KR100704986B1 - Establishment of functional microbial community being capable of degrading diesel oil and the preservation method - Google Patents
Establishment of functional microbial community being capable of degrading diesel oil and the preservation method Download PDFInfo
- Publication number
- KR100704986B1 KR100704986B1 KR1020060038251A KR20060038251A KR100704986B1 KR 100704986 B1 KR100704986 B1 KR 100704986B1 KR 1020060038251 A KR1020060038251 A KR 1020060038251A KR 20060038251 A KR20060038251 A KR 20060038251A KR 100704986 B1 KR100704986 B1 KR 100704986B1
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- microbial community
- diesel
- community
- culture
- diesel oil
- Prior art date
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/04—Preserving or maintaining viable microorganisms
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/26—Processes using, or culture media containing, hydrocarbons
- C12N1/28—Processes using, or culture media containing, hydrocarbons aliphatic
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Virology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
- Processing Of Solid Wastes (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
본 발명은 디젤유 분해활성을 갖는 미생물 커뮤니티의 확보 및 보존방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 디젤오염 토양에 존재하고 있는 많은 미생물 중에서 디젤 생분해 및 내성에 관련된 미생물만을 확보하고, 그 확보된 기능성 미생물 커뮤니티의 다양성을 분자 유전학 기법으로 확인하며, 미생물 커뮤니티의 개체 손실을 최소화하는 보존조건을 확립함으로써 미생물 커뮤니티의 개체 구조와 디젤 분해 활성이 90% 이상 유지되는 디젤유 분해활성을 갖는 미생물 커뮤니티의 확보 및 보존방법에 관한 것이다.The present invention relates to a method for securing and preserving a microbial community having a diesel oil decomposing activity, and more particularly, to secure only microorganisms related to diesel biodegradation and resistance among many microorganisms present in diesel-contaminated soils. By confirming the diversity of the community by molecular genetic techniques and establishing the preservation conditions that minimize the individual loss of the microbial community, the microbial community having the microorganism community with the diesel oil degradation activity of maintaining the individual structure of the microbial community and the diesel degradation activity is maintained at least 90% and It is about a preservation method.
디젤유 분해활성, 미생물 커뮤니티, 확보, 보존방법 Diesel oil decomposition activity, microbial community, securing and preservation method
Description
도 1은 집적배양 중의 미생물 커뮤니티 다양성 변화를 DGGE로 확인한 사진이다[soil: 토양에서 DNA를 추출, 1-4: 집적배양 cycle수].1 is a photograph confirming the change of microbial community diversity in agglutination culture by DGGE [soil: DNA extraction from soil, 1-4: the number of agglutination cycle].
도 2는 집적배양 중의 미생물 커뮤니티 다양성 변화를 t-RFLP로 확인한 그림이다[soil: 토양에서 DNA를 추출, 1-4: 집적배양 cycle수].Figure 2 is a figure confirming the microbial community diversity change in the integrated culture by t-RFLP [soil: DNA extraction from the soil, 1-4: the number of integration culture cycle].
도 3은 보존방법에 따른 미생물 커뮤니티의 다양성을 DGGE로 확인한 사진이다[Z: 제올라이트 첨가, G: 10% 글리세롤 사용, D: 8% DMSO 사용].3 is a photograph confirming the diversity of the microbial community according to the preservation method by DGGE [Z: zeolite addition, G: 10% glycerol use,
도 4는 저장 후 1개월부터 6개월간의 미생물 커뮤니티의 다양성 보존 정도를 t-RFLP로 확인한 그림이다[1: 1개월, 2: 2개월, 3: 3개월, 4: 4개월, 6: 6개월].Figure 4 shows the degree of diversity preservation of the microbial community for 1 to 6 months after storage by t-RFLP [1: 1 month, 2: 2 months, 3: 3 months, 4: 4 months, 6: 6 months ].
도 5는 도 4의 t-RFLP를 액셀을 통하여 수치화한 그림이다[A: 존재하는 모든 피크, B: 1개월에 존재하는 피크, C: 2개월에 존재하는 피크, D: 3개월에 존재하는 피크, E: 4개월에 존재하는 피크, F: 6개월에 존재하는 피크].FIG. 5 is a figure quantifying the t-RFLP of FIG. 4 through an accelerator [A: all peaks present, B: peak present at 1 month, C: peak present at 2 months, D: present at 3 months Peak, E: peak at 4 months, F: peak at 6 months].
도 6은 저장 후 1개월부터 6개월간의 미생물 커뮤니티의 디젤분해 활성을 확인한 그림이다.6 is a diagram confirming the diesel degradation activity of the microbial community for 1 month to 6 months after storage.
본 발명은 디젤유 분해활성을 갖는 미생물 커뮤니티의 확보 및 보존방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 디젤오염 토양에 존재하고 있는 많은 미생물 중에서 디젤 생분해 및 내성에 관련된 미생물만을 확보하고, 그 확보된 기능성 미생물 커뮤니티의 다양성을 분자 유전학 기법으로 확인하며, 미생물 커뮤니티의 개체 손실을 최소화하는 보존조건을 확립함으로써 미생물 커뮤니티의 개체 구조와 디젤 분해 활성이 90% 이상 유지되는 디젤유 분해활성을 갖는 미생물 커뮤니티의 확보 및 보존방법에 관한 것이다.The present invention relates to a method for securing and preserving a microbial community having a diesel oil decomposing activity, and more particularly, to secure only microorganisms related to diesel biodegradation and resistance among many microorganisms present in diesel-contaminated soils. By confirming the diversity of the community by molecular genetic techniques and establishing the preservation conditions that minimize the individual loss of the microbial community, the microbial community having the microorganism community with the diesel oil degradation activity of maintaining the individual structure of the microbial community and the diesel degradation activity is maintained at least 90% and It is about a preservation method.
자연 환경 내에서 미생물들은 독자적으로 존재하는 경우는 극히 드물며, 미생물, 다른 생물, 또는 주변 환경과 상호관계를 이루는 미생물 커뮤니티를 형성하며, 이러한 특성은 폐수처리 및 정수시스템, 병원성 미생물의 생존과 항생제 내성, 오염 환경 복원, 금속의 부식 등 우리 주변에서 발견되는 거의 모든 미생물 현상에서 발견되고 있다. 미생물이 커뮤니티를 이룰 때의 발현적 특성은 개별적으로 존재하는 경우와는 완전히 다르기 때문에 개별적으로 존재하는 미생물보다는 미생물 군집을 하나의 기능 발현 단위로 생각하고 자원을 확보하며, 다양성 및 기능 연구 등의 복합적 정보 분석이 필요하다.In natural environments, microorganisms rarely exist on their own and form a microbial community that interacts with microorganisms, other organisms, or the surrounding environment, which characterizes wastewater treatment and water purification systems, viability of pathogenic microorganisms, and antibiotic resistance. It is found in almost all microbial phenomena found around us, including the restoration of polluted environments and the corrosion of metals. Since the expressive characteristics of the microorganisms form a community are completely different from those of individual organisms, the microbial community is regarded as a functional expression unit rather than the individual microorganisms, and resources are secured. Information analysis is needed.
따라서, 미생물을 단독으로 분리하여 응용하기보다는 미생물 커뮤니티 자체 를 확보하여 이를 구성하는 다양한 미생물들의 동력학적 특성, 환경 변화에 따른 미생물 표현형 및 활성 변화, 그리고 미생물 세포들 간의 상호관계의 분석을 통한 응용 연구가 필요하다. Therefore, rather than separating and applying microorganisms alone, it is possible to secure the microbial community itself and to apply it through analysis of the dynamic characteristics of various microorganisms constituting the microorganisms, microbial phenotype and activity according to environmental changes, and the interrelationship between microbial cells. Is needed.
현재 국내에서는 중요한 생물자원 및 세포간의 상호작용 연구모델로서 미생물 커뮤니티의 중요성은 점차로 인식되고 있으나, 본격적인 미생물 커뮤니티의 확보 및 연구는 아직 수행되지 못하고 있고, 단지 오염 환경의 시료로부터 메타게놈을 확보하여 이의 염기서열 분석을 통해 주로 미생물 커뮤니티의 다양성 분석만을 수행하고 있는 실정이다. 오염물질의 환경복원 기술은 단일 물질에 대한 단일 미생물 균주를 이용한 분해대사의 연구가 주를 이루고 있으며, 이를 이용한 분해 미생물세포의 재설계 및 바이오모니터링을 위한 프로브 개발 연구 등이 주로 수행되고 있다. At present, the importance of microbial community as a research model of important biological resources and interactions between cells is gradually recognized, but full-scale microbial community acquisition and research have not been carried out yet. Through sequencing analysis, only the diversity of the microbial community is analyzed. The environmental restoration technology of pollutants mainly consists of the study of degradation metabolism using a single microbial strain on a single substance, and the research on the redesign of the degraded microbial cells and the development of probes for biomonitoring are mainly performed.
Katsivela et al.은 그리스의 petroleum refinery Motor Oil Hellas의 농경지를 대상으로 농경지의 전과 후의 토착미생물 커뮤니티의 변화를 t-RFLP(terminal-Restriction Fragment Length Polymorphism) 법으로 조사하였다. 집적 배양 후 분리된 균들 중 잘 자라는 종은 16S rDNA 염기서열 결과 엔테로박터(Enterobacter)와 오크로박테리움(Ochrobacterium)이였으며, t-RFLP 결과에서도 동일종들이 발견되었다. 또한 이들이 분해 활성에도 중요한 영향을 미침을 밝혔다[Wat. Air Soil Poll. 2003, 3: 103-115].Katsivela et al. Investigated the changes in the indigenous microbial community before and after farmland in petroleum refinery Motor Oil Hellas in Greece by the t-RFLP (terminal-restriction fragment length polymorphism) method. Among the isolates that grew after the incubation, the well growing species were Enterobacter and Ochrobacterium based on the 16S rDNA sequence, and the same species were found in the t-RFLP results. They also have a significant effect on degradation activity [Wat. Air Soil Poll. 2003, 3: 103-115.
Laurie et al.은 PAH로 오염된 뉴질랜드의 와이카토 지역의 토양 두 곳과 오염되지 않은 시베리아 토양, 안타틱로스 섬의 토양으로부터 nahAc, phnAc (phenanthrene dioxygenase)의 양을 정량하였다[Appl. Environ. Microbiol. 2000, 66: 1814-1817].Laurie et al. Quantified the amount of nahAc and phnAc (phenanthrene dioxygenase) from two soils in Waikato, New Zealand, PAH-contaminated, uncontaminated Siberian and Antarctic islands [Appl. Environ. Microbiol. 2000, 66: 1814-1817.
Yeates et al.은 오스트레일리아의 웨일즈의 네 지역 중 방향족 탄화수소로 오염된 지역 두 곳과 오염되지 않은 지역 두 곳의 토양 시료를 대상으로 기존의 알려진 방향족 탄화수소 분해 유전자들로부터 만들어진 프라이머를 이용하여 PCR과 하이브리다이제이션(hybridization)법으로 새로운 유전자 탐색 및 이들의 기능을 관찰하였다[Environ. Microbiol. 2000, 2: 644-653].Yeates et al. Conducted PCR and hive using primers made from known aromatic hydrocarbon degradation genes for soil samples from two aromatic hydrocarbon-contaminated and two non-contaminated soils in four of Wales, Australia. New gene search and their function were observed by the hybridization method [Environ. Microbiol. 2000, 2: 644-653.
그리고, Jeon 등은 콜타르가 오염된 지역에서 나프탈렌 분해 미생물을 방사선동위원소 기술을 이용하여 in situ로 분석하여 미생물의 계통학적 분석과 기능적인 특징을 서로 연결하고자 하였다[Jeon et al., 2003].In addition, Jeon et al. Attempted to analyze the naphthalene-degrading microorganisms in situ using radioisotope techniques in coal tar-contaminated areas and to link the phylogenetic analysis and functional characteristics of the microorganisms [Jeon et al., 2003].
이렇게 현재까지 알려진 미생물 커뮤니티 확보 및 보존방법은 많이 알려지지 않고 있으며, 대부분 단일 미생물의 분리와 보존이나 미생물 커뮤니티의 다양성 분석을 수행하여, 환경오염물질의 효과적인 분해가 이루어지지 않는 문제점이 야기되었고, 효과적인 환경복원을 위해 분해 미생물 커뮤니티의 확보와 보존이 절실히 요구되고 있다.As such, many methods for securing and preserving the microbial community are not known, and most of them have caused problems that are not effectively decomposed of environmental pollutants by separating and preserving a single microorganism or analyzing the diversity of the microbial community. There is an urgent need to secure and preserve a degraded microbial community for restoration.
이에, 본 발명자들은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위하여 연구 노력한 결과, 디젤오염 토양에 존재하고 있는 많은 미생물 중에서 디젤 생분해 및 내성에 관련된 미생물만을 확보하고, 그 확보한 미생물 커뮤니티의 다양성을 분자 유전학 기 법으로 확인하면서 미생물 커뮤니티의 개체 손실을 최소화하며 분해활성을 최대로 유지하는 보존조건을 확립함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.Accordingly, the present inventors have made efforts to solve the above problems, and as a result, only the microorganisms related to diesel biodegradation and resistance among the many microorganisms present in diesel-contaminated soils are secured, and the diversity of the microbial community secured by the molecular genetic techniques The present invention was completed by establishing a preservation condition that minimizes individual loss of the microbial community and maintains maximum degradation activity.
따라서, 본 발명은 유류 오염 토양으로부터 디젤유 분해능이 우수한 기능성 미생물 커뮤니티를 확보하고, 미생물 커뮤니티 관리의 핵심기술이 되는 보존기술을 확립하여 목적하는 분해활성 및 미생물 다양성을 유지시키는 보존방법을 제공하는데 그 목적이 있다.Accordingly, the present invention provides a preservation method for securing a functional microbial community excellent in diesel oil resolution from oil contaminated soil and establishing a preservation technology that is a core technology of microbial community management to maintain a desired degradation activity and microbial diversity. There is a purpose.
본 발명은 디젤유 분해능이 우수한 기능성 미생물 커뮤니티를 확보하는 방법을 그 특징으로 한다.The present invention is characterized by a method of securing a functional microbial community excellent in diesel oil resolution.
또한, 상기 미생물 커뮤니티를 보존하는 방법을 포함한다.It also includes a method of conserving the microbial community.
이하, 본 발명을 더욱 상세하게 설명하면 다음과 같다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail.
본 발명은 디젤오염 토양에 존재하고 있는 많은 미생물 중에서 디젤 생분해 및 내성에 관련된 미생물만을 확보하고, 그 확보된 기능성 미생물 커뮤니티의 다양성을 분자 유전학 기법으로 확인하며, 미생물 커뮤니티의 개체 손실을 최소화하는 보존조건을 확립함으로써 미생물 커뮤니티의 개체 구조와 디젤 분해 활성이 90% 이상 유지되는 디젤유 분해활성을 갖는 미생물 커뮤니티의 확보 및 보존방법에 관한 것이다.The present invention secures only microorganisms related to diesel biodegradation and resistance among many microorganisms present in diesel-contaminated soil, confirms the diversity of the functional microbial community obtained by molecular genetic techniques, and preserves conditions to minimize individual loss of microbial community. The present invention relates to a method for securing and preserving a microbial community having a diesel oil decomposition activity in which the individual structure of the microbial community and diesel decomposition activity is maintained by 90% or more.
본 발명은The present invention
1) BH(Bushnell-Haas) 배지에 디젤 0.1 ~ 10 %(w/v), 석유 탄화수소가 함유 된 토양 0.1 ~ 10 %(w/v) 및 제올라이트 0.5 ~ 5 %(w/v)를 첨가하여 20 ~ 40 ℃에서 200 ~ 300 rpm으로 3 ~ 15일 동안 집적 배양하여 배양액을 얻는 단계; 및1) Add 0.1-10% (w / v) of diesel, 0.1-10% (w / v) of soil containing petroleum hydrocarbons and 0.5-5% (w / v) of zeolite to the BH (Bushnell-Haas) medium. Obtaining a culture solution by integrating the culture at 20 to 40 ° C. at 200 to 300 rpm for 3 to 15 days; And
2) 상기 배양액에서 디젤유 분해활성을 갖는 미생물 커뮤니티의 DNA를 Ultra clean soil extract kit(Mobio,U.S.A.)를 이용하여 추출하고 PCR을 수행하여 DGGE(Denaturing Gradient Gel Electrophoresis) 또는 t-RFLP(Terminal-Restriction Fragment Length Polymorphism)로 분석하는 단계2) DNA of the microbial community having diesel oil decomposing activity in the culture solution was extracted using Ultra clean soil extract kit (Mobio, USA) and PCR was performed to determine the concentration gradient gel electrophoresis (DGGE) or terminal-restriction (t-RFLP). Analysis by Fragment Length Polymorphism
를 포함하는 디젤유 분해활성을 갖는 미생물 커뮤니티의 확보방법을 포함한다.It includes a method of securing a microbial community having a diesel oil decomposition activity comprising a.
상기 미생물 커뮤니티의 확보방법을 단계별로 상세히 설명하면 다음과 같다.When explaining the method of securing the microbial community step by step as follows.
첫 번째 단계에서는 디젤유 분해 활성을 갖는 미생물 커뮤니티를 확보하기 해 집적 배양하는 단계로서, 무기물 배지로 알려진 BH(Bushnell-Haas) 배지에 디젤 0.1 ~ 10 %(w/v), 석유 탄화수소가 함유된 토양 0.1 ~ 10 %(w/v) 및 제올라이트 0.5 ~ 5 %(w/v)를 첨가하여 20 ~ 40 ℃에서 200 ~ 300 rpm으로 3 ~ 15일 동안 집적 배양을 수행한다. 이때, BH 배지는 MgSO4 0.002 ~ 0.2중량%, CaCl2 0.001 ~ 0.1 중량%, KH2PO4 0.01 ~ 1 중량%, K2HPO4 0.01 ~ 1 중량%, KNO3 0.01 ~ 1 중량% 및 FeCl2 0.001 ~ 0.1 중량%를 포함하는 것이 바람직하다. 또한, 상기 토양의 경우에는 석유 탄화수소가 10 ~ 200 ppm 함유된 것이 바람직하며, 더욱 바람직하기로는 20 ~ 100 ppm 가 함유된 것이 좋다. 또한, 흡착 미생물의 흡착 및 확보를 위하여 고상담체로 제올라이트를 사용한다. 이때, 제올라이트가 0.5 %(w/v) 미만 사 용할 경우에는 흡착 미생물의 흡착의 효율의 낮아져 흡착 미생물의 확보에 문제가 있고, 5 %(w/v)를 초과하면 배양액 중 제올라이트의 농도가 높아 제올라이트가 뭉치는 문제점이 있어 바람직하지 못하다. 또한, 상기 집적 배양은 기능성 미생물 커뮤니티가 5회, 6회 때에도 안정화된 4회의 기능성 미생물 커뮤니티의 다양성이 동일하였기 때문에 집적 배양은 4회만 실시해도 충분하였다.In the first step, the microbial community having diesel oil decomposition activity is secured and integrated culture.Bushnell-Haas (BH) medium, known as mineral medium, contains 0.1 to 10% (w / v) of petroleum hydrocarbon. Soil 0.1-10% (w / v) and zeolite 0.5-5% (w / v) are added to perform incubation for 3-15 days at 200-300 rpm at 20-40 ° C. At this time, the BH medium is MgSO 4 0.002 ~ 0.2% by weight, CaCl 2 0.001 ~ 0.1% by weight, KH 2 PO 4 0.01 ~ 1% by weight, K 2 HPO 4 0.01 ~ 1% by weight, KNO 3 0.01 ~ 1% by weight and FeCl It is preferable to include 2 0.001 to 0.1% by weight. In the case of the soil, it is preferable that the petroleum hydrocarbon is contained 10 ~ 200 ppm, more preferably 20 ~ 100 ppm is contained. In addition, zeolite is used as a solid carrier for adsorption and securing the adsorption microorganisms. At this time, when the zeolite is used less than 0.5% (w / v), the efficiency of adsorption microorganisms of the adsorption is lowered, there is a problem in securing the adsorption microorganisms, if the zeolite exceeds 5% (w / v) the concentration of zeolite in the culture medium is high Zeolite is agglomeration problem is not preferable. In addition, since the diversity of the functional microbial community was the same as the diversity of the functional microbial community four times when the functional microbial community was stabilized 5 times and 6 times, the integrated culture was sufficient only four times.
집적배양한 배지에 포함된 기능성 미생물 커뮤니티는 DNA를 추출하고 PCR를 통해 증폭하여 DGGE와 t-RFLP를 통하여 기능성 미생물 커뮤니티의 개체 다양성변화를 확인한다. 본 발명에서는 4회의 집적배양 동안에 미생물 커뮤니티를 DGGE와 t-RFLP로 확인한 결과, 점차로 커뮤니티의 개체수가 감소하여 줄어들다가 일정한 커뮤니티 개체군을 유지하였다. 이것은 디젤을 분해하지 못하거나 내성이 없는 미생물은 사멸하고 디젤을 분해하는 미생물군만 유지되었기 때문이다. 이렇게 확보된 기능성 MC(MC-KY-7)을 이후의 실험에 사용하였다.The functional microbial community included in the cultured medium extracts DNA and amplifies it through PCR to confirm individual diversity of the functional microbial community through DGGE and t-RFLP. In the present invention, as a result of confirming the microbial community by DGGE and t-RFLP during four integrated cultures, the population of the community gradually decreased and then decreased to maintain a constant community population. This is because microorganisms that do not break down diesel or that are not resistant are killed and only microbial groups that break down diesel are maintained. This secured functional MC (MC-KY-7) was used in subsequent experiments.
한편, 본 발명은 제올라이트를 첨가한 BH 배지에 집적 배양 후, DMSO(dimethyl sulfoxide) 5 ~ 10%(w/v)를 첨가하여 액체 질소 하에서 수행하는 디젤유 분해활성을 갖는 미생물 커뮤니티의 보존방법을 또 다른 특징으로 한다.Meanwhile, the present invention provides a method for preserving a microbial community having a diesel oil decomposition activity carried out under liquid nitrogen by adding 5 to 10% (w / v) of DMSO (dimethyl sulfoxide) after integrated culture in BH medium containing zeolite. It is another feature.
본 발명에서 사용된 저장방법은 글리세롤을 첨가하여 액체질소에 저장하는 방법, 전체용량의 DMSO를 첨가하여 액체질소에 저장하는 방법, 전체용량의 40% 글리세롤을 첨가하여 -20 ℃에 저장하는 방법, 배양액을 4℃에 저장하는 방법을 사용한다. 그리고 각각의 저장방법에서 제올라이트를 첨가한 실험구와 첨가하지 않은 실험구를 동일하게 실행하여 고상담체의 영향을 검토한다. 이렇게 저장된 미 생물 커뮤니티는 1개월 후에 복원(해동하여 동일한 배지에 배양)하여 DNA를 추출하고, 추출한 DNA를 PCR을 통하여 증폭하고 DGGE를 실행한 결과, 제올라이트를 첨가하고 8% DMSO를 사용하여 액체질소에 저장한 방법이 가장 많은 수의 DGGE 밴드를 나타내었으며, 이는 상기 보존 방법이 미생물 커뮤니티의 다양성을 가장 잘 유지한다고 말할 수 있다.The storage method used in the present invention is a method for storing in liquid nitrogen by adding glycerol, a method for storing in liquid nitrogen by adding DMSO in full capacity, a method for adding in 40% glycerol in full capacity and storing at -20 ° C, The method of storing the culture at 4 ° C is used. In each storage method, experiments with and without zeolite were carried out in the same manner to examine the effect of the solid carrier. The microbial community thus stored was recovered (thawed and cultured in the same medium) one month later, DNA extracted, amplified extracted DNA by PCR, DGGE, and added with zeolite and liquid nitrogen using 8% DMSO. The method stored at showed the highest number of DGGE bands, which can be said to best preserve the diversity of the microbial community.
이에, DMSO를 첨가하여 액체질소에 저장하는 방법으로 저장된 미생물 커뮤니티 시료를 6개월 동안 5회 채취하여 t-RFLP방법을 통하여 기능성 미생물 커뮤니티의 다양성 보존율 및 디젤 분해능을 조사한 결과, 기능성 미생물 커뮤니티가 효과적으로 보존되고 동일한 배양방법에 의해 다양성 및 활성이 90% 이상 복원되는 것을 확인할 수 있다.Therefore, the microbial community sample stored in liquid nitrogen by DMSO addition was collected five times for 6 months, and the diversity microbial preservation rate and diesel resolution of the functional microbial community were examined through the t-RFLP method. It can be seen that by the same culture method diversity and activity is restored more than 90%.
즉, 본 발명은 디젤오염토양에 존재하는 디젤 분해 기능성 미생물 커뮤니티의 확보와 보존방법에 관한 것으로, 본 발명에서 미생물 커뮤니티의 다양성을 확인하기 위해 사용된 분자유전학적 방법은 DGGE와 t-RFLP이고, 배지에 영향을 주지 않는 제올라이트를 고상담체로 사용하여 기능성 미생물 커뮤니티의 확보와 보존을 용이하게 한다. That is, the present invention relates to a method for securing and preserving a diesel decomposition functional microbial community present in diesel contaminated soil. The molecular genetic methods used to confirm the diversity of the microbial community in the present invention are DGGE and t-RFLP. The zeolite that does not affect the medium is used as a solid carrier to facilitate the securing and preservation of the functional microbial community.
이하, 실시예를 들어 본 발명을 상세히 기술할 것이나 본 발명의 범위를 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in detail with reference to Examples, but the scope of the present invention is not limited to these Examples.
실시예 1 : 토양시료의 선택Example 1 Selection of Soil Sample
토양시료는 광양제철소 주위의 디젤 오염이 예상되는 토양을 채취하였고, 가스 크로마토그래피(GC)를 이용하여 총 석유 탄화수소(Total petroleum hydrocarbone; TPH)를 분석하였으며(표 1), TPH가 가장 높은 KY7 토양시료를 실험에 사용하였다.Soil samples were collected from soils expected to be diesel-contaminated around Gwangyang Works. Gas chromatography (GC) was used to analyze total petroleum hydrocarbone (TPH) (Table 1). Samples were used for the experiment.
[표 1]TABLE 1
실시예 2 : 토양시료에서 디젤분해 미생물 커뮤니티 확보를 위한 집적배양 조건Example 2 Integrated Culture Conditions for Securing Diesel-Decomposing Microbial Communities in Soil Samples
사용된 배지는 BH 배지(MgSO4 0.2 g/L, CaCl2 0.02 g/L, KH2PO4 1.0 g/L, K2HPO4 1.0 g/L, KNO3 1.0 g/L, FeCl2 0.05 g/L)로 200 ml의 삼각플라스크에 50 ml의 BH배지, 0.5 g의 디젤, 토양시료 1 g을 넣어주었다. 멸균된 제올라이트(Sigma, U.S.A.)를 첨가한 배양액과 미첨가한 배양액을 준비하였다. 첨가한 배양액은 0.5 g의 제올라이트를 첨가하였다. 배양조건은 30 ℃ 배양기에서 120 rpm으로 10일간 진탕 배양하였다. 배양 후 염화메틸렌으로 남아 있는 디젤을 추출하여 GC를 이용하여 디젤 분해 활성을 분석하였다. 그 결과 집적배양 1회 후의 분해활성은 90% 정도로 나타났으며, 이는 첨가해 준 토양 입자에 의한 흡착과 유기성분에 의한 변환에 의해 분해활성이 높게 나타난 것으로 보여지며, 2회부터는 토양성 분을 거의 포함하지 않기 때문에 50% 정도의 분해활성을 보이며 적응기를 거쳐 집적배양 4회 후부터 96%의 분해활성을 나타내었다.The medium used was BH medium (MgSO 4 0.2 g / L, CaCl 2 0.02 g / L, KH 2 PO 4 1.0 g / L, K 2 HPO 4 1.0 g / L, KNO 3 1.0 g / L, FeCl 2 0.05 g / L) 50 ml BH medium, 0.5 g diesel, 1 g soil sample was added to the 200 ml Erlenmeyer flask. Sterilized zeolites (Sigma, USA) added and the addition of the culture medium was prepared. 0.5 g of zeolite was added to the added culture. Culture conditions were shaken for 10 days at 120 rpm in a 30 ℃ incubator. After incubation, the diesel remaining with methylene chloride was extracted and analyzed for diesel degradation activity using GC. As a result, the decomposition activity after 1 time of integrated culture was about 90%, which was shown to be high by adsorption by the added soil particles and conversion by organic components. Since it contains almost no degradation activity, it showed about 50% degradation activity and showed 96% degradation activity after 4 times of integrated culture after adaptation.
실시예 3 : DNA 추출과 다양성 분석Example 3 DNA Extraction and Diversity Analysis
BH 배지에서 배양된 기능성 미생물 커뮤니티는 UltraClean soil DNA kit(Mobio)을 이용하여 DNA를 추출하였고, DGGE과 t-RFLP의 다양성 분석을 위한 PCR은 아래와 같은 조건으로 수행되었다.Functional microbial community cultured in BH medium was extracted DNA using UltraClean soil DNA kit (Mobio), PCR for diversity analysis of DGGE and t-RFLP was performed under the following conditions.
DGGE를 위하여 사용된 프라이머Primer used for DGGE
27F ; 5'-FAM-AGA GTT TGA TCC TGG CTC GA-3' (서열번호 1)27F; 5'-FAM-AGA GTT TGA TCC TGG CTC GA-3 '(SEQ ID NO: 1)
1542R ; 5'-AGA AAG GAG GTG ATC CAG CC-3' (서열번호 2)1542R; 5'-AGA AAG GAG GTG ATC CAG CC-3 '(SEQ ID NO: 2)
t-RFLP를 위하여 사용된 프라이머Primer used for t-RFLP
341F GC ; 5'-CGC CCG CCG CGC GCG GCG GGC GGG GCG GGG GCA CGG GGG GCC TAC GGG AGG CAG CAG-3' (서열번호 3)341F GC; 5'-CGC CCG CCG CGC GCG GCG GGC GGG GCG GGG GCA CGG GGG GCC TAC GGG AGG CAG CAG-3 '(SEQ ID NO: 3)
907r ; 5'-CCG TCA ATT CAT TTG AGT TT-3' (서열번호 4)907r; 5'-CCG TCA ATT CAT TTG AGT TT-3 '(SEQ ID NO: 4)
DGGE를 위한 PCR조건PCR Conditions for DGGE
반응 혼합물의 구성:Composition of reaction mixture:
DNA 1 ㎕1 μl DNA
12.5 pmol 341F-GC 2.5 ㎕12.5 pmol 341F-GC 2.5 μl
12.5 pmol 907R 2.5 ㎕12.5 pmol 907R 2.5 μl
10 mM dNTP 혼합물 1 ㎕1
10 × PCR 완충액 5 ㎕5 μl of 10 × PCR buffer
Taq DNA 중합효소(superbio, Korea) 0.5 ㎕0.5 μl of Taq DNA polymerase (superbio, Korea)
dH2O 37.5 ㎕37.5 μl dH 2 O
반응조건(초기 변성 및 최종 연장과정을 제외하고 30회 반복):Reaction conditions (30 repetitions except for initial denaturation and final extension):
초기 변성 과정 - 94 ℃, 5분Initial denaturation process-94 ℃, 5 minutes
변성 과정 - 94 ℃, 1분Denaturation process-94 ℃, 1 minute
어닐링 과정 - 55 ℃, 1분Annealing process-55 ℃, 1 minute
중합 과정 - 72 ℃, 1분Polymerization process-72 ℃, 1 minute
최종 연장 과정 - 72 ℃, 10분Final extension process-72 ° C, 10 minutes
t-RFLP를 위한 PCR 조건PCR conditions for t-RFLP
반응 혼합물의 구성:Composition of reaction mixture:
DNA 1 ㎕1 μl DNA
40 pmol FAM-27F 0.5 ㎕40 pmol FAM-27F 0.5 μl
40 pmol 1542R 0.5 ㎕40 pmol 1542R 0.5 μl
10 mM dNTP 혼합물 2 ㎕2
10 × PCR 완충액 5 ㎕5 μl of 10 × PCR buffer
보빈 시럼 알부민(BSA) 0.5 ㎕0.5 μl bobbin serum albumin (BSA)
Taq DNA 중합효소(superbio, Korea) 0.5 ㎕0.5 μl of Taq DNA polymerase (superbio, Korea)
dH2O 40㎕40 μl dH 2 O
반응조건(초기 변성 및 최종 연장과정을 제외하고 30회 반복):Reaction conditions (30 repetitions except for initial denaturation and final extension):
초기 변성 과정 - 95 ℃, 3분Initial denaturation process-95 ℃, 3 minutes
변성 과정 - 94 ℃, 45초Denaturation process-94 ℃, 45 seconds
어닐링 과정 - 61 ℃, 45초Annealing process-61 ℃, 45 seconds
중합 과정 - 72 ℃, 2분Polymerization process-72 ℃, 2 minutes
최종 연장 과정 - 72 ℃, 7분Final extension process-72 ° C, 7 minutes
PCR 반응물은 아가로스 겔에서 확인하였다.PCR reactions were identified on agarose gels.
실시예 4 : 집적배양 중 미생물 커뮤니티의 다양성Example 4 Diversity of Microbial Communities in Integrated Culture
토양시료로부터 4회에 걸쳐 집적배양을 한 배양액에서 미생물 커뮤니티의 DNA를 추출하고 PCR을 수행하여 DGGE를 확인하였다. DGGE는 아크릴 아마이드 겔에 우레아와 포름아마이드의 농도구배에 염기서열의 차이를 이용하여 미생물커뮤니티를 확인하는 방법이다. 미생물 커뮤니티 다양성을 분석하는 가장 신속한 방법이다. DGGE를 수행하기 위한 조건으로는 6% 아크릴 아마이드 겔에 우레아 와 포름아마이드를 45 ~ 55%로 농도구배를 하였고, 전기영동은 60V, 16시간으로 수행하였다.DGGE was confirmed by extracting the DNA of the microbial community from the culture medium in which the culture was integrated four times from the soil sample and performing PCR. DGGE is a method of identifying microbial community using the difference in nucleotide sequence in the concentration gradient of urea and formamide in acrylamide gel. The fastest way to analyze microbial community diversity. As a condition for performing DGGE, urea and formamide were gradientd to 45-55% in 6% acrylamide gel, and electrophoresis was performed at 60V for 16 hours.
t-RFLP를 통해 미생물커뮤니티를 이루는 미생물 개체의 변화를 확인하였다. t-RFLP는 프라이머 5'말단에 형광물질을 부착한 후 PCR을 수행하고 그 PCR반응물을 제한효소를 이용하여 절단한 후 형광을 나타내는 DNA 단편의 길이를 측정함으로써 미생물 커뮤니티의 다양성을 확인할 수 있는 방법이다. t-RFLP confirmed the change of microbial organisms making up the microbial community. t-RFLP is a method that can confirm the diversity of the microbial community by attaching a fluorescent material to the 5 'end of the primer, performing PCR, cutting the PCR reaction using restriction enzymes, and measuring the length of the fluorescent DNA fragment. to be.
실시예 3 조건으로 수행한 PCR 반응물은 PCR 정제 킷트(Qiagen)로 정제하고 제한효소 HaeⅢ로 37℃에서 14시간 반응하였다. 반응 후 반응물은 뉴클레오타이드 리무발 킷트(Nucleotide removal kit, Qiagen)로 다시 한번 정제하여 쏠젠트(대전)에 의뢰하여 t-RFLP를 분석하였다. Example 3 PCR reactions carried out under the conditions were purified by PCR purification kit (Qiagen) and reacted for 14 hours at 37 ° C. with restriction enzyme HaeIII. After the reaction, the reaction product was once again purified by a Nucleotide Removal Kit (Qiagen) and commissioned by Solgent (Charge) to analyze t-RFLP.
DGGE를 통하여 확인한 미생물 커뮤니티의 미생물 개체의 변화는 도 1에서 볼 수 있다. 1번 레인은 토양에서 DNA를 추출한 것이고 2번 레인은 은 1차 집적배양, 3번 레인은 2차 , 4번 레인은 3차 , 5번 레인은 4차 후 DGGE의 결과이다. Changes in microbial populations of the microbial community identified through DGGE can be seen in FIG. 1.
도 1에 보이는 것과 같이, 토양 중에 많이 존재하던 밴드들은 1차와 2차 집적배양을 거치면서 디젤을 분해할 수 있는 미생물로만 개체가 감소하고, 3차, 4차 계대에서는 미생물 커뮤니티가 이미 안정화된 것을 볼 수 있다. 이것을 t-RFLP와 비교해보면 도 2에서 보듯이 토양 중에 많이 존재하는 미생물들이 t-RFLP에서는 피크(peak)로 나타나고 집적배양을 진행할수록 미생물 개체의 수는 감소하여 안정화 되는 것을 확인하였다.As shown in FIG. 1, the bands that existed in the soil were reduced to only microorganisms capable of decomposing diesel during the first and second integrated culture, and the microbial community was already stabilized in the third and fourth passages. You can see that. Comparing this with t-RFLP, as shown in FIG. 2, many microorganisms present in the soil appeared as peaks in t-RFLP, and as the incubation proceeded, the number of microbial populations decreased and stabilized.
실시예 5 : 기능성 미생물 커뮤니티의 보존방법의 조사Example 5 Investigation of Preservation Method of Functional Microbial Community
4회 집적배양한 배양액을 표 2와 같은 방법으로 각각 저장하였다. 고상담체 제올라이트 유무, 배양액 농축, 글리세롤, DMSO(dimethyl sulfoxide) 등의 영향을 조사하였고, G는 글리세롤, D는 DMSO, Z는 제올라이트, 5ㅧ 는 배양액을 5배 농축한 것을 의미한다.Each culture cultured 4 times was stored in the same manner as in Table 2. The presence of solid carrier zeolite, the concentration of the culture solution, glycerol, DMSO (dimethyl sulfoxide), and the effects of the investigation were investigated, G means glycerol, D means DMSO, Z means zeolite, 5 ㅧ means 5 times the concentration of the culture medium.
[표 2] TABLE 2
기능성 미생물 커뮤니티의 다양성은 실시예 4와 동일한 방법으로 DGGE를 통하여 수행하였다. DGGE의 수행결과는 도 3에 나타난 것과 같다. 1번 레인부터 6번 레인까지는 제올라이트를 첨가한 것이고 7번 레인부터 12번 레인은 제올라이트를 첨가하지 않은 미생물 커뮤니티이다. 도 3에서 확인할 수 있듯이, 제올라이트를 첨가한 미생물 커뮤니티는 밴드수가 평균 10.5개, 첨가하지 않은 미생물커뮤니티는 밴드 수가 평균 7.8개로 제올라이트를 사용한 보존방법이 커뮤니티 다양성 유지에 유리했음을 확인하였다. 이 외에도 제올라이트 첨가 시 균체회수 및 DNA 추출이 용이하였다. 배양액을 5배 농축하는 것은 크게 영향이 없었으며, -20 ℃ 보다는 더욱 낮은 온도(-196 ℃)에서 MC 보존이 우수하였고, 글리세 롤 보다는 DMSO에서 보존하는 것이 MC 다양성 유지에 더 좋은 효과를 나타내었다.The diversity of the functional microbial community was carried out via DGGE in the same manner as in Example 4. The result of performing the DGGE is as shown in FIG. 3.
실시예 6 : 장기 보존 후 미생물 커뮤니티 복원율 조사Example 6 Investigation of Microbial Community Recovery Rate after Long Term Preservation
최적 보존조건(제올라이트를 첨가한 배지에 4차 집적배양 후 그 배양액을 DMSO를 8%의 양으로 첨가하여 액체질소에 보존)에서 보존하면서 6개월간 5회 보존시료를 채취하여 BH 배지에 동일한 조건으로 10일간 진탕배양 후 실시예 4와 동일한 조건으로 t-RFLP를 실행하였다. Preserved under optimal preservation conditions (fourth integrated culture in zeolite-added medium and the culture solution in liquid nitrogen by adding DMSO in an amount of 8%), the preservation samples were collected five times for six months under the same conditions in BH medium. After 10 days shaking culture, t-RFLP was performed under the same conditions as in Example 4.
도 4의 t-RFLP의 결과에서는 이러한 미생물 커뮤니티의 보존 및 복원을 확실하게 확인할 수 있었다. t-RFLP의 결과에서 각각의 피크의 크기는 변화가 있지만 그 피크의 수는 일정하게 유지되는 것을 확인하였다. 이것은 제올라이트를 첨가한 배양액을 6개월간 보존 시 미생물 커뮤니티의 개체변화가 없이 보존되고 있는 것을 나타낸다.In the results of t-RFLP of Figure 4 it was confirmed that the preservation and restoration of this microbial community. In the results of t-RFLP, it was confirmed that the size of each peak was changed, but the number of the peaks remained constant. This indicates that the zeolite-added cultures are preserved without alteration of the microbial community when stored for 6 months.
이러한 t-RFLP의 결과를 액셀(마이크로 소프트 2000) 프로그램을 이용하여 수치화 시킨 것은 도 5이다. 결과를 수치화한 도면에서 모든 구간에서 존재하는 피크의 수는 총 14개 이었으며, 1개월 후에는 6개의 피크, 2개월 후에는 10개의 피크, 3개월 후에는 8개의 피크, 4개월과 6개월 후에는 9개와 10개의 피크가 존재하는 것을 확인하였다. 모든 구간에서 4, 8, 13, 14번 피크가 유지되는 것을 확인하였다. 이렇게 수치화된 각 개월들의 결과를 SPSS(SPSS 11.5 for window)를 통하여 상관관계를 조사하였다(표 3). 그 결과, 1개월 후와 6개월 후의 결과가 40%로 낮은 결과를 보여주었지만 1개월 후의 결과를 제외하면 모든 구간에 90%정도의 유사도를 보여주고 있다. The result of the t-RFLP is quantified using an Excel (Microsoft 2000) program. In the numerical figures, the total number of peaks in all sections was 14, 6 peaks after 1 month, 10 peaks after 2 months, 8 peaks after 3 months, 4 months and 6 months later. It was confirmed that 9 and 10 peaks are present. It was confirmed that
[표 3]TABLE 3
디젤의 분해 활성은 도 6과 같이 처음 보존시와 유사하게 92% 이상의 높은 디젤 분해 활성을 보여주었으며, 이것은 보존 6개월 후에 BH 배지에서 상기조건으로 배양하면 미생물 커뮤니티 다양성이 90% 이상 복원되는 것을 의미한다.The degradation activity of diesel showed a high diesel degradation activity of 92% or more similar to the initial storage as shown in Figure 6, which means that the culture of the microbial community diversity is restored more than 90% after 6 months of storage in the above conditions in BH medium do.
이상에서 상술한 바와 같이, 본 발명자들은 자연계에 존재하는 미생물들이 단일 미생물로 역할을 하기보다는 커뮤니티로 존재하고 있으나, 미생물에 관련된 연구들이 단일 미생물에 집중되어 왔기 때문에 유용미생물 커뮤니티의 확보 및 보존 방법에 대해선 전무한 현실 가운데 디젤을 생분해하는 미생물 커뮤니티를 확보 및 보존하는 방법을 확립하였다. As described above, the inventors of the present invention exist as a community rather than act as a single microorganism in the natural world, but since research related to microorganisms has been concentrated on a single microorganism, the method for securing and preserving a useful microorganism community. In the absence of reality, we have established ways to secure and preserve microbial communities that biodegrade diesel.
본 발명자들에 의해 수행될 미생물 커뮤니티 구축 사업은 기존의 분리된 타 균주에 비해 탁월한 신규성을 보유(최소 Unknown gene, 60%)한 신규 미생물군의 자원화를 가능케 할 것이며, 구축될 미생물 커뮤니티 뱅크를 통하여 제공될 MC 시료는 국내뿐만 아니라 국외의 미생물군을 이용한 오염 환경의 바이오레메디에이션(Bioremediation) 공정 개발을 가속화할 것이며, 이를 통해 오염 환경의 정화라는 기술적인 성과뿐만 아니라 경제적으로도 큰 부가가치를 창출할 수 있을 것으로 기대된다.The microbial community building project to be carried out by the present inventors will enable the resourceization of a new microbial group having excellent novelty (minimum unknown gene, 60%) compared to other existing strains, and through the microbial community bank to be built The MC samples to be provided will accelerate the development of bioremediation processes in contaminated environments using microbial populations both domestically and internationally, thereby creating significant added value not only in technological achievements in the purification of contaminated environments but also in economics. It is expected to be able.
서열목록 전자파일 첨부 Attach sequence list electronic file
Claims (5)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020060038251A KR100704986B1 (en) | 2006-04-27 | 2006-04-27 | Establishment of functional microbial community being capable of degrading diesel oil and the preservation method |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020060038251A KR100704986B1 (en) | 2006-04-27 | 2006-04-27 | Establishment of functional microbial community being capable of degrading diesel oil and the preservation method |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR100704986B1 true KR100704986B1 (en) | 2007-04-09 |
Family
ID=38161204
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020060038251A KR100704986B1 (en) | 2006-04-27 | 2006-04-27 | Establishment of functional microbial community being capable of degrading diesel oil and the preservation method |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR100704986B1 (en) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR101109120B1 (en) | 2009-07-22 | 2012-02-16 | 한국생명공학연구원 | Functional microbial community being capable of degrading petroleum contaminated ocean environment |
| KR101554155B1 (en) | 2013-05-10 | 2015-09-18 | 한국해양과학기술원 | New Alcanivorax spp. degrading petroleum hydrocarbon and Methods of bioremediation by using thereof |
| CN111041118A (en) * | 2019-12-25 | 2020-04-21 | 山西晋城无烟煤矿业集团有限责任公司 | Method for rapidly detecting flora structure in drainage and production water of coal-bed gas well by using PCR-DGGE (polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis) |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH026A (en) * | 1987-11-23 | 1990-01-05 | Polaroid Corp | Common driver for shutter blade and objective lens assembly |
| JPH02503A (en) * | 1987-09-30 | 1990-01-05 | Nitto Denko Corp | Functional polymer sheet |
| KR20000034035A (en) * | 1998-11-27 | 2000-06-15 | 구본탁 | Bioaugmentation of oil contaminated soil by microbial composition which can decompose hydrocarbons derived from petroleum |
| KR20010004647A (en) * | 1999-06-29 | 2001-01-15 | 허태학 | Complex strain for disintegrating diesel oil and its making method |
| KR20050043506A (en) * | 2003-11-06 | 2005-05-11 | (주)네오팜 | Method for bioremediation of oil-contaminated soils using a specific microorganism and biosurfactant agent |
-
2006
- 2006-04-27 KR KR1020060038251A patent/KR100704986B1/en not_active IP Right Cessation
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH02503A (en) * | 1987-09-30 | 1990-01-05 | Nitto Denko Corp | Functional polymer sheet |
| JPH026A (en) * | 1987-11-23 | 1990-01-05 | Polaroid Corp | Common driver for shutter blade and objective lens assembly |
| KR20000034035A (en) * | 1998-11-27 | 2000-06-15 | 구본탁 | Bioaugmentation of oil contaminated soil by microbial composition which can decompose hydrocarbons derived from petroleum |
| KR20010004647A (en) * | 1999-06-29 | 2001-01-15 | 허태학 | Complex strain for disintegrating diesel oil and its making method |
| KR20050043506A (en) * | 2003-11-06 | 2005-05-11 | (주)네오팜 | Method for bioremediation of oil-contaminated soils using a specific microorganism and biosurfactant agent |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| 논문2005.03 |
| 논문2006 |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR101109120B1 (en) | 2009-07-22 | 2012-02-16 | 한국생명공학연구원 | Functional microbial community being capable of degrading petroleum contaminated ocean environment |
| KR101554155B1 (en) | 2013-05-10 | 2015-09-18 | 한국해양과학기술원 | New Alcanivorax spp. degrading petroleum hydrocarbon and Methods of bioremediation by using thereof |
| CN111041118A (en) * | 2019-12-25 | 2020-04-21 | 山西晋城无烟煤矿业集团有限责任公司 | Method for rapidly detecting flora structure in drainage and production water of coal-bed gas well by using PCR-DGGE (polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis) |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Bordenave et al. | Effects of heavy fuel oil on the bacterial community structure of a pristine microbial mat | |
| Watanabe | Microorganisms relevant to bioremediation | |
| Popp et al. | Bacterial diversity in the active stage of a bioremediation system for mineral oil hydrocarbon-contaminated soils | |
| Labbé et al. | Comparative phylogenetic analysis of microbial communities in pristine and hydrocarbon-contaminated Alpine soils | |
| Ali et al. | The potential of epiphytic hydrocarbon-utilizing bacteria on legume leaves for attenuation of atmospheric hydrocarbon pollutants | |
| Vázquez et al. | Bacterial community dynamics during bioremediation of diesel oil-contaminated Antarctic soil | |
| Greene et al. | Analysis of environmental microbial communities by reverse sample genome probing | |
| Zucchi et al. | Response of bacterial community during bioremediation of an oil‐polluted soil | |
| Chaillan et al. | Role of cyanobacteria in the biodegradation of crude oil by a tropical cyanobacterial mat | |
| Petri et al. | Genetic analysis of sea-ice bacterial communities of the Western Baltic Sea using an improved double gradient method | |
| Gomez et al. | Characterization of bacterial diversity at different depths in the Moravia Hill landfill site at Medellín, Colombia | |
| US20060275887A1 (en) | Mycobacteria compositions and methods of use in bioremediation | |
| Nwankwegu et al. | Reclamation of DPK hydrocarbon polluted agricultural soil using a selected bulking agent | |
| Alekhina et al. | Molecular analysis of bacterial diversity in kerosene-based drilling fluid from the deep ice borehole at Vostok, East Antarctica | |
| Chikere | Culture-independent analysis of bacterial community composition during bioremediation of crude oil-polluted soil | |
| Gu et al. | Isolation and transcriptome analysis of phenol-degrading bacterium from carbon–sand filters in a full-scale drinking water treatment plant | |
| Zhang et al. | Molecular assessment of inoculated and indigenous bacteria in biofilms from a pilot-scale perchlorate-reducing bioreactor | |
| Hauptfeld et al. | A metagenomic portrait of the microbial community responsible for two decades of bioremediation of poly-contaminated groundwater | |
| Nakagawa et al. | Successive changes in community structure of an ethylbenzene-degrading sulfate-reducing consortium | |
| KR100704986B1 (en) | Establishment of functional microbial community being capable of degrading diesel oil and the preservation method | |
| Chen et al. | Effect of different enrichment strategies on microbial community structure in petroleum-contaminated marine sediment in Dalian, China | |
| Fidiastuti et al. | Studies of Bacillus subtilis NAP1 to degrade BOD, COD, TSS, and pH: The indigenous bacteria in Indonesia batik wastewater | |
| Kundu et al. | Impacts of Arctic diesel contamination on microbial community composition and degradative gene abundance during hydrocarbon biodegradation with and without nutrients: A case study of seven sub-Arctic soils | |
| Krumme et al. | Behavior of pollutant-degrading microorganisms in aquifers: predictions for genetically engineered organisms | |
| Moon et al. | Distribution of the microbial community structure in sulfur-based autotrophic denitrification columns |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A201 | Request for examination | ||
| E701 | Decision to grant or registration of patent right | ||
| GRNT | Written decision to grant | ||
| FPAY | Annual fee payment | ||
| FPAY | Annual fee payment | ||
| LAPS | Lapse due to unpaid annual fee |