KR100706032B1 - 파클리탁셀 방출스텐트의 시술을 위한 유전자형 분석키트 - Google Patents

파클리탁셀 방출스텐트의 시술을 위한 유전자형 분석키트 Download PDF

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장양수
이민구
박성하
안철민
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장양수
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Abstract

본 발명은 MDR1 유전자 및 MRP2 유전자의 유전적 다형을 분석할 수 있는 DNA 칩 및 전기 DNA칩을 포함하는 유전자형 분석키트에 관한 것이다. 본 발명의 유전자형 분석용 키트는 (ⅰ) 특정한 유전적 다형을 지닌 사람의 MDR1 유전자 및 MRP2 유전자와 특이적으로 결합할 수 있고, 서열번호 43 내지 48의 염기서열을 갖는 유전자 탐침; 올리고(dT)15, -(CH2)6- 및 아민(amine)기를 순차적으로 포함하고, 전기 유전자 탐침의 5' 말단이 올리고(dT)15의 3'말단부위에 연결된 링커; 및, 표면에 알데히드가 결합되고, 전기 링커의 아민기가 표면의 알데히드기와 시프염기(Schiff's base)반응을 통해 연결된 고체를 포함하는, 유전자형 분석용 DNA 칩; 및, (ii) 시료에서 채취한 RNA로부터 합성된 cDNA를 표지하기 위하여 형광표지된 데옥시 뉴클레오타이드를 포함한다. 본 발명의 유전자형 분석용 키트를 이용하면, 파클리탁셀 방출스텐트를 시술한 환자에게서 혈관재협착이 발생할 것인지의 여부를 미리 예측할 수 있으므로, 보다 안전한 스텐트 시술에 널리 활용될 수 있을 것이다.
MDR1 유전자, MRP2 유전자, DNA칩, 유전자형 분석키트

Description

파클리탁셀 방출스텐트의 시술을 위한 유전자형 분석키트{A Genotyping Kit for Surgical Operation of Paclitaxel Eluting Stent}
본 발명은 파클리탁셀 방출스텐트의 시술 적합성 판정을 위한 유전자형 분석키트에 관한 것이다. 좀 더 구체적으로, 본 발명은 MDR1 유전자 및 MRP2 유전자의 유전적 다형을 분석할 수 있는 DNA 칩 및 전기 DNA칩을 포함하는 유전자형 분석키트에 관한 것이다.
스텐트 시술방법은 폐색성 관상동맥질환의 환자에 있어서, 가장 효과적인 치료방법으로 알려져 있다. 스텐트 시술은 금속제의 그물망 형태인 스텐트를 질환이 나타난 혈관부위에 삽입시켜서, 폐색된 혈관을 개통하는 방법이며, 종래의 풍선도자 시술법과는 달리 시술된 곳에 금속성 스텐트를 남긴다는 특징이 있다. 그러나, 혈관에 삽입된 스텐트로 인하여, 혈관벽이 지속적으로 손상되고, 손상된 혈관벽의 세포 이상증식으로 인하여 스텐트가 시술된 부위의 혈관이 다시 폐색되는 혈관재협착(restenosis)이 발생할 확률이 높아, 이러한 단점을 극복하기 위한 노력이 계속 되고 있다.
이러한 노력의 결과로서, 스텐트에 특정한 약물을 코팅시켜서, 스텐트 시술 이후에, 특정 약물이 혈관내부로 방출되는 약물방출스텐트(drug eluting stent)를 개발하게 되었고, 이처럼 개발된 약물방출스텐트를 시술함으로써, 스텐트로 인한 혈관재협착(stent restenosis)의 비율이 현저히 감소하고 있는 실정이다(참조: Windecker S. et al., N. Engl. J. Med., 353:653-662, 2005).
그러나, 몇몇 특정 약물을 코팅시킨 스텐트의 경우에는 스텐트로 인한 혈관재협착의 비율이 감소되지 않고 있는데, 그 중 대표적인 것이 파클리탁셀(paclitaxel) 방출 스텐트이다. 유방암과 난소암에 특이적인 치료효과를 나타내는 파클리탁셀은 세포의 증식과정에서 비정상적인 튜블린의 중합체를 형성하게 함으로써, 세포증식을 억제하는 효과를 나타내며, 세포내로의 흡수가 용이하여 세포내에서 장시간 약효가 지속될 수 있다는 장점이 있다. 이러한 특징을 활용하기 위하여 파클리탁셀이 코팅된 파클리탁셀 방출 스텐트를 환자에게 시술할 경우, 스텐트로 인한 혈관재협착의 원인인 비정상적인 혈관세포의 증식을 방지할 수 있을 것으로 예상되었으나, 파클리탁셀 방출 스텐트를 시술한 경우에는 평균적으로 11.7-13.1%의 스텐트 재협착율을 여전히 나타내고 있으며, 이의 원인에 대한 연구결과는 보고되지 않고 있는 실정이다.
만일, 파클리탁셀 방출 스텐트의 시술시 발생하는 재협착의 원인을 규명할 수 있다면, 파클리탁셀 방출 스텐트를 시술하여 관상동맥질환을 보다 높은 확률로 완치시킬 수 있을 것으로 예측되고 있다.
따라서, 파클리탁셀 방출 스텐트의 시술시 발생하는 재협착을 규명하여, 보다 안전하게 파클리탁셀 방출 스텐트를 시술할 수 있는 방법을 개발하여야 할 필요성이 끊임없이 대두되었다.
이에, 본 발명자들은 파클리탁셀 방출 스텐트의 시술시 발생하는 재협착을 규명하여, 보다 안전하게 파클리탁셀 방출 스텐트를 시술할 수 있는 방법을 개발하고자 예의 연구노력한 결과, 사람의 MDR1 유전자와 MRP2 유전자의 특정 부분에서 유전적 다형(genetic polymorphism)이 발생한 환자의 경우, 파클리탁셀 방출 스텐트의 시술시 재협착의 발생확률이 높은 수준을 유지함을 발견하였는 바, 이러한 특정부위에서의 유전적 다형을 검출할 수 있는 DNA 칩 또는 전기 DNA 칩을 포함하는 진단용 키트를 이용하여, 파클리탁셀 방출 스텐트의 시술이전에 환자가 특정한 유전적 다형을 나타내는 지의 여부를 확인할 경우, 보다 안전하게 파클리탁셀 방출 스텐트를 시술할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
결국, 본 발명의 주된 목적은 사람의 MDR1 유전자와 MRP2 유전자의 특정 부분에서 유전적 다형을 검출할 수 있는 DNA 칩을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 전기 DNA 칩을 포함하는 진단용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 유전자형 분석용 키트는 (ⅰ) 특정한 유전적 다형을 지닌 사람의 MDR1 유전자 및 MRP2 유전자와 특이적으로 결합할 수 있고, 서열번호 43 내지 48의 염기서열을 갖는 유전자 탐침; 올리고(dT)15, -(CH2)6- 및 아민(amine)기를 순차적으로 포함하고, 전기 유전자 탐침의 5' 말단이 올리고(dT)15의 3'말단부위에 연결된 링커; 및, 표면에 알데히드가 결합되고, 전기 링커의 아민기가 표면의 알데히드기와 시프염기(Schiff's base)반응을 통해 연결된 고체를 포함하는, 유전자형 분석용 DNA 칩; 및, (ii) 시료에서 채취한 RNA로부터 합성된 cDNA를 표지하기 위하여 형광표지된 데옥시 뉴클레오타이드를 포함한다. 이때, 형광표지된 데옥시 뉴클레오타이드는 특별히 이에 제한되지 않으나, 텍사스 레드(Texas Red) dATP, 시아닌 3(cyanine 3) dCTP, 시아닌 5(cyanine 5) dGTP, 플루오레세인-12(fluorescein-12) dUTP 등을 사용함이 바람직하다.
본 발명자들은 파클리탁셀 방출 스텐트의 시술시 발생하는 재협착의 원인을 규명하기 위하여, 다중 약물저항 유전자(multiple drug resistance gene-1, MDR1)과 그의 발현산물인 P-당단백질(P-glycoprotein), 및 MRP2(multidrug resistance associated protein 2)에 주목하게 되었다.
MDR1과 그의 발현산물인 P-당단백질은 암세포 및 일반세포에서 다양한 약물 에 대한 저항력을 부여하는 것으로 알려져 있다. MDR유전자는 사람에 있어서 7번 염색체상에 존재하는 100kb의 유전자로서, 4.5kb의 mRNA로 스플라이싱되는 28개의 액손으로 구성되며, 그로부터 발현되는 P-당단백질은 ATP 결합 카세트 서브패밀리 B의 일종(ATP binding cassette sub-family B member 1, ABCB1)으로서, 다양한 약물을 포집할 수 있는 광범위한 기질특이성을 갖는다고 보고되었다(참조: Fojo A.T. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA., 84:265-9, 1987; Thiebaut F. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA., 84:7735-8, 1987; Pauli-Magnus C et al., Pharmaceutical Research, 21(6):904-913, 2004).
아울러, 최근의 연구결과에 의하면, MDR1의 유전적 다형(genetic polymorphism)은 기능이 변화된 P-당단백질을 발현시킬 수 있으며, MDR1의 유전자형에 따라 약물에 대한 반응성이 변화될 수 있다는 사실이 보고되었다(참조: Kim R.B. et al., Clin. Pharmacol. Ther., 70:189-199, 2001; Kurata Y. et al., Clin. Pharmacol. Ther., 72:209-219, 2002; Sakaeda T. et al., Pharm. Res., 18:1400-1404, 2001; Horinouchi M. et al., Pharm. Res., 19:1581-1585, 2002; Siddiqui A. et al., N. Engl. J. Med., 348:1442-1448, 2003).
아울러, ABCB1에 속하는 단백질을 암호화하는 MRP2 유전자 역시 MDR1 유전자와 마찬가지로 다양한 약물에 대한 내성형성에 관여하는 것으로 알려져 있으며, MRP2의 약물 수송 능력에 영향을 주는 유전자 변이를 갖는 개체의 경우 약물의 약물역동이 달라져 그 약물에 대한 반응이 다른 개체와 다르게 나타날 수 있다고 알려져 있다(참조: Yi S.Y. et al., Clin. Pharmacol. Ther., 76:418-427, 2004).
한편, 파클리탁셀의 세포증식 억제활성은 상기 P-당단백질의 활성 및 MRP2 단백질에 의하여 영향을 받는다고 알려져 있기 때문에, 파클리탁셀 방출스텐트를 시술한 후, 나타나는 11.7-13.1%의 스텐트 재협착율이 MDR1 및 MRP2 유전자의 유전적 다형에 의하여 영향을 받을 수 있을 것이라고 가정하였다. 이러한 가정을 확인하기 위하여, 파클리탁셀 방출스텐트를 시술받고 혈관재협착이 발생한 환자들의 게놈 DNA를 대상으로 하여, 전기 게놈 DNA에 존재하는 다양한 MDR1 및 MRP2 단백질을 암호화하는 유전자에서 유전적 다형을 검출하고, 혈관재협착의 발생과 통계학적으로 관련성이 있는 것으로 확인된 유전적 다형을 선별하고자 하였다. 그 결과, MDR1의 21번 액손의 G2677T/A과 26번 액손의 C3435T 및 MRP2 유전자의 전사 시작점을 기준하여 상부로 1774번째 염기가 혈관재협착의 발생과 통계학적으로 관련성이 있는 것으로 밝혀졌으며, 특히 MDR1 유전자의 경우는 동형 또는 이형으로 T 형질을 나타내는 유전적 다형이 혈관재협착의 발생과 통계학적으로 밀접한 관련성이 있음을 확인하였다.
이에, 본 발명자들은 파클리탁셀 방출스텐트를 시술하기 이전에, 환자의 MDR1 전기 21번 액손의 G2677T/A과 26번 액손의 C3435T 및 MRP2 유전자의 전사 시작점을 기준하여 상부로 1774번째 염기의 유전자형을 분석하여, MDR1 유전자의 동형 또는 이형으로 T 형질을 나타내는 환자와 MRP2 유전자의 전사 시작점을 기준하여 상부로 1774번째 염기가 동형변이형인 환자의 경우 파클리탁셀 방출스텐트를 시술하면, 혈관재협착이 발생할 가능성이 높다는 점을 사전에 인식할 수 있어, 파클 리탁셀 방출스텐트의 시술로 인한 혈관재협착의 발생을 방지할 수 있을 것이라고 예측하였다.
이를 입증하기 위하여, MDR1 유전자의 T 형질을 나타내는 21번 액손의 G2677T/A과 26번 액손의 C3435T 및 MRP2 유전자의 전사 시작점을 기준하여 상부로 1774번째 염기를 검출할 수 있는 DNA 칩을 포함하는 유전자형 분석키트를 제작하였다. 이어, 파클리탁셀 방출스텐트를 시술한 후, 혈관재협착이 발생된 환자와 혈관재협착이 발생하지 않은 환자로부터 각각의 cDNA를 수득하고, 이를 전기 제작한 DNA 칩에 적용하였다. 그 결과, 파클리탁셀 방출스텐트를 시술한 후, 혈관재협착이 발생된 환자로부터 수득한 cDNA는 전기 DNA칩과 특이적으로 결합하여 검출되는 반면, 혈관재협착이 발생하지 않은 환자로부터 수득한 cDNA는 전기 DNA칩과 비특이적으로 결합함을 확인하였다.
따라서, MDR1의 T 형질을 나타내는 21번 액손의 G2677T/A과 26번 액손의 C3435T 및 MRP2 유전자의 전사 시작점을 기준하여 상부로 1774번째 염기를 검출할 수 있는 DNA 칩을 포함하는 유전자형 분석키트를 사용할 경우, 파클리탁셀 방출스텐트의 시술여부를 미리 확인할 수 있음을 알 수 있었다.
본 발명의 유전자형 분석용 키트를 이용하면, 파클리탁셀 방출스텐트를 시술한 환자에게서 혈관재협착이 발생할 것인지의 여부를 미리 예측할 수 있으므로, 보다 안전한 스텐트 시술에 널리 활용될 수 있을 것이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: 파클리탁셀 방출스텐트를 시술받은 관상 동맥질환 환자의 유전자형의 결정
실시예 1-1: 파클리탁셀 방출스텐트를 시술받은 관상 동맥질환 환자의 MDR1 유전자형의 결정
파클리탁셀 방출스텐트(Taxus, Boston Scientific, USA)를 시술받고, 9개월 동안 관상동맥 혈관조영술로 혈관재협착 여부를 진단받아 온 106명의 관상동맥질환 환자를 대상으로 하여, 이들로부터 게놈 DNA를 수득하고, MDR1 유전자형을 결정하였다.
구체적으로, 환자에서 채혈한 혈액 8㎖를 DNA 추출키트(QIAGEN, Hilden, Germany)에 적용하여 환자의 게놈 DNA를 수득하였다. 전기 수득한 각각의 게놈 DNA를 주형으로 하고, 하기의 프라이머를 사용하며, PCR 반응액(10.0ng of DNA, 1X PCR Buffer, 0.125units of AmpliTaq Gold DNA polymerase(ABI, USA), 3.0mM MgCl2, 0.25mM of each dNTP, and 0.5pmol of each primer in 10㎕ reaction volume)을 이용하여, PCR을 수행(95℃에서 10분, 30사이클(95℃에서 30초, 60℃에서 1분 및 72℃에서 1분) 및 72℃에서 5분)하고, 증폭된 각각의 절편을 수득하였다.
MDR1_-1459G/A-F: 5'-ggagcaaagaaatggaatacaat-3'(서열번호 1), MDR1_-1459G/A-R: 5'-ttctcccgtgaagaccaagtt-3'(서열번호 2), MDR1_-935A/G-F: 5'-caggaaacagctatgaccgcatgctgaagaaagacc-3'(서열번호 3), MDR1_-935A/G-R: 5'-tgtaaaacgacggccagtccttctcccgtgaagac-3'(서열번호 4), MDR1_-709C/G-F: 5'-caggaaacagctatgaccgcatgctgaagaaagacc-3(서열번호 5)', MDR1_-709C/G-R: 5'-tgtaaaacgacggccagtccttctcccgtgaagac-3'(서열번호 6), MDR1_-693T/G-F: 5'-ggagcaaagaaatggaatacaat-3'(서열번호 7), MDR1_-693T/G-R: 5'-ttctcccgtgaagaccaagtt-3'(서열번호 8), MDR1_-A61G-F: 5'-gaccgcaatggaggagc-3'(서열번호 9), MDR1_-A61G-R: 5'-actatgtaaactatgaaaatgaaacaag-3'(서열번호 10), MDR1_-C1236T-F: 5'-caggaaacagctatgacctattcgaagagtgggcaca-3'(서열번호 11), MDR1_-C1236T-R: 5'-tgtaaaacgacggccagttccatcaacactgacctgg-3'(서열번호 12), MDR1_G2677T/A-F: 5'-caggaaacagctatgacctcagcattctgaagtcatgg-3'(서열번호 13), MDR1_G2677T/A-R: 5'-tgtaaaacgacggccagttccaagaactggctttgc-3'(서열번호 14), MDR1_C3435T-F: 5'-tgtttgactgcagcattg-3'(서열번호 15), MDR1_C3435T-R: 5'-tttatttgaagagagacttacattagg-3'(서열번호 16), MDR1_G3751A-F: 5'-acctgcattgtgattgct-3'(서열번호 17), MDR1_G3751A-R: 5'-actgaccattgaaaaatagatg- 3'(서열번호 18)
이어, 전기 수득한 증폭된 절편에 1U의 알칼라인 포스파타아제 및 엑소뉴클레아제 I을 처리하고 37℃에서 1시간 동안 반응시킨 다음, 다시 72℃에서 15분동안 처리하여, 정제된 절편을 수득하였다.
전기 정제된 절편 1㎕를 유전자형 분석키트(SNaPShot assay kit, ABI, USA)에 적용하여, 이들 각각의 염기서열 데이터를 수득한 다음, 전기 데이터를 유전형 분석프로그램(Gene Mapper software, ABI, USA)에 입력하고, 9곳의 SNP 위치(프로모터-1459G/A(실험군 1), 프로모터-935A/G(실험군 2), 프로모터-709C/G/T(실험군 3), 프로모터-693T/C(실험군 4), 2번 액손의A61G(실험군 5), 12번 액손의 C1236T(실험군 6), 21번 액손의 G2677T/A(실험군 7), 26번 액손의 C3435T(실험군 8) 및 28번 액손의 G3751A(실험군 9))에서 유전적 다형을 분석하여, 이들의 유전자형 분포와 혈관재협착율을 비교하였다(참조: 표 1a).
파클리탁셀 방출스텐트를 시술받은 환자에 있어서, MDR1 유전자의 SNP 위치에 따른 유전자형 분포 및 혈관재협착율의 비교
실험군 유전자형 분포 혈관재협착율 P값*
실험군 1 실험군 2 실험군 3 실험군 4 실험군 5 실험군 6 실험군 7 실험군 8 실험군 9 GG:GA:AA=53(52.0%):40(39.2%):9(8.8%) AA:AG:GG=89(84.0%):16(15.1%):1(0.9%) CC:CG,CT:GG,TT=101(95.3%):5(4.7%):0 TT:TC:CC=95(90.5%):10(9.5%):0(0%) AA:AG:GG=106(100%):0(0%):0(0%) CC:CT:TT=17(16.0%):49(46.2%):40(37.7%) GG:GT:TT=42(40.8%):48(46.6%):13(12.6%)b CC:CT:TT=42(40.0%):51(48.6%):12(11.4%) TT:TC:CC=95(90.5%):10(9.5%):0(0%) GG:GA:AA=9/53:6/40:0/9 GG:GA:AA=14/89:2/16:0/1 CC:CG,CT:GG,TT=16/101:0/5:0/0 TT:TC:CC=15/95:1/10:0/0 AA:AG:GG=16/106:0/0:0/0 CC:CT:TT=1/17:9/49:6/40 GG:GT:TT=2/44:12/47:2/13 CC:CT:TT=1/44:13/50:2/12 GG:GA:AA=16/104:0/2:0/0 0.412 0.865 1.00 1.00 -a 0.464 0.008 0.002 1.00
*: P<0.05인 경우 유의함
a: 유전자 다형 없음
b: G와 A 형질은 동일한 기능을 가졌음
상기 표 1a에서 보듯이, 실험군 7(21번 액손의 G2677T/A) 및 실험군 8(26번 액손의 C3435T)의 결과가 유의함을 알 수 있었는 바, 21번 액손의 G2677T/A 및 26번 액손의 C3435T가 파클리탁셀 방출스텐트 시술에 의한 혈관재협착과 관련성이 있을 것으로 예측되었다.
실시예 1-2: 파클리탁셀 방출스텐트를 시술받은 관상 동맥질환 환자의 MRP2 유전자형의 결정
파클리탁셀 방출스텐트(Taxus, Boston Scientific, USA)를 시술받고, 9개월 동안 관상동맥 혈관조영술로 혈관재협착 여부를 진단받아 온 106명의 관상동맥질환 환자를 대상으로 하여, 이들로부터 게놈 DNA를 수득하고, MRP2 유전자형을 결정하였다. 즉, 하기의 프라이머를 사용하는 것을 제외하고는, 전기 실시예 1-1과 동일한 방법으로 PCR을 수행하여, 각각의 절편을 수득하고, 이들의 염기서열을 결정하였다.
1774-F:5'-caggaaacagctatgaccgattctccaccctctctttt-3'(서열번호 19), 1774-R:5'-tgtaaaacgacggccagtcattcagtgtgggagaaaat-3'(서열번호 20), 1549-F:5'-caggaaacagctatgacccccactttttaatttgttagtgta-3'(서열번호 21), 1549-R:5'-tgtaaaacgacggccagtctgggactacaggcacat-3'(서열번호 22), 24-F:5'-caggaaacagctatgacctaggctcacactggataagc-3'(서열번호 23), 24-R:5'-tgtaaaacgacggccagttgcacatctaacatttctgg-3'(서열번호 24), 23-F:5'-caggaaacagctatgacctaggctcacactggataagc-3'(서열번호 25), 23-R:5'-tgtaaaacgacggccagttgcacatctaacatttctgg-3'(서열번호 26), 31-F:5'-caggaaacagctatgacccatgggtcctggaaaggtt-3'(서열번호 27), 31-R:5'-tgtaaaacgacggccagtccccatggtacctcctcat-3'(서열번호 28), 1249-F:5'-tttgtccatgggtcctaattt-3'(서열번호 29), 1249-R:5'-atgaagttggtcacatccatg-3'(서열번호 30), 1457-F:5'-atggtgcttgtaatcccaatt-3'(서열번호 31), 1457-R:5'-ttgcccaaactcccatta-3'(서열번호 32), 19-F:5'-aaaaaaggagagtttgctaagaatc-3'(서열번호 33), 19-R:5'-atactgagcagttcaggaattagatatt-3'(서열번호 34), 2934-F:5'-agttctactaatattgaggtgggga-3'(서열번호 35), 2934-R:5'-aataaaagccacagaattcatca-3'(서열번호 36), 3972-F:5'-taccgacctgagctggatc-3'(서열번호 37), 3972-R:5'-catccaggccttccttca-3'(서열번호 38), 30-F:5'-caggaaacagctatgaccgtagccactccgagccttag-3'(서열번호 39), 30-R:5'-tgtaaaacgacggccagtggaatcagacctggatgaaaa-3'(서열번호 40), 12-F:5'-cccacaggctgcacaccat-3'(서열번호 41), 12-R:5'-tgttactgttgagcaagggtta-3'(서열번호 42)
그럼 다음, 이를 유전형 분석프로그램에 입력하고, 12곳의 SNP 위치(MRP2 유전자의 전사 시작점을 기준하여 상부로 1774번째 염기(실험군 11), 전사 시작점 기준하여 상부로 1549번째 염기(실험군 12), 전사 시작점 기준하여 상부로 24번째 염기(실험군 13), 전사 시작점 기준하여 상부로 23번째 염기(실험군 14), 액손 4를 기준하여 상부로 49번째 염기(실험군 15), 액손 10의 1249번째 염기(실험군 16), 액손 10의 1457번째 염기(실험군 17), 액손 19를 기준으로 하부로 3번째 염기(실험군 18), 액손 22의 2934번째 염기(실험군 19), 액손 28의 3972번째 염기(실험군 20), 액손 30을 기준하여 상부로 35번째 염기(실험군 21) 및 액손 31을 기준으로 하부로 12번째 염기(실험군 22))에서 유전적 다형을 분석하여, 이들의 분석결과를 비교하였다(참조: 표 1b).
파클리탁셀 방출스텐트를 시술받은 환자에 있어서, MRP2 유전자의 SNP 위치에 따른 유전자형 분포 및 혈관재협착율의 비교
실험군 유전자형 형질　 restenosis(-)a n=91 restenosis(+)b n=15 P 값*
실험군 11 야생형 G/G 41 7 0.0010
이형접합 G/Del 45 3
변이형 Del/Del 5 5
실험군 12 야생형 AA 4 1 0.0110
이형접합 AG 42 1
변이형 GG 42 13
실험군 13 야생형 CC 43 13 0.0100
이형접합 CT 43 1
변이형 TT 3 1
실험군 14 야생형 GG 90 14 0.1420
이형접합 GA 1 1
변이형 AA 0 0
실험군 15 야생형 CC 42 13 0.0080
이형접합 CT 45 1
변이형 TT 4 1
실험군 16 야생형 GG 73 11 0.5180
이형접합 GA 15 4
변이형 AA 3 0
실험군 17 야생형 CC 90 15 0.6830
이형접합 CT 1 0
변이형 TT 0 0
실험군 18 야생형 AA 91 15 .
이형접합 AG 0 0
변이형 GG 0 0
실험군 19 야생형 GG 84 15 0.5880
이형접합 GA 5 0
변이형 AA 1 0
실험군 20 야생형 CC 42 13 0.0080
이형접합 CT 45 1
변이형 TT 4 1
실험군 21 야생형 GG 89 15 0.8570
이형접합 GA 1 0
변이형 AA 0 0
실험군 22 야생형 GG 88 17 .
이형접합 GA 0 0
변이형 AA 0 0
a: 혈관재협착이 발생하지 않음
b: 혈관재협착이 발생함
*: P<0.05인 경우 유의함
상기 표 1b에서 보듯이, MRP2 유전자 전사 시작점을 기준하여 상부로 1774번째 염기가 파클리탁셀 방출스텐트 시술에 의한 혈관재협착과 관련성이 있을 것으로 예측되었다.
실시예 2: 반수체형(haplotype) 분석
전기 실시예 1-1의 결과에서, 파클리탁셀 방출스텐트 시술에 의한 혈관재협착과 관련성이 있을 것으로 예측된 MDR1 유전자의 21번 액손의 G2677T/A 및 26번 액손의 C3435T를 대상으로 하여 이들의 반수체형 분석을 수행하였다.
즉, 전기 실시예 1의 106명의 관상동맥질환 환자로부터 수득한 각각의 게놈 DNA 중에서, 21번 액손 및 26번 액손의 염기서열 데이터를 바이에시안 알고리즘(Bayesian algorithm)에 기초한 반수체 프로그램(Haploview 3.2, Broad Institute of Harvard and MIT, USA) 프로그램에 입력하고, 그 결과를 분석하였다(참조: 표 2).
MDR1 유전자의 반수체형 분석결과 및 비교
하플로형 Restenosis(+)a Restenosis(-)b P 값*
GC 13(43.1%) 120(65.8%) 0.0173
TT 16(53.1%) 54(29.6%) 0.0113
TC 0(0.0%) 4(2.3%) 0.4628
GT 1(0.3%) 4(2.3%) 0.6775
합계 30 182
a: 혈관재협착이 발생하지 않음
b: 혈관재협착이 발생함
*: p<0.05 인 경우 유의함
상기 표 2에서 보듯이, MDR1 유전자의 반수체형 분석을 수행한 결과, 4종의 반수체형이 검출되었다. 이 중에서도, P값을 감안한다면, TT 반수체형은 파클리탁셀 방출스텐트 시술에 의한 혈관재협착과 밀접한 관련성이 있을 것으로 예측되었다(P = 0.0113).
실시예 3: 환자의 기초생리적 데이터 분석
실시예 3-1: MDR1 유전자 21번 액손의 G2677T/A 및 26번 액손의 C3435T을 대상으로 한 기초생리적 데이터 분석
전기 실시예 1-1에서 선별된 21번 액손의 G2677T/A에서 유전적 다형을 가지는 환자중에서 42명의 GG/AA 다형과 61명의 GT/TT 다형, 및 26번 액손의 C3435T에서 유전적 다형을 가지는 환자중에서 44명의 CC 다형과 62명의 CT/TT 다형을 대상으로, 이들의 연령(A), 성비(S), 당뇨병 환자 비율(D), 고혈압 환자 비율(H), 흡연자 비율(Sk) 및 이전에 급성심근경색증의 병력이 있는 환자의 비율(Hm)과 같은 기초생리적 데이터를 비교하였다(참조: 표 3a).
MDR1 유전자의 유전자형에 따른 환자의 기초생리적 데이터 비교
G2677T/A P값* C3435T P값
GG/AA(42) GT/TT(61) CC(44) CT/TT(62)
A S(M:F) D(%) H(%) Sk(%) Hm(%) 60.3±10.2 29:13 14(33.3%) 25(59.5%) 8(19.0%) 8(19.0%) 60.2±8.8 49:12 13(21.3%) 28(45.9%) 16(26.2%) 7(11.5%) 0.955 0.189 0.173 0.174 0.350 0.255 60.0±8.9 30:14 14(32.6%) 24(55.8%) 8(18.6%) 7(15.9%) 59.8±9.8 49:13 14(22.6%) 30(48.4%) 17(27.4%) 14(22.2%) 0.903 0.360 0.271 0.552 0.356 0.492
*: P<0.05인 경우 유의함
상기 표 3a에서 보듯이, 환자의 기초생리적 데이터는 유전자형에 따라 유의한 차이를 나타내지 않았다.
실시예 3-2: MRP2 유전자 전사 시작점을 기준하여 상부로 1774번째 염기를 대상으로 한 기초생리적 데이터 분석
전기 실시예 1-2에서 선별된 MRP2 유전자 전사 시작점을 기준하여 상부로 1774번째 염기에서 유전적 다형을 가지는 환자를 대상으로 하는 것을 제외하고는, 전기 실시예 3-1의 방법으로 환자들의 기초생리적 대이터를 분석하였다(참조: 표 3b).
MRP2 유전자의 유전자형에 따른 환자의 기초생리적 데이터 비교
MRP2_-1774G/Del P값*
GG(48) G/Del(48) Del/Del(10)
A S(M:F) D(%) H(%) Sk(%) Hm(%) 60.0±8.9 37:11 15 30 9 8 60.3±10.2 36:12 10 21 14 7 59.8±9.8 7:3 3 4 3 0 0.903 0.889 0.828 0.135 0.453 0.386
*: P<0.05인 경우 유의함
상기 표 3b에서 보듯이, 환자의 기초생리적 데이터는 유전자형에 따라 유의한 차이를 나타내지 않았다.
실시예 4: 환자의 관상혈관조영술 데이터의 정량분석
실시예 4-1: 21번 액손의 G2677T/A 및 26번 액손의 C3435T을 대상으로 한 관상혈관조영술 데이터의 정량분석
전기 실시예 1-1에서 선별된 21번 액손의 G2677T/A에서 유전적 다형을 가지는 환자중에서 42명의 GG/AA 다형과 61명의 GT/TT 다형, 및 26번 액손의 C3435T에서 유전적 다형을 가지는 환자중에서 44명의 CC 다형과 62명의 CT/TT 다형을 대상으로, 관상혈관조영술 데이터(다중스텐트 시술율(MS), B2/C형 병변의 발생율(BC), 시술전 평균 기준직경(pre-RD), 시술직후 평균 최소내경(post-MLD), 시술전 병변 길이(pre-LL), acute gain(AG), 스텐트내에서의 재협착율(STR), 스텐트 주변부에서의 재협착율(SGR), 9개월 경과후(FU) 평균 기준직경(FU-RD), 9개월 경과후 평균 최소내경(FU-MLD), late loss(LL) 및 loss index(LI))를 측정하고, 측정된 값을 정량분석시스템(quantitative coronary angiography system, Inturis DICOM Recorder, ModuleInfo, Philips, Netherlands)에 입력하여, 정량분석을 수행하였다(참조: 표 4a). 이때, AG는 최종 스탠트 시술이후의 최소내경(post-MLD)과 스텐트 시술이전의 최소내경의 차이를 의미하고, LL은 post-MLD와 FU-MLD의 차이를 의미하며, LI는 상기 LL값을 AG값으로 나눈 결과값을 의미한다.
MDR1 유전자에서 유전자형에 따른 환자의 관상혈관조영술 데이터 비교
G2677T/A P값 C3435T P값*
GG/AA(42) GT/TT(61) CC(44) CT/TT(62)
MS(%) BC(%) pre-RD(mm) post-MLD(mm) pre-LL(mm) AG(mm) STR(%) SGR(%) FU-RD(mm) FU-MLD(mm) LL(mm) LI 8(19.0%) 31(73.8%) 2.86±0.44 2.65±0.49 25.8±14.4 2.00±0.47 1(2.4%) 2(4.8%) 2.88±0.43 2.48±0.59 0.16±0.58 0.07±0.29 10(16.4%) 41(67.2%) 2.86±0.45 2.72±0.44 21.3±12.2 2.00±0.53 14(22.9%) 14(22.9%) 2.84±0.47 2.23±0.76 0.48±0.73 0.23±0.45 0.727 0.473 0.950 0.420 0.089 0.956 0.004 0.012 0.690 0.087 0.022 0.047 9(20.5%) 31(72.1%) 2.82±0.41 0.62±0.47 25.8±14.9 2.00±0.48 0(0%) 1(2.3%) 2.87±0.39 2.48±0.52 0.14±0.54 0.05±0.26 9(14.5%) 41(66.1%) 2.87±0.46 0.76±0.47 20.9±11.5 1.98±0.51 14(22.6%) 14(22.6%) 2.87±0.50 2.23±0.81 0.49±0.73 0.25±0.46 0.341 0.345 0.586 0.122 0.064 0.768 0.001 0.004 0.990 0.072 0.009 0.017
*: p<0.05 인 경우 유의함
상기 표 4a에서 보듯이, 두 가지 유전자형에 존재하는 T 형질이 스텐트 시술후 재협착과 중요한 연관성이 있는 것으로 분석되었다.
특히, LI 값은 스텐트 시술이후에 발생하는 재협착 정도를 직접적으로 나타내는 값으로서, LI 값이 클수록 재협착율이 증가한다고 간주될 수 있다. 따라서, 상기 표 4a의 LI 값을 참조한다면, 최소한 하나의 T 형질을 갖는 유전적 다형을 갖는 환자가 T 형질을 갖지 않는 환자보다 재협착율이 약 3 내지 5배 정도 증가함을 확인하였다.
실시예 4-2: MRP2 유전자 전사 시작점을 기준하여 상부로 1774번째 염기를 대상으로 한 관상혈관조영술 데이터의 정량분석
전기 실시예 1-2에서 선별된 MRP2 유전자 전사 시작점을 기준하여 상부로 1774번째 염기에서 유전적 다형을 가지는 환자를 대상으로 하는 것을 제외하고는, 전기 실시예 4-1의 방법으로 환자들의 관상혈관조영술 데이터(LL 및 LI)를 수득하고, 이를 정량분석하였다(참조: 표 4b).
MRP2 유전자에서 유전자형에 따른 환자의 관상혈관조영술 데이터 비교
MRP2_-1774G/Del P값*
GG(48) G/Del(48) Del/Del(10)
LL(mm) LI 0.508 0.254 0.108 0.015 0.981 0.598 0.001 <0.001
*: p<0.05 인 경우 유의함
상기 표 4b에서 보듯이, MRP2 유전자 전사 시작점을 기준하여 상부로 1774번째 염기가 제거된 경우에는, 스텐트 시술후 재협착발생율이 유의하게 증가되는 것으로 분석되었다.
특히, LI 값을 참조한다면, MRP2 유전자 전사 시작점을 기준하여 상부로 1774번째 염기가 제거된 경우에는, 상기 염기가 제거되지 않은 환자보다 재협착율이 약 2배 이상으로 증가함을 확인하였다.
실시예 5: 유전자형 분석 키트의 제조
전기 실시예 1 내지 4의 결과에서 보듯이, MDR1 유전자 및 MRP2 유전자의 특정부위의 유전적 다형을 분석하면, 파클리탁셀 방출스텐트의 시술시 혈관재협착의 발생여부를 예측할 수 있었으므로, 전기 유전자의 유전적 다형을 분석할 수 있도록, 전기 d전적 다형을 검출할 수 있는 DNA칩 및 시료로부터 수득한 mRNA로 부터 cDNA를 수득하는데 이용되는 형광표지된 데옥시 뉴클레오타이드를 포함하는, 유전자형 분석 키트를 제조하였다.
먼저, MDR1 전기 21번 액손의 G2677T/A과 26번 액손의 C3435T 및 MRP2 유전자의 전사 시작점을 기준하여 상부로 1774번째 염기의 유전적 다형을 분석할 수 있는 분석용 탐침을 작제하였으며, 탐침의 염기서열은 다음과 같다.
2677F: 5'-caggaaacagctatgacctattcgaagagtgggcacaa-3'(서열번호 43)
2677R: 5'-tgtaaaacgacggccagttccaagaactggctttgct-3'(서열번호 44)
3435F: 5'-tgtttgactgcag-3'(서열번호 45)
3435R: 5'-tttatttgaagagagacttacattaggc-3'(서열번호 46)
1774F: 5‘-agattcatgacttcctggctcctt-3'(서열번호 47)
1774R: 5‘-acaacaattctccttcctcacacg-3'(서열번호 48)
그런 다음, 올리고(dT)15, -(CH2)6- 및 아민(amine)기가 순차적으로 연결된 링커를 작제한 다음, 전기 수득한 각 탐침의 5' 말단을 링커의 티민부위에 연결시켰다.
이어, 전기 링커와 연결된 탐침을 완충용액(350mM sodium bicarbonate, pH 9.0)에 각각 50μM로 용해시키고, 알데히드가 부착된 슬라이드(silylated slide, CSS-100, CEL, USA) 표면에 어레이어(MicroGrid II, BioRobotics, USA)를 이용하여 크기 150㎛, 간격 400㎛로 점적한 후, 시프염기 반응을 수행하였다. 이어, 0.2%(w/v) SDS용액과 3차 증류수를 이용하여 순차적으로 세척하고, NaBH4 용액(0.1g NaBH4, 30㎖ PBS, 10㎖ ethanol)에 15분 동안 침지하여, 아민이 결합되지 않은 알데히드 잔기를 환원시킨 후, 3차증류수로 세척하고 건조시켜서 DNA 칩을 제조하였다.
한편, 시료에서 채취한 RNA로부터 합성된 cDNA를 표지하기 위하여 형광표지된 데옥시 뉴클레오타이드인 시아닌 5 dGTP(Cyanine 5 dGTP, Amersham, GB)를 준비하였다.
실시예 6: 유전자형 분석키트를 이용한 혈관재협착 환자의 선별
실시예 1의 파클리탁셀 방출스텐트를 시술하고 혈관재협착 증세를 나타내는 환자 40인(실험군 31) 및 실시예 1의 파클리탁셀 방출스텐트를 시술하고 혈관재협착 증세를 나타내지 않는 환자 40인(실험군 32)으로부터 각각 채혈하여 혈액을 수득하고, 수득한 각 혈액을 RNA 추출키트(Micro-to-Midi Toㅂtal RNA purification system, Life Technologies, USA)에 적용하여, 각각의 mRNA를 분리하였다. 분리된 각각의 mRNA를 역전사 키트(Platinum Biochip Reagent Kit, Genocheck, 한국) 및 전기 실시예 5에서 제작한 키트에 포함된 시아닌 5 dGTP를 이용하여 전기 분리된 mRNA로부터 형광표지된 각각의 cDNA를 합성하였다.
이어, 전기 실시예 5에서 제조된 DNA 칩에 전기 합성된 각 cDNA를 가하고, 혼성화반응을 12시간동안 수행한 후, 혼성화반응이 종결된 DNA 칩을 평판 스캐너(GenePix Scanner 4000A, Axon Inc, USA)으로 스캔하여, 전기 DNA 칩에 구비된 탐침 중에서 형광발색반응을 나타내는 탐침의 수를 계수하고, 이로부터 발색반응 탐침의 평균비율을 측정하였다(참조: 표 5).
DNA 칩에 의하여 검출된 각 시료의 평균 발색반응 비율(%)
실험군 평균 발색반응 비율
실험군 31 80.6
실험군 32 13.4
상기 표 5에서 보듯이, 전기 실시예 6에서 제조한 유전자형 분석키트에 포함된 DNA 칩은 파클리탁셀 방출스텐트를 시술하고 혈관재협착 증세를 나타내는 환자로부터 수득한 시료에 대하여는 높은 비율로 발색반응을 나타내었으나, 파클리탁셀 방출스텐트를 시술하고 혈관재협착 증세를 나타내지 않는 환자로부터 수득한 시료에 대하여는 지극히 낮은 비율로 발색반응을 나타냄을 확인하였다.
따라서, 스텐트의 시술 이전에 본 발명의 유전자형 분석키트를 이용하여, 환자의 유전자형을 미리 확인하면, 환자가 파클리탁셀 방출스텐트의 시술에 적합한지의 여부를 확인할 수 있을 것으로 분석되었다.
이상에서 상세히 설명하고 입증하였듯이, 본 발명은 MDR1 유전자 및 MRP2 유전자의 유전적 다형을 분석할 수 있는 DNA 칩 및 전기 DNA칩을 포함하는 유전자형 분석키트를 제공한다. 본 발명의 유전자형 분석용 키트를 이용하면, 파클리탁셀 방출스텐트를 시술한 환자에게서 혈관재협착이 발생할 것인지의 여부를 미리 예측할 수 있으므로, 보다 안전한 스텐트 시술에 널리 활용될 수 있을 것이다.
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Claims (3)

  1. (ⅰ) 사람의 MDR1 유전자 및 MRP2 유전자와 특이적으로 결합할 수 있고, 서열번호 43 내지 48의 염기서열을 갖는 유전자 탐침;
    (ⅱ) 올리고(dT)15, -(CH2)6- 및 아민(amine)기를 순차적으로 포함하고, 전기 유전자 탐침의 5' 말단이 올리고(dT)15의 3'말단부위에 연결된 링커; 및,
    (ⅲ) 표면에 알데히드가 결합되고, 전기 링커의 아민기가 표면의 알데히드기와 시프염기(Schiff's base)반응을 통해 연결된 고체를 포함하는, MDR1 유전자 및 MRP2 유전자의 유전자형 분석용 DNA 칩.
  2. 제 1항의 유전자형 분석용 DNA 칩 및 시료에서 채취한 RNA로부터 합성된 cDNA를 표지하기 위하여 형광표지된 데옥시 뉴클레오타이드를 포함하는, MDR1 유전자 및 MRP2 유전자의 유전자형 분석용 키트.
  3. 제 2항에 있어서,
    형광표지된 데옥시 뉴클레오타이드는 텍사스 레드(Texas Red) dATP, 시아닌 3(cyanine 3) dCTP, 시아닌 5(cyanine 5) dGTP 또는 플루오레세인-12(fluorescein- 12) dUTP인 것을 특징으로 하는
    유전자형 분석용 키트.
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KR20040008816A (ko) * 2002-07-19 2004-01-31 한미약품 주식회사 파클리탁셀 또는 그의 유도체와 ｐ-당단백질 저해제를함유하는 혈관재협착 방지를 위한 경구투여용 약학 조성물
KR20040050915A (ko) * 2001-10-15 2004-06-17 헤모텍 게엠베하 재협착증의 방지를 위한 스텐트의 코팅

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