KR100704007B1

KR100704007B1 - 화학발광 및 형광을 이용한 신속진단키트 및 이의 사용방법

Info

Publication number: KR100704007B1
Application number: KR1020060005111A
Authority: KR
Inventors: 박재환; 박재관; 최영진; 변재철
Original assignee: 한국과학기술연구원
Priority date: 2006-01-17
Filing date: 2006-01-17
Publication date: 2007-04-04

Abstract

본 발명은 화학발광 및 화학형광을 이용한 신속진단키트 및 이의 사용방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 시료패드, 콘주게이트패드, 신호밴드와 확인밴드로 구성된 분리멤브레인 및 흡수패드로 이루어진 신속진단키트에 있어서, 상기 분리멤브레인에 화학발광 및 화학형광의 각각 측정이 가능한 특정의 CdS_x/CdSe_1-x(0 < x < 1)의 혼합 고용체 나노선이 포함된 광센서를 적용하면, 상기 단결정인 혼합 고용체 나노선이 가진 물리적, 화학적 환경에 대한 반응 및 감지력이 우수성으로 센서로서의 기능이 탁월하고, 별도의 기기 및 광 차단 장치 없이 사용 가능하며, 소형화 및 생산원가가 저렴하여 경제성이 향상된 화학발광 및 화학형광을 이용한 신속진단키트 및 이의 사용방법에 관한 것이다.

혼합 고용체 나노선, 광센서, 화학발광, 화학형광, 신속진단키트

Description

화학발광 및 형광을 이용한 신속진단키트 및 이의 사용방법{Lateral flow immunoassay kit based on chemiluminescence and chemifluorescence reaction and using method thereof}

도 1은 본 발명에 따른 분리멤브레인을 사용하여 제조한 화학형광 및 화학발광용 신속진단키트를 나타낸 것이다.

도 2는 본 발명의 화학발광용 신속진단키트의 발광중인 신호밴드를 나타낸다.

도 3은 본 발명의 화학발광 측정용 나노선 광센서를 나타낸 것이다.

도 4는 본 발명의 CdS_x/CdSe_1-x(x = 0.8) 혼합 고용체 나노선을 포함하는 광센서를 사용하여 제조된 화학발광 측정용 나노선 광센서의 광파장 특성을 나타낸 것이다.

도 5는 본 발명의 CdS_x/CdSe_1-x(x = 0.2) 혼합 고용체 나노선을 포함하는 광센서를 사용하여 제조된 화학발광 측정용 나노선 광센서의 광파장 특성을 나타낸 것이다.

도 6은 본 발명의 화학형광 측정용 나노선 광센서를 나타낸 것이다.

도 7은 본 발명의 양고추냉이 퍼옥시다제(HRP)의 사용량 변화에 따른 화학발광량 변화의 상관관계를 나타낸 것이다.

도 8은 본 발명의 플루오레세인(Fluorecein)의 사용량 변화에 따른 화학형광량 변화의 상관관계를 나타낸 것이다.

신속진단키트(Rapid Test Kit for Immunoassay)는 일반인의 체액을 이용하여 진단 검사가 가능한 현장검사(point-of-care)를 위한 검사 도구이다[Grubb et.al, uS Patent 4,168,146 (1979), Kang et.al, US Patent 제 5,559,041호(1996) 참조].

이러한 신속진단키트의 대표적인 예로서, 가정용 임신 진단 키트, 응급실용 에이즈 진단 키트 등을 들 수 있다. 일반적으로 사용되는 신속진단키트는 스트립형 구조로 되어 있으며, 스트립에 점주입된 액체시료가 모세관 현상에 의하여 이동한다.

이러한 신속진단키트의 기본원리는 면역분석으로, 시료중의 분석 대상물이 이동경로 중에 위치된 신호밴드에서 항원-항체 반응을 일으키게 되고, 이러한 반응의 결과를 화학발색을 통하여 육안으로 확인하는 것이다. 신속진단검사의 유효성 판정은 신호밴드 전후에 위치한 확인밴드에서 시료 내 분석 대상물의 양에 따라 일어나는 시료의 발색반응을 통해 진단과정에서 수행되는 시료의 정상적인 이동과 검사 키트의 유효성을 확인하도록 제조된다. 이러한 신속진단키트는 시료 내에 분석 대상물이 일정 농도 이상 존재함을 확인하는 제한적인 정량검사에 해당되며, 세분화된 정량을 위해서는 여러 개의 반응점을 위치시키는 방법이 적용된다. 발색반응으로 확인 가능한 분석대상물의 농도의 한계는 10^-9 M 내지 10^-6 M 수준으로 알려져 있다.

일회용 신속검사키트 스트립상의 발색반응에 대한 검출한계를 향상시키기 위해 기기를 사용하는 연구도 보고되어 있다[Allen et.al, US Patent 제 5,580,794호(1996), Allen et.al. US　Patent 제 5,837,546호(1998) 참조]. 이 기기의 경우 신호밴드와 확인밴드에 발광다이오드(LED)를 통해 빛을 가하고 반사되는 광량을 측정하여 신호밴드 및 확인밴드의 발색반응량을 확인한다.

이에 비하여, 화학발광을 사용하는 경우 분석 가능한 한계는 10^-19 M 까지, 화학형광의 경우 10^-12 M 까지 향상될 수 있음이 알려져 있다[K. Dyke, Light Probes, in Luminescence biotechnology, CRC Press, 2002, pp. 5 참조]. 또한, 화학형광 및 화학발광을 사용한 키트의 구성을 위해서는 종래의 발색을 이용하는 신속진단키트에 사용되는 시료패드, 콘주게이트 패드, 분리멤브레인, 흡수패드 등 구조재료를 동일하게 사용할 수 있고, 화학형광 및 화학발광을 일으키는 특이기질을 콘주게이트 패드에 대체하여 사용하게 된다. 신속진단키트에 화학발광이나 화학형광을 이용하면, 감도의 향상으로 인하여 다양한 종류의 체액 시료내에 포함된 극미량의 분속대상물의 분석이 가능하기 때문에, 신속진단키트의 응용 범위의 확장이 가능하고, 반응기질만을 교체하거나 형광물질을 결합시킴으로써 화학발광 또는 화학형광 키트의 구성이 가능하므로, 기존의 생산시설을 그대로 사용할 수 있는 장점이 있다. 그러나, 화학발광이나 화학형광을 이용하는 경우, 종래의 화학발색과 달리, 육안으로 검사 결과의 식별이 불가능하기 때문에, 검사결과의 확인을 위해서는 화학발광량과 화학형광량을 측정하기 위한 별도의 검출기가 필요하다.

기존에 사용되는 화학발광 측정용 검출기로는 광전 증배관(PMT, Photomultiplier tube)와 전하결합소자(CCD, Charge-coupled device)를 사용한 기기가 일반적이다[K. Dyke, Instrumentation for the Measurement of Luminescence, in Luminescence biotechnology, CRC Press, 2002, pp. 31-39 참조]. 이러한 광전 증배관은 소형화가 곤란하고 생산 단가가 높아 일회용으로 사용이 불가능하다는 단점이 있고, 전하결합소자는 소형화는 용이하나 감응하는 광파장의 범위가 넓어서 정확한 측정을 위해서는 암실조건이 필요하기 때문에 현장에서 외부기기 없이 사용하기 곤란하다는 단점이 있다.

따라서, 신속진단키트에 화학발광 및 화학형광을 도입하기 위해서는 키트에 내장할 수 있도록 소형화가 가능하고, 일회용으로 사용할 수 있도록 생산 단가가 저렴하며, 사용현장에서 별도의 외부 기기나 빛의 차단 없이 사용이 가능한 나노선 광센서를 사용한 검출기의 개발이 진행되었다[Choi, et. al, Korean Patent(2004), Choi, et.al, PCT(2005) 참조].

이에 본 발명자들은 상기와 같이 화학발광과 화학형광이 동시에 도입된 새로운 개념의 신속진단키트를 제조하고자 연구 노력하였다. 그 결과, 시료패드, 콘주게이트패드, 신호밴드와 확인밴드로 구성된 분리멤브레인 및 흡수패드로 이루어진 신속진단키트에 있어서, 상기 분리멤브레인에 화학발광 및 화학형광의 각각 측정이 가능한 특정의 CdS_x/CdSe_1-x(0 < x < 1)의 혼합 고용체 나노선이 포함된 광센서를 적용하면, 상기 단결정인 혼합 고용체 나노선이 가진 물리적, 화학적 환경에 대한 반응 및 감지력의 우수성으로 센서로서의 기능이 탁월하고, 별도의 기기 및 광 차단 장치 없이 사용 가능하며, 마이크로전극을 이용한 기기의 소형화 및 생산 원가가 저렴하여 경제성이 향상된다는 것을 알게 되어 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명은 광 센서로서 특정의 CdS_x/CdSe_1-x(0 < x < 1)의 혼합 고용체 나노선을 사용하여, 화학발광 및 화학형광의 각각 감지가 가능한 신속진단키트 및 이의 사용방법을 제공하는 데 그 목적이 있다.

본 발명은 시료패드, 콘주게이트패드, 신호밴드와 확인밴드로 구성된 분리멤브레인 및 흡수패드로 이루어진 신속진단키트로 구성되어 있되, 상기 분리멤브레인에, CdS_x/CdSe_1-x(0 < x < 1)의 혼합 고용체 나노선이 포함된 광센서가 포함되어 화학형광 및 발광을 발현하는 신속진단키트에 그 특징이 있다.

이하 본 발명을 상세히 설명하면 다음과 같다.

본 발명은 감지하는 광센서에 화학발광 및 화학형광 각각 측정이 가능한 특정의 혼합고용체 나노선을 도입한 신속진단키트에 관한 것이다.

화학발광이나 화학형광의 각각의 방법을 도입 사용한 여러 문헌은 공지된 바 있으나, 상기 발광이나 형광을 감지하기 위한 별도의 장치가 요구되거나, 경제성 면에서 효율적이지 못하여 그 실용성 면에서 많은 문제가 있다.

이에 본 발명은 CdS_x/CdSe_1-x(0 < x < 1)의 혼합 고용체 나노선 형태의 광센서를 도입하여, 나노선 물리·화학적 특성과 함께 CdS_x/CdSe_1-x의 혼합 고용체 성분의 특성이 동시에 갖게 함으로써 종래의 별도 감지 장치 및 제조원가 등의 경제적 인 면을 개선한 것이다.

구체적으로 설명하면, 먼저 나노선은 일반적으로 단결정 물질로 결함 또는 불순물의 물리적, 화학적 특성에 대한 영향이 거의 없으며, 표면적이 대단히 크고, 나노 크기로 얻어지기 때문에 물리적, 화학적 환경 변화에 대한 반응 및 감지력이 크기 때문에, 센서로서의 기능이 탁월하다. 또한, 한 방향으로 충분히 큰 길이를 갖기 때문에 다른 나노 물질과 비교하여 소자 형태로 제작하기에 용이하다.

특히, 반도체 나노선은 특정 파장(광 감응 파장대역)에서 광여기에 의하여 전기 저항이 낮아지는 특성이 알려져 있으며, 이러한 특성을 이용하여 특정 파장에 대한 광스위치 또는 광센서로 사용하고자 하는 연구가 보고되어 있다. 이의 예로는 ZnO 나노선을 이용한 광센서가 보고되어진 바 있다[H. Kind, H. Yan, B. Messer, M. Law, P. Yang. Nanowire Ultraviolet photodetectors and optical switches, Adv. Mater. 14 (2002) 158-160 참조]. 이때, 상기 나노선의 전기저항 또는 도통전류를 측정함으로써 특정 파장의 방출여부 및 방출정도를 측정할 수 있다.

다음으로, 나노선을 구성하는 CdS_x/CdSe_1-x의 혼합 고용체 성분은 단일물질로 제조된 나노선과 달리 성분비의 조절을 통해 전기 저항변화를 나타내는 광파장의 변조가 가능하며, 이를 이용한 단결정 성분의 경우, 감응광 파장에 해당하는 광이 조사되는 경우 가장 효과적인 전자전달 통로(electron transfer pathway)를 제공하므로 미약한 광강도를 이용하는 신속진단키트의 광센서로 적용 시 보다 효과적이 다.

보다 구체적으로, 통상적으로 항원, 항체 반응에서 발생되는 광은 대부분 400 ∼ 700 ㎚ 범위의 가시영역의 파장대이며, 여기에 효과적으로 감응할 수 있는 밴드갭은 1.5 ∼ 2.5 eV 정도범위가 바람직하다. 본 발명의 혼합 고용체 나노선에 사용되는 성분인 CdS_x와 CdSe_1-x은 각각 약 2.5 eV와 1.7 eV를 유지하는 바, 이 두 조성을 연속적으로 혼합 사용하면, 상기 가시영역의 파장대에 감응하는 범위로 연속적인 변조가 가능하게 된다. 이는 가시영역의 밴드갭을 유지하는 최적의 금속을 적절히 선택 사용한 것으로 당 업자의 단순 조합 및 반복 실시에 의해서 결코 얻어질 수 없는 것이다.

따라서, 본 발명은 특정 광파장에 감응하여 전기저항이 변화되는 특성을 갖는 CdS_x/CdSe_1-x의 혼합 고용체 성분을 이용한 나노선이 포함된 광센서가 함유되어 이루어진 신속진단키트에 기술구성상의 특징이 있는 것이다.

통상적으로 신속진단키트는 도 1에 나타낸 바와 같이, 시료 패드, 콘주게이트 패드, 분리멤브레인, 흡수패드 등으로 구성된다. 상기 콘주게이트 패드에는 시료내의 분석대상물과 결합하는 항체가 건조상태로 저장되어 있으며, 이 항체는 금 입자 또는 라텍스 비드 등의 물질과 연결된 형태이다.

시료가 시료패드에 가해지면 액체인 시료는 건조상태의 시료패드를 적신 후, 콘주게이트 패드로 이동하여 분석대상물은 건조상태로 저장되어있는 항체와 결합을 이루어 복합체를 형성하며 분리멤브레인을 따라 이동하게 된다. 분리멤브레인 의 표면에는 신호밴드와 확인밴드가 인쇄되어 있으며, 시료내에 분석대상물이 포함되어 있는 경우 신호밴드부분에 복합체가 축적된다. 콘주게이트 패드의 항체에는 금 입자 또는 라텍스 비드 등의 물질 연결되어 있어 일정량 이상의 복합체가 응집되는 경우 육안으로 신호밴드가 발색을 하는 것으로 관찰되는 것이다.

시트의 확인밴드에는 저장부의 항체와 결합하는 항체가 인쇄되어 있어 확인밴드의 발색유무를 통해 액체시료가 필요부분까지 이동 여부 및 항체의 작동여부를 판정하여 검사의 실효성 여부를 판독하는 기준으로 사용하며, 분리멤브레인의 말단에 부착된 흡수패드는 분리멤브레인을 통해 이동한 액체시료를 흡수하여 액체시료가 지속적으로 이동하도록 하는 펌프 역할을 한다. 또한 상기 흡수패드는 콘주게이트 패드에서 이동한 항체가 분리멤브레인에 남아 잔색을 남겨두지 않도록 하여 백그라운드를 낮추는 역할을 한다.

본 발명의 신속진단키트는 화학형광 및 화학발광에 따라 사용방법에 미차가 있는 바, 이는 구체적으로 설명하면 다음과 같다.

먼저, 본 발명에서 제공하는 화학형광을 이용하는 신속진단키트는 형광물질인 형광물질이 화학연결된 항체를 콘주게이트 패드에 건조상태로 저장하고, 시료를 시료패드에 주입하여 검사를 진행한다. 시료내 분석대상물은 콘주게이트 패드로 이동하여 저장된 항체와 결합체를 이루어 분리멤브레인으로 이동한다. 신호밴드에 결합체가 축적되고 여분의 형광물질 결합 항체는 분리멤브레인을 통과하여 흡수패드에 흡수된다. 이때 신호밴드에 선택적으로 흡착된 분석대상물과 형광물질 연결 항체의 결합체는 발광다이오드(LED)를 사용한 광원으로부터 에너지를 받 아 화학형광을 발생시킨다.

이때 사용되는 형광물질로는 구체적으로 플루오레세인(Fluorecein), 바이오디피-FL(Biodipy-FL), 알렉사 플루오르 그린(Alexa Fluor Green), R-피코에리트린(R-phycoerythrin), 피코에리트린-텍사스 레드(Phycoerythrin-Texas Red), 피코에리트린-시아닌5(Phycoerythrin-cyanine5), 피코에리트린-시아닌7(Phycoerythrin-cyanine7), 페리디닌-클로로필 단백질(Peridinin-chlorophyll protein), 알로피코시아닌(Allophycocyanin) 및 알로피코시아닌-시아닌7(Allophycocyanin-cyanine7) 중에서 선택된 것을 사용할 수 있다. 바람직하기로는 488 ㎚에서 흡광하여 522 ㎚에서 형광을 발생하는 형광물질인 플루오레세인(Fluorecein)이 좋으며, 이는 임뮤노어세이를 사용하는 의료진단, 환경모니터링 등에 널리 이용되고 있어 관련분야에 널리 활용 가능하다.

다음으로, 본 발명에서 제공하는 화학발광을 이용하는 신속진단키트는 콘주게이트패드에 발광효소가 화학 연결된 항체를 건조상태로 저장하고, 시료를 발광전개액과 혼합하여 혼합액을 시료패드에 주입하여 검사를 진행한다.

시료내 분석대상물은 발광기질과 인헨서로 이루어진 발광전개액과 섞인 상태로 콘주게이트 패드로 이동하여 이곳에 저장된 항체와 결합체를 이루어 분리멤브레인으로 이동한다. 신호밴드에 결합체가 축적되고 여분의 발광효소 결합항체는 분리멤브레인을 통과하여 흡수패드에 흡수된다. 이때 신호밴드에 선택적으로 흡착된 분석대상물과 발광효소 결합 항체의 결합체는 발광전개액과 반응하여 신호밴드에서 다음 도 2에 나타낸 바와 같이 화학발광을 발생시킨다. 다음 반응식 은 화학발광에 사용되는 발광효소와 발광전개액의 반응의 일례로, 발광요소로 양고추냉이 퍼옥시다제와 발광전개액으로 루미놀의 반응을 나타낸 것이다.

[반응식]

이때, 상기 발광효소는 양고추냉이 퍼옥시다제(HRP), 알칼라인 포스파타아제(AP) 및 루시페라제(luciferase) 중에서 선택 사용할 수 있으며, 상기 발광기질은 아다만탄-디옥세탄(Adamantane-dioxetane), 아크리디늄(Acridinium) 유도체, 루미놀(Luminol) 유도체, 루시게닌(Lucigenin), 반딧불이 루시페린(Firefly luciferin), 포토프로테인(Photoprotein), 히드라지드(hydrazides) 및 쉬프(schiff)의 염기 화합물, 전기화학적 발광기질 및 발광성 산소채널링 기질 중에서 선택 사용할 수 있다.

한편, 나노선 광센서의 제조는 나노선의 합성과 광센서 전극과의 결합을 통해 이루어진다. 상기 광센서 전극은 당 분야에서 일반적으로 사용되는 것으로 특별히 한정하지는 않으며, 본 발명은 다음 도 3과 같은 전극을 사용하는 바, 본 발명에 이에 국한되는 것은 아니다.

다음 도 3에 나타낸 바와 같이, 나노선 광센서 전극은 전극간 간격이 5 ∼ 10 ㎛로 고정된 인터디지탈형 전극으로 각각 50 ∼ 100 개의 전극이 약 5 ㎛ 간격 으로 나란히 배열되어 있다. 이때, 전극의 폭은 5 ㎛이며 길이는 0.5 mm이며, 전극의 외형은 가로 2 mm, 세로 3.5 mm이다. 이와 같은 전극은 0.5 mm 두께의 유리웨이퍼에 나노선의 고정에 사용 가능한 금속을 스퍼터한 후, 포토레지스트와 마스크를 사용한 패턴작업으로 제조한다. 이때, 나노선의 고정에 사용 가능한 금속으로 본 발명에서는 Cr와 Au을 각각 5 nm와 100 nm 두께로 사용한다. 전극의 양편에는 접촉패드가 있어 전체회로와 연결을 위해 사용한다.

본 발명에서 사용된 CdS_x/CdSe_1-x 혼합 고용체 나노선은 다음과 같은 방법으로 제조된다.

고강도의 레이저빔(λ = 248 nm)을 CdS_x/CdSe_1-x 혼합 고용체로 이루어진 타켓 표면에 조사하여 레이저빔과 타켓의 상호작용으로 인해 타켓 조성의 열적, 비열적인 광분해 현상이 발생하여 타켓 조성이 기판 위에 증착하게 된다. 이때, 운송 가스(carrier gas)는 알곤 가스를 사용하고, 레이저 반복 주기는 1 ∼ 10 Hz, 에너지 밀도는 1 ∼ 5 J/㎠, 반응온도는 500 ∼ 1000 ℃의 범위, 반응기내의 압력을 1 ∼ 10 torr로 조절된 조건하에서 타켓의 조성이 기화되어 나노선이 실리콘 기판 상에 증착 및 성장하여 CdS_x/CdSe_1-x나노선을 재현성 있게 합성할 수 있다. 상기 CdS_x/CdSe_1-x 나노선이 성장된 기판을 이소프로판올에 넣은 후 초음파를 가하여 나노선을 기판으로부터 분리한 후, 나노선 광센서 전극에 분주하여 건조시켜 고정시킨다. 이때 전극의 접촉패드를 통해 멀티메터로 저항을 측정하여 CdS_x/CdSe_1-x 나노선 고정여부를 판정하며, 적합 저항범위는 수백 ㏀ ∼ 10 ㏁ 이다. 적합 저항범위를 벗어나는 경우 나노선 용액을 더 가하고 건조한 후 측정을 반복한다.

본 발명에서와 같이 화학발광을 사용한 신속진단키트의 경우, 일례로 발광전개액에 포함된 루미놀은 420 nm 파장의 화학발광을 일으키므로 이를 측정하기 위해서는 이 파장대의 광에 선택적으로 감응하는 광센서가 요구된다. 다음 도 6에 보 것과 같이 CdS_x/CdSe_1-x (x = 0.8) 나노선의 경우 앞서의 방법으로 나노선 광센서용 전극을 제조한 경우, 루미놀의 발광파장인 420 nm 근처에서 최고감응을 보이는 것으로 관찰되었다. 상기와 같이 제조된 광센서는 양고추냉이 퍼옥시다제(HRP)와 루미놀의 반응을 사용한 신속진단키트에서 화학발광의 측정에 사용이 가능하다. 나노선 광센서의 표면보호를 위해 자외선으로 큐어링 하는 아크릴계 접착제를 사용하여 부착하였으며, 사용된 아크릴계 접착제는 400 nm 이상인 파장의 광을 95 % 이상 통과시키는 광학성질을 만족하는 것으로 선별하였다.

또한, 화학형광을 사용한 신속진단키트의 경우, 일례로 콘주게이트 패드 항체에 결합된 형광제인 플루오레세인(Fluorescein)의 경우 488 nm 파장에서 흡광을 일으킨 후, 522 nm의 화학형광을 발생시킨다. 따라서 화학형광을 측정하기 위해서는 형광물질의 흡광을 유도하기 위해 광원에서 발생시키는 488 nm의 광에는 감응이 최소이고 형광으로 나타나는 522 nm 파장의 광에 최대감응을 보이는 나노선 광센서가 요구된다. 이 파장대의 광에 선택적으로 감응하는 광센서가 요구된다. 다음 도 7에 보인 것과 같이 CdS_x/CdSe_1-x(x = 0.2) 나노선을 사용한 나노선 광센서는 플루오레세인(Fluorescein)의 흡광파장인 488 nm 근처에서 최소감응을 보이고, 형광파장인 522 nm의 파장에서 최대감응을 나타내는 것으로 관찰되었다. 이와 같은 감응을 보이는 나노선 광센서는 앞서와 같이 CdS_x/CdSe_1-x 나노선을 광센서 전극에 고정시킨 후, 500 nm 이하의 파장의 광을 차단하는 소형 고역필터(high pass filter)를 전극의 전면에 부착하는 방법으로 제조되었다. 고역필터(high pass filter)는 자외선으로 큐어링 하는 아크릴계 접착제를 사용하여 부착하였으며 사용된 아크릴계 접착제는 400 nm 이상인 파장의 광을 95% 이상 통과시키는 광학성질을 만족하는 것으로 선별하였다.

이러한 나노선을 이용하는 광센서는 신속진단키트에 내장이 가능하도록 소형화가 용이하고, 일회용으로 사용할 수 있도록 생산 단가가 저렴하며, 사용 현장에서 별도의 외부기기 없이 사용이 가능하다. 또한, 나노선을 사용하는 광스위치의 경우 일반 전하결합소자나 광다이오드와 달리 감응하는 광파장 범위가 좁아 별도의 광차단 장치 없이 신속진단키트용 플라스틱 용기내에 내장하여 사용이 가능하고, 소비전력이 작아 신속진단키트에 내장 가능한 단추형 전지를 사용하여 구동이 가능하다.

이하, 본 발명을 다음의 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명하는 바, 본 발명이 다음의 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

제조예 1 : CdS_x/CdSe_1-x 혼합 고용체 나노선 제조

고강도의 레이저빔(λ = 248 nm)을 CdS_x/CdSe_1-x 혼합 고용체로 이루어진 타켓 표면에 조사하여 레이저빔과 타켓의 상호작용으로 인해 타켓 조성의 열적, 비열적인 광분해 현상이 발생하여 타켓 조성이 기판 위에 증착하게 된다. 이때, 운송 가스(carrier gas)는 알곤 가스를 사용하고, 레이저 반복 주기는 5 Hz, 에너지 밀도는 3 J/㎠, 반응온도는 700 ℃의 범위, 반응기내의 압력을 5 torr로 조절된 조건하에서 타켓의 조성이 기화되어 나노선이 실리콘 기판 상에 증착 및 성장하여 CdS_x/CdSe_1-x나노선을 합성하였다.

제조예 2 : 나노선 광센서 전극 제조

전극간 간격이 5 ㎛로 고정된 인터디지탈형 전극으로 각각 50 개의 전극이 5 ㎛ 간격으로 나란히 배열되어 있으며, 전극의 폭은 5 ㎛이고, 길이는 5 mm이며, 전극의 외형은 가로 15 mm이고, 세로 8 mm이었다. 이와 같은 전극은 1 mm 두께의 유리웨이퍼에 Cr와 Au을 각각 5 nm와 100 nm 두께로 스퍼터한 후, 포토레지스트와 마스크를 사용한 패턴작업으로 제조하였다. 전극의 양편에는 접촉패드가 있어 전체회로와 연결을 위해 사용하였다.

실시예 1

분리멤브레인에는 anti-HRP 항체(1 uL, 농도 1 mg/mL, pH 7.0, PBS)를 분주 하여 신호밴드를 만들고 콘주게이트 패드에 양고추냉이 퍼옥시다제(HRP) 용액(1 uL, 농도 1 mg/ml, pH 7.0 PBS)을 분주한 후 건조하였다. 시료패드에 루미놀이 포함된 발광전개액(10 mg/mL, pH 9.0, 소듐 카보네이트)을 200 uL 가하여 반응을 개시하였다. 콘주게이트 패드의 HRP 용액이 발광전개액을 만나 발광반응을 시작하며 분리멤브레인을 따라 흡수패드로 이동하였다. 반응이 시작되고 1분이 지나면 분리멤브레인상의 HRP는 모두 흡수패드에 흡수되고 신호밴드에 결합된 HRP가 전개액의 루미놀과 반응을 지속하여 발광하는 신호밴드가 관찰되었다.

이와 같은 신호밴드의 발광은 CdS_x/CdSe_1-x(x = 0.8) 나노선을 사용한 나노선 광센서를 사용하여, 다음 도 4와 같이 정량적으로 관찰되었으며, 냉각기가 장착된 CCD 카메라를 장착한 발광측정 전용기기를 통해 동시에 관찰 가능하였다. 상기와 같은 결과는 화학발광을 이용한 신속진단키트가 나노선 광센서를 사용하여 측정이 가능하며 CCD 카메라를 사용한 기존기기를 사용하여 측정이 가능함을 확인할 수 있었다.

실시예 2

플렉시그라스 재질의 두께 1 mm과, 폭 3 mm의 플로우 채널 하단에 CdS_x/CdSe_1-x(x=0.2) 나노선과 저역필터(low pass filter)를 사용한 화학형광 측정용 나노선 광센서를 설치하고, 상단에 470 nm의 파장을 내는 발광다이오드(LED)를 광원으로 설치한 후, 다음 도 5에 나타낸 바와 같은 0 ∼ 1000 uM 농도로 플루오레 세인(Fluorescein)을 흘리면서 발생하는 화학형광을 측정하였다.

다음 도 5에 나타낸 바와 같이 플루오레세인(Fluorescein)의 농도에 따라 발생하는 화학형광의 정량적 측정이 가능함을 확인할 수 있었다.

실시예 3

임신진단용 호르몬인 hCG(NatuTec GmbH, Germany)의 항체(1 uL, 농도 1 mg/mL, pH 7.0, PBS)를 분리멤브레인에 분주하여 고정시킨 후, 양고추냉이 퍼옥시다제(HRP)가 화학연결된 폴리크로날 hCG 항체(Dianova GmbH, Germany)를 콘주게이트 패드에 분주(1 uL, 농도 1 mg/mL, pH 7.0, PBS)한 후 건조시켰다. 루미놀이 포함된 발광전개액과 의료진단시 검출한계치인 25 mIU 인근의 hCG 시료를 혼합하여 시료패드에 200 uL를 가하여 반응을 시작한 후, 제조예 2에서 제조된 광센서를 이용하여 화학발광량을 측정하였다.

상기 hCG가 함유된 양성시료의 경우 발생된 화학발광이 CdS_x/CdSe₁ _-x CdS_x/CdSe_1-x(x = 0.8) 나노선 광센서에 검출되었다. 이러한 실험 결과는 화학 발광 파장에 적합한 나노선으로 제조한 광센서가 임신진단용으로 응용 가능함을 확인할 수 있었다.

실시예 4

B형 간염 항원(Natutec GmbH, Germany)을 분리멤브레인에 분주(1 uL, 농도 1 mg/mL, pH 7.0, PBS)하여 고정하고, 플루오레세인(Fluorescein)이 결합된 폴리크로날 B형 간염 항체(Natutec GmbH)를 콘주게이트 패드에 분주(1 uL, 농도 1 mg/mL, pH 7.0, PBS)한 후 건조시켰다. B형 간염항원이 1 ng/mL의 농도로 함유된 시료를 소혈청(Sigma Chemical Co., USA)에 준비한 후, 200 uL의 시료를 샘플패드에 가하여 반응을 진행하였다. 플루오레세인의 여기 파장인 470 nm의 광을 발광다이오드(LED, Nichia Co., Japan)를 사용하여 조사하고 다음 도 3b에 보인 바와 같이, CdS_x/CdSe_1-x(x = 0.2) 나노선 광센서를 신속진단키트의 발광다이오드(LED) 반대면에 위치시켜 검사를 수행하였다.

상기 검사결과 1 ng/mL 이하의 농도의 B형 간염 항원에 대해서도 시료내 항원유무에 대한 정성검사가 가능함을 확인할 수 있었다.

실시예 5

암표지 물질인 CA 19-9(NatuTec GmbH, Germany)의 항체를 분리멤브레인에 분주(1 uL, 농도 1 mg/mL, pH 7.0, PBS)하여 고정시킨 후, HRP가 화학연결된 CA 125 항체(NatuTec GmbH, Germany)를 콘주게이트 패드에 분주(1 uL, 농도 1 mg/mL, pH 7.0, PBS)한 후 건조시켰다. 루미놀이 포함된 발광전개액과 시료를 혼합하여 시료패드에 200 uL를 가하여 반응을 시작한 후, 제조예 2에서 제조된 광센서를 이용하여 화학발광량을 측정하였다.

상기 암 표지물질인 CA 19-9가 함유된 양성시료의 경우 발생된 화학발광이 CdS_x/CdSe_1-x(x = 0.8) 나노선 광센서에 검출되었다. 이러한 결과는 화학 발광 파장에 적합한 나노선으로 제조한 광센서가 암표지물질의 검출에 응용 가능함을 확인할 수 있었다.

상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명은 특정의 혼합 고용체 나노선이 포함된 광센서를 적용한 신속진단키트를 사용하여, 상기 단결정인 혼합 고용체 나노선이 가진 물리적, 화학적 환경에 대한 반응 및 감지력이 우수성으로 센서로서의 기능이 탁월하고, 별도의 기기 및 광 차단 장치 없이 사용 가능하며, 소형화 및 생산원가가 저렴하여 경제성의 향상이 기대된다.

Claims

시료패드, 콘주게이트패드, 신호밴드와 확인밴드로 구성된 분리멤브레인 및 흡수패드로 이루어진 신속진단키트로 구성되어 있되,

상기 분리멤브레인에, CdS_x/CdSe_1-x(0 < x < 1)의 혼합 고용체 나노선이 결합된 광센서가 포함되어 이루어진 것임을 특징으로 하는 신속진단키트.
제 1 항에 있어서, 상기 광센서는 화학형광 및 화학발광에 감응하는 것을 특징으로 하는 신속진단키트.
제 2 항에 있어서, 상기 화학형광은 콘주게이트패드에 형광물질이 연결된 항원과 항체를 함유하는 것을 특징으로 하는 신속진단키트.
제 3 항에 있어서, 상기 형광물질은 플루오레세인(Fluorecein), 바이오디피-FL(Biodipy-FL), 알렉사 플루오르 그린(Alexa Fluor Green), R-피코에리트린(R-phycoerythrin), 피코에리트린-텍사스 레드(Phycoerythrin-Texas Red), 피코에리트 린-시아닌5(Phycoerythrin-cyanine5), 피코에리트린-시아닌7(Phycoerythrin-cyanine7), 페리디닌-클로로필 단백질(Peridinin-chlorophyll protein), 알로피코시아닌(Allophycocyanin) 및 알로피코시아닌-시아닌7(Allophycocyanin-cyanine7) 중에서 선택된 것임을 특징으로 하는 신속진단키트.
제 2 항에 있어서, 상기 화학발광은 콘주게이트패드에 발광효소가 연결된 항원과 항체를 함유하고, 시료에 발광기질을 함유하는 것을 특징으로 하는 신속진단키트.
제 5 항에 있어서, 상기 발광효소는 양고추냉이 퍼옥시다제(HRP), 알칼라인 포스파타아제(AP) 및 루시페라제(luciferase) 중에서 선택된 것임을 특징으로 하는 신속진단키트.
제 5 항에 있어서, 상기 발광기질은 아다만탄-디옥세탄(Adamantane-dioxetane), 아크리디늄(Acridinium) 유도체, 루미놀(Luminol) 유도체, 루시게닌(Lucigenin), 반딧불이 루시페린(Firefly luciferin), 포토프로테인(Photoprotein), 히드라지드(hydrazides) 및 쉬프(schiff)의 염기 화합물, 전기화 학적 발광기질 및 발광성 산소채널링 기질 중에서 선택된 것임을 특징으로 하는 신속진단키트.
제 1 항에 있어서, 상기 혼합 고용체 나노선은 레이저 반복주기 1 ∼ 10 Hz, 에너지 밀도 1 ∼ 5 J/㎠, 반응시간 500 ∼ 1000 ℃, 반응기내의 압력 1 ∼ 10 torr의 조건하에서 제조된 것임을 특징으로 하는 신속진단키트.
제 1 항에 있어서, 상기 광센서는 인터디지탈형 전극인 것임을 특징으로 하는 신속진단키트.
발광기질이 함유된 시료를 시료패드에 주입하는 단계;

상기 시료는 발광효소가 연결된 항체를 함유하는 콘주게이트패드로 이동하여, 항체와 시료내의 분석물질이 결합체를 이루는 단계; 및

상기 결합체가 분리멤브레인으로 이동하여 신호밴드에 결합체가 흡착되고 나머지 발광기질 결합항체는 분리멤브레인을 통과하여 흡수패드에 흡수되며,

상기 신호밴드의 결합체내의 분석물질과 흡수패드의 발광기질 결합항체가 발 광효소와 CdS_x/CdSe_1-x(0 < x < 1)의 혼합 고용체 나노선이 포함된 광센서에 의해 발광하는 단계

를 포함하여 이루어진 것을 특징으로 하는 화학발광에 의한 신속진단키트 사용방법.
시료를 시료패드에 주입하는 단계;

상기 시료는 형광물질이 연결된 항체를 함유하는 콘주게이트패드로 이동하여, 항체와 시료내의 분석물질이 결합체를 이루는 단계; 및

상기 결합체가 분리멤브레인으로 이동하여 신호밴드에 결합체가 흡착되고 나머지 형광물질 결합항체는 분리멤브레인을 통과하여 흡수패드에 흡수되며,

상기 신호밴드의 결합체내의 분석물질과 흡수패드의 형광물질 결합항체가 CdS_x/CdSe_1-x(0 < x < 1)의 혼합 고용체 나노선이 포함된 광센서에 의해 형광하는 단계

를 포함하여 이루어진 것임을 특징으로 하는 화학형광에 의한 신속진단키트 사용방법.