일치하였다.

다수 카피의 플라스미드 상에 pdc 유전자를 지니고 있는 에이. 파스퇴리아누스 (A. pasteurianus) 6.3 kb AatII 게놈 단편의 서브클론을, ADH 커플링 분석에 의해 PDC 활성에 대해 분석하였다. 유의한 양의 PDC 활성은, pdc 유전자의 124 bp 상류 및 236 bp 하류에 더하여 완전한 pdc 오픈 리딩 프레임을 갖는 플라스미드 pJAM304를 지닌 균주에서만 검출되었다 (도 2 및 도 5). 아세토박터 파스퇴리아누스 (Acetobacter pasteurianus) 서열에 진뱅크 허가번호 AR368435가 부여되었다.

<실시예 3>

그람-양성 박테리아인 사르시나 벤트리쿨리 (Sarcina ventriculi)로부터 PDC 유전자의 동정 및 특성화

본 실시예에서는 그람-양성 박테리아인 사르시나 벤트리쿨리 (Sarcina ventriculi)로부터 PDC 유전자를 동정하고 특성화하는 것에 대해 기재한다.

요컨대, 사르시나 벤트리쿨리 (Sarcina ventriculi)로부터 정제된 PDC의 N-말단 아미노산 서열에 기초하여 다의성 올리고뉴클레오티드 5'-AARGARGTNAAYGTNGARCAYATGTTYGGNGT-3' (R은 A 또는 G이고, N은 A, C, G 또는 T이며, Y는 C 또는 T임)(서열 11)를 합성하였다 (Lowe and Zeikus, 1992). 말단 트랜스퍼라제를 이용하여, 공급자 (Roche Molecular Biochemicals)의 제안에 따라 이 올리고뉴클레오티드를 디옥시제닌-11-dUTP 및 dATP로 표지하여, 에스. 벤트리쿨리 (S. ventriculi)로부터의 게놈 DNA를 스크리닝하는 데 사용하였다.

서던 분석을 위해, 게놈 DNA를 BglI, EcoRI 또는 HincII로 분해하고, 0.8％ 아가로스 전기영동에 의해 분리한 후, (+)하전 나일론 막으로 옮겼다 (Southern, 1975). 1％ 블로킹 시약 (Roche Molecular Biochemicals), 0.1％ N-라우로일사르코신 및 0.02％ SDS를 함유하는 5X SSC (1X SSC는 0.15 M NaCl 및 0.015 M 시트르산나트륨임) 중에서 58℃로 2시간 동안 막을 평형화시켰다. 프로브 (0.2 pmol/ml) 및 Poly(A) (0.01 mg/ml)를 첨가한 후, 막을 58℃에서 18.5시간 동안 인큐베이션시켰다. 막을 0.1％ SDS를 함유하는 2X SSC로 25℃에서 2회 세척 (1회 세척 당 5분)한 후, 0.1％ SDS를 함유하는 0.5X SSC로 58℃에서 2회 세척 (1회 세척 당 15분)하였다. 신호는 공급자 (Roche Molecular Biochemicals)의 지침에 따라 발색 검출을 이용하여 가시화하였다.

플라스미드 pBR322에서 서브게놈 라이브러리를 생성하기 위해, 에스. 벤트리쿨리 (S. ventriculi)의 염색체 DNA를 HincII로 분해하고, 전기영동에 의해 분획화하였다. 2.5 내지 3.5 kb의 HincII DNA 단편을 pBR322의 EcoRV 부위에 라이게이션 시켜 이. 콜라이 (E. coli) SE2309에 형질전환시켰다. 발색 검출에 의해 다의성 올리고뉴클레오티드로 콜로니를 스크리닝하였다. 이 방법에 의해, pdc 유전자의 1,350 bp를 함유하는 HincII 단편을 지닌 플라스미드 pJAM400을 단리하였다 (도 3).

람다블루스타 벡터 시스템 (λBlueSTAR Vector System; Novagen)을 이용하여, 에스. 벤트리쿨리 (S. ventriculi)로부터 유래한 전장 pdc 유전자의 단리를 촉진하기 위한 부가의 서브게놈 라이브러리를 생성하였다. 게놈 DNA를 BclI로 분해하고, 0.8％ 아가로스에서 전기영동하여 분리한 후, 6.5 내지 8.5 kb의 단편을 람다블루스타 BamHI 암 (arm)과 라이게이션시켰다. 공급자 (Novagen)의 지침에 따라 파지를 시험관내에서 패키징시키고 플레이팅하였다. pJAM400으로부터 유래한 pdc 유전자의 800 bp EcoRI 단편을 이용하여 DNA 프로브를 생성하고, 공급자 (Roche Molecular Biochemicals)의 제안에 따라 무작위 프라이밍 방법을 이용하여 디옥시제닌-11-dUTP로 표지하였다. 발색 검출을 이용하여 플라크를 스크리닝하였다. Cre-loxP-매개의 서브클로닝을 이용하여, Cre 리콤비나제 (Novagen)를 발현하는 이. 콜라이 (E. coli) BM25.8과 함께 람다블루스타 파지를 플레이팅함으로써, 양성 플라크의 DNA를 환형으로 만들었다. 이어서, 환형 플라스미드 pJAM410을 정제하여 이. 콜라이 (E. coli) DH5α로 전기천공시켰다.

pdc 발현 벡터를 생성하기 위해, 프로모터가 없는 pdc 유전자를 중합효소 연쇄 반응 (PCR)에 의해 pJAM413 (도 3)으로부터 증폭시킨 후에 pET21d로 서브클로닝하였다. 프라이머는 BspHI (올리고 1) 및 XhoI (올리고 2) 제한 부위를 이용하여 방향에 맞게 삽입되도록 디자인되었다. 생성된 단편을 pET21d (Novagen)의 적합한 NcoI 및 XhoI 부위에 라이게이션시켜 pJAM419 (도 3)를 제조하였다. pdc 유전자의 충실도 (fidelity)는 DNA 서열분석에 의해 확인하였다.

에스. 벤트리쿨리 (S. ventriculi)의 피루베이트 데카르복실라제 오페론을 결정하기 위해, 에스. 벤트리쿨리 (S. ventriculi)로부터 정제된 PDC 폴리펩티드의 N-말단 아미노산 서열 (Lowe and Zeikus, 1992)을 사용하여 게놈 DNA에 혼성화시키기 위한 다의성 올리고뉴클레오티드를 생성하였다. 이 방법은 에스. 벤트리쿨리 (S. ventriculi)로부터 유래한 7.0 kb BclI 게놈 DNA의 삽입을 용이하게 하였다. 이 단편을 추가로 서브클로닝하여, 올리고뉴클레오티드 프로브에 혼성화되는 3,886 bp의 HincII 내지 HincII 영역의 양쪽 가닥 모두를 서열분석하였다. DNA 서열을 분석한 결과, 기존에 알려진 에스. 벤트리쿨리 (S. ventriculi)의 PDC (도 6)와 N-말단이 동일한 폴리펩티드를 코딩하는 1,656 bp의 오픈 리딩 프레임 (ORF)이 밝혀졌다. 따라서, 이 ORF를 pdc라 명명하였다. 통상의 샤인-달가노 서열이 번역 출발 코돈의 7 bp 상류에 존재하였다. 또한, pdc의 상류 82 내지 110 bp 영역은 유박테리아의 -35 및 -10 프로모터 컨센서스 서열과 제한된 동일성을 나타내었다. pdc 번역 정지 코돈의 하류 (43 bp)는 스템-루프 구조를 형성할 것으로 예상되는 영역이었고, 그 뒤쪽에 AT-풍부 영역이 있었는데, 이는 ρ-독립성 전사 종결인자와 일치하는 것이다. 따라서, 에스. 벤트리쿨리 (S. ventriculi) pdc는 제트. 모빌리스 (Z. mobilis) pdc 유전자 (Conway et al., 1987)와 유사하게 단일 시스트론 오페론으로서 전사된다.

177개의 아미노산 폴리펩티드 단편 (ORF1^*)을 코딩하는, pdc의 상류 722 bp에서 부분 ORF가 동정되었다. ORF1^*은 몇몇 가상의 막 폴리펩티드 (진뱅크 허가번호 CAC11620, CAC24018, CAA22902)와 동일성 (28 내지 29％)을 나타냈으며, 몇몇 막횡단 관통 도메인을 형성할 것으로 예상되었다 (데이타는 나타내지 않음). ORF1^*을 코딩하는 유전자는 pdc 오페론의 추정 -35 및 -10 프로모터로부터 전사되는 것으로 예상되지는 않았다.

상기 연구에 기초하여, 에스. 벤트리쿨리 (S. ventriculi) pdc 유전자는 pI 계산치가 5.16이고 무수 분자량이 61,737 Da인 552개 아미노산 (N-말단 메티오닌 포함)의 폴리펩티드를 코딩하는 것으로 결정되었다. 사르시나 벤트리쿨리 (Sarcina ventriculi)의 서열에 진뱅크 허가번호 AF354297이 부여되었다.

<실시예 4>

PDC 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체의 제조 방법

본 실시예에서는 피루베이트 데카르복실라제에 대한 면역특이적 항체를 제조하는 방법에 대해 기재한다.

요컨대, 정제된 재조합 에이. 파스퇴리아누스 (A. pasteurianus) PDC 폴리펩티드 (300 ㎍)를 SDS-PAGE에 의해 분리하였다. PDC 단백질을 함유하는 겔 단편을 절개한 후, 쿠마시 블루 R-250으로 염색하였다. 공급자 (Cocalico Biologicals, Reamstown, Penn.)의 제안에 따라, 이를 토끼에서의 폴리클로날 항체 (항-ApPDC) 제조를 위한 항원으로서 사용하였다. 면역블롯 분석을 위해, 단백질을 SDS-PAGE에 의해 분리하여, 10％ 메탄올이 함유된 10 mM MES 중의 4℃에서 20 볼트로 16시간 동안 PVDF 막에 옮겼다. 항원 검출을 위해, 면역블롯 방법 및 발색 검출을 표준 기술로 수행하였다. 1차 항체인 항-ApPDC를 1:7,000으로 희석하였다. 알칼리성 포스파타제가 결합된 염소 항-토끼 2차 항체 (Fisher Biotech)를 1:7,500으로 희석하였다. 상기 방법을 이용하여, PDC 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 폴리클로날 항혈청을 동정하였다.

필요한 경우, PDC에 대한 항체 분자는 포유동물 (예를 들어, 혈액)로부터 단리될 수 있으며, 단백질 A 크로마토그래피와 같은 공지 기술에 의해 정제하여 IgG 분획을 수득할 수 있다. 또한, 면역화 후 적당한 시간에, 예를 들어 항-PDC 항체의 역가가 가장 높을 때, 대상체로부터 항체-생성 세포를 수득하여, 문헌 [Kohler and Milstein (1975) Nature 256:495-497] 및 [Using Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow et al., C.S.H.L. Press, Pub. (1999)]에 기재된 하이브리도마 기술 등과 같은 표준 기술에 의해 모노클로날 항체를 제조하는 데 이를 사용할 수 있다.

<실시예 5>

다른 숙주 세포에서 pdc 유전자의 코돈 이용도를 확인하는 방법

본 실시예에서는 코돈 이용도에 기초하여 발현이 향상된 PDC 폴리펩티드를 동정하는 방법에 대해 기재한다.

박테리아 PDC는 다양한 생물체에서 에탄올 경로를 조작하는 데 사용될 수 있다. 그러나, 이종 시스템에서의 기능적 발현을 보장하기 위해서는 적당한 코돈 이 용도 패턴을 결정하는 것이 유리하다 (4, 14, 16, 22). G+C 함량을 간략히 표로 작성하는 것이 최초 길잡이로서 작용할 수 있다. 이들 4개의 pdc 유전자에 대한 G+C 함량은 에이. 파스퇴리아누스 (A. pasteurianus)의 경우 60％에서부터 에스. 벤트리쿨리 (S. ventriculi)의 경우 31％까지이다. 이. 콜라이 (E. coli) ORF에 대한 평균 G+C 함량은 52％로, 제트. 모빌리스 (Z. mobilis)의 pdc (52％)와 동일하고 제트. 팔매 (Z. palmae)의 pdc (55％)와 유사하다. 대부분의 아미노산의 경우, 상기 2종의 생물체에 대한 코돈 이용도 패턴은 서로 매우 유사하며, 이. 콜라이 (E. coli)와도 유사하다. 제트. 팔매 (Z. palmae)의 pdc는 재조합 이. 콜라이 (E. coli)에서 높은 수준으로 기능적으로 발현된다 (활성에 기초하여 폴리펩티드의 대략 1/3). 제트. 모빌리스 (Z. mobilis)의 pdc 및 에이. 파스퇴리아누스 (A. pasteurianus)의 pdc는 보다 낮은 수준으로 발현되며 (활성에 기초하여 폴리펩티드의 7 내지 9％), 에스. 벤트리쿨리 (S. ventriculi)의 pdc는 재조합 이. 콜라이 (E. coli)에서의 발현율이 낮다 (활성에 기초하여 폴리펩티드의 0.3％ 미만) (45).

기능적 재조합 에스. 벤트리쿨리 (S. ventriculi) PDC를 다량으로 생산하기 위해, AGA (알라닌), GGA (글리신), AUA (이소루이신) 및 CUA (루이신)와 같은 희귀 코돈에 대한 부가의 tRNA 유전자를 함유하는 변형 이. 콜라이 (E. coli) 숙주를 사용하는 것은 높은 수준의 폴리펩티드 생산 (활성에 기초하여 폴리펩티드의 거의 1/4)에 있어 중요한 것으로 증명되었다 (45). 에스. 벤트리쿨리 (S. ventriculi) pdc의 코돈 이용도 패턴은, 비. 서브틸리스 (B. subtilis)의 ORF와 비교하여 예시된 바와 같이 G+C 함량이 낮은 그람-양성 박테리아에서의 에탄올 경로를 유전공학 으로 조작하는 데 있어 특히 유용하다 (표 1). 이와 반대로, 에이. 파스퇴리아누스 (A. pasteurianus)의 pdc는 써모비피다 종 (Thermobifidia sp.) (23) 또는 셀룰로모나스 종 (Cellulomonas sp.) (35)과 같은 높은 G+C 함량의 박테리아에서 호모에탄올 경로를 조작하기 위해 선택될 수 있다.

<실시예 6>

PDC 활성의 생화학적 특성화

본 실시예에서는 몇몇 대표적인 PDC 폴리펩티드의 생화학적 특성을 규명하는 것에 대해 기재한다.

4개의 대표적인 박테리아 PDC 폴리펩티드의 정제는 하기 표 2에 제시된 바와 같이 수행하였다. 제트. 팔매 (Z. palmae) 및 재조합 이. 콜라이 (E. coli)로부터 ZpaPDC를 균일하게 정제하였다. 비교를 위해, 3종의 다른 박테리아 PDC를 재조합 이. 콜라이 (E. coli)로부터 정제하였다. 또한, PDC를 에이. 파스퇴리아누스 (A. pasteurianus)로부터도 정제하였다. 일반적으로, '천연' PDC의 정제는 부가의 단계 (즉, 페닐 세파로스 및 히드록시아파타이트 크로마토그래피)를 필요로 하였다. 이는 '재조합' 세포 용균액에 비해 '천연' PDC의 활성량이 10 내지 250배 더 낮기 때문이었다. 모든 PDC 폴리펩티드는 환원성 SDS-PAGE에 의해 측정시 55 내지 60 kDa의 서브유닛 분자량을 가졌으며, 이는 추정 폴리펩티드 서열로부터 계산된 분자량과 일치하였다.

제트. 팔매 (Z. palmae)로부터 정제된 PDC의 N-말단 아미노산 서열 (MYTVGMYLAE)은 유전자로부터 추정된 서열과 동일하였으며, N-말단 메티오닌을 포함하였다. 선행 연구는 에스. 벤트리쿨리 (S. ventriculi)로부터 정제된 PDC도 리신 잔기의 아미노에 있는 N-말단 메티오닌을 가지고 있음을 입증하였다 (28, 45). 이와 반대로, 에이. 파스퇴리아누스 (A. pasteurianus)로부터 정제된 N-말단 서열 (TYTVGMYLAERL)은 N-말단 메티오닌이 결여되어 있었으며, 이는 천연 메티오닌 아미 노펩티타제에 의해 절단되었음을 의미한다. 제트. 모빌리스 (Z. mobilis)로부터 정제된 PDC도 절단되어 N-말단에 세린이 노출된 것으로 결정되었다 (34). 이들 결과는 P₁' 잔기에 의해 지시된 메티오닌 아미노펩티다제의 매우 보존적인 기질 특이성과 일치하는 것이다. N-말단 메티오닌은 두번째 아미노산이 작고 하전되지 않은 경우에만 제거된다. 이러한 기질 선호도는 폴리펩티드 분해에 대한 'N-말단 규칙' (47)과 상반된 것이다.

PDC 폴리펩티드의 3차원 구조도 결정하였다. ZmoPDC는 보조인자인 TPP 및 Mg²⁺ (15)의 제거 후에도 240 kDa의 4량체로 결합한다. 이와 유사하게, SvePDC 및 ZpaPDC도 보조인자의 분해 후에도 240 kDa의 4량체로 결합한다 (데이타는 나타내지 않음). 흥미롭게도, ApaPDC는 유사한 비활성 (specific acitvity)의 4량체 및 8량체 (224 및 447 kDa) 둘 다를 형성하며, 보조인자 추출 후에 2량체 (120 kDa)로 분해된다. ApaPDC 아포효소의 활성 및 4량체 구조는, 각각 반 포화 상수 3.1 μM 및 5.8 μM과 힐 (Hill) 상수 1.17 내지 1.22로 Mg²⁺ 및 TPP를 첨가한 후에 완전히 복구된다. 모든 4가지 박테리아 PDC에 대해 관찰된 4량체 구조는 대부분 진핵생물 PDC의 3차원 구조와 일치한다. 그러나 ApaPDC와 유사하게, 보다 고등한 구조가 섬유상 진균류인 뉴로스포라 크라사 (Neurospora crassa)로부터 유래한 PDC에서 관찰되었다 (8 내지 10 nm의 단독중합성 필라멘트로서 결합함 (1)). 이와 유사하게, 식물 (옥수수, 완두 및 맥아)에서도 PDC는 최대 1 MDa의 복합체를 형성한다 (24, 27, 32). 보조인자를 제거한 후에 ApaPDC가 2량체로 분해되는 것은 또한 진핵생물 PDC와 일치한다 (25).

<실시예 7>

PDC 열안정성의 특성화

본 실시예에서는 몇몇 대표적인 PDC 폴리펩티드의 열안정성에 대해 기재한다.

ZmoPDC는 보조인자 (TPP 및 Mg²⁺)의 존재시 세포 용균액을 가열한 후에도 열 에 안정하다는 것이 관찰되었다 (11). 이 현상을 추가로 다루기 위해, 포화된 보조인자의 존재 하에 다양한 온도에 노출시킨 후, 25℃에서 정제된 박테리아 PDC의 활성을 분석하였다 (도 7). 모든 3종의 그람-음성 PDC는 비교적 열에 안정하였으며, 60℃로 30분 동안 가열한 후에도 60 내지 100％의 활성을 보유하였다. 이와 반대로, 정제된 SvePDC는 50℃ 이상의 온도에 노출시킨 후에 완전히 불활성화되었다. 아미노산 비교가 열안정성에 대한 보편적인 지침으로서 이용될 수는 없지만 (30, 31, 48), 3종의 열안정성 PDC에는 보다 다량의 알라닌 및 시스테인과 보다 소량의 페닐알라닌이 함유됨이 관찰되었다. 이러한 변화는 상동성 효소들의 조성 비교에 기초한 열안정성 증가와 일치하였다 (2, 31). 알라닌의 양 증가는 헬릭스 구조 및 보다 치밀한 폴리펩티드 코어를 형성함으로써, 고온에서 그람-음성 PDC 폴리펩티드를 안정화시킬 수 있다. 따라서, 본 발명은 또한 상응하는 시스테인 및(또는) 알라닌 아미노산 변화를 포함하여 열안정성이 향상된 PDC 폴리펩티드를 발현하도록 변화된 pdc 유전자를 포함한다. 또한, 그람-음성 박테리아로부터 유래한 PDC의 열안정성 PDC를 분석한 결과, 이들의 최적 온도인 60℃에서 분석하는 경우가 실온에서 분석하는 경우에 비해 그 활성이 2.5배가 넘게 증가함을 밝혀냈다. 아레니우스 (Arrhenius) 플롯에 기초하여, 이들 효소는 12.6 내지 14.2 kJmol^-1의 활성화 엔탈피 및 -92.8 내지 -98.2 Jmol^-1K^-1의 엔트로피를 갖는 것으로 평가되었다.

<실시예 8>

PDC의 기질 친화도 및 최적 pH의 특성화

본 실시예에서는 몇몇 대표적인 PDC 폴리펩티드의 기질 친화도 및 최적 pH의 특성을 규명하는 것에 대해 기재한다.

구체적으로, 최적 pH의 유의한 차이가 박테리아 PDC 폴리펩티드들에 대해 관찰되었다. ZpaPDC는 pH 5.5 내지 6.0에서 가장 활성이 높았으며 (도 8), 이는 최적 pH 6.0인 ZmoPDC와 유사하였다 (34). 그러나, ApaPDC의 최적 pH는 다른 2종의 그람-음성 PDC에 대해 관찰된 것보다 상당히 낮았으며, 그 범위는 5.0 내지 5.5였다 (도 8). 그람-양성인 SvePDC에 대한 최적 pH (pH 6.3 내지 7.6)는 훨씬 더 넓은 것으로 밝혀졌고, 그람-음성 PDC보다 중성인 것으로 밝혀졌다 (28). 이는 활성 부위 또는 활성 부위 근처에서 구조 및(또는) 하전 잔기의 조성이 상이함을 나타낸다.

진핵생물 및 박테리아 SvePDC는 기질인 피루베이트의 존재시에 양성의 협동적 반응속도를 나타냈다 (9, 25, 28). 그러나, ZpaPDC 및 ApaPDC는 정상 미캘리스-멘텐 반응속도를 나타냈으며, 피루베이트에 대한 K_m값은 0.2 내지 0.4 mM이고 k_cat값은 20,500 내지 30,500 분^-1 (최적 pH, 25℃)이었다 (표 3). 이들 그람-음성 PDC 효소에서 관찰되는 피루베이트에 대한 알로스테릭 (allosteric) 조절의 결여는, 제트. 모빌리스 (Z. mobilis)로부터 유래한 관련성 높은 PDC에 대해 확립된 것과 유사하였다 (7, 34). 추가의 비교를 위해, 4종의 모든 박테리아 PDC 폴리펩티드에 대한 반응속도 상수를, 그들의 최적 pH 및 pH 7.0에서 측정하였다 (표 3). 이 방법은 높은 수준으로 에탄올을 생산하는 데 있어 기존에 사용되어 온 재 조합 숙주들 (예를 들어, 이. 콜라이 (E. coli), 에르위니아 종 (Erwinia spp.))의 중성 세포질을 보다 유사하게 반영하여 박테리아 PDC 효소를 분석하기 위해 선택하였다. 이러한 온건한 pH 변화는 모든 4종의 박테리아 PDC 폴리펩티드의 최대 반응 속도에 단지 미약한 영향만을 주었다. 이와 반대로, pH는 피루베이트에 대한 그람-음성 PDC의 친화도에 상당한 영향을 주었다. 가장 두드러지게는, ApaPDC의 pH가 최적 pH에서 중성 조건으로 이동하였을 때, K_m값이 13배가 넘게 증가하였다.

상기 결과는 3종의 모든 그람-음성 PDC가, 탈양성자화 (중성 pH)되었을 때보다 양성자화 (최적 pH)되었을 때 효소로 하여금 피루베이트와 더욱 효율적으로 결합할 수 있게 하는 아미노산 잔기(들)을 가지고 있음을 의미한다. 그러나, 이러한 잔기의 양성자화된 상태는 전반적인 탈카르복시화 속도에 영향을 주지 않는다. 그람-음성 PDC에 대한 K_m값의 변화가 5 내지 7의 pH에서 관찰되었기 때문에, 모든 3종의 효소에 대해 기질 결합을 조절하는 데 관여하는 상기 잔기는 히스티딘일 수 있 다. 유리 히스티딘에 대한 pK_a는 6.04인 반면, 피루베이트 및 다른 이온화가능한 아미노산 잔기 (즉, Asp, Glu, Lys 및 Arg)에 대한 pK_a는 상기 pH 범위에 들지 않는다.

하나 이상의 히스티딘을 양성자화시키는 것은, 피루베이트의 카르복실기와 이온쌍을 형성함으로써, 또는 활성 부위에 기질이 보다 용이하게 접근하게 함으로써 기질 결합을 촉진하는 데 중요하다. 또한, 상이한 잔기(들)이 기질 결합에 관여할 수도 있으나, 그의 pK_a는 폴리펩티드의 환경에 의해 조절된다.

제트. 모빌리스 (Z. mobilis)의 PDC 효소에 있어 k_cat와 비교한 k_cat/K_m 에 대한 pH의 영향은, 기질 결합을 조절하는 데 관여하는 잔기들에 대해 pK_a값을 6.23 내지 6.45로 예상한 적정 곡선을 이용하여 측정하였다 (21, 43). His113의 탈양성자화는 구조적 변화를 유발하는 것으로 밝혀졌으며, 그 결과 촉매 작용시 활성 부위를 덮어 씌우는 가요성 루프 (잔기 105 내지 112)가 생겨난다 (43). His113 및 His114 둘 모두는 이미 특성화된 모든 PDC 폴리펩티드에서 보존적이다. 따라서, His113은 모든 3종의 그람-음성 PDC에서 관찰된 pH-의존성 K_m 변화의 논리적인 후보이다. 그러나, 제트. 모빌리스 (Z. mobilis) PDC의 활성 부위 내로 뻗어 나오는 이온화가능한 측쇄를 갖는 5개의 중대한 잔기 (Asp27, Glu50, His113, His114 및 Glu473)를 이온화가 불가능하거나 pK_a값이 변화된 잔기들로 변형시켰다 (21). k_cat/K_m의 pH-의존성은 이러한 변형에 비교적 영향을 받지 않았으며, 이는 His113을 비롯한 이들 잔기가 관여하지 않음을 의미한다. 중요하게는, His113을 유의하게 높은 pK_a값을 갖는 잔기 (즉, Arg 및 Lys)로 변형시키는 동일한 연구 결과, 피루베이트에 대한 ZmoPDC의 친화도가 20배가 넘게 증가하였다.

이들 결과는 (+)하전된 형태의 His113이 기질 결합을 위해 활성 부위가 열린 상태로 유지시켜준다는 것을 보여준다.

<실시예 9>

상이한 생물체로부터 유래한 pdc 유전자의 비교 정렬

본 실시예에서는 상이한 생물체들로부터 유래한 피루베이트 데카르복실라제 효소 (PDC)의 아미노산 서열을 비교하고 대조하는 것에 대해 기재한다.

제트. 팔매 (Z. palmae)의 추정 PDC 폴리펩티드 (ZpaPDC)는 556개의 아미노산 (N-말단 메티오닌 포함)을 함유하였으며, 무수 분자량이 60,113 Da이었다. 이는 552개 내지 568개의 아미노산 및 59,830 내지 61,809 Da인 다른 3종의 박테리아 PDC와 유사하다. ZpaPDC의 pI 계산치는 4.93이었으며, 이는 제트. 모빌리스 (Z. mobilis)에 대해 실험적으로 측정된 pI (4.87 내지 5.3)와 유사하다 (7, 33). 상대적으로 알라닌 함량 (13.1％)이 높은 ZpaPDC는 그람-음성인 제트. 모빌리스 (Z. mobilis) 및 에이. 파스퇴리아누스 (A. pasteurianus)의 PDC (ZmoPDC 및 ApaPDC)와 필적할만 하였으나, 그람-양성인 에스. 벤트리쿨리 (S. ventriculi) PDC (SvePDC) (6.9％)보다는 거의 2배가 더 높았다. 다중 아미노산 서열 정렬 (도 9) 및 수상도 (dendrogram) 클러스터 분석 결과, ZpaPDC는 ApaPDC (72％ 동일성)와 가장 밀접하 게 연관되어 있었으며, ZmoPDC (62％ 동일성)와 높은 연관성을 나타냄이 밝혀졌다. 모든 3종의 그람-음성 PDC는 식물 PDC (예를 들어, 제아 마이즈 (Zea mays) PDC; 39 내지 40％ 동일성)와 서열 동일성을 갖는 것으로 클로스터링되었다.

이와 반대로, 그람-양성 SvePDC는 그람-음성 PDC와 단지 30 내지 31％ 동일하였으며, 대부분의 섬유상 진균류 및 효모 PDC (예를 들어, 사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae) PDC1; 38％ 동일성)와 함께 따로 분류되었다. 식물계의 PDC에 대한 공통적인 N-말단 연장은 모든 4종의 박테리아 PDC에 나타나지 않았다. 제트. 모빌리스 (Z. mobilis) 및 효모 PDC의 결정 구조에 기초하여, TPP 및 Mg²⁺ 결합에 관여하는 잔기들은 모든 4종의 박테리아 PDC에서 보존적이었다. 이와 반대로, 효모 PDC1의 잔기들 (Tyr157 및 Arg224)은 피루베이트 유사체인 피루바미드 (29)에 대한 결합에 기초하여 기질 활성화에 관여하며, 이는 박테리아 SvePDC에서만 나타나고 나머지 3종의 박테리아 PDC에서는 나타나지 않았다.

추정의 에이. 파스퇴리아누스 (A. pasteurianus) PDC 아미노산 서열을 제트. 모빌리스 (Z. mobilis) 및 효모 (PDC1) (이 둘 모두는 X-선 결정학에 의해 분석되어 있음)(Dyda et al., 1993; Arjunan et al., 1996; Lu et al., 2000; Dobritzsch et al., 1998), 및 제아 마이즈 (Zea mays)로부터 유래한 PDC 서열과 정렬하였다 (도 9). 다중 정렬 결과, 에이. 파스퇴리아누스 (A. pasteurianus) PDC가 제트. 모빌리스 (Z. mobilis) PDC (62％ 동일성 및 74％ 유사성)와 가장 유사한 것으로 밝혀졌다. 다른 식물 PDC에서 공통적인 제트 마이즈 (Z. mays) PDC의 N-말단 연장은 에이. 파스퇴리아누스 (A. pasteurianus)를 비롯한 진균류 또는 박테리아 PDC 폴리펩티드에서 관찰되지 않았다. 효모 및 제트. 모빌리스 (Z. mobilis) PDC 효소의 TPP 및 Mg²⁺ 결합 부위 0.4 nm 내에 있는 것으로 입증된 잔기들은 에이. 파스퇴리아누스 (A. pasteurianus) PDC 폴리펩티드 서열에서 매우 보존적이었다 (V24, D27, E50, T72, V75, N82, H113, H114, T384, D386, G408, I410, D435, S437, L440, I460, N462, G464, I467, E468). 또한, TPP-의존성 효소에서 동정된 모티프 (문헌 [Hawkins et al. 1989)]에서 Mg²⁺ 및 TPP 결합에 관여하는 것으로 제안됨)도 에이. 파스퇴리아누스 (A. pasteurianus) PDC 폴리펩티드 서열에서 보존적이었다 (G435 내지 N462). 알로스테릭 조절에 관여할 것으로 제안되고 피루베이트 유사체인 피루바미드에 결합하는 것으로 입증 (Lu et al., 2000)된 효모 PDC1의 잔기들 (Tyr157 및 R224)은 에이. 파스퇴리아누스 (A. pasteurianus), 제트. 모빌리스 (Z. mobilis) 또는 제트 마이즈 (Z. mays) PDC 폴리펩티드에서 보존되지 않았다. 그 대신, 이들 잔기는 대부분의 진균류 PDC에 제한되며, 기질이 활성화된 그람-양성 박테리아 에스. 벤트리쿨리 (S. ventriculi)로부터 유래한 PDC 폴리펩티드와 연관되어 있다 (Lowe and Zeikus, 1992). 아세트산 박테리아의 세포 용균액에서 관찰된, 피루베이트로부터 CO₂를 생산하는 반응속도에 기초하여 (King and Cheldelin, 1953), 제트. 모빌리스 (Z. mobilis) PDC와 유사한 에이. 파스퇴리아누스 (A. pasteurianus) PDC 폴리펩티드는 기질이 활성화되지 않은 것으로 결론내렸다. 그러나, 식물 PDC는 이들 보존적 잔기들을 함유하지 않지만 기질에 의해 조절되기 때 문에, 이는 PDC 폴리펩티드들 사이에 알로스테릭 조절의 메카니즘이 일부 상이함을 의미한다.

PDC 폴리펩티드의 클러스터 분석에 기초하여, 에이. 파스퇴리아누스 (A. pasteurianus) PDC는 제트. 모빌리스 (Z. mobilis) PDC와 가장 밀접하게 연관되어 있다. 이는 상기 2종의 박테리아를 그람-음성 α-프로테오박테리아로서 분류하는 것과 일치한다. 대부분의 진균류 PDC와 밀접한 진화적 근원을 공유하는, G+C 함량이 낮은 그람-양성 에스. 벤트리쿨리 (S. ventriculi) PDC와는 반대로, α-프로테오박테리아로부터 유래한 PDC 폴리펩티드는 식물 및 한쌍의 외집단 (out-grouping) 진균류 PDC와 가장 밀접하게 연관되어 있다.

등가물

당업자는 본원에 기재된 본 발명의 구체적인 실시양태에 대한 무수한 등가물을 단지 일상적인 실험만을 이용하여 인식하거나 확인할 수 있을 것이다. 그러한 등가물은 하기 청구의 범위에 포함되는 것이다. 더욱이, 미국 특허 제5,821,093호, 제5,482,846호, 제5,424,202호, 제5,028,539호, 제5,000,000호, 제5,487,989호, 제5,554,520호 및 제5,162,516호에 기재된 임의 수의 유전자 작제물, 숙주 세포 및 방법이 본 발명을 수행하는 데 이용될 수 있으며, 상기 문헌들은 이 거명을 통해 본원에 참고로 포함된다.

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430 Gly Ser Phe Gln Leu Thr Val Gln Glu Val Ser Thr Met Ile Arg Gln 435 440 445 Lys Leu Asn Thr Val Leu Phe Val Val Asn Asn Asp Gly Tyr Thr Ile 450 455 460 Glu Arg Leu Ile His Gly Pro Glu Arg Glu Tyr Asn His Ile Gln Met 465 470 475 480 Trp Gln Tyr Ala Glu Leu Val Lys Thr Leu Ala Thr Glu Arg Asp Ile 485 490 495 Gln Pro Thr Cys Phe Lys Val Thr Thr Glu Lys Glu Leu Ala Ala Ala 500 505 510 Met Glu Glu Ile Asn Lys Gly Thr Glu Gly Ile Ala Phe Val Glu Val 515 520 525 Val Met Asp Lys Met Asp Ala Pro Lys Ser Leu Arg Gln Glu Ala Ser 530 535 540 Leu Phe Ser Ser Gln Asn Asn Tyr 545 550 <210> 7 <211> 1707 <212> DNA <213> Zymomonas mobilis <400> 7 atgagttata ctgtcggtac ctatttagcg gagcggcttg tccagattgg tctcaagcat 60 cacttcgcag tcgcgggcga ctacaacctc gtccttcttg acaacctgct tttgaacaaa 120 aacatggagc aggtttattg ctgtaacgaa ctgaactgcg gtttcagtgc agaaggttat 180 gctcgtgcca aaggcgcagc agcagccgtc gttacctaca gcgtcggtgc gctttccgca 240 tttgatgcta tcggtggcgc ctatgcagaa aaccttccgg ttatcctgat ctccggtgct 300 ccgaacaaca atgatcacgc tgctggtcac gtgttgcatc acgctcttgg caaaaccgac 360 tatcactatc agttggaaat ggccaagaac atcacggccg cagctgaagc gatttacacc 420 ccagaagaag ctccggctaa aatcgatcac gtgattaaaa ctgctcttcg tgagaagaag 480 ccggtttatc tcgaaatcgc ttgcaacatt gcttccatgc cctgcgccgc tcctggaccg 540 gcaagcgcat tgttcaatga cgaagccagc gacgaagctt ctttgaatgc agcggttgaa 600 gaaaccctga aattcatcgc caaccgcgac aaagttgccg tcctcgtcgg cagcaagctg 660 cgcgcagctg gtgctgaaga agctgctgtc aaatttgctg atgctctcgg tggcgcagtt 720 gctaccatgg ctgctgcaaa aagcttcttc ccagaagaaa acccgcatta catcggtacc 780 tcatggggtg aagtcagcta tccgggcgtt gaaaagacga tgaaagaagc cgatgcggtt 840 atcgctctgg ctcctgtctt caacgactac tccaccactg gttggacgga tattcctgat 900 cctaagaaac tggttctcgc tgaaccgcgt tctgtcgtcg ttaacggcgt tcgcttcccc 960 agcgttcatc tgaaagacta tctgacccgt ttggctcaga aagtttccaa gaaaaccggt 1020 gctttggact tcttcaaatc cctcaatgca ggtgaactga agaaagccgc tccggctgat 1080 ccgagtgctc cgttggtcaa cgcagaaatc gcccgtcagg tcgaagctct tctgaccccg 1140 aacacgacgg ttattgctga aaccggtgac tcttggttca atgctcagcg catgaagctc 1200 ccgaacggtg ctcgcgttga atatgaaatg cagtggggtc acatcggttg gtccgttcct 1260 gccgccttcg gttatgccgt cggtgctccg gaacgtcgca acatcctcat ggttggtgat 1320 ggttccttcc agctgacggc tcaggaagtc gctcagatgg ttcgcctgaa actgccggtt 1380 atcatcttct tgatcaataa ctatggttac accatcgaag ttatgatcca tgatggtccg 1440 tacaacaaca tcaagaactg ggattatgcc ggtctgatgg aagtgttcaa cggtaacggt 1500 ggttatgaca gcggtgctgg taaaggcctg aaggctaaaa ccggtggcga actggcagaa 1560 gctatcaagg ttgctctggc aaacaccgac ggcccaaccc tgatcgaatg cttcatcggt 1620 cgtgaagact gcactgaaga attggtcaaa tggggtaagc gcgttgctgc cgccaacagc 1680 cgtaagcctg ttaacaagct cctctag 1707 <210> 8 <211> 568 <212> PRT <213> Zymomonas mobilis <400> 8 Met Ser Tyr Thr Val Gly Thr Tyr Leu Ala Glu Arg Leu Val Gln Ile 1 5 10 15 Gly Leu Lys His His Phe Ala Val Ala Gly Asp Tyr Asn Leu Val Leu 20 25 30 Leu Asp Asn Leu Leu Leu Asn Lys Asn Met Glu Gln Val Tyr Cys Cys 35 40 45 Asn Glu Leu Asn Cys Gly Phe Ser Ala Glu Gly Tyr Ala Arg Ala Lys 50 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Thr Met Lys Glu Ala Asp Ala Val Ile Ala Leu Ala Pro Val Phe Asn 275 280 285 Asp Tyr Ser Thr Thr Gly Trp Thr Asp Ile Pro Asp Pro Lys Lys Leu 290 295 300 Val Leu Ala Glu Pro Arg Ser Val Val Val Asn Gly Val Arg Phe Pro 305 310 315 320 Ser Val His Leu Lys Asp Tyr Leu Thr Arg Leu Ala Gln Lys Val Ser 325 330 335 Lys Lys Thr Gly Ala Leu Asp Phe Phe Lys Ser Leu Asn Ala Gly Glu 340 345 350 Leu Lys Lys Ala Ala Pro Ala Asp Pro Ser Ala Pro Leu Val Asn Ala 355 360 365 Glu Ile Ala Arg Gln Val Glu Ala Leu Leu Thr Pro Asn Thr Thr Val 370 375 380 Ile Ala Glu Thr Gly Asp Ser Trp Phe Asn Ala Gln Arg Met Lys Leu 385 390 395 400 Pro Asn Gly Ala Arg Val Glu Tyr Glu Met Gln Trp Gly His Ile Gly 405 410 415 Trp Ser Val Pro Ala Ala Phe Gly Tyr Ala Val Gly Ala Pro Glu Arg 420 425 430 Arg Asn Ile Leu Met Val Gly Asp Gly Ser Phe Gln Leu Thr Ala Gln 435 440 445 Glu Val Ala Gln Met Val Arg Leu Lys Leu Pro Val Ile Ile Phe Leu 450 455 460 Ile Asn Asn Tyr Gly Tyr Thr Ile Glu Val Met Ile His Asp Gly Pro 465 470 475 480 Tyr Asn Asn Ile Lys Asn Trp Asp Tyr Ala Gly Leu Met Glu Val Phe 485 490 495 Asn Gly Asn Gly Gly Tyr Asp Ser Gly Ala Gly Lys Gly Leu Lys Ala 500 505 510 Lys Thr Gly Gly Glu Leu Ala Glu Ala Ile Lys Val Ala Leu Ala Asn 515 520 525 Thr Asp Gly Pro Thr Leu Ile Glu Cys Phe Ile Gly Arg Glu Asp Cys 530 535 540 Thr Glu Glu Leu Val Lys Trp Gly Lys Arg Val Ala Ala Ala Asn Ser 545 550 555 560 Arg Lys Pro Val Asn Lys Leu Leu 565 <210> 9 <211> 610 <212> PRT <213> Zea mays <400> 9 Met Glu Thr Leu Leu Ala Gly Asn Pro Ala Asn Gly Val Ala Lys Pro 1 5 10 15 Thr Cys Asn Gly Val Gly Ala Leu Pro Val Ala Asn Ser His Ala Ile 20 25 30 Ile Ala Thr Pro Ala Ala Ala Ala Ala Thr Leu Ala Pro Ala Gly Ala 35 40 45 Thr Leu Gly Arg His Leu Ala Arg Arg Leu Val Gln Ile Gly Ala Ser 50 55 60 Asp Val Phe Ala Val Pro Gly Asp Phe Asn Leu Thr Leu Leu Asp Tyr 65 70 75 80 Leu Ile Ala Glu Pro Gly Leu Thr Leu Val Gly Cys Cys Asn Glu Leu 85 90 95 Asn Ala Gly Tyr Ala Ala Asp Gly Tyr Ala Arg Ser Arg Gly Val Gly 100 105 110 Ala Cys Ala Val Thr Phe Thr Val Gly Gly Leu Ser Val Leu Asn Ala 115 120 125 Ile Ala Gly Ala Tyr Ser Glu Asn Leu Pro Val Val Cys Ile Val Gly 130 135 140 Gly Pro Asn Ser Asn Asp Tyr Gly Thr Asn Arg Ile Leu His His Thr 145 150 155 160 Ile Gly Leu Pro Asp Phe Ser Gln Glu Leu Arg Cys Phe Gln Thr Ile 165 170 175 Thr Cys Tyr Gln Ala Ile Ile Asn Asn Leu Asp Asp Ala His Glu Gln 180 185 190 Ile Asp Thr Ala Ile Ala Thr Ala Leu Arg Glu Ser Lys Pro Val Tyr 195 200 205 Ile Ser Val Ser Cys Asn Leu Ala Gly Leu Ser His Pro Thr Phe Ser 210 215 220 Arg Asp Pro Val Pro Met Phe Ile Ser Pro Arg Leu Ser Asn Lys Ala 225 230 235 240 Asn Leu Glu Tyr Ala Val Glu Ala Ala Ala Asp Phe Leu Asn Lys Ala 245 250 255 Val Lys Pro Val Met Val Gly Gly Pro Lys Ile Arg Val Ala Lys Ala 260 265 270 Arg Glu Ala Phe Ala Ala Val Ala Asp Ala Ser Gly Tyr Pro Phe Ala 275 280 285 Val Met Pro Ala Ala Lys Gly Leu Val Pro Glu His His Pro Arg Phe 290 295 300 Ile Gly Thr Tyr Trp Gly Ala Val Ser Thr Thr Phe Cys Ala Glu Ile 305 310 315 320 Val Glu Ser Ala Asp Ala Tyr Leu Phe Ala Gly Pro Ile Phe Asn Asp 325 330 335 Tyr Ser Ser Val Gly Tyr Ser Leu Leu Leu Lys Arg Glu Lys Ala Val 340 345 350 Ile Val Gln Pro Asp Arg Met Val Val Gly Asp Gly Pro Ala Phe Gly 355 360 365 Cys Ile Leu Met Pro Glu Phe Leu Arg Ala Leu Ala Lys Arg Leu Arg 370 375 380 Arg Asn Thr Thr Ala Tyr Asp Asn Tyr Arg Arg Ile Phe Val Pro Asp 385 390 395 400 Arg Glu Pro Pro Asn Gly Lys Pro Asn Glu Pro Leu Arg Val Asn Val 405 410 415 Leu Phe Lys His Ile Lys Gly Met Leu Ser Gly Asp Ser Ala Val Val 420 425 430 Ala Glu Thr Gly Asp Ser Trp Phe Asn Cys Gln Lys Leu Arg Leu Pro 435 440 445 Glu Gly Cys Gly Tyr Glu Phe Gln Met Gln Tyr Gly Ser Ile Gly Trp 450 455 460 Ser Val Gly Ala Thr Leu Gly Tyr Ala Gln Ala Ala Lys Asp Lys Arg 465 470 475 480 Val Ile Ala Cys Ile Gly Asp Gly Ser Phe Gln Val Thr Ala Gln Asp 485 490 495 Val Ser Thr Met Leu Arg Cys Gly Gln Lys Ser Ile Ile Phe Leu Ile 500 505 510 Asn Asn Gly Gly Tyr Thr Ile Glu Val Glu Ile His Asp Gly Pro Tyr 515 520 525 Asn Val Ile Lys Asn Trp Asp Tyr Thr Gly Leu Val Asn Ala Ile His 530 535 540 Asn Ser Glu Gly Asn Cys Trp Thr Met Lys Val Arg Thr Glu Glu Gln 545 550 555 560 Leu Lys Glu Ala Ile Ala Thr Val Thr Gly Ala Lys Lys Asp Cys Leu 565 570 575 Cys Phe Ile Glu Val Ile Val His Lys Asp Asp Thr Ser Lys Glu Leu 580 585 590 Leu Glu Trp Gly Ser Arg Val Ser Ala Ala Asn Ser Arg Pro Pro Asn 595 600 605 Pro Gln 610 <210> 10 <211> 563 <212> PRT <213> Saccromyces cerevisae <400> 10 Met Ser Glu Ile Thr Leu Gly Lys Tyr Leu Phe Glu Arg Leu Lys Gln 1 5 10 15 Val Asn Val Asn Thr Val Phe Gly Leu Pro Gly Asp Phe Asn Leu Ser 20 25 30 Leu Leu Asp Lys Ile Tyr Glu Val Glu Gly Met Arg Trp Ala Gly Asn 35 40 45 Ala Asn Glu Leu Asn Ala Arg Tyr Ala Ala Asp Gly Tyr Ala Arg Ile 50 55 60 Lys Gly Met Ser Cys Ile Ile Thr Thr Phe Gly Val Gly Glu Leu Ser 65 70 75 80 Ala Leu Asn Gly Ile Ala Gly Ser Tyr Ala Glu His Val Gly Val Leu 85 90 95 His Val Val Gly Val Pro Ser Ile Ser Ser Gln Ala Lys Gln Leu Leu 100 105 110 Leu His His Thr Leu Gly Asn Gly Asp Phe Thr Val Phe His Arg Met 115 120 125 Ser Ala Asn Ile Ser Glu Thr Thr Ala Met Ile Thr Asp Ile Cys Thr 130 135 140 Ala Pro Ala Glu Ile Asp Arg Cys Ile Arg Thr Thr Tyr Val Thr Gln 145 150 155 160 Arg Pro Val Tyr Leu Gly Leu Pro Ala Asn Leu Val Asp Leu Asn Val 165 170 175 Pro Ala Lys Leu Leu Gln Thr Pro Ile Asp Met Ser Leu Lys Pro Asn 180 185 190 Asp Ala Glu Ser Glu Lys Glu Val Ile Asp Thr Ile Leu Val Leu Ala 195 200 205 Lys Asp Ala Lys Asn Pro Val Ile Leu Ala Asp Ala Cys Cys Ser Arg 210 215 220 His Asp Val Lys Ala Glu Thr Lys Lys Leu Ile Asp Leu Thr Gln Phe 225 230 235 240 Pro Ala Phe Val Thr Pro Met Gly Lys Gly Ser Ile Ser Glu Gln His 245 250 255 Pro Arg Tyr Gly Gly Val Tyr Val Gly Thr Leu Ser Lys Pro Glu Val 260 265 270 Lys Glu Ala Val Glu Ser Ala Asp Leu Ile Leu Ser Val Gly Ala Leu 275 280 285 Leu Ser Asp Phe Asn Thr Gly Ser Phe Ser Tyr Ser Tyr Lys Thr Lys 290 295 300 Asn Ile Val Glu Phe His Ser Asp His Met Lys Ile Arg Asn Ala Thr 305 310 315 320 Phe Pro Gly Val Gln Met Lys Phe Val Leu Gln Lys Leu Leu Thr Asn 325 330 335 Ile Ala Asp Ala Ala Lys Gly Tyr Lys Pro Val Ala Val Pro Ala Arg 340 345 350 Thr Pro Ala Asn Ala Ala Val Pro Ala Ser Thr Pro Leu Lys Gln Glu 355 360 365 Trp Met Trp Asn Gln Leu Gly Asn Phe Leu Gln Glu Gly Asp Val Val 370 375 380 Ile Ala Glu Thr Gly Thr Ser Ala Phe Gly Ile Asn Gln Thr Thr Phe 385 390 395 400 Pro Asn Asn Thr Tyr Gly Ile Ser Gln Val Leu Trp Gly Ser Ile Gly 405 410 415 Phe Thr Thr Gly Ala Thr Leu Gly Ala Ala Phe Ala Ala Glu Glu Ile 420 425 430 Asp Pro Lys Lys Arg Val Ile Leu Phe Ile Gly Asp Gly Ser Leu Gln 435 440 445 Leu Thr Val Gln Glu Ile Ser Thr Met Ile Arg Trp Gly Leu Lys Pro 450 455 460 Tyr Leu Phe Val Leu Asn Asn Asp Gly Tyr Thr Ile Glu Lys Leu Ile 465 470 475 480 His Gly Pro Lys Ala Gln Tyr Asn Glu Ile Gln Gly Trp Asp His Leu 485 490 495 Ser Leu Leu Pro Thr Phe Gly Ala Lys Asp Tyr Glu Thr His Arg Val 500 505 510 Ala Thr Thr Gly Glu Trp Asp Lys Leu Thr Gln Asp Lys Ser Phe Asn 515 520 525 Asp Asn Ser Lys Ile Arg Met Ile Glu Val Met Leu Pro Val Phe Asp 530 535 540 Ala Pro Gln Asn Leu Val Glu Gln Ala Lys Leu Thr Ala Ala Thr Asn 545 550 555 560 Ala Lys Gln <210> 11 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <221> misc_feature <222> 3, 6, 18 <223> r= a or g <221> misc_feature <222> 12, 21, 27 <223> y= c or t <221> misc_feature <222> 9, 15, 30 <223> n= any nucleotide base <400> 11 aargargtna aygtngarca yatgttyggn gt 32

Claims (61)

1. 서열 1, 서열 3 또는 서열 5의 뉴클레오티드 서열, 또는 그의 상보체, 또는 서열 2, 서열 4 또는 서열 6의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자를 포함하는, 피루베이트를 아세트알데히드로 탈카르복시화할 수 있는 폴리펩티드를 코딩하는 단리된 핵산 분자.
2. 삭제
3. 제1항에 있어서, 벡터 핵산 서열을 더 포함하는 핵산 분자.
4. 제1항에 있어서, 대리 (surrogate) 프로모터와 작동가능하게 연결된 핵산 분자.
5. 제1항에 있어서, 이종 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열을 더 포함하는 핵산 분자.
6. 제1항의 핵산 분자를 함유하는 재조합 숙주 세포.
7. 제6항에 있어서, 그람-음성 박테리아 세포 및 그람-양성 박테리아 세포로 구성된 군으로부터 선택된 재조합 숙주 세포.
8. 제7항에 있어서, 그람-음성 박테리아 세포가 글루코노박터 (Gluconobacter), 리조비움 (Rhizobium), 브라디리조비움 (Bradyrhizobium), 알칼리게네스 (Alcaligenes), 로도박터 (Rhodobacter), 로도코커스 (Rhodococcus), 아조스피릴룸 (Azospirillum), 로도스피릴룸 (Rhodospirillum), 스핑고모나스 (Sphingomonas), 부르콜데리아 (Burkholderia), 데술포모나스 (Desulfomonas), 게오스피릴룸 (Geospirillum), 숙시노모나스 (Succinomonas), 에어로모나스 (Aeromonas), 쉬와넬라 (Shewanella), 할로크로마티움 (Halochromatium), 시트로박터 (Citrobacter), 에세리치아 (Escherichia), 클레브시엘라 (Klebsiella), 자이모모나스 (Zymomonas), 자이모박터 (Zymobacter) 및 아세토박터 (Acetobacter)로 구성된 군으로부터 선택된 것인 재조합 숙주 세포.
9. 제7항에 있어서, 그람-양성 박테리아 세포가 피브로박터 (Fibrobacter), 아시도박터 (Acidobacter), 박테로이데스 (Bacteroides), 스핑고박테리움 (Sphingobacterium), 악티노마이세스 (Actinomyces), 코리네박테리움 (Corynebacterium), 노카르디아 (Nocardia), 로도코커스 (Rhodococcus), 프로피오니박테리움 (Propionibacterium), 비피도박테리움 (Bifidobacterium), 바실러스 (Bacillus), 게오바실러스 (Geobacillus), 패니바실러스 (Paenibacillus), 술포바실러스 (Sulfobacillus), 클로스트리디움 (Clostridium), 안에어로박터 (Anaerobacter), 유박테리움 (Eubacterium), 스트렙토코커스 (Streptococcus), 락토바실러스 (Lactobacillus), 류코노스톡 (Leuconostoc), 엔테로코커스 (Enterococcus), 락토코커스 (Lactococcus), 써모비피다 (Thermobifida), 셀룰로모나스 (Cellulomonas) 및 사르시나 (Sarcina)로 구성된 군으로부터 선택된 것인 재조합 숙주 세포.
10. 서열 2, 서열 4 또는 서열 6의 아미노산 서열을 포함하는, 피루베이트를 아세트알데히드로 탈카르복시화할 수 있는 단리된 폴리펩티드.
11. 삭제
12. 삭제
13. 삭제
14. 삭제
15. 제10항에 있어서, 이종 아미노산 서열을 더 포함하는 폴리펩티드.
16. 제10항의 폴리펩티드에 선택적으로 결합하는 항체.
17. 제6항의 숙주 세포를 핵산 분자가 발현되는 조건 하에서 배양하는 것을 포함하는,

    서열 2, 서열 4 또는 서열 6의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드의 생산 방법.
18. a) 샘플을, 제10항의 폴리펩티드에 선택적으로 결합하는 항체와 접촉시키는 단계; 및

    b) 상기 항체가 상기 샘플 중의 폴리펩티드와 결합하는지의 여부를 결정하여 샘플에서 제10항의 폴리펩티드의 존재를 검출하는 단계

    를 포함하는, 샘플에서 제10항의 폴리펩티드의 존재를 검출하는 방법.
19. 삭제
20. a) 샘플을, 제1항의 핵산 분자의 상보체와 선택적으로 혼성화되는 핵산 프로브 또는 프라이머와 접촉시키는 단계; 및

    b) 상기 핵산 프로브 또는 프라이머가 상기 샘플 중의 핵산 분자와 결합하는지의 여부를 결정하여 샘플에서 제1항의 핵산 분자의 존재를 검출하는 단계

    를 포함하는, 샘플에서 제1항의 핵산 분자의 존재를 검출하는 방법.
21. 제20항에 있어서, 샘플이 mRNA 분자를 포함하며, 샘플을 핵산 프로브와 접촉시키는 방법.
22. 제1항의 핵산 분자의 상보체와 선택적으로 혼성화되는 핵산 및 사용 지침을 포함하는, 제1항의 핵산 분자 존재 검출용 킷트.
23. 삭제
24. 삭제
25. 삭제
26. 제6항에 있어서, 상기 핵산 분자가 대리 프로모터와 작동가능하게 연결된 것인 재조합 숙주 세포.
27. 삭제
28. 삭제
29. 제6항에 있어서, 알콜 데히드로게나제, 글루카나제 및 세크레타제로 구성된 군으로부터 선택된 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 더 포함하는 재조합 숙주 세포.
30. 제29항에 있어서, 알콜 데히드로게나제를 코딩하는 핵산을 더 포함하는 재조합 숙주 세포.
31. 제6항에 있어서, 에탄올 생산성 (ethanologenic)인 것인 재조합 숙주 세포.
32. 제6항에 있어서, 당으로부터 에탄올을 발효시키는 데 적합한 재조합 숙주 세포.
33. 삭제
34. 삭제
35. 삭제
36. 외생성 대리 프로모터의 전사 조절 하에 있는, 서열 2, 서열 4 및 서열 6으로 구성된 군으로부터 선택된 PDC를 코딩하는 이종 핵산을 포함하는 재조합 에탄올 생산성 숙주 세포.
37. 제6항의 숙주 세포를, 피루베이트로부터 아세트알데히드가 생산되기에 충분한 양으로 피루베이트 데카르복실라제가 발현되는 조건 하에서 배양하는 것을 포함하는, 아세트알데히드의 생산 방법.
38. 제37항에 있어서, 숙주 세포가 알콜 데히드로게나제, 세크레타제 및 글루카나제로 구성된 군으로부터 선택된 에탄올 생산성 유전자를 더 포함하는 것인 방법.
39. 제6항의 숙주 세포로부터 수득한 세포 용균액을, 피루베이트로부터 아세트알데히드가 생산되는 조건 하에 접촉시키는 것을 포함하는, 아세트알데히드의 생산 방법.
40. 제6항의 숙주 세포를, 1차 발효 산물로서 에탄올이 생산되기에 충분한 양으로 피루베이트 데카르복실라제 및 알콜 데히드로게나제가 발현되는 조건 하에서 배양하는 것을 포함하는, 에탄올의 생산 방법.
41. 제38항에 있어서, 수용액 중에서 수행되는 방법.
42. 제40항에 있어서, 수용액 중에서 수행되는 방법.
43. 제6항의 숙주 세포로부터 유래한 피루베이트 데카르복실라제를 검출가능한 양으로 포함하는 효소 추출물.
44. 삭제
45. 삭제
46. 삭제
47. 삭제
48. 피루베이트 데카르복실라제의 아미노산 서열을 서열 2, 서열 4 또는 서열 6의 아미노산 서열과 비교하는 단계; 및

    서열 2, 서열 4 또는 서열 6의 상응하는 아미노산 잔기와 동일성을 갖도록 상기 피루베이트 데카르복실라제의 아미노산 잔기 1개 이상을 변화시켜, 피루베이트 데카르복실라제의 활성 향상을 달성하는 단계

    를 포함하는, 향상된 데카르복실라제 활성을 갖는 피루베이트 데카르복실라제 효소의 선별 방법.
49. 제48항에 있어서, 피루베이트 데카르복실라제 활성이 피루베이트에 대해 향상된 피루베이트 데카르복실라제 친화도를 포함하는 것인 방법.
50. 제48항에 있어서, 피루베이트 데카르복실라제 활성이 향상된 열 안정성을 포함하는 것인 방법.
51. 피루베이트 데카르복실라제를 코딩하는 핵산 서열을 서열 1, 서열 3 또는 서열 5의 핵산 서열과 비교하는 단계; 및

    서열 1, 서열 3 또는 서열 5의 상응하는 코돈과 동일성을 갖도록 상기 피루베이트 데카르복실라제 효소를 코딩하는 상기 핵산의 코돈 1개 이상을 변화시켜, 수용 숙주 세포에서 피루베이트 데카르복실라제 효소를 코딩하는 상기 변화된 핵산의 발현 향상을 달성하는 단계

    를 포함하는, 상기 숙주 세포에서 발현이 향상된 피루베이트 데카르복실라제 효소를 선별하는 방법.
52. 피루베이트 데카르복실라제를 코딩하는 핵산 서열인 서열 1, 서열 3 또는 서열 5를 수용 숙주 세포의 코돈 이용도와 비교하는 단계; 및

    상기 수용 숙주 세포의 코돈 이용도와 상응하도록 상기 피루베이트 데카르복실라제 효소를 코딩하는 상기 핵산의 코돈 1개 이상을 변화시켜, 상기 숙주 세포에서 피루베이트 데카르복실라제 효소를 코딩하는 상기 변화된 핵산의 발현을 향상시키는 단계

    를 포함하는, 상기 숙주 세포에서 발현이 향상된 피루베이트 데카르복실라제 효소를 선별하는 방법.
53. 피루베이트 데카르복실라제를 코딩하는 핵산 서열인 서열 1, 서열 3 또는 서열 5를 수용 숙주 세포의 코돈 이용도와 비교하는 단계; 및

    상기 피루베이트 데카르복실라제 효소를 코딩하는 상기 핵산의 코돈에 상응하는 1개 이상의 tRNA가 재조합에 의해 생성되도록 상기 수용 숙주 세포를 변화시켜, 상기 변화된 숙주 세포에서 피루베이트 데카르복실라제 효소를 코딩하는 상기 핵산의 발현 향상을 달성하는 단계

    를 포함하는, 상기 숙주 세포에서 발현이 향상된 피루베이트 데카르복실라제 효소를 선별하는 방법.
54. 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (American Type Culture Collection)에 기탁 번호 ATCC PTA-4254로서 기탁된, 서열 1의 핵산 서열을 갖고 자이모박터 팔매 (Zymobacter palmae)로부터 유래한 pdc 유전자를 포함하는 플라스미드 pJAM3440.
55. 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션에 기탁 번호 ATCC PTA-4252로서 기탁된, 서열 3의 핵산 서열을 갖고 아세토박터 파스퇴리아누스 (Acetobacter pasteurianus)로부터 유래한 pdc 유전자를 포함하는 플라스미드 pJAM304.
56. 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션에 기탁 번호 ATCC PTA-4253으로서 기탁된, 서열 5의 핵산 서열을 갖고 사르시나 벤트리쿨리 (Sarcina ventriculi)로부터 유래한 pdc 유전자를 포함하는 플라스미드 pJAM419.
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