KR100754398B1 - 심혈관 질환 진단용 다중 ｓｎｐ, 그를 포함하는마이크로어레이 및 키트 및 그를 이용한 심혈관 질환 진단방법 - Google Patents

심혈관 질환 진단용 다중 ｓｎｐ, 그를 포함하는마이크로어레이 및 키트 및 그를 이용한 심혈관 질환 진단방법 Download PDF

Info

Publication number
KR100754398B1
KR100754398B1 KR1020060018449A KR20060018449A KR100754398B1 KR 100754398 B1 KR100754398 B1 KR 100754398B1 KR 1020060018449 A KR1020060018449 A KR 1020060018449A KR 20060018449 A KR20060018449 A KR 20060018449A KR 100754398 B1 KR100754398 B1 KR 100754398B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
seq
cardiovascular disease
snp
polynucleotide
present
Prior art date
Application number
KR1020060018449A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20060119737A (ko
Inventor
남윤순
최승학
김재흡
박경희
이연수
전효정
송옥렬
안태진
이규상
Original Assignee
삼성전자주식회사
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 삼성전자주식회사 filed Critical 삼성전자주식회사
Priority to US11/435,662 priority Critical patent/US7732139B2/en
Priority to JP2008512217A priority patent/JP2008545387A/ja
Priority to PCT/KR2006/001829 priority patent/WO2006123885A1/en
Priority to EP06768500A priority patent/EP1883711A4/en
Publication of KR20060119737A publication Critical patent/KR20060119737A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR100754398B1 publication Critical patent/KR100754398B1/ko

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6834—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase
    • C12Q1/6837—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase using probe arrays or probe chips
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

본 발명은 서열번호 1 내지 35로 구성된 폴리뉴클레오티드들에 있어서 각 SNP 위치(서열번호 4의 경우 76번째, 서열번호 8의 경우 85번째, 서열번호 9의 경우 51번째, 서열번호 10의 경우 35번째, 서열번호 19의 경우 85번째 및 나머지 서열번호의 경우 101번째) 염기를 포함하는 10개 이상의 연속 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드들로부터 선택되는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드를 포함하는 심혈관 질환 진단용 다중 SNP를 제공한다. 또한, 본 발명은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 마이크로어레이 및 키트 및 상기 폴리뉴클레오티드를 이용한 심혈관 질환 진단 방법을 제공한다. 본 발명에 의하면, 심혈관 질환의 발병 또는 발병 가능성을 조기에 효과적으로 진단할 수 있다.
SNP(single nucleotide polymorphism), 심혈관 질환, 심근경색증, 폴리뉴클레오티드, 다중 SNP

Description

심혈관 질환 진단용 다중 ＳＮＰ, 그를 포함하는 마이크로어레이 및 키트 및 그를 이용한 심혈관 질환 진단 방법{Multiple SNP for diagnosing cardiovascular disease, microarray and kit comprising the same, and method for diagnosing cardiovascular disease using the same}
본 발명은 심혈관 질환 진단용 다중 SNP, 그를 포함하는 마이크로어레이 및 키트 및 그를 이용한 심혈관 질환 진단 방법에 관한 것이다.
모든 생물의 게놈은 진화의 과정에서 자손의 서열에 변이체를 생기게 하는 자발적 돌연변이를 겪는다(Gusella, Ann. Rev. Biochem . 55, 831-854, 1986). 변이체는 자손 형태에 비하여 진화적으로 이익 또는 불이익을 주거나 중성적일 수 있다. 어떤 경우는 변이체가 치사적 불이익을 주어 자손에게 전달되지 않는 경우도 있다. 다른 경우에는, 종에게 진화학적인 이익을 주고, 결국에는 종의 대부분에 DNA가 삽입되어 효과적으로 선조 형태가 된다. 많은 경우 이 선조 형태 및 변이체는 살아남아 종집단 중에 공존하게 된다. 서열의 복수 형태의 공존에 의하여, 다형(polymorphism)이 발생한다.
이러한 다형에는 RFLP(restriction fragment length polymorphism), STR(short tandem repeats) 및 SNP(single nucleotide polymorphism) 등이 알려져 있다. 이중 SNP는 동일한 종의 개체 사이의 단일뉴클레오티드 변이의 형태를 취한다. SNP는 코딩 영역 서열에 발생하는 경우, 다형 형태 중 어느 하나에 의하여 결함 있거나 변이된 단백질이 발현될 수도 있다. 다른 경우에는 비코딩 영역 서열에 SNP가 발생할 수 있다. 이들 중 일부는 예컨대, 결함 있는 스플라이싱의 결과로서 결함 있거나 변이된 단백질의 발현을 초래할 수 있다. 어떤 SNP는 표현형에 아무런 영향을 미치지 않을 수도 있다.
SNP는 인간의 경우 약 1,000bp 마다 1회의 빈도로 발생하는 것으로 알려져 있다. 이들 SNP가 질병과 같은 표현형에 영향을 미치는 경우, 상기 단일 염기 다형을 포함하는 폴리뉴클레오티드는 이러한 질병을 진단하는 데에 프라이머 또는 프로브로서 사용될 수 있다. 상기 SNP에 특이적으로 결합하는 모노클로날 항체 또한, 질병의 진단에 사용될 수 있다. 현재 여러 연구 기관에서 단일염기 분석 및 그 기능 분석에 관한 연구를 수행하고 있다. 이렇게 찾아낸 SNP의 염기서열 및 기타 실험결과를 데이터베이스화하여 공개, 누구나 접근하여 연구에 이용할 수 있도록 하고 있다.
그러나 이러한 SNP는 단순히 인간의 게놈 또는 cDNA 상에 SNP가 존재한다는 것만을 발견하였을 뿐, 이들이 표현형에 미치는 영향을 밝힌 것은 아니었다. 이들 중 일부에 대하여는 그 기능이 알려진 것도 있으나, 대부분이 알려지지 않았다.
심혈관 질환(cardiovascular disease)은 전세계적으로 산업화된 국가들에서 주요 사망 원인이고, 우리나라에서도 1970년대부터 주요 사망 원인이 되고 있다. 통계청에 따르면, 2003년 한해 동안 우리나라 전체 사망자(24만 6천명)의 9.1%인 2만 2천명(10만명당 사망률 9087명)이 심장질환 및 고혈압으로 사망하여 암(1위) 및 뇌혈관 질환(2위)에 이어 사망원인 순위 3위를 기록하였다.
심혈관 질환은 심근경색증, 협심증, 죽상경화증, 고혈압, 심부전, 동맥류, 동맥경화증, 색전증, 뇌졸중 및 혈전증을 포함한다.
심혈관 질환 중에 중요한 부분을 차지하는 관상동맥질환은 대개 동맥경화에 의해서 심장에 혈액을 공급하는 관상동맥이 막히거나, 좁아져서 발생한다. 동맥경화에 의해 관상동맥이 완전히 막히는 것을 심근경색증, 좁아지는 것을 협심증이라고 한다. 관상동맥질환의 원인으로는 고지혈증(고콜레스테롤혈증), 고혈압, 흡연, 당뇨, 유전, 비만, 운동부족, 스트레스 및 여성의 폐경 등이 알려져 있다. 여러 가지 위험 요인을 복합적으로 가질수록 병의 위험도 증가한다. 다른 많은 질병들과 마찬가지로 심혈관 질환도 유전적 요인에 큰 영향을 받는다.
종래 심혈관 질환을 비롯한 복잡한 질병을 진단 혹은 조기 예측하는데 가장 큰 문제점은 이들 질환은 어느 정도 진행되어야 물리적인 방법을 사용하여 진단해 낼 수 있다는 것이다. 현재 심혈관 질환의 경우 조영 장비를 이용하여 심장 내부 및 관상동맥을 X-선 및 초음파 촬영하여 진단을 하고 있지만, 이는 발병 후에야 진단이 가능하다. 그러나, 최근의 여러 가지 분자생물학적 기술의 발전과 인간 유전체에 대한 연구가 1차적으로 완료됨에 따라 질병과 직접 또는 간접적으로 관련있는 유전자 혹은 유전적 변이를 찾아내어 질병의 조기진단에 사용할 수 있게 됨으로써, 기존의 표현형 혹은 외형적인 질병의 특징에 의존하던 진단법으로부터 유전적 요인 을 가지고 질병의 발병 여부를 예측할 수 있는 조기진단이 가능하게 되었다.
본 발명자들은 심혈관 질환의 발병 및 그의 확률을 조기에 진단할 수 있는 SNP를 발굴하기 위하여 연구를 계속하던 중, 심혈관 질환이 발병된 개체들의 경우 특정 SNP들을 동시에 갖고 있고 상기 특정 SNP들을 이용하여 심혈관 질환의 발병 확률 및 유전적 감수성을 예측할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 심혈관 질환 진단용 다중 SNP를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 다중 SNP의 폴리뉴클레오티드와 혼성화하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 폴리뉴클레오티드, 그에 의해 코딩되는 폴리펩티드 또는 그의 cDNA를 포함하는 심혈관 질환 진단용 마이크로어레이를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 마이크로어레이를 포함하는 심혈관 질환 진단용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 다중 SNP를 이용하는 심혈관 질환을 진단하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1 내지 35로 구성된 폴리뉴클레오티드들에 있어서 각 SNP 위치 염기를 포함하는 10개 이상의 연속 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드들로부터 선택되는 하나 이상의 폴리뉴클레오티 드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드를 포함하는 심혈관 질환 진단용 다중 SNP를 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드와 혼성화하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드 또는 그들과 혼성화하는 폴리뉴클레오티드, 그에 의해 코딩되는 폴리펩티드 또는 그의 cDNA를 포함하는 심혈관 질환 진단용 마이크로어레이를 제공한다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 마이크로어레이를 포함하는 심혈관 질환 진단용 키트를 제공한다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 a) 피검체로부터 핵산 시료를 분리하는 단계; 및 b) 서열번호 1 내지 35 중에서 선택되는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드의 각 다형성 부위의 유전자형을 결정하는 단계;를 포함하는 심혈관 질환 진단 방법을 제공한다.
이하 본 발명을 보다 상세히 설명한다.
본 발명의 일면은 심혈관 질환 진단용 다중 SNP에 관한 것이다.
본 발명에 따른 심혈관 질환 진단용 다중 SNP는 서열번호 1 내지 35로 구성된 폴리뉴클레오티드들에 있어서 각 SNP 위치(서열번호 4의 경우 76번째, 서열번호 8의 경우 85번째, 서열번호 9의 경우 51번째, 서열번호 10의 경우 35번째, 서열번호 19의 경우 85번째 및 나머지 서열번호의 경우 101번째) 염기를 포함하는 10개 이상의 연속 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드들로부터 선택되는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 한다.
<표 1>
SNP의 NCBI 젠 뱅크 등록번호 SNP가 포함된 폴리뉴클레오티드 SNP의 NCBI 젠 뱅크 등록번호 SNP가 포함된 폴리뉴클레오티드
rs4459610 서열번호 1 rs731710 서열번호 19
rs20568 서열번호 2 rs991827 서열번호 20
rs5050 서열번호 3 rs1566307 서열번호 21
rs1404396 서열번호 4 rs1467523 서열번호 22
rs511678 서열번호 5 rs378660 서열번호 23
rs1916382 서열번호 6 rs1546642 서열번호 24
rs995717 서열번호 7 rs209176 서열번호 25
rs2611 서열번호 8 rs1056409 서열번호 26
rs1805564 서열번호 9 rs1859754 서열번호 27
rs1469876 서열번호 10 rs1527509 서열번호 28
rs251692 서열번호 11 rs1028140 서열번호 29
rs1409765 서열번호 12 rs1983628 서열번호 30
rs889179 서열번호 13 rs557831 서열번호 31
rs882432 서열번호 14 rs1194029 서열번호 32
rs1801 서열번호 15 rs388332 서열번호 33
rs973126 서열번호 16 rs2055018 서열번호 34
rs361594 서열번호 17 rs1557771 서열번호 35
rs734072 서열번호 18
SNP(단일염기다형; single nucleotide polymorphism)는 개인과 개인간의 DNA에 존재하는 한 염기쌍(single base-pair variation)의 차이로 DNA 서열 다형성(polymorphism) 중에서 가장 많이 존재하는 형태이다(약 1개/1kb).
또한, 상기 SNP의 NCBI 젠 뱅크 등록번호는 상기 각 SNP의 서열 및 그 위치를 나타내는 것이다. 당업자라면 상기 등록번호를 이용하여 SNP의 위치 및 서열을 용이하게 확인할 수 있을 것이다. NCBI에 등록되어 있는 SNP의 rs 번호에 해당하는 구체적인 서열은 시간이 지남에 따라 약간 변경될 수 있다. 본 발명의 범위가 상기 변경된 서열에도 미치는 것은 당업자에게 자명할 것이다.
또한, 상기 서열번호 1 내지 35은 상기 SNP 부위의 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드이다. 상기 폴리뉴클레오티드 및 상기 폴리뉴클레오티드에 존재하는 각 SNP의 특성에 관하여는 하기 표 2에 기재되어 있다.
상기 서열번호 1 내지 35는 다형성 부위를 포함하는 다형성 서열이다. 다형성 서열(polymorphic sequence)이란 폴리뉴클레오티드 서열 중에 SNP를 나타내는 다형성 부위(polymorphic site)를 포함하는 서열을 말한다. 상기 폴리뉴클레오티드 서열은 DNA 또는 RNA가 될 수 있다.
<표 2>
SNP의 NCBI 젠 뱅크 등록번호 SNP가 포함된 폴리뉴클레오티드 다중 SNP 참여 횟수 밴드 유전자 SNP 역할
rs4459610 서열번호 1 1 17q23.3 ACE 코딩 엑손
rs20568 서열번호 2 1 3q13.33 ADPRH 코딩 엑손
Rs5050 서열번호 3 1 1q42.2 AGT 프로모터
rs1404396 서열번호 4 1 7p21.1 ANKMY2 인트론
rs511678 서열번호 5 1 1q32.2 CR2 인트론
rs1916382 서열번호 6 1 10q21.3 CTNNA3 인트론
rs995717 서열번호 7 1 21q22.13 DSCR4 인트론
Rs2611 서열번호 8 1 10q22.1 FLJ22761 엑손
rs1805564 서열번호 9 1 3q26.33 FXR1 인트론
rs1469876 서열번호 10 1 1p31.3 KIAA1573 인트론
rs251692 서열번호 11 1 19q13.32 LIG1 엑손
rs1409765 서열번호 12 1 1p31.1 LPHN2 인트론 (boundary)
rs889179 서열번호 13 1 19p13.2 MGC15716 3' UTR
rs882432 서열번호 14 1 22q12.1 MYO18B 인트론
Rs1801 서열번호 15 1 4q24 NFKB1 인트론
rs973126 서열번호 16 1 4q25 PAPSS1 코딩 엑손
rs361594 서열번호 17 1 22q11.21 PEX26 3' UTR
rs734072 서열번호 18 1 3p21.31 SCOTIN 인트론
<표 2(계속)>
SNP의 NCBI 젠 뱅크 등록번호 SNP가 포함된 폴리뉴클레오티드 다중 SNP 참여 횟수 밴드 유전자 SNP 역할
rs731710 서열번호 19 1 16q24.2 SLC7A5 인트론
rs991827 서열번호 20 1 12q24.32
rs1566307 서열번호 21 1 12q24.21
rs1467523 서열번호 22 1 14q22.1
rs378660 서열번호 23 2 16q23.1
rs1546642 서열번호 24 1 2p21
rs209176 서열번호 25 1 6p22.1
rs1056409 서열번호 26 1 9q33.1
rs1859754 서열번호 27 1 7q21.13
rs1527509 서열번호 28 1 21q21.1
rs1028140 서열번호 29 1 2q14.1
rs1983628 서열번호 30 1 20q13.2
rs557831 서열번호 31 1 11q24.2
rs1194029 서열번호 32 1 12q24.32
rs388332 서열번호 33 1 21q22.2
rs2055018 서열번호 34 1 11p14.1
rs1557771 서열번호 35 1 7p21.1
표 2에서 '다중 SNP 참여 횟수'는 각 단일 SNP가 본 발명에 따른 12개의 다중 SNP의 조합에 인용된 횟수를 나타내는 것이다(표 3 참조).
상기 '밴드'는 각 단일 SNP가 위치하는 염색체 번호, 각 염색체 상의 동원체를 중심으로 한 단완(short arm; p) 부분 또는 장완(long arm; q) 부분 및 밴드 번호를 의미한다. 예컨대, 서열번호 1에 포함되어 있는 SNP의 위치는 17q23.3이며, 이는 17번 염색체 상의 장완 부분(q)의 23.3 밴드 상에 존재함을 의미한다.
상기 '유전자'는 각 SNP를 포함하는 유전자를 의미한다.
상기 'SNP의 역할'은 상기 유전자 내에서 상기 각 단일 SNP가 수행하는 역할을 의미한다.
본 발명에 따른 진단용 다중 SNP에 있어서, 상기 하나 이상의 폴리뉴클레오티드가 서열번호 1 내지 35로 구성된 폴리뉴클레오티드들에 있어서 각 SNP 위치(서열번호 4의 경우 76번째, 서열번호 8의 경우 85번째, 서열번호 9의 경우 51번째, 서열번호 10의 경우 35번째, 서열번호 19의 경우 85번째 및 나머지 서열번호의 경 우 101번째) 염기를 포함하는 10개 이상의 연속 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드들로부터 표 3의 조합으로 선택되는 1 내지 12로 구성된 군에서 선택되는 것이 바람직하다.
<표 3>
번호 다중 SNP
1 (서열번호 2, 서열번호 25, 서열번호 3)
2 (서열번호 11, 서열번호 15, 서열번호 35)
3 (서열번호 6, 서열번호 23, 서열번호 16)
4 (서열번호 20, 서열번호 22, 서열번호 13)
5 (서열번호 17, 서열번호 1, 서열번호 31)
6 (서열번호 5, 서열번호 29, 서열번호 8)
7 (서열번호 27, 서열번호 30, 서열번호 32)
8 (서열번호 26, 서열번호 19, 서열번호 7)
9 (서열번호 23, 서열번호 9, 서열번호 28)
10 (서열번호 21, 서열번호 14, 서열번호 4)
11 (서열번호 10, 서열번호 18, 서열번호 33)
12 (서열번호 24, 서열번호 12, 서열번호 34)
본 발명에 따른 심혈관 질환 진단용 다중 SNP에 있어서, 상기 선택된 폴리뉴클레오티드들의 상기 각 SNP 위치(서열번호 4의 경우 76번째, 서열번호 8의 경우 85번째, 서열번호 9의 경우 51번째, 서열번호 10의 경우 35번째, 서열번호 19의 경우 85번째 및 나머지 서열번호의 경우 101번째) 염기의 유전자형이 각각 표 4와 같은 것이 바람직하다.
<표 4>
번호 다중 SNP 대립 유전자형
1 (서열번호 2, 서열번호 25, 서열번호 3) (CC, CC, TG)
2 (서열번호 11, 서열번호 15, 서열번호 35) (CC, GC, TT)
3 (서열번호 6, 서열번호 23, 서열번호 16) (CC, AG, TT or TC)
4 (서열번호 20, 서열번호 22, 서열번호 13) (AA or AC, CG, TT or TG)
5 (서열번호 17, 서열번호 1, 서열번호 31) (TC or CC, TT or TA, TT or TG)
6 (서열번호 5, 서열번호 29, 서열번호 8) (GC, TT or TC, GC)
7 (서열번호 27, 서열번호 30, 서열번호 32) (CC, CC, AA or AG)
8 (서열번호 26, 서열번호 19, 서열번호 7) (TG, TC or CC, GG)
9 (서열번호 23, 서열번호 9, 서열번호 28) (AG, GG, TC or CC)
10 (서열번호 21, 서열번호 14, 서열번호 4) (CT, AG or GG, CT or TT)
11 (서열번호 10, 서열번호 18, 서열번호 33) (TT or TC, CG or GG, AC)
12 (서열번호 24, 서열번호 12, 서열번호 34) (AC, CC or CG, TA)
본 발명에 따른 다중 SNP는 상기 각 단일 SNP들을 조합한 12개의 다중 SNP에 특징이 있다. 상기 각 단일 SNP들의 조합 및 그들의 유전자형은 표 3 및 표 4에 기재되어 있는 바와 같다. 표 3 및 표 4에서, '다중 SNP' 칼럼은 선택된 3개의 단일 SNP의 조합을 나타내는 것이고, '유전자형' 칼럼은 동일한 순서의 각 단일 SNP의 SNP 위치에서의 유전자형을 나타낸다. 예컨대, 표 4의 다중 SNP 1번에 있어서, rs20568의 유전자형은 CC이고, rs209176의 유전자형은 CC이고, rs5050의 유전자형은 TG이다.
본 발명에 있어서, 심혈관 질환은 심근경색증, 협심증, 죽상경화증, 고혈압, 심부전, 동맥류, 동맥경화증, 색전증, 뇌졸중 및 혈전증으로 구성된 군에서 선택될 수 있고, 심근경색증인 것이 바람직하다.
본 발명의 일 실시예에서는 상기 각 단일 SNP들로부터 심혈관 질환 발병과의 연관성이 매우 큰 단일 SNP들의 조합, 즉 다중 SNP를 개발하기 위하여 일련의 선별 과정을 거쳤다. 상기 다중 SNP 선별 과정은 남성을 대상으로 하였다. 즉, 남성 심혈관 질환 환자들 및 남성 정상인들의 혈액으로부터 DNA를 분리 및 증폭하고, 상기 DNA 중 SNP 부위의 서열을 분석한 다음, 남성 심혈관 질환 환자들에서만 특이적으로 나타나지만, 남성 정상인들에게서는 거의 나타나지 않는 SNP의 특정 조합 및 그들의 유전자형을 확인하였다. 본 발명의 실시예에서 확인된 SNP 조합 및 그들의 유전자형을 표 3 및 표 4에 나타내었다. 각 다중 SNP의 특성에 관하여는 하기 표 5에 기재되어 있다.
<표 5>
번호 환자군 출현 빈도 정상군 출현 빈도 오즈비 95% 신뢰 구간
1 30 0 61.3 3.7 1010
2 30 0 61.3 3.7 1010
3 28 0 56.7 3.4 935.5
4 25 0 50 3 826.5
5 25 0 50 3 826.5
6 24 0 47.8 2.9 790.9
7 23 0 45.6 2.8 755.7
8 28 1 27.7 3.7 205.7
9 33 1 33.5 4.5 247.6
10 35 3 11.9 3.6 39.22
11 29 2 14.4 3.4 60.98
12 34 3 11.5 3.5 37.94
표 5에서, '번호'는 다중 SNP의 번호를 나타내는 것으로, 표 3에 기재되어 있는 번호와 동일한 것이다.
'환자군 출현 빈도' 및 '정상군 출현 빈도'는 각각 시험된 221명의 환자 및 192명의 정상인 중 해당 다중 SNP를 갖는 것으로 판명된 환자 및 정상인의 수를 나타낸다.
상기 '오즈비(odds ratio)'는 정상군 중에서 해당 다중 SNP를 가질 확률에 대한 환자군 중에서 해당 다중 SNP를 가질 확률의 비율을 나타낸다. 즉, 오즈비는 ad/bc로서, 상기 식에서 a는 표 5에서 환자군의 출현 빈도를 나타내고, c는 표 5에서 정상군의 출현 빈도를 나타낸다. 그리고 b = [(총 환자군 수) - a]이고, d = [(총 정상군 수) - c]이다. 시험된 환자 및 정상군이 각각 221명 및 192명이므로 결국 b = [221 - a]이고, d = [192 - c]이다.
상기 오즈비가 1을 초과하는 경우 해당 다중 SNP가 환자군과 연관성이 있음을 나타낸다. 오즈비가 클수록 상기 연관성도 증가한다. 표 5에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 다중 SNP 1 내지 12는 11.5 내지 61.3의 오즈비를 갖는다. 이 수치는 1 보다 훨씬 큰 수치이므로, 본 발명에 따른 다중 SNP 1 내지 12는 심혈관 질환의 발병과 큰 연관성이 있음을 알 수 있다.
상기 '95% 신뢰구간'은 해당 오즈비가 존재할 확률이 95%인 구간을 나타내는 것으로, 하기의 식으로 계산된다. 신뢰구간이 1을 포함하는 경우, 즉 신뢰구간의 하계가 1 이하이고 상계가 1 이상인 경우에는 질병과의 연관성을 유의하다고 판단할 수 없다.
- 95% 신뢰구간 = (하계, 상계) = (오즈비×exp(-1.960
Figure 112006013859635-pat00001
), 오즈비×exp(1.960
Figure 112006013859635-pat00002
)) (상기 식에서, V=1/a + 1/b + 1/c +1/d)
본 발명에 따른 심혈관 질환 진단용 다중 SNP는 상기 다중 SNP 각각으로 구성될 수 있고, 보다 바람직하게 2 이상의 다중 SNP로 구성될 수 있고, 가장 바람직하게 상기 다중 SNP 1 내지 12 전부로 구성될 수 있다.
본 발명에 따른 심혈관 질환 진단용 다중 SNP를 구성하는 각 단일 SNP의 폴리뉴클레오티드는 10개 이상의 연속 염기인 것이 바람직하고, 10 내지 100개의 연속 염기인 것이 보다 바람직하다.
본 발명의 다른 일면은 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드와 혼성화하는 심혈관 질환 진단용 대립형질 특이적 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다.
상기 대립형질 특이적(allele-specific) 폴리뉴클레오티드란 각 대립형질에 특이적으로 혼성화하는 것을 의미한다. 즉, 서열번호 1 내지 35의 각 다형성 서열 중의 다형성 부위의 염기를 특이적으로 구별할 수 있도록 혼성화하는 것을 말한다. 상기 혼성화는 엄격한 조건에서 수행된다. 예컨대, 상기 엄격한 조건은 1M 이하의 염 농도 및 25 ℃ 이상의 온도하에서 수행된다. 다르게는, 5×SSPE(750 mM NaCl, 50 mM Na Phosphate, 5 mM EDTA, pH 7.4) 및 25∼30℃의 조건이 대립형질 특이적 프로브 혼성화에 적합할 수 있다. 상기 혼성화 조건은 당업자에 의해 용이하게 변형되어 사용될 수 있을 것이다.
본 발명에 있어서 상기 대립형질 특이적 폴리뉴클레오티드는 프라이머일 수 있다. 여기서 프라이머(primer)란 적절한 버퍼 중의 적절한 조건(예를 들면, 4개의 다른 뉴클레오시드 트리포스페이트 및 DNA, RNA 폴리머라제 또는 역전사 효소와 같은 중합제) 및 적당한 온도 하에서 주형-지시 DNA 합성의 시작점으로서 작용할 수 있는 단일가닥 올리뉴클레오티드를 말한다. 상기 프라이머의 적절한 길이는 사용 목적에 따라 달라질 수 있으나, 통상 15 내지 30 뉴클레오티드이다. 짧은 프라이머 분자는 일반적으로 주형과 안정한 혼성체를 형성하기 위해서는 더 낮은 온도를 필요로 한다. 프라이머 서열은 주형과 완전하게 상보적일 필요는 없으나, 주형과 혼성화할 정도로 충분히 상보적이어야 한다. 상기 프라이머는 그 3′말단이 서열번호 1 내지 35의 다형성 부위와 정렬하는 것이 바람직하다. 상기 프라이머는 다형성 부위를 포함하는 표적 DNA에 혼성화하고, 상기 프라이머가 완전한 상동성을 보이는 대립형질 형태의 증폭을 개시한다. 이 프라이머는 반대편에 혼성화하는 제2 프라이머와 쌍을 이루어 사용된다. 증폭에 의하여 두개의 프라이머로부터 산물이 증폭되고, 이는 특정 대립형질 형태가 존재한다는 것을 의미한다. 본 발명의 프라이머에는 리가제 연쇄 반응(ligase chain reaction : LCR)에서 사용되는 폴리 뉴클레오티드 단편을 포함한다.
본 발명에 있어서, 상기 대립형질 특이적 폴리뉴클레오티드는 프로브일 수 있다. 본 발명에서 프로브(probe)란 혼성화 프로브를 의미하는 것으로, 핵산의 상보성 가닥에 서열 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드를 의미한다. 이러한 프로브에는 Nielsen 등, Science 254, 1497-1500 (1991)에 기재된 펩티드 핵산을 포함한다. 본 발명의 프로브는 대립형질 특이적 프로브로서, 같은 종의 두 구성원으로부터 유래한 핵산 단편 중에 다형성 부위가 존재하여, 한 구성원으로부터 유래한 DNA 단편에는 혼성화하나, 다른 구성원으로부터 유래한 단편에는 혼성화하지 않는다. 이 경우 혼성화 조건은 대립형질간의 혼성화 강도에 있어서 유의한 차이를 보여, 대립형질 중 하나에만 혼성화하도록 충분히 엄격해야 한다. 이러한 본 발명의 프로브는 중앙부위(즉, 15 개의 뉴클레오티드로 된 프로브이면 7번 위치가, 16 개의 뉴클레오티드로 된 프로브이면 8 또는 9번 위치)가 상기 서열의 다형성 부위와 정렬하는 것이 바람직하다. 이렇게 함으로써 다른 대립형질성 형태 간에 좋은 혼성화 차이를 유발할 수 있다. 본 발명의 상기 프로브는 대립형질을 검출하기 위한 진단 방법 등에 사용될 수 있다. 상기 진단 방법에는 서던 블롯팅 등과 같은 핵산의 혼성화에 근거한 검출방법들이 포함되며, 마이크로어레이를 이용한 방법에서 마이크로어레이의 기판에 미리 결합된 형태로 제공될 수도 있다.
본 발명의 다른 일면은 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드 또는 그들과 혼성화하는 폴리뉴클레오티드, 그에 의해 코딩되는 폴리펩티드 또는 그의 cDNA를 포함하는 심혈관 질환 진단용 마이크로어레이에 관한 것이다.
본 발명에 따른 마이크로어레이는 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드를 프로브 또는 그들과 혼성화하는 폴리뉴클레오티드, 그에 의해 코딩되는 폴리펩티드 또는 그의 cDNA를 이용하여 본 분야의 당업자에게 알려져 있는 통상적인 방법에 의해 제조될 수 있다.
예컨대, 상기 폴리뉴클레오티드는 아미노-실란(amino-silane), 폴리-L-라이신(poly-L-lysine) 및 알데히드(aldehyde)로 이루어진 군에서 선택되는 활성기가 코팅된 기판 상에 고정될 수 있다. 또한, 상기 기판은 실리콘 웨이퍼, 유리, 석영, 금속 및 플라스틱으로 이루어진 군에서 선택될 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드를 기판에 고정화시키는 방법으로는 피에조일렉트릭(piezoelectric) 방식을 이용한 마이크로피펫팅(micropipetting) 법, 핀(pin) 형태의 스폿터(spotter)를 이용한 방법 등을 사용할 수 있다.
본 발명의 또 다른 일면은 본 발명에 따른 마이크로어레이를 포함하는 심혈관 질환 진단용 키트에 관한 것이다.
본 발명에 따른 키트는 본 발명의 마이크로어레이 이외에 피검체로부터 해당 SNP를 포함하는 DNA를 분리 및 증폭하는데 사용되는 프라이머 세트를 추가로 포함할 수 있다. 상기 적절한 프라이머 세트는 본 발명의 서열을 참조하여 당업자는 용이하게 설계할 수 있을 것이다. 예컨대, 상기 프라이머 세트로서 표 6에 도시된 것을 이용할 수 있다.
본 발명의 또 다른 일면은 본 발명에 따른 다중 SNP를 이용하는 심혈관 질 환을 진단하는 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 심혈관 질환을 진단하는 방법은 a) 피검체로부터 핵산 시료를 분리하는 단계; 및 b) 서열번호 1 내지 35 중에서 선택되는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드의 각 SNP 위치(서열번호 4의 경우 76번째, 서열번호 8의 경우 85번째, 서열번호 9의 경우 51번째, 서열번호 10의 경우 35번째, 서열번호 19의 경우 85번째 및 나머지 서열번호의 경우 101번째) 염기인 다형성 부위의 유전자형을 결정하는 단계를 포함한다.
본 발명의 방법에 있어서, 피검체로부터 DNA를 분리하는 방법은 당업계에 알려진 방법을 통하여 이루어질 수 있다. 예를 들면, 조직 또는 세포로부터 DNA를 직접적으로 정제하거나 PCR과 같은 증폭 방법을 사용하여 특정한 영역을 특이적으로 증폭하고 이를 분리함으로써 이루어질 수 있다. 본 발명에 있어서, DNA란 DNA 뿐만 아니라 mRNA로부터 합성되는 cDNA도 포함하는 의미이다. 피검체로부터 핵산을 얻는 단계는 예를 들면, PCR 증폭법, 리가제 연쇄 반응(LCR)(Wu 및 Wallace, Genomics 4, 560(1989), Landegren 등, Science 241, 1077(1988)), 전사증폭(transcription amplification) (Kwoh 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 1173(1989)) 및 자가유지 서열 복제 (Guatelli 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 1874(1990)) 및 핵산에 근거한 서열 증폭 (NASBA)이 사용될 수 있다.
분리된 DNA의 염기서열의 결정은 당업계에 알려진 다양한 방법에 의하여 이루어질 수 있다. 예를 들면, 디데옥시 법에 의하여 직접적인 핵산의 뉴클레오티드 서열의 결정을 통하여 이루어지거나 SNP 부위의 서열을 포함하는 프로브 또는 그에 상보적인 프로브를 상기 DNA와 혼성화시키고 그로부터 얻어지는 혼성화 정도를 측정함으로써 다형성 부위의 뉴클레오티드 서열을 결정하는 방법 등이 이용될 수 있다. 혼성화의 정도는 예를 들면, 검출가능한 표지를 표적 DNA에 표지하여, 혼성화된 표적 DNA 만을 특이적으로 검출함으로써 이루어질 수 있으나, 그외 전기적 신호 검출방법 등이 사용될 수 있다. 보다 바람직하게, 상기 b) 단계는 b-1) 상기 피검체로부터 분리한 핵산 시료를 본 발명에 따른 SNP를 포함하는 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드, 또는 그와 혼성화하는 폴리뉴클레오티드와 혼성화 시키는 단계; 및 b-2) 상기 혼성화 결과를 검출하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 심혈관 질환을 진단하는 방법은 c) 상기 서열번호 1 내지 35 중에서 선택되는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드의 다형성 부위의 유전자형이 표 4의 1 내지 12 중 하나 이상인 경우 상기 피검체를 심혈관 질환에 걸릴 확률이 높은 위험군에 속하는 것으로 판정하는 단계를 추가적으로 포함할 수 있다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1
본 발명에 따른 다중 SNP의 선별
본 실시예에서는 한국인 중 심혈관 질환 환자로 판명되어 치료 중인 환자군과 아직 심혈관 질환 증상이 없는 정상인의 혈액으로부터 DNA를 분리하고, 특정한 SNP의 출현 빈도를 분석하였다. 본 실시예에 선택된 SNP는 공개된 데이터베이스 (NCBI dbSNP:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP/) 또는 Sequenom 사의 realsnp.com (http:://www.realsnp.com/)으로부터 선택하였으며, 선택된 SNP 주변의 서열을 이용한 프라이머를 이용하여 시료 중의 SNP 서열을 분석하였다.
1-1. DNA 시료의 준비
심근경색증으로 판명되어 치료 중인 남성 환자군(221 명)과 아직 심근경색 증상이 없는 남성 정상인(192 명)의 혈액으로부터 DNA를 추출하였다. 염색체 DNA 추출은 공지의 추출 방법(Molecular cloning : A Laboratory Manual, p 392, Sambrook, Fritsch and Maniatis, 2nd edition, Cold Spring Harbor Press, 1989)과 상업용 키트(Gentra system, D-50K)의 설명서에 따라 이루어졌다. 추출된 DNA 중 순도 기준이 UV 측정비율(260/280nm)로 최소 1.7 이상 되는 것만을 선별하여 사용하였다.
1-2. 표적 DNA의 증폭
분석하고자 하는 705개의 SNP가 포함된 일정한 DNA 영역인 표적 DNA를 PCR을 이용하여 증폭하였다. PCR은 통상적인 방법으로 진행하였으며, 그 조건은 다음과 같았다. 먼저, 염색체 DNA를 2.5 ng/ml로 준비하였다. 다음으로 다음의 PCR 반응액을 준비하였다.
물(HPLC 급) 2.24㎕
10x 버퍼 (15 mM MgCl2, 25 mM MgCl2 함유) 0.5㎕
dNTP 믹스(GIBCO)(25 mM/각) 0.04㎕
Taq pol(HotStart)(5U/㎕) 0.02㎕
전위/후위 프라이머 믹스 (1μM/각) 0.02㎕
DNA 1.00㎕
총 반응 부피 5.00㎕
여기서, 상기 전위(forward) 및 후위(reverse) 프라이머는 공지의 데이데이터 베이스의 SNP의 상류와 하류로부터, 적당한 위치에서 선택하였다. 상기 프라이머 705개 세트 중 일부를 표 6에 정리하였다.
PCR의 열 순환은, 95 ℃에서 15분 동안 유지하고, 95 ℃에서 30초, 56 ℃에서 30초, 72 ℃에서 1분을 45회 반복하고, 72 ℃에서 3분 동안 유지한 후, 4 ℃에 보관하였다. 그 결과, 200개 뉴클레오티드 이하의 길이를 가진 표적 DNA 단편을 얻었다.
1-3. 증폭된 표적 DNA 중의 SNP의 분석
표적 DNA 단편 중의 SNP의 분석은 시쿼넘 (Sequenom)사의 균질적 MassEXTEND (homogeneous Mass Extend: 이하 hME라고도 한다) 기법을 이용하였다. 상기 MassEXTEND 기법의 원리는 다음과 같다. 먼저, 표적 DNA 단편 중의 SNP 바로 전까지의 염기에 상보적인 프라이머(연장용 프라이머(extension primer)라고도 한다.)를 제작한다. 다음으로, 상기 프라이머를 표적 DNA 단편에 혼성화시키고, DNA 중합 반응을 일으킨다. 이 때, 반응액 중에 대상 SNP 대립인자 중 제1 대립인자 염기(예를 들면, A 대립인자)에 상보적인 염기가 첨가된 후 반응이 멈추도록 하는 시약(Termination mix; 예를 들면, ddTTP)을 포함시킨다. 그 결과, 표적 DNA 단편 에 제1 대립인자(예를 들면, A 대립인자)가 존재하는 경우에는, 상기 제1 대립인자에 상보적인 염기(예를 들면, T) 하나만이 첨가된 산물이 얻어진다. 반면, 표적 DNA 단편에 제2 대립인자(예를 들면, G 대립인자)가 존재하는 경우에는, 상기 제2 대립인자에 상보적인 염기(예를 들면, C)가 첨가된 가장 근접한 제1 대립인자 염기 (예를 들면, A)까지 연장된 산물을 얻게 된다. 이렇게 얻어진 상기 프라이머로부터 연장된 산물의 길이를 질량 분석을 통하여 결정함으로써, 표적 DNA에 존재하는 대립인자의 종류를 결정할 수 있다. 구체적인 실험조건은 다음과 같았다.
먼저, 상기 PCR 산물로부터 결합되지 않는 dNTP를 제거하였다. 이를 위하여 순수 1.53㎕, hME 버퍼 0.17㎕, SAP(shrimp alkaline phosphatase) 0.30㎕를 1.5 ml 튜브에 넣고 혼합하여 SAP 효소 용액을 준비하였다. 상기 튜브를 5,000 rpm에서 10 초 동안 원심분리하였다. 그 후, PCR(Polymerase Chain Reaction) 산물을 상기 SAP 용액 튜브에 넣고, 밀봉한 다음 37 ℃에서 20분, 85 ℃에서 5분 동안 유지한 후, 4 ℃에 보관하였다.
다음으로, 상기 표적 DNA 산물을 주형으로 하여 균질적 연장 반응을 실시하였다. 반응액은 다음과 같았다.
물(나노급 순수) 1.728㎕
hME 연장 믹스 (2.25 mM d/ddNTPs를 포함하는 10x버퍼) 0.200㎕
연장 프라이머 (각 100μM) 0.054㎕
Thermosequenase(32U/㎕) 0.018㎕
총부피 2.00㎕
상기 반응액을 잘 혼합한 후, 스핀다운 원심분리하였다. 상기 반응액이 든 튜브 또는 플레이트를 잘 밀봉한 다음, 94℃에서 2분 동안 유지한 다음, 94 ℃에서 5초, 52 ℃에서 5초, 72 ℃에서 5초를 40회 반복 한 다음, 4 ℃에 보관하였다. 이렇게 얻어진 균질적 연장 반응 산물로부터 레진(SpectroCLEAN, Sequenom사 #10053)을 사용하여 염들을 제거하였다. 연장 반응에 사용된 연장 프라이머 705개 중 일부를 표 6에 나타내었다.
<표 6>
SNP 포함 서열번호 표적 DNA 증폭용 프라이머(서열번호) 연장 프라이머(서열번호)
전위 프라이머 후위 프라이머
1 36 37 38
2 39 40 41
3 42 43 44
4 45 46 47
5 48 49 50
6 51 52 53
7 54 55 56
8 57 58 59
9 60 61 62
10 63 64 65
11 66 67 68
12 69 70 71
13 72 73 74
14 75 76 77
15 78 79 80
16 81 82 83
17 84 85 86
18 87 88 89
<표 6(계속)>
SNP 포함 서열번호 표적 DNA 증폭용 프라이머(서열번호) 연장 프라이머(서열번호)
전위 프라이머 후위 프라이머
19 90 91 92
20 93 94 95
21 96 97 98
22 99 100 101
23 102 103 104
24 105 106 107
25 108 109 110
26 111 112 113
27 114 115 116
28 117 118 119
29 120 121 122
30 123 124 125
31 126 127 128
32 129 130 131
33 132 133 134
34 135 136 137
35 138 139 140
얻어진 연장 반응 산물을 질량 분석 방법 중 MALDI-TOF(Matrix Assisted Laser Desorption and Ionization-Time of Flight)를 이용하여 다형성 부위의 서열을 분석하였다. 상기 MALDI-TOF는 분석하고자 하는 물질이 레이저 빔을 받으면, 이온화된 매트릭스(3-Hydorxypicolinic acid)와 함께 비행하여 진공상태에서 반대편에 있는 검출기까지 날아가는 데 걸린 시간을 계산하여 질량을 분석해내는 원리에 의하여 작동한다. 질량이 작은 물질은 검출기에 빨리 도달하게 되는데, 이렇게 얻어지는 질량의 차이와 이미 알고 있는 SNP의 서열을 근거로 하여 표적 DNA의 SNP의 서열을 결정할 수 있는 것이다.
상기와 같은 MALDI-TOF를 사용한 표적 DNA의 SNP의 서열을 결정한 결과의 일부는 표 1 내지 표 2에 나타내었다. 이 때, 각 대립인자는 각 개체에 있어서 동형접합자(homozygote) 또는 이형접합자(heterozygote)의 형태로 존재할 수 있다. 멘델의 유전법칙과 하디-와인버그(Hardy-Weinberg) 법칙에 의하면, 집단을 구성하는 대립인자의 조성은 일정한 빈도로 유지되며, 통계적으로 유의한 경우 생물학적 기능상의 의미를 부여할 수 있다. 본 발명의 705개의 단일 SNP는 심혈관 질환 환자에게서 통계적으로 유의한 수준으로 출현되어, 심혈관 질환의 진단 등에 사용될 수 있음을 알 수 있었다.
1-4. 다중 SNP의 선별
상기에서 분석한 221명의 심혈관 질환 환자(남성)와 192명의 정상인(남성)의 705개의 SNP 서열을 기초로 하여, 심혈관 질환 환자에서 자주 발견되는 SNP의 조합, 즉 다중 SNP를 선별하였다.
먼저, 상기 705개의 SNP 서열 중 1 내지 3개의 조합으로 이루어진 다중 SNP의 가능한 수는 대략 7.3×109 개임을 확인하였다.
1차 스크리닝 기준으로 하기의 식으로 계산되는 유전자형 비가 2 이상이고, 하기의 식으로 계산되는 유전자형 차이가 0.1×(전체 환자의 수, 즉 221) 이상인 것을 이용하여 11,582,361개의 다중 SNP를 선별하였다.
- 유전자형 비 = (어느 한 유전자형을 갖는 환자의 수)/(어느 한 유전자형을 갖는 정상인의 수)
- 유전자형 차이 = (어느 한 유전자형을 갖는 환자의 수) - (어느 한 유전자형을 갖는 정상인의 수)
추가적으로 p-value가 10-6 이하인 5,348개의 다중 SNP를 선별하였다. 상기 p-value는 Fisher's exact test를 나타내는 것으로, 보다 정확한 통계적 유의성(p-value)을 검정하는데 사용되는 변수이다. 상기와 같이, 본 발명에서는 p-value≤ 10-6인 경우 그 유전자형이 위험요인(risk factor) 또는 보호요인(protective factor)로 작용한다. 즉, 질병과 유의한 연관관계가 있다고 판단하였다.
2차 스크리닝 기준으로 하기 식으로 계산되는 오즈비(odds ratio), 그의 95% 신뢰구간(confidential interval) 및 99% 신뢰구간을 이용하였다.
- 오즈비(odds ratio): 어느 한 유전자형을 갖거나 갖지 않는 환자 및 정상인의 수가 각각 하기 표 7과 같은 경우, 오즈비(odds ratio)=ad/bc (오즈비가 1을 초과하는 경우 상기 유전자형은 심혈관 질환에 위험 요인으로 작용함을 의미.)
<표 7>
특정 다중 SNP 유전자형을 갖는 수 특정 다중 SNP 유전자형을 갖지 않는 수
환자군 빈도 a b
정상군 빈도 c d
- 상기 오즈비(odds ratio)의 95% 신뢰구간 = (오즈비×exp(-1.960
Figure 112006013859635-pat00003
), 오즈비×exp(1.960
Figure 112006013859635-pat00004
)) (상기 식에서, V=1/a + 1/b + 1/c +1/d)
- 상기 오즈비(odds ratio)의 99% 신뢰구간 = (오즈비×exp(-2.576
Figure 112006013859635-pat00005
), 오즈비×exp(2.576
Figure 112006013859635-pat00006
)) (상기 식에서, V=1/a + 1/b + 1/c +1/d)
상기에서 선별된 5,348개의 다중 SNP에 대해 먼저 상기 오즈비(odds ratio)의 95% 신뢰구간의 하계가 2.0 이상인 것을 선별하고, 상기 오즈비(odds ratio)가 3.0 이상인 것을 선별한 다음, 상기 오즈비(odds ratio)의 99% 신뢰구간의 하계가 2.0 이상인 것을 선별하여 2,826개의 다중 SNP를 선별하였다. 상기 각 수치가 1.0을 초과하면 통계적으로 유의한 것이지만, 강력한 마커를 선별하기 위해 그의 기준 수치를 각 2.0, 3.0 및 2.0으로 하였다.
상기에서 선별한 2,826개의 다중 SNP에 대해 최적화 문제의 해결 방법 중 하나인 그리디 방법(greedy method)(Cormen et al., "Introduction to Algorithms", MIT Press, 2001)을 이용하여 다중 SNP의 수를 적게 사용하고, 각각의 오즈비가 높으며, 환자군에 대한 커버리지는 높으면서도 정상군에 대한 커버리지는 낮은 12개의 다중 SNP를 선별하였다. 상기 12개의 다중 SNP는 표 3 내지 표 4에 도시되어 있다.
실시예 2
본 발명에 따른 다중 SNP가 고정된 마이크로어레이의 제작
상기에서 선별된 다중 SNP를 기판 상에 고정하여 마이크로어레이를 제작하였다. 즉, 표 1에 나타낸 각 서열번호로 구성된 폴리뉴클레오티드에서 각 SNP 위치(서열번호 4의 경우 76번째, 서열번호 8의 경우 85번째, 서열번호 9의 경우 51번째, 서열번호 10의 경우 35번째, 서열번호 19의 경우 85번째 및 나머지 서열번호의 경우 101번째) 염기를 포함하는 20개의 연속 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드들(각 SNP는 상기 20개 중 11번째에 위치 함)을 기판상에 고정하였다. 각 SNP 위치에 두 개의 대립형질이 존재하므로 각 서열마다 2개씩의 폴리뉴클레오티드가 기판상에 고정화된다.
먼저, 상기 각 폴리뉴클레오티드의 N-말단을 아민기로 치환한 다음 실릴화 슬라이드(Telechem 사)에 스팟팅하였으며, 이 때 상기 스팟팅 버퍼는 2×SSC(pH 7.0)를 사용하였다. 스팟팅 후 건조기에 두어 결합을 유도한 후 0.2% SDS로 2분 간, 3차 증류수로 2분간 세척하여 결합되지 않는 올리고를 제거하였다. 상기 슬라이드를 95℃에서 2분간 처리하여 변성을 유도한 후, 블로킹 용액(1.0g NaBH4, PBS(pH 7.4) 300 mL, EtOH 100 mL)으로 15분간, 0.2% SDS 용액으로 1분간, 3차 증류수로 2분간 각각 세척하고 상온에서 건조시켜 마이크로어레이를 제작하였다.
실시예 3
본 발명에 따른 마이크로어레이를 이용한 심혈관 질환 진단
상기 실시예 1의 1-1 단계 및 1-2 단계에 설명되어 있는 방법을 이용하여 심혈관 질환 발병 또는 발병 가능성을 진단하고자 하는 대상의 혈액으로부터 표적 DNA를 분리하고, 형광 표지 시켰다. UniHyb 혼성화 용액(TeleChem 사) 하에서 상기 실시예 2에서 제조된 마이크로어레이과 형광 표지된 표적 DNA의 혼성화를 42℃에서 4시간 동안 수행하였다. 2×SSC로 실온에서 5분간 두 번 세척한 후 공기 중에서 건조시켰다. 건조 후 슬라이드를 스캔어레이 5000(ScanArray 5000; GSI Lumonics 사)으로 스캔하고 스캔 결과를 퀀트어레이(QuantArray)(GSI Lumonics 사)와 ImaGene 소프트웨어(BioDiscover 사)로 분석하여 상기 대상이 본 발명에 따른 다중 SNP 전부 또는 일부를 갖고 있는지를 확인함으로써, 심혈관 질환의 발병 가능성 및 심혈관 질환에 대한 감수성을 측정하였다.
본 발명의 SNP에 의하면, 심혈관 질환의 진단 및 치료와 같은 심혈관 질환과 관련된 용도로 사용될 수 있다. 또한, 본 발명의 SNP를 포함하는 마이크로어레 이 및 키트에 의하여, 심혈관 질환을 효과적으로 진단할 수 있다. 또한, 본 발명의 심혈관 질환과 관련된 SNP를 분석하는 방법에 의하여, 심혈관 질환의 존재 또는 위험의 유무를 효과적으로 진단할 수 있다.
서열목록 전자파일 첨부

Claims (16)

  1. 서열번호 1 내지 35로 구성된 폴리뉴클레오티드들에 있어서 각 SNP 위치(서열번호 4의 경우 76번째, 서열번호 8의 경우 85번째, 서열번호 9의 경우 51번째, 서열번호 10의 경우 35번째, 서열번호 19의 경우 85번째 및 나머지 서열번호의 경우 101번째) 염기를 포함하는 10개 이상의 연속 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드들로부터 선택되는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드로 이루어지는 심혈관 질환 진단용 다중 SNP.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 하나 이상의 폴리뉴클레오티드가 서열번호 1 내지 35로 구성된 폴리뉴클레오티드들에 있어서 각 SNP 위치(서열번호 4의 경우 76번째, 서열번호 8의 경우 85번째, 서열번호 9의 경우 51번째, 서열번호 10의 경우 35번째, 서열번호 19의 경우 85번째 및 나머지 서열번호의 경우 101번째) 염기를 포함하는 10개 이상의 연속 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드들로부터 표 3의 조합으로 선택되는 1 내지 12로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 심혈관 질환 진단용 다중 SNP.
    <표 3>
    번호 다중 SNP 1 (서열번호 2, 서열번호 25, 서열번호 3) 2 (서열번호 11, 서열번호 15, 서열번호 35) 3 (서열번호 6, 서열번호 23, 서열번호 16) 4 (서열번호 20, 서열번호 22, 서열번호 13) 5 (서열번호 17, 서열번호 1, 서열번호 31) 6 (서열번호 5, 서열번호 29, 서열번호 8) 7 (서열번호 27, 서열번호 30, 서열번호 32) 8 (서열번호 26, 서열번호 19, 서열번호 7) 9 (서열번호 23, 서열번호 9, 서열번호 28) 10 (서열번호 21, 서열번호 14, 서열번호 4) 11 (서열번호 10, 서열번호 18, 서열번호 33) 12 (서열번호 24, 서열번호 12, 서열번호 34)
  3. 제 2항에 있어서,
    상기 선택된 폴리뉴클레오티드들의 상기 각 SNP 위치(서열번호 4의 경우 76번째, 서열번호 8의 경우 85번째, 서열번호 9의 경우 51번째, 서열번호 10의 경우 35번째, 서열번호 19의 경우 85번째 및 나머지 서열번호의 경우 101번째) 염기의 대립 유전자형이 각각 표 4와 같은 것을 특징으로 하는 심혈관 질환 진단용 다중 SNP.
    <표 4>
    번호 다중 SNP 대립 유전자형 1 (서열번호 2, 서열번호 25, 서열번호 3) (CC, CC, TG) 2 (서열번호 11, 서열번호 15, 서열번호 35) (CC, GC, TT) 3 (서열번호 6, 서열번호 23, 서열번호 16) (CC, AG, TT or TC) 4 (서열번호 20, 서열번호 22, 서열번호 13) (AA or AC, CG, TT or TG) 5 (서열번호 17, 서열번호 1, 서열번호 31) (TC or CC, TT or TA, TT or TG) 6 (서열번호 5, 서열번호 29, 서열번호 8) (GC, TT or TC, GC) 7 (서열번호 27, 서열번호 30, 서열번호 32) (CC, CC, AA or AG) 8 (서열번호 26, 서열번호 19, 서열번호 7) (TG, TC or CC, GG) 9 (서열번호 23, 서열번호 9, 서열번호 28) (AG, GG, TC or CC) 10 (서열번호 21, 서열번호 14, 서열번호 4) (CT, AG or GG, CT or TT) 11 (서열번호 10, 서열번호 18, 서열번호 33) (TT or TC, CG or GG, AC) 12 (서열번호 24, 서열번호 12, 서열번호 34) (AC, CC or CG, TA)
  4. 제 1항에 있어서,
    상기 심혈관 질환은 심근경색증, 협심증, 죽상경화증, 고혈압, 심부전, 동맥류, 동맥경화증, 색전증, 뇌졸중 및 혈전증로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 심혈관 질환 진단용 다중 SNP.
  5. 제 1항에 있어서,
    상기 심혈관 질환은 심근경색증인 것을 특징으로 하는 심혈관 질환 진단용 다중 SNP.
  6. 제 2항에 있어서,
    상기 다중 SNP 1 내지 12로 구성되는 것을 특징으로 하는 심혈관 질환 진단용 다중 SNP.
  7. 제 1항에 있어서,
    상기 10개 이상의 연속 염기는 10 내지 100개의 연속 염기인 것을 특징으로 하는 심혈관 질환 진단용 다중 SNP.
  8. 삭제
  9. 제 1항의 다중 SNP의 폴리뉴클레오티드, 그에 의해 코딩되는 폴리펩티드 또는 그의 cDNA를 포함하는 심혈관 질환 진단용 마이크로어레이.
  10. 제 9항에 있어서,
    상기 폴리뉴클레오티드는 아미노-실란, 폴리-L-라이신 또는 알데히드의 활성기가 코팅된 기판에 고정되는 것을 특징으로 하는 심혈관 질환 진단용 마이크로어레이.
  11. 제 10항에 있어서,
    상기 기판은 실리콘 웨이퍼, 유리, 석영, 금속 또는 플라스틱인 것을 특징으로 하는 심혈관 질환 진단용 마이크로어레이.
  12. 제 9항의 마이크로어레이를 포함하는 심혈관 질환 진단용 키트.
  13. 삭제
  14. 삭제
  15. 삭제
  16. 삭제
KR1020060018449A 2005-05-18 2006-02-24 심혈관 질환 진단용 다중 ｓｎｐ, 그를 포함하는마이크로어레이 및 키트 및 그를 이용한 심혈관 질환 진단방법 KR100754398B1 (ko)

Priority Applications (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US11/435,662 US7732139B2 (en) 2005-05-18 2006-05-17 Multiple SNP for diagnosing cardiovascular disease, microarray and kit comprising the same, and method of diagnosing cardiovascular disease using the same
JP2008512217A JP2008545387A (ja) 2005-05-18 2006-05-17 心血管疾患診断のための方法及び構成
PCT/KR2006/001829 WO2006123885A1 (en) 2005-05-18 2006-05-17 Methods and compositions for diagnosing cardiovascular disease
EP06768500A EP1883711A4 (en) 2005-05-18 2006-05-17 METHOD AND USES FOR DIAGNOSIS OF A HEART CIRCULATION DISEASE

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020050041653 2005-05-18
KR20050041653 2005-05-18

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20060119737A KR20060119737A (ko) 2006-11-24
KR100754398B1 true KR100754398B1 (ko) 2007-08-31

Family

ID=37706512

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020060018449A KR100754398B1 (ko) 2005-05-18 2006-02-24 심혈관 질환 진단용 다중 ｓｎｐ, 그를 포함하는마이크로어레이 및 키트 및 그를 이용한 심혈관 질환 진단방법

Country Status (2)

Country Link
JP (1) JP2008545387A (ko)
KR (1) KR100754398B1 (ko)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2009104730A1 (ja) * 2008-02-21 2009-08-27 国立大学法人愛媛大学 高血圧感受性遺伝子群の同定
US20140141432A1 (en) * 2011-07-11 2014-05-22 School Corporation, Azabu Veterinary Medicine Educational Institution Method and kit for diagnosing glaucoma in dogs
CN111057755B (zh) * 2019-06-14 2022-07-26 陕西九州医学检验有限公司 一种心脑血管疾病遗传风险评估检测panel及其应用
KR102314972B1 (ko) * 2020-01-28 2021-10-20 한국식품연구원 Pex26 유전자의 메틸화 수준을 이용한 비만의 예측 또는 진단을 위한 정보제공방법 및 이를 위한 조성물

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20020065677A (ko) * 2001-02-07 2002-08-14 (주)진매트릭스 뇌졸중을 예진 또는 진단하는 방법
EP1298220A1 (en) 2001-10-01 2003-04-02 Bayer Ag Single nucleotide polymorphisms predicting cardiovascular disease
KR100466779B1 (ko) 2001-04-03 2005-01-24 주식회사 서린바이오사이언스 본태성 고혈압의 발병 가능성을 예측하는 방법에서사용되는 폴리머라제 연쇄중합반응용 프라이머

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20020065677A (ko) * 2001-02-07 2002-08-14 (주)진매트릭스 뇌졸중을 예진 또는 진단하는 방법
KR100466779B1 (ko) 2001-04-03 2005-01-24 주식회사 서린바이오사이언스 본태성 고혈압의 발병 가능성을 예측하는 방법에서사용되는 폴리머라제 연쇄중합반응용 프라이머
EP1298220A1 (en) 2001-10-01 2003-04-02 Bayer Ag Single nucleotide polymorphisms predicting cardiovascular disease

Also Published As

Publication number Publication date
KR20060119737A (ko) 2006-11-24
JP2008545387A (ja) 2008-12-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR101206029B1 (ko) 대장암 진단용 다중 ｓｎｐ, 그를 포함하는 마이크로어레이및 키트 및 그를 이용한 대장암 진단 방법
US7732139B2 (en) Multiple SNP for diagnosing cardiovascular disease, microarray and kit comprising the same, and method of diagnosing cardiovascular disease using the same
KR100754398B1 (ko) 심혈관 질환 진단용 다중 ｓｎｐ, 그를 포함하는마이크로어레이 및 키트 및 그를 이용한 심혈관 질환 진단방법
KR101206028B1 (ko) 유방암 특이적 다형성 서열을 이용한 유방암의 진단방법,유방암 특이적인 폴리뉴클레오티드 및 상기 폴리뉴클레오티드가 고정되어 있는 마이크로어레이
KR101523769B1 (ko) 허혈성 뇌졸중 진단용 다중 snp 및 이의 용도
KR101138862B1 (ko) 단일염기 다형을 포함하는 유방암과 관련된 폴리뉴클레오티드, 그를 포함하는 마이크로어레이 및 진단 키트 및 그를이용한 유방암 진단 방법
KR101100437B1 (ko) 단일염기 다형을 포함하는 대장암과 관련된 폴리뉴클레오티드, 그를 포함하는 마이크로어레이 및 진단 키트 및 그를 이용한 대장암의 진단방법
KR20060117691A (ko) 대상의 유형에 따른 심혈관 질환 진단용 ｓｎｐ, 그를포함하는 마이크로어레이 및 키트 및 그를 이용한 심혈관질환 진단 방법
KR100790871B1 (ko) 심근 경색에 관련된 유전자 다형성 및 그의 용도
KR100851971B1 (ko) 심근 경색에 관련된 유전자 다형성 및 그의 용도
EP1880026B1 (en) Genetic polymorphisms associated with myocardial infarction and uses thereof
KR101972333B1 (ko) 섬유근육통 진단용 조성물, 그를 포함하는 마이크로어레이 및 키트
KR101138866B1 (ko) 심근 경색에 관련된 유전자 다형성 및 그의 용도
KR101058583B1 (ko) 뇌경색 진단용 다중 ｓｎｐ, 및 이를 포함하는 마이크로어레이 및 키트
KR100695147B1 (ko) 다중좌 마커를 이용한 2형 당뇨병의 진단방법, 2형당뇨병과 연관된 마커를 포함하는 폴리뉴클레오티드 및마이크로어레이
WO2006137644A2 (en) Genetic polymorphisms associated with myocardial infarction and uses therof

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20120716

Year of fee payment: 6

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20130724

Year of fee payment: 7

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20140721

Year of fee payment: 8

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20150728

Year of fee payment: 9

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20160718

Year of fee payment: 10

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20170719

Year of fee payment: 11

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20180718

Year of fee payment: 12