KR100678519B1 - 다슬기, 유황오리, 유근피, 송화가루, 산청목, 죽염,인진쑥, 도라지 및 흑두로 구성되는 복합제 추출물을포함하는 지방간 예방 및 치료를 위한 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 다슬기, 유황오리, 유근피, 송화가루, 산청목, 죽염, 인진쑥, 도라지 및 흑두로 구성되는 복합제 추출물을 유효성분으로 하는 지방간 예방 및 치료용 조성물을 제공하는 것이다. 보다 상세하게는 본 발명의 복합제 추출물은 혈중 포도당이나 인슐린 농도에는 아무런 영향을 미치지 않은 반면에, 간조직 내에서 지방 합성에 관여하는 물질인 SREBP-1, FAS, SCD-1 mRNA의 발현을 억제하며 혈중 ALT 농도를 감소시키는 효과를 나타내는 비알코올성 지방간 치료 및 예방용 약학조성물 및 비알코올성 지방간 개선 및 예방용 건강기능식품을 제공하는 것이다.

다슬기, SREBP-1, FAS, SCD-1, 지방간

Description

다슬기, 유황오리, 유근피, 송화가루, 산청목, 죽염, 인진쑥, 도라지 및 흑두로 구성되는 복합제 추출물을 포함하는 지방간 예방 및 치료를 위한 조성물{A composition comprising the extract of Semisulospira libertine, Sulfur Fed Duck, Ulmus devidiana, Pine Pollen Powder, Acer tegmentosum Maxim., Bamboo Salt, Artemisia capillaries, Platycodon Grandiflorum, Rhynchosiavolubilis for the prevention and treatment of fatty liver}

도 1은 간세포의 적출한 조직과 조직을 HE 염색한 지방세포를 그룹간 비교한 것이고,

도 2는 혈중 ALT 와AST의 농도를 그룹간 비교한 것이고,

도 3은 SREBP-1의 mRNA 발현을 그룹간 비교한 것이고,

도 4는 FAS mRNA 발현을 그룹간 비교한 것이고,

도 5는 SCD-1의 mRNA 발현을 그룹간 비교한 것이다.

대다수의 산업화된 국가에서 성인의 25% 가까이는 간 조직에 과도한 지방이 축적되어 있다(el-Hassen, A.Y., et al., Br. J. Radiol., 65, pp774, 1992; Bellentani, S., Tiribelli, C. et al., Hepatology, 20, pp1442, 1994). 이러한 지방간 (fatty liver)의 원인은 정확히 알려져 있지 않으나 종종 비만, 2형 당뇨병과 연관이 있다( Marchesini, G., Brizi, M., et al., Am. J. Med., 107, pp450, 1999). 지방간을 가진 환자에서 간 손상은 수년에 걸쳐 서서히 진행이 된다(Sheth, S.G., Gordon, F.D. et al., Ann. Intern. Med., 126, pp137, 1997). 따라서 지방간이 심각한 간 질환의 주요 위험 인자라는 사실이 최근 연구에 의해 밝혀지기 전에는 간 질환이 전반적인 비만-관련 유병율과 사망률의 주요 공헌자라는 사실이 사람들 사이에 충분히 인식되지 않았다. 지방간을 가진 사람들 중 적어도 20%는 간경화를 일으키며 간경화 환자의 50%는 진단 후 10년 이내에 간 질환으로 사망한다(Matteoni, C., Younossi, Z.M. et al., Gastroenterology, 116, pp1413, 1999). 현재까지 지방간 질환을 예방하거나 치료하는 약물은 없고, 단지 비만을 개선하기 위해 식이요법이나 운동요법 등에 초점이 맞추어져 있었다. 그러나 이러한 방법들이 지방간 질환을 개선시킨다는 근거가 없어 적절한 지방간 치료제의 개발이 필요한 실정이다.

SREBP-1 (sterol regulatory element-binding protein-1)은 지방의 항상성에 관여하는 지방산 합성효소 (fatty acid synthase; FAS)와 다른 많은 유전자들 (SCD-1, steroyl CoA desaturase; GPAT, glycerol 3-phosphate acyltransferase)의 전사를 활성화시킨다(Shimomura, I., Hammer, R.E. et al., Genes Dev., 12, pp3182, 1998). Ob/ob 마우스의 지방간 내에 SREBP-1 단백질과 FAS의 mRNA 농도가 증가되어 있다는 사실은(Lin, H.Z., Yang, S.Q. et al., Nature medicine, 6(8), pp998, 2000), 간 지방증 (hepatic steatosis)이 부분적으로 증가된 지방산 합성에 기인한다는 것을 시사한다.

본 발명의 다슬기, 유황오리, 유근피, 송화가루, 산청목, 죽염, 인진쑥, 도라지 및 흑두로 구성되는 복합제 추출물의 주성분인 다슬기 (Semisulospira libertine)는 동의보감 등 한방고전에 따르면 "갈증을 해소하고 간의 열과 염증을 다스리는 효능을 가고 있다" 고 알려져 있다. 또한 민속 의학자 인산 김일훈 선생은 다슬기에 들어있는 푸른 색소가 사람의 간 색소와 닮았기 때문에 간담계의 질환에 훌륭한 약이 된다고 하였다(김일훈, 신약본초 (전편), 도서출판 인산가, 서울, p78, 2002).

그러나 상기 언급한 문헌에는 다슬기의 간질환에 도움이 된다는 단순한 지식만 기재되어 있고, 어디에도 간 질환에 효능이 있다는 임상적 혹은 실험적 근거가 교시나 개시된 바가 없다.

또한, 다슬기, 유황오리, 유근피, 송화가루, 산청목, 죽염, 인진쑥, 도라지 및 흑두 등은 오랫동안 식용되거나 생약으로 사용되어 오던 약재로서 이로부터 추출된 본 발명의 추출물들 역시 독성 및 부작용 등의 문제가 없다.

따라서, 본 발명의 목적은 간조직 내에서 지방 합성에 관여하는 물질인 SREBP-1, FAS, SCD-1 mRNA의 발현을 억제효과를 나타내며, 혈중 ALT 농도를 감소시 키는 다슬기, 유황오리, 유근피, 송화가루, 산청목, 죽염, 인진쑥, 도라지 및 흑두로 구성되는 복합제 추출물을 유효성분으로 하는 지방간 예방 및 치료용 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 다슬기, 유황오리, 유근피, 송화가루, 산청목, 죽염, 인진쑥, 도라지 및 흑두로 구성되는 복합제 추출물, 바람직하게는 다슬기 20~1 : 유황오리 1~10 : 유근피 5~1 : 산청목 5~1: 송화가루 5~1: 죽염 5~1 : 인진쑥 5~1 : 도라지 5~1 : 흑두 2~1 배합중량비(w/w%)로 구성되는 복합제 추출물을 유효성분으로 함유하는 지방간 치료 및 예방용 약학조성물을 제공한다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 다슬기, 유황오리, 죽염, 인진쑥, 산청목, 유근피, 송화가루, 도라지 및 흑두로 구성되는 복합제 추출물, 바람직하게는 다슬기 20~1 : 유황오리 1~10 : 유근피 5~1 : 산청목 5~1: 송화가루 5~1: 죽염 3~1 : 인진쑥 3~1 : 도라지 3~1 : 흑두 2~1 배합중량비(w/w%)로 구성되는 복합제 추출물을 유효성분으로 함유하는 지방간 개선 및 예방용 건강기능식품을 제공한다.

상기 추출물은 물, 탄소수 1 내지 4의 저급알코올 또는 이들의 혼합용매로부터 선택된 용매에 가용한 추출물을 포함한다.

본 발명의 복합제 추출물을 제조하는 방법은 하기와 같다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명의 복합체추출물은, 다슬기를 깨끗이 세척한 후 중량(kg)의 약 1배 내지 10배, 바람직하게는 약 2배 내지 5배의 물, 탄소수 1 내지 4의 저급알코올 또는 이들의 혼합용매로부터 선택된 용매, 바람직하게는 물로 0 내지 200℃, 바람직하게는 50 내지 150℃ 추출온도에서 약 1시간 내지 60시간, 바람직하게는 24시간 내지 48시간 동안 냉침추출, 열수추출, 초음파 추출, 환류냉각 추출 등의 추출방법, 바람직하게는 열수추출법으로 수회 반복 추출한 후 여과하여 본 발명의 다슬기 추출물을 얻는 제 1단계;

유황오리는 내장과 털만을 제거한 후 세척하여 중량(kg)의 약 1배 내지 5배, 바람직하게는 약 1배 내지 3배의 물, 탄소수 1 내지 4의 저급알코올 또는 이들의 혼합용매로부터 선택된 용매, 바람직하게는 물로 0 내지 200℃, 바람직하게는 50 내지 150℃ 추출온도에서 약 1시간 내지 48시간, 바람직하게는 20시간 내지 30시간 동안 냉침추출, 열수추출, 초음파 추출, 환류냉각 추출 등의 추출방법, 바람직하게는 열수추출법으로 수회 반복 추출한 후 고형물이 남지 않도록 여과하여 유황오리 추출물을 얻는 제 2단계;

세척한 유근피 10~1: 산청목 10~1: 인진쑥 5~1의 중량배합비(w/w%), 바람직하게는 유근피 5~1: 산청목 5~1: 인진쑥 3~1의 중량배합비(w/w%)로 혼합하여 중량(kg)의 약 1배 내지 5배, 바람직하게는 약 1배 내지 3배의 물, 탄소수 1 내지 4의 저급알코올 또는 이들의 혼합용매로부터 선택된 용매, 바람직하게는 물로 0 내지 200℃, 바람직하게는 50 내지 150℃ 추출온도에서 약 1시간 내지 48시간, 바람직하 게는 20시간 내지 30시간 동안 냉침추출, 열수추출, 초음파 추출, 환류냉각 추출 등의 추출방법, 바람직하게는 열수추출법으로 수회 반복 추출한 후, 고형물이 남지 않도록 여과하여 추출물을 얻는 제 3단계;

상기 여과액을 한곳에 모은 후 다시 70 내지 150℃, 바람직하게는 75 내지 100℃의 온도를 유지하며 10 내지 60시간, 바람직하게는 40 내지 50시간 농축시키는 제 4단계;

상기 1단계에서 여과한 다슬기 고형분을 완전하게 건조하여 다슬기 20~1: 도라지 5~1: 흑두 2~1의 중량배합비(w/w%)로 혼합한 후, 완전 분쇄하여 분말로 만드는 제 5단계;

상기 5단계에서 제조한 분말을 상기 4단계의 농축액에 고루 혼합하고, 환으로 제형 한 후 50 내지 100℃, 바람직하게는 60 내지 80℃에서 건조시키는 제 6단계의 공정을 포함한다.

상기 방법으로 제조된 복합제 추출물은 식욕억제 호르몬인 렙틴(Campfield, L.A., Smith, F.J. et al., Horm. Metab. Res., 28, pp619, 1996)의 변이로 인해 고인슐린혈증, 비만, 인슐린저항성( Meglasson, M.D., Wilson, J.M. et al., J. Pharmacol. Exp. Ther. 266, pp1454, 1993; Uysal, K.T., Wiesbrock. S.M. et al., Nature, 389, pp610, 1997)과 지방간(Yang, S.Q., Lin, H.Z. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94, pp2557, 1997)특성을 가지고 있는 C57BL/6J ob/ob 마우스에서 간조직 내에서 지방 합성에 관여하는 물질인 SREBP-1, FAS, SCD-1 mRNA의 발현을 억제하며, 혈중 ALT 농도를 감소시키는 비알코올성 지방간 (non-alcoholic fatty liver disease; NAFLD) 개선 효과를 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

상기 본 발명의 다슬기, 유황오리, 유근피, 송화가루, 산청목, 죽염, 인진쑥, 도라지 및 흑두로 구성되는 복합제 추출물을 함유하는 지방간 치료용 약학조성물은 조성물 총 중량에 대하여 상기 추출물을 0.1 내지 50 % 중량백분율로 포함한다.

본 발명의 추출물을 포함하는 약학조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 추출물의 약학적 투여 형태는 이들의 약학적 허용가능한 염의 형태로도 사용될 수 있고, 또한 단독으로 또는 타 약학적 활성 화합물과 결합뿐만 아니라 적당한 집합으로 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 추출물을 포함하는 약학조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 추출물을 포함하는 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정 제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트 (Calcium carbonate), 수크로스 (Sucrose) 또는 락토오스 (Lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜 (Propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔 (Witepsol), 마크로골, 트윈 (Tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 추출물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나, 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 추출물은 1일 0.0001 내지 100 mg/kg으로, 바람직하게는 0.001 내지 100 mg/kg으로 투여하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 추출물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또 는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내 (Intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.

또한, 본 발명은 SREBP-1, FAS, SCD-1 mRNA의 발현억제 및 혈중 ALT 농도감소 효과를 갖는 다슬기, 유황오리, 유근피, 송화가루, 산청목, 죽염, 인진쑥, 도라지 및 흑두로 구성되는 복합제 추출물을 유효성분으로 함유하는 지방간 개선 및 예방을 위한 건강기능식품을 제공한다.

본원에서 정의되는 "건강기능식품"은 건강기능식품에 관한 법률 제6727호에 따른 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 제조 및 가공한 식품을 의미하며, "기능성"이라 함은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건 용도에 유용한 효과를 얻을 목적으로 섭취하는 것을 의미한다.

본 발명의 지방간 개선 및 예방을 위한 건강기능식품은, 조성물 총 중량에 대하여 상기 추출물을 0.01 내지 95 %, 바람직하게는 1 내지 80 % 중량백분율로 포함한다.

또한, 지방간 개선 및 예방을 위한 목적으로 정제, 캅셀, 분말, 과립, 액상, 환 등의 형태인 건강기능식품으로 제조 및 가공이 가능하다.

예를 들어, 상기 정제 형태의 건강기능식품은 그대로 또는 부형제, 결합제, 붕해제 또는 다른 첨가제를 넣어 고르게 섞은 것을 적당한 방법으로 과립상으로 한 다음 활택제 등을 넣어 압축성형하여 조제하거나 정제 형태의 건강기능식품을 그대로 또는 부형제, 결합제, 붕해제 또는 다른 적당한 첨가제를 넣어 고르게 섞은 것 을 직접 압축성형하여 만들거나 또는 미리 만든 과립에 건강기능식품을 그대로 혹은 적당한 첨가제를 넣어 고르게 섞은 다음 압축성형하여 조제하거나 건강기능식품에 부형제, 결합제 또는 다른 적당한 첨가제를 넣어 고르게 섞은 분말을 용매로 습윤시키고, 습윤된 분말을 저압으로 틀에 넣어서 성형한 후, 적당한 방법으로 건조하여 조제한다. 또한, 상기 정제 형태의 건강기능식품에 필요에 따라 교미제 등을 넣을 수 있으며, 적당한 제피제로 제피 가능하다.

상기 캅셀 형태의 건강기능식품 중 경질캅셀제는 보통 캅셀에 건강기능식품 또는 건강기능식품에 적당한 부형제 등을 고르게 섞은 것 또는 적당한 방법으로 입상으로 한 것 또는 입상으로 한 것에 적당한 제피제로 제피한 것을 그대로 또는 가볍게 성형하여 충전하여 조제하며, 연질캅셀제는 보통 캅셀에 건강기능식품 또는 건강기능식품에 적당한 부형제 등을 넣은 것을 젤라틴 등 적당한 캅셀기제에 글리세린 또는 소르비톨 등을 넣어 소성을 높인 캅셀기제로 피포하여 일정한 형상으로 성형하여 조제하며, 필요에 따라 상기 캅셀기제에 착색료 보존료 등을 첨가할 수 있다.

환형태의 건강기능식품은 보통 건강기능식품에 부형제, 결합제, 붕해제 등을 고르게 섞은 다음 적당한 방법으로 구상으로 성형하여 조제하며, 필요에 따라 백당이나 다른 적당한 제피제로 제피를, 또는 전분, 탈크 또는 적당한 물질로 환의를 입힐 수도 있다.

과립형태의 건강기능식품은 보통 건강기능식품을 그대로 또는 건강기능식품에 부형제, 결합제, 붕해제 등을 넣어 고르게 섞은 다음 적당한 방법으로 입상으로 만들고 될 수 있는 대로 입자를 고르게 한 것이며, 필요에 따라 착향료, 교미제 등을 넣을 수 있다. 과립형태의 건강기능식품은 12호 (1680 μm), 14호 (1410 μm) 및 45호 (350 μm) 체를 써서 다음 입도시험을 할 때에 12호체를 전량 통과하고 14호체에 남는 것은 전체량의 5.0 %이하이고 또 45호체를 통과하는 것은 전체량의 15.0 %이하이어야 한다.

본원 발명의 상기 부형제, 결합제, 붕해제, 활택제, 교미제, 착향료 등에 대한 용어 정의는 당업계에 공지된 문헌에 기재된 것으로 그 기능 등이 동일 내지 유사한 것들을 포함한다 (대한약전 해설편, 문성사, 한국약학대학협의회, 제 5 개정판, p33-48, 1989 ).

이하, 본 발명을 하기 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 실험예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 복합제 추출물의 제조

1-1. 시료의 준비

살아있는 다슬기 15kg, 1년 이상 유황을 먹여 사육한 유황오리 1마리, 유근피(느릎나무뿌리껍질) 2kg, 9번 구워 정제한 자색소금(죽염) 1kg, 산청목 2kg, 송화가루 2kg, 인진쑥 1kg, 도라지(길경) 1kg, 흑두 0.6kg을 준비한다.

1-2. 농축액의 제조

다슬기를 깨끗이 세척한 후 정제수를 세배 분량을 넣어 36시간 다리고, 유황오리는 내장과 털만을 제거한 후 세척하여 정제수 두배 분량으로 24시간 다림하여 고형물이 남지 않도록 여과한다. 유근피 2kg, 인진쑥 1kg, 산청목 2kg을 함께 세척하여 정제수 2배 분량을 넣어 36시간 다림하여 여과하고, 상기 여과액을 한곳에 모은 후 다시 75~90℃의 온도를 유지하며 48시간 농축시킨다.

1-3. 분말의 제조

실시예 1-2에서 여과된 다슬기의 4.5kg을 골라내어 완전하게 건조시킨다. 건조시킨 다슬기와 도라지, 흑두를 완전 분쇄하여 분말로 만들었다.

1-4. 비탐-에스의 제조

실시예 1-3에서 제조한 분말을 실시예 1-2의 농축 고형물에 고루 혼합하고, 환으로 제형 한 후 73℃에서 열풍 건조한다. 환제를 증류수에 녹인 후 교반기로 균질화시켜 본 발명의 시료(이하 비탐-에스; BS라 명명함)로 사용하였다.

참고예 1. 실험동물 준비

본 연구에서 사용된 마우스는 ㈜오리엔트로부터 20-25g 정도의 6주령 C57BL/6J ob/ob 마우스를 구입하여 사용하였다. 마우스는 plastic rat cage에 보관하여 동물실에서 23± 2℃, 상대습도 50±10%, light/dark cycle (12/12hr)의 조건하에서 사육하였으며, 물 및 사료는 자유로이 섭취할 수 있도록 하였다. 실험동물은 실험시작 전 일주일 동안 동물실 환경에 적응시킨 후 사용하였다. 마우스는 8 마리씩 4군으로 다음과 같이 구분하였다. 대조군은 증류수를 투여하였으며(Con) 시 료 투여군은 비탐-에스를 250 ㎎/㎏ (BS250) 과 500 ㎎/㎏ (BS500) 농도로 그리고 양성 대조약물로 메트포르민300 ㎎/㎏ (MT300) 용량을 8주 동안 경구로 투여하였다.

참고예 2. 데이터 분석 및 통계 처리

모든 실험 결과는 평균 ± SE로 나타내었다. Ob/ob 대조군과 비교하여 통계적 유의성을 스튜던트 t-test로 처리하였으며 p<0.05 이하인 경우 유의적인 차이가 있다고 판정하였다.

실험예 1. 체중변화 및 식이효율 측정

비탐-에스의 지방간 개선 효과를 실험하기 위해 실험군간 체중 증가, 식이 섭취 및 식이효율을 비교하였다. 실험전 체중은 동물실 환경에 적응시키기 위해 일주일간 사육한 후, 투여하기 직전에 재고, 실험후 처음 체중을 재고 정확히 8주후 같은 시간에 재었다. 식이효율은 하기의 수학식을 이용하여 계산하였다. 각 생쥐가 8주 동안 증가한 체중을 8주간 먹은 식이량으로 나눈 값이다.

식이효율 = [체중증가량 (g/ 8주)] / [식이섭취량 (g/ 8주)]

실험결과, 하기 표 1에서 보이는 바와 같이, 8주 동안 체중증가량 은 대조군이 9.37±2.16g 증가한 반면, 비탐-에스 투여군은 250, 500 mg/kg 용량에서 5.89 ±2.79g, 6.01±1.65g 증가하여 대조군과 비교시 37%, 36% 체중 증가량을 억제하는 활성을 나타내었다. 양성 대조 약물인 메트포르민 투여군에서는 같은 기간 동안 체중이 6.56±1.23g 증가하여 대조군에 비해 30% 체중증가량을 억제하였다. 또한 그룹간 8주 동안의 식이 섭취량에 따른 체중 증가율을 비교해 본 결과 비탐-에스 250, 500 mg/kg 투여군 및 메트포르민 투여군들은 대조군에 비해 식이효율이 각각 25%, 23%, 17% 감소하는 활성을 나타내었다. 대조군에 비해 식이효율이 감소하였다는 것은 8주간 섭취한 총 식이량에 비해 체중증가 폭이 작음을 의미한다. BS250 투여군의 식이효율이 대조군에 비해 25% 감소하여 가장 큰 활성을 나타내어 지방간 개선 및 치료용 약학조성물로 유용하게 사용할 수 있음을 확인하였다.

BS 및 메트포르민 투여군의 체중증가량 및 식이섭취량, 식이효율

실험군	체중 (g)		체중증가량 (g)	식이섭취량 (g/8주/마우스)	식이효율 (x 10-3)
	실험전	실험후
대조군	47.05±2.44	57.37±3.05	9.37±2.16	244.16±2.81	38.38
BS250	46.49±3.39	52.39±3.43*	5.89±2.79*	204.99±3.34*	28.73
BS500	46.92±3.04	52.93±2.89	6.01±1.65**	204.93±2.86*	29.33
MT300	46.87±2.20	53.11±3.23	6.56±1.23*	205.38±2.21**	31.94
각각은 평균 ± SD (n=8)로 나타냄. *P < 0.05, **P <0.01 vs. Con.

실험예 2. 간, 부고환의 무게 및 조직학적 관찰

2-1. 간과 부고환의 무게변화 측정

실험 8주후, 무게변화를 측정한 에테르로 마취시킨 C57BL/6J ob/ob 마우스에서 적출한 간과 부고환 (epididymal fat pad)의 그룹간 무게를 비교하여 하기 표 2에 나타내었다. BS250, BS500, MT300 투여군은 대조군과 비교 시 각각 24%, 20%, 20% 간의 무게가 감소한 것으로 나타났으나 통계적으로 유의한 차이를 보이지는 않았다. 체중 대비 간 무게에서도 세 그룹에서 대조군에 비해 감소한 경향은 보이고 있으나 유의한 차이는 발견되지 않았다. 한편 부고환의 경우는 BS250 투여군에서 대조군과 비교시 19%의 유의한 감소를 나타내었다.

실험군	간의 무게 (g)	간무게(g)/체중(g)	부고환의 무게(g)
대조군	3.29±1.36	5.18±0.45	2.69±0.40
BS250	2.50±0.28	5.05±0.56	2.17±0.20*
BS500	2.63±0.33	5.07±0.57	2.60±0.75
MT300	2.64±0.39	5.07±0.54	2.52±0.32
수치는 평균 ± SD (n=8)로 나타냄 *P < 0.05 vs. Con.

2-2. 간과 부고환의 조직 관찰

C57BL/6J ob/ob 마우스로부터 적출한 조직을 10% 중성 완화 포르말린(neutral buffered formalin) 을 사용하여 고정하였다. 이후 탈수 및 포매 과정을 거쳐 파라핀 블록을 제작하고 두께 5 ㎛의 관상 절편을 제작한 후 자일렌(xylene)으로 파라핀을 제거시키고, 100%, 95%, 90%, 80%, 70% 알코올로 친수화시켰다. 염색방법으로는 헤마톡실린-에오신 (Hematoxylin-Eosin) 염색으로 탈수 과정을 거쳐 캐나다 발삼(Canada balsam)으로 봉합하고 광학현미경 (BX-50, Olympus, Japan)으로 관찰하였다.

그룹간 부고환의 지방세포의 크기를 비교해 본 결과 대조군의 면적은 4,186±221.4mm²인 반면 비탐-에스 250 mg/kg 투여군의 경우는 3,427±118.0 mm²으로 대조군에 비해 18% 지방세포의 크기가 감소하는 유의한 차이를 나타내었다. 또한, 간세포의 적출한 조직과 조직을 HE 염색한 것을 그룹간 비교하여 도 1에 나타내었다. 비탐-에스 투여군은 대조군에 비해 조직이 작아짐을 볼 수 있었고, 간세포 내 지방구 (lipid droplet)들의 숫자가 현저하게 줄어듦을 관찰할 수 있었다. 이 결과로부터 비탐-에스의 비알코올성 지방간 개선 활성을 확인할 수 있었다

실험예 3. 혈장내 혈당 및 인슐린 농도 분석

혈액 지표 분석을 위한 혈액 채취는 4시간 절식 후 실시하였다. 안와 정맥을 통해 얻어진 전혈을 5,000 rpm에서 5분간 원심분리 한 후, 혈장을 채취하여 사용하였다. 혈중 포도당 농도는 글루코스 옥시다제 측정법 (Trinder method)를 사용하여 측정하였으며 (Chomczynski, P. and Sacchi, N., Anal. Biochem., 162, pp156, 1987), 흡광도 측정은 UV Spectrophotometer(U-3210; HITACHI, Japan)를 사용하였다. 혈중 인슐린 농도는 마우스 인슐린 ELISA 키트 (Shibayagi, Japan)를 구입하여 ELISA 리더 (Labsystems; Finland)로 측정하였다.

8주 동안 그룹간 혈당 및 인슐린저항성 지수를 하기 표 3에 나타내었다. 8주째 공복 시 혈당을 비교해 보면 ob/ob 대조군은 7.23±0.76 mM (130.1 mg/dl)인 반면 비탐-에스 투여군은 250, 500 mg/kg 용량에서 각각 6.81±0.39 (122.6 mg/dl), 6.62±0.56 (119.2 mg/dl)을 나타내어 메트포르민 투여군과 함께 대조군에 비해 유의한 혈당강하 활성을 나타내지는 못하였다. 한편 혈액 중 인슐린 농도를 비교해 보면 각 그룹은 대조군과 비교 시 88%, 116%, 51%의 인슐린 농도를 나타내어 비탐-에스 투여군은 혈중 인슐린 농도에 큰 영향을 나타내지 못한 반면 메트포르민은 인슐린 농도를 49% 낮추어주는 활성을 보여주었다. 매튜스 등이 개발한 혈중 포도당과 인슐린 농도를 이용한 인슐린저항성 지수 계산법(Matthews, D.R., Hosker, J.P. et al., Diabetologia, 28, pp412, 1985)을 사용하여 그룹간 인슐린저항성 지수를 그룹간 비교해 본 결과 비탐-에스는 대조군과 비교시 유의한 차이를 나타내지 못한 반면 메트포르민의 경우는 인슐린저항성을 51% 감소시키는 탁월한 활성을 나타내었다. 본 실험 결과 비탐-에스는 ob/ob 마우스에서 혈당이나 인슐린 농도에는 별 영향을 나타내지 않음을 알 수 있었다.

실험군	혈당(mM)	인슐린(μU/㎖)	HOMA-IR
대조군	7.23±0.76	72.05±13.19	22.41±3.71
BS250	6.81±0.39*	63.28±11.77	19.14±3.44
BS500	6.62±0.56*	83.34±14.18	24.36±4.18
MT300	6.57±0.84	37.03±12.42*	10.54±3.33*
*각각 평균± SE로 나타냄(n=8) *혈장의 혈당과 인슐린 분석은 4시간 금식한 쥐의 혈액에서 얻었다. *인슐린 저항성 지표(HOMA-IR)는 아래 공식으로 계산한다. *인슐린저항성 = glucose (mM) x insulin (μU/㎖)/22.5.

실험예 4. 간 기능관련 효소 농도 측정

혈액 중 간 기능의 지표가 되는 효소 농도를 측정하기 위하여 안와 정맥을 통하여 얻어진 전혈을 5,000rpm에서 5분간 원심분리한 후 혈장을 사용하였다. 알라닌 아미노트랜스퍼라제(Alanine aminotransferase; ALT)와 아스파르테이트 아미노트랜스퍼라제(Aspartate aminotransferase; AST)는 아산제약에서 시판되는 키트를 사용하여 측정하였다.

ALT, AST의 농도를 그룹간 비교해 본 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이 ALT의 경우 대조군에 비해 BS250, BS500, MT300 군의 ALT 농도는 각각 73%, 93%, 68%를 나타내었으며, 반면 AST의 농도는 대조군에 비해 각각 105%, 110%, 74% 효소 농도를 나타내었다. 메트포르민은 두 효소 농도를 모두 감소시켜 지방간 개선에 탁월한 약효가 있음을 확인할 수 있었고 비탐-에스 투여군의 경우는 AST에는 큰 영향이 없는 반면 ALT 농도에는 유의한 감소를 나타내었다. ALT는 주로 간세포 속에 있으므로 간세포가 파괴될 경우만 수치가 올라가지만 AST는 심장과 근육세포 속에도 있으므로 간 손상 외에 심장질환이나 근육질환인 경우에도 증가할 수 있다(Lin, H.Z., Yang, S.Q. et al., Nature medicine, 6(8), pp998, 2000). 따라서 AST보다는 ALT가 간질환 진단에 더 정확하고 유용하므로 비탐-에스 투여군에서 ALT 농도가 유의적으로 줄어든 것은 비탐-에스의 지방간 개선을 의미한다고 볼 수 있다.

실험예 5. 지방합성 관련 유전자들의 발현

5-1. RNA 분리 및 RT-PCR

간 조직 내 SREBP-1과 이와 관련된 유전자들인 FAS, SCD-1의 mRNA 발현을 그룹간 비교하기 위해 간세포로부터 RNA를 분리하였다. 간으로부터 총 RNA는 구아니딘 티오시안산염-물 포화된 페놀/클로로포름(guanidine thiocyanate-water saturated phenol/chloroform)과 산성의 아세트산 나트륨을 이용하여 분리하였다( Chomczynski, P. and Sacchi, N., Anal. Biochem., 162, pp156, 1987). 총 RNA 양은 UV 분광광도계를 사용하여 260 nm 과 280 nm에서 흡광도로 측정하였다. 1 ㎍의 총 RNA를 몰로니 뮤라인 루케미아 바이러스 전사효소(Moloney murine leukemia virus transcriptase) 와 올리고 dT(15) (Promega, USA)를 이용하여 cDNA로 역전사하였다. 각 효소의 프라이머는 하기 표 4 및 서열목록 1 내지 8에 나타내었다.

SREBP-1	sense primer	5'-GCGCTACCGGTCTTCTATCA-3',
	anti-sense	5'-TGCTGCCAAAAGACAAGGG-3'
FAS	sense primer	5'-GATCCTGGAACGAGAACAC-3'
	anti-sense	5'-AGACTGTGGAACACGGTGGT-3'
SCD-1	sense primer	5'-CGAGGGTTGGTTGTTGATCTGT-3'
	anti-sense	5'-ATAGCACTGTTGGCCCTGGA-3'
GAPDH	sense primer	5'-CAACTTTGGCATTGTGGAAGG-3',
	anti-sense	5'-ATGGAAATTGTGAGGGAGATGC-3'

PCR 버퍼 조건은 20 mM Tris-HCl (pH 8.4), 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl₂, 0.5 mM dNTP, 2.5 units Taq DNA 폴리머라제 (TaKaRa, medicals, Japan), 0.05 ㎍cDNA, 0.5 μM 프라이머를 혼합하였다. PCR 조건은 94 ℃에서 변성, 57 ℃ 에서 결합, 72 ℃에서 신장하였으며, PCR 생성물은 1% 아가로스 겔을 이용하여 전기영동하였다. 밀도는 GS-700 이미징 밀도계(image densitometer) 이용하여 측정하여 비교하여 하기의 도 3 내지 도 5에 나타내었다.

도 3은 SREBP-1의 mRNA 발현을 그룹간 비교한 것으로 대조군과 비교 시 BS250, BS500, MT300 투여군은 각각 61%, 46%, 106%의 발현을 나타내어 비탐-에스 투여군의 경우 용량의존적으로 39%, 54%의 발현 억제 활성을 나타내었다. 도 4는 FAS mRNA 발현을 비교한 그림으로 대조군과 비교 시 BS250, BS500, MT300 군은 각각 49%, 40%, 70%의 발현을 나타내어 비탐-에스 투여군의 경우 용량의존적으로 51%, 60%의 발현 억제 활성을 나타내었다. 메트포르민 투여군의 경우도 대조군에 비해 30% FAS mRNA 발현을 억제하여 Lin 등이 ob/ob 마우스에서 메트포르민 투여에 의한 FAS 단백질 발현을 면역화학법으로 확인한 결과와 일치한다(Matthews, D.R., Hosker, J.P. et al., Diabetologia, 28, pp412, 1985). 도 5는 SCD-1의 mRNA 발현을 그룹간 비교한 그림으로 대조군에 비해 각각 84%, 50%, 90% 발현을 나타내어 16%, 50%, 10%의 발현 억제 양상을 나타내었다. 비탐-에스 투여군은 역시 용량의존적으로 SCD-1 mRNA 발현을 억제효과를 나타냄으로써, 본 발명의 다슬기, 유황오리, 유근피, 송화가루, 산청목, 죽염, 인진쑥, 도라지 및 흑두로 구성되는 복합제 추출물을 지방간 치료 및 예방용조성물로 유용하게 사용할 수 있음을 확인하였다.

본 발명의 복합제 추출물은 아래와 같은 제형으로 투여할 수 있으며, 아래의 제제예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 이에 의해 본 발명의 내용이 제한되는 것은 아니다.

제제예 1. 산제의 제조

복합제 추출물 300 mg

유당 100 mg

탈크 10 mg

상기의 성분들을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조한다.

제제예 2. 정제의 제조

복합제 추출물 300 mg

옥수수전분 100 mg

유당 100 mg

스테아린산 마그네슘 2 mg

상기의 성분들을 혼합한 후 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조한다.

제제예 3. 캅셀제의 제조

복합제 추출물 300 mg

결정성 셀룰로오스 3 mg

락토오스 14.8 mg

마그네슘 스테아레이트 0.2 mg

통상의 캡슐제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조한다.

제제예 4. 주사제의 제조

복합제 추출물 300 mg

만니톨 180 mg

주사용 멸균 증류수 2974 mg

Na₂HPO_4·12H₂O 26 mg

통상의 주사제의 제조방법에 따라 1 앰플당(2㎖) 상기의 성분 함량으로 제조한다.

제제예 5. 액제의 제조

복합제 추출물 300 mg

이성화당 10 g

만니톨 5 g

정제수 적량

통상의 액제의 제조방법에 따라 정제수에 각각의 성분을 가하여 용해시키고 레몬향을 적량 가한 다음 상기의 성분을 혼합한 다음 정제수를 가하여 전체를 정제수를 가하여 전체 100 ㎖로 조절한 후 갈색 병에 충진하여 멸균시켜 액제를 제조한다.

제제예 6. 건강 식품의 제조

복합제 추출물의 환제 1000 ㎎

비타민 혼합물 적량

비타민 A 아세테이트 70 ㎍

비타민 E 1.0 ㎎

비타민 B₁ 0.13 ㎎

비타민 B₂ 0.15 ㎎

비타민 B₆ 0.5 ㎎

비타민 B₁₂ 0.2 ㎍

비타민 C 10 ㎎

비오틴 10 ㎍

니코틴산아미드 1.7 ㎎

엽산 50 ㎍

판토텐산 칼슘 0.5 ㎎

무기질 혼합물 적량

황산제1철 1.75 ㎎

산화아연 0.82 ㎎

탄산마그네슘 25.3 ㎎

제1인산칼륨 15 ㎎

제2인산칼슘 55 ㎎

구연산칼륨 90 ㎎

탄산칼슘 100 ㎎

염화마그네슘 24.8 ㎎

상기의 비타민 및 미네랄 혼합물의 조성비는 비교적 건강식품에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하며, 통상의 건강식품 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 과립을 제조하고, 통상의 방법에 따라 건강식품 조성물 제조에 사용할 수 있다.

제제예 7. 건강 음료의 제조

복합제 추출물 1000 ㎎

구연산 1000 ㎎

올리고당 100 g

매실농축액 2 g

타우린 1 g

정제수를 가하여 전체 900 ㎖

통상의 건강음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 약 1시간동안 85 ℃에서 교반 가열한 후, 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 2 L 용기에 취득하여 밀봉, 멸균한 뒤 냉장 보관한 다음 본 발명의 건강음료 조성물 제조에 사용한다.

상기 조성비는 비교적 기호음료에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만 수요계층이나, 수요국가, 사용용도 등 지역적, 민족적 기호도에 따라서 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다.

본 발명의 다슬기, 유황오리, 유근피, 송화가루, 산청목, 죽염, 인진쑥, 도라지 및 흑두로 구성되는 복합제 추출물을 함유하는 지방간 치료용 약학조성물은 간조직 내에서 지방 합성에 관여하는 물질인 SREBP-1, FAS, SCD-1 mRNA의 발현억제 및 혈중 ALT 농도감소효과를 확인함으로써 지방간 치료 및 예방용 약학조성물 및 지방간 개선 및 예방용 건강기능식품으로 유용하게 사용할 수 있다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims (4)

1. 다슬기, 유황오리, 유근피, 송화가루, 산청목, 죽염, 인진쑥, 도라지 및 흑두로 구성되는 복합제 추출물을 유효성분으로 함유하는 지방간 치료 및 예방용 약학조성물.
2. 제 1항에 있어서, 다슬기 20~1 : 유황오리 1~10 : 유근피 5~1 : 산청목 5~1: 송화가루 5~1: 죽염 5~1 : 인진쑥 5~1 : 도라지 5~1 : 흑두 2~1 배합중량비(w/w%)로 구성되는 복합제 추출물을 유효성분으로 함유하는 지방간 치료 및 예방용 약학조성물.
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4. 삭제

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