본 발명을 대두를 바실러스 속 씨케이 11-4 [Bacillus sp. CK 11-4 (KCCM 10042)] 균주로 발효시켜 얻은 고지혈증 및 혈소판 응집에 대해 억제작용을 갖는 대두발효 추출물을 특징으로 한다.
또한 본 발명은 상기 대두발효 추출물의 분말 8.0 ∼ 80.0 중량%, 카카오 추출물의 분말 7.0 ∼ 35.0 중량%, 산사자 추출물의 분말 5.0 ∼ 22.0 중량%, 멜리사엽 추출물의 분말 0.7 ∼ 5.0 중량%, 옥타코사놀 0.4 ∼ 3.0 중량% 및 은행잎 추출물의 분말 0.4 ∼ 3.0 중량%가 유효성분으로 포함되어 있고, 전체 조성물의 합량이 100 중량%가 되도록 하는 양의 첨가제를 포함하여 이루어지는 고지혈증 및 혈소판 응집에 대해 억제작용을 갖는 조성물을 또 다른 특징으로 한다.
상기 조성물을 식품에 첨가하거나, 건강기능성 식품으로 제조시, 부형제로는 연질 갑셀의 경우 감마리놀렌산, 야자경화유, 밀납, 레시틴, 정제어유 등을 사용하며, 경질 캅셀의 경우 락토스 분말, 옥수수전분, 스테아린산 Mg, 결정셀롤로오스 등을 사용하며, 정제의 경우는 락토스 분말, 결정셀룰로오스, 마그네슘 스테아레이트 등을 사용한다. 발효유의 경우 감미료로 DHA, EPA, 정제어유 등을 사용하며, 음료에는 젖산철 및 각 종 비타민 및 향료 등을 사용한다.
또한 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 식품 및 건강식품을 또 다른 특징으로 한다.
이와 같은 본 발명을 상세하게 설명하면 다음과 같다.
본 발명은 혈전용해능이 우수한 효소를 생산하는 것으로 알려진 균주인 바실러스 속 씨케이 11-4 [Bacillus sp. CK 11-4 (KCCM 10042)]를 대두에 접종하여 일전시간 발효시킨 다음 상기 발효균을 제거하고 얻어진 대두발효 추출물을 건조 및 분쇄하여 제조한 대두발효 추출물을 주요 성분으로 하고, 여기에 카카오 추출물, 산사자 추출물, 멜리사엽 추출물, 옥타코사놀 및 은행잎 추출물을 특이성 있는 함량비로 함유하는 조성물을 제조함으로써, 각 성분 자체의 혈전용해능 보다 강한 혈전용해능을 나타내어 탁월한 콜레스테롤 저하, 항동맥경화 및 혈소판 응고 억제 효능을 나타내는 대두발효 추출물 및 이를 함유하는 조성물 및 식품에 관한 것이다.
본 발명의 조성물을 구성하는 각 성분을 개별적으로 자세하게 살펴보면 다음과 같다.
먼저, 바실러스 속 씨케이 11-4 [Bacillus sp. CK 11-4 (KCCM 10042)]는 우리나라의 전통 발효식품인 청국장으로부터 분리된 균주로서, 혈전용해능이 우수한 효소를 생성해내는 균주이다. 본 발명에서는 상기 균주를 대두에 접종한 다음 일정기간동안 배양시키며 혈전용해능이 우수한 효소가 생성되도록 하고, 충분한 발효가 일어난 후 막여과에 의하여 상기 발효 균주를 제거하여 대두발효 추출물을 얻을 수 있었다. 상기 대두발효 추출물을 농축한 다음 동결건조한 후 마쇄한 분말은 상기 균주가 생성한 혈전용해능이 우수한 효소를 포함하고 있으므로, 대두발효 추출물의 분말은 그 자체로서도 우수한 혈전용해능을 가지게 된다. 이러한 대두발효 추출물의 분말을 본 발명의 조성물에서는 8.0 ∼ 80.0 중량% 사용하는데, 이때 사용량이 8.0 중량% 미만이면 혈전용해능이 충분히 발현되지 않고, 80.0 중량% 를 초과하더라도 혈전용해능의 차이를 보이지 않는다.
다음으로 본 발명의 조성물에는 카카오 추출물의 분말을 사용한다. 카카오의 종자에는 알칼로이드로서 테오브로민(theobromin)을 포함하고 있으며, 이는 중추신경 흥분작용, 골격근 및 심근의 흥분작용, 평활근 및 관상동맥의 이완효과, 위산분비 항진 및 이뇨효과 등의 약리작용을 나타내는 것으로 알려진 물질이다. 본 발명에서는 카카오 추출물은 '항산화 활성을 갖는 카카오 콩껍질의 발효물의 제조방법[대한민국등록특허 제0353886호]'에 따라 제조하여 분말화하여 사용하는데, 이는 상기 대두발효 추출물의 분말과 함께 본 발명의 혈전용해능이 우수한 조성물의 주요한 구성성분이다. 이와 같은 카카오 추출물의 분말은 본 발명의 혈전용해능이 우수한 조성물에 7.0 ∼ 35.0 중량% 사용하며, 이때 사용량이 7.0 중량% 미만이면 조성물에 대한 시너지 효과가 나타나지 않았으며, 35.0 중량% 를 초과면 추가적인 시너지 효과를 보이지 않았다.
산사자는 장미과 식물인 산사(Crataegus pinnatifida Bge.)의 과실로서, 위(胃)의 소화액 분비를 촉진시켜서 지방 함량이 높은 음식이 소화를 돕는 건위작용이 있으며, 심근의 수축력과 수출량을 증가시키고, 심장 박동수를 완만하게 낮추며, 관상혈관을 확장시키며, 간맥류량을 증가시키고, 혈압을 낮출 수 있을 뿐만 아니라 혈중 지질의 함량을 저하시키는 효능이 있는 것으로 알려져 있다. 본 발명에서는 이와 같은 산사자를 잘게 분쇄한 후, 물(H2O), 에탄올(EtOH) 등의 수용액에 넣고 30 ∼ 70 ℃에서 2 ∼ 3회 용매추출한다. 이때 수용액의 사용량은 산사자 부피의 3 ∼ 5배 정도가 적당하다. 상기에서 분리된 추출액을 30 ∼ 70 ℃의 조건하에서 증발농축한 후, 가열 또는 동결건조하여 추출액을 분말화 한 다음 조성물에 첨가하는데, 사용량은 5.0 ∼ 22.0 중량%이다. 이때 산사자 추출물 분말의 사용량이 5.0 중량% 미만이면 조성물에 대한 시너지 효과가 나타나지 않았으며, 22.0 중량% 를 초과하면 추가적인 시너지 효과를 보이지 않았다.
멜리사(Melissa officinalis)는 꿀풀과(Labiatae)에 속하는 다년생초본(多年生草本)으로, 비혈초 또는 레몬밤(Lemon Balm)이라는 별칭을 갖는다. 멜리사엽을 분쇄한 후, 물(H2O), 에탄올(EtOH) 등의 수용액에 넣고 30 ∼ 70 ℃에서 2 ∼ 3회 용매추출한다. 이때 수용액의 사용량은 멜리사엽 부피의 3 ∼ 5배 정도가 적당하다. 상기에서 분리된 추출액을 30 ∼ 70 ℃의 조건하에서 증발농축한 후, 가열 또는 동결건조하여 추출액을 분말화 한 다음 조성물에 첨가하는데, 이 추출물은 플라보노이드(flavonoid)와 테르펜산(terpene acid), 휘발성 오일(volatile oil), 알코올 및 페놀 화합물 등의 배당체 및 카페산 유도체를 함유하고 있다. 상기와 같은 멜리사에 함유되어 있는 비휘발성 성분의 하나인 로즈마린산(rosmarine acid)은 그 함량이 클뿐만 아니라 소염해열(消炎解熱)의 작용도 강하며, 잎에 포함되어 있는 정유(essential oil)는 약효가 풍부하고, 특히 우울증, 신경성 두통, 기억력 저하, 신경통, 발열 등이 질병의 치료제로서 널리 쓰여왔으며, 그 외에도 진정작용, 항균작용, 항바이러스 작용, 항산화작용 및 항호르몬 작용이 있다고 알려져 있어서 혈액순환 개선제 성분으로 사용되고 있다. 상기와 같은 멜리사엽을 상기의 추출방법으로 가공한 추출물을 분말화하여 본 발명의 조성물에 0.7 ∼ 5.0 중량% 사용하며, 이때 사용량이 0.7 중량% 미만이면 조성물에 대한 시너지 효과가 나타나지 않았으며, 5.0 중량% 를 초과하면 추가적인 시너지 효과를 보이지 않았다.
옥타코사놀(Octacosanol)은 미강(米糠)이나, 알팔파, 사과, 포도의 껍질, 사탕수수, 귤, 소맥배아 등의 식물에서 극미량 발견되는 천연의 포화 고급지방족 알코올의 일종으로 화학적으로 매우 안정한 미백색 결정상태의 물질이다. 이와 같은 옥타코사놀은 지구력과 체력을 향상시켜주는 생리활성물질로서, 체내 콜레스테롤 저하, 체내 중성지질 조절, 혈전증 예방과 심장기능 강화 등에 의한 성인병 예방 및 개선의 효능을 가지는 것으로 알려져 있다. 상기와 같은 옥타코사놀을 본 발명의 조성물에는 0.4 ∼ 3.0 중량% 포함하며, 이때 사용량이 0.4 중량% 미만이면 조성물에 대한 시너지 효과가 나타나지 않았으며, 3.0 중량%를 초과하면 추가적인 시너지 효과를 보이지 않았다.
은행잎(白果葉) 추출물은 일반적으로 플라본글리코시드를 함유하고 있어 항산화작용과 세포보호작용을 나타냄이 보고되어 있으며, 혈소판응집 억제작용, 혈관 확장작용 및 아드레날린에 의한 혈관수축을 억제하는 혈관이완작용 등 심혈관계에 다양한 작용을 갖는 것으로 보고되고 있다. 또한 뇌혈류량을 증가시켜 뇌의 영양상태를 개선하며, 일정수준으로 혈압을 내리는 작용 및 항균작용을 나타내는 것 으로 알려져 있다. 상기와 같은 은행잎을 산사자를 잘게 분쇄한 후, 물(H2O), 에탄올(EtOH) 등의 수용액에 넣고 30 ∼ 70 ℃에서 2 ∼ 3회 용매추출한다. 이때 수용액의 사용량은 은행잎 부피의 3 ∼ 5배 정도가 적당하다. 상기에서 분리된 추출액을 30 ∼ 70 ℃의 조건하에서 증발농축한 후, 가열 또는 동결건조하여 추출액을 분말화하여 본 발명의 조성물에 0.4 ∼ 3.0 중량% 사용하는데, 이때 그 사용량이 0.4 중량% 미만이면 조성물에 대한 시너지 효과가 나타나지 않았으며, 3.0 중량% 를 초과하면 추가적인 시너지 효과를 보이지 않았다.
즉, 본 발명의 조성물을 구성하는 각 성분은 그 자체로서도 우수한 혈전용해능을 가질 뿐만 아니라, 체내의 콜레스테롤 및 중성지방의 함량을 적당한 수준으로 조절하는 약리작용을 가지고 있다. 그러나 본 발명의 조성물은 상기와 같은 우수한 혈전용해능을 가지는 성분의 함량을 특이성 있게 조절함으로써, 상기 각 성분이 가지는 혈전용해능, 체내 콜레스테롤 저하, 항동맥경화 및 혈소판 응고 억제 효능을 보다 증진하여 발현하도록 함에 특징이 있다.
상기와 같은 성분을 포함하는 본 발명의 혈전용해능이 우수한 조성물은 다양한 방법으로 식품에 적용할 수 있으며, 특별히 제한하지는 않지만, 본 발명의 혈전용해능이 우수한 조성물은 식품에 적용할 경우 보다 바람직한 효과를 얻을 수 있으며, 구체적으로 예를 들면, 일반 식품으로는 음료, 발효유, 껌 및 건강기능성 식품으로 정제, 캅셀, 과립제, 환제 등에 적용할 수 있다.
이에 본 발명을 실시예에 의거하여 더욱 구체적으로 설명하겠는 바, 본 발명이 다음 실시 예에 의하여 한정되는 것은 아니다.
실시예 1 : 혈전용해효소를 포함하는 대두발효 추출물의 제조(G군)
대두발효균인 바실러스 속 씨케이 11-4 (Bacillus sp. CK 11-4)[KCCM 10042]를 대두와 암모늄염을 20 :1 중량비로 포함하는 혼합물에 접종하여 25 ∼ 45 ℃를 유지하는 50 ∼ 100 ℓ 발효조에서 2 ∼ 4 일간 배양한 다음 0.2 ∼ 0.25 ㎛의 필터(filter)를 통과시켜 대두발효 추출물을 얻었다. 상기 대두발효 추출물을 농축한 후 동결건조하고 마쇄하여 분말화하였다.
실시예 2 : 혈전용해능이 우수한 조성물의 제조(L군)
상기 실시예 1에 따라 제조된 대두발효 추출물의 분말 58.0 중량%, 카카오 추출물의 분말 23.0 중량%, 산사자 추출물의 분말 15.0 중량%, 멜리사엽 추출물의 분말 3.0 중량%, 옥타코사놀 0.5 중량%, 은행잎 추출물의 분말 0.5 중량% 를 혼합하여 조성물을 제조하였다.
이하의 실험예에는 상기 실시 예1에서 제조한 대두발효 추출물과 실시예 2에서 제조한 조성물을 사용하여 동물(쥐)실험을 행하였다.
실험예 1 : 고지혈증 유발 모델을 이용한 동물실험
실험동물은 생후 3 주령의 흰쥐[Sprague Dawley male, 약 70 g, (주) 대한바이오링크]를 사용하였다. 각 실험동물은 5 일동안 시판사료(상품명:실험동물 쥐 사료용 5057, 제조사명: 퓨리나코리아)를 급여하여 환경에 적응시킨 후 정상군 8마리, 고지혈군(비처리군 및 처리군)군 10마리로 분류하였다.
정상군은 상기한 분말상의 시판사료를 급여하였으며 비처리군 및 처리군은 고지혈 식이를 급여하였는데, 비처리군은 상기 고지혈 식이만을 급여하고, 처리군에는 대두발효추출물군에서는 실시예 1에서 제조된 대두발효 추출물 분말을 경구투여하였으며, 조성물군에는 실시예 2에서 제조된 조성물을 경구투여하면서 7주 동안 사육하였다.
사육환경으로서 온도는 22 ± 2.0 ℃, 습도 55 ± 5.0 %를 유지하였고, 조명주기는 12 시간으로 조절하였다. 식이는 매일 오전 10 ∼ 11 시 사이에 물과 함께 공급하였고, 각 군의 식이 조성은 다음 표 1에 나타내었으며, 식이량은 식이를 공급할 때마다 측정하였다.
실험동물은 희생시키기 전 12시간 절식시킨 후 디에틸에테르로 마취시켜 혈액 및 조직, 분변 시료를 채취하였다.
실험 개시일을 0 일로 하여 1주마다 동물의 체중 변화상태를 측정하였으며, 체중 측정은 측정전 12 시간 절식 후 수행하였다. 전 실험 기간 동안의 사료섭취량과 체중 증가량으로부터 사료 효율[feed efficiency ratio, 체중증가량(g)/ 사료섭취량(g)]을 구하였다.
구분 (중량%) |
대조군 |
처리군 |
대두발효추출물군 |
조성물군 |
수크로스 |
65 |
65 |
65 |
카제인 |
15 |
15 |
15 |
라드 |
8 |
8 |
8 |
옥수수유 |
2 |
2 |
2 |
콜레스테롤 |
1 |
1 |
1 |
비타민 혼합물 |
1 |
1 |
1 |
미네랄 혼합물 |
3.5 |
3.5 |
3.5 |
비 영양성 섬유 |
4.45 |
4.45 |
4.45 |
염화 콜린 |
0.05 |
0.05 |
0.05 |
합계 |
100.0 |
100.0 |
100.0 |
처리(경구투여량) |
|
25 mg/kg1)
|
55 mg/kg2)
|
1)동물 체중 1 ㎏ 당 실시예 1 에 따라 제조된 대두발효 추출물의 분말 25 ㎎ 2)동물 체중 1 ㎏ 당 실시예 2 에 따라 제조된 조성물 55 ㎎ |
원심 분리하여 얻어진 혈청 중의 총 중성지방은 부콜로(Bocolo)방법에 준한 효소 키트(아산제약 제품)를 사용하여 550 ㎚에서 흡광도의 변화로 측정하였으며, 혈중 충 콜레스테롤은 효소법에 의한 키트(아산제약 제품)를 사용하여 500 ㎚에서 흡광도를 측정하여 비생정량하였다. HDL-콜레스테롤은 혈청내 HDL-콜레스테롤을 제외한 콜레스테롤을 침전시켜 제거한 후 상층액을 검체로 하여 혈중 총콜레스테롤과 같은 방법으로 측정하였다. LDL-콜레스테롤은 분리시액으로 혈청내 LDL-콜레스테롤만을 침전시켜 역시 총콜레스테롤과 같은 방법으로 측정하였다. 혈중 유리 콜레스테롤, 콜레스테롤 에스테르 및 혈중 인지질의 측정은 효소 키트(아산제약 제품)를 사용하여 비색정량하였다.
<실험 결과>
실험식이 급여 후 7주 동안 측정된 사료 섭취량, 체중 증가량 및 식이 효율은 다음 표 2와 같다.
|
사료 섭취량 (g/7주) |
체중 증가량 (g/7주) |
식이효율 |
정상군 |
490.3 ± 41.3 |
193.8 ± 3.9 |
0.401 ± 0.056 |
비처리군 |
337.8 ± 33.1 |
126.9 ±13.7 |
0.376 ± 0.039 |
처리군 (대두발효추출물군) |
325.1 ± 31.5 |
124.0 ±13.8 |
0.381 ± 0.043 |
처리군 (조성물군) |
278.8 ±26.7 |
140.1 ±8.21 |
0.507 ± 0.063 |
식이효율 = 7주 동안의 체중 증가량 / 7주 동안의 사료섭취량 |
상기 표 2에 나타낸 바와 같이, 식이효율을 측정한 결과 정상군보다 비처리군 및 대두발효추출물군이 낮은 수치를 나타냈다. 이는 콜레스테롤이 합성 식이에 혼합된 결과로 보여지며, 조성물군에서의 식이 효율이 상당히 정상군보다 좋게 나타났다.
혈장내 중성지방, 총콜레스테롤 및 HDL-콜레스테롤, LDL-콜레스테롤 등 각종 생화학 항목들을 상업용 지질 분석 키트(아산제약 제품)로 측정한 것을 다음 표 3에 나타내었다.
구분 (㎎/㎗) |
대조군 |
비처리군 |
처리군 |
대두발효추출물군 |
조성물군 |
총콜레스테롤 |
73.0 ±1.6 |
212.6±22.4 |
190.4±11.7 |
165.1±16.1 |
HDL-콜레스테롤 |
53.2 ±1.1 |
22.4±2.7 |
27.9±2.3 |
32.6±4.0 |
LDL-콜레스테롤 |
12.0 ±0.5 |
67.1±6.4 |
61±5.8 |
47±6.3 |
HDL/LDL 비 |
4.46 ±0.2 |
0.4±0.1 |
0.5±0.1 |
0.79±0.1 |
콜레스테롤에스테르 |
69.0 ±1.3 |
195.9±20.0 |
175.3±10.1 |
153±14.0 |
유리콜레스테롤 |
4.0 ±0.3 |
16.7±2.5 |
15.1±1.7 |
12.1±1.9 |
동맥경화지수 |
0.37±0.05 |
9.8±1.8 |
6.3 ±0.9 |
4.68±1.1 |
상기 수치는 평균±표준편차를 나타낸 것이다 동맥경화지수 = (총콜레스테롤 - HDL-콜레스테롤) / HDL-콜레스테롤 |
상기 표 3에 나타낸 바와 같이, 혈액의 총 콜레스테롤을 측정한 결과 대조군보다 비처리군이 2.9 배 증가한 수치를 나타내 적절한 고지혈 유도가 이루어진 것 으로 관찰되었다. 여기에, 제조예 1에서 제조한 대두발효 추출물군에서는 대조군에 비해 수치가 별 차이 없는 것으로 나타나 콜레스테롤 농도 저하에선 미비한 효과가 나타난 것으로 확인되었지만, 제조예 2에서 제조된 조성물군은 23.7 % 정도의 콜레스테롤 수치 저하 효과가 관찰되어 각 조성물을 조합하여 사용할 경우 콜레스테롤 저하에 보다 강한 효능을 나타내는 것으로 확인되었다.
혈장의 HDL-콜레스테롤 농도는 그 수치가 높을수록 바람직한 혈액 조성을 보여주는 것으로서, 이를 측정한 결과 대조군보다 비처리군에 있어서 수치가 약 57 % 정도 감소된 것으로 나타나, 비처리군의 경우 고지혈 동물의 특성을 잘 보여주었다. 대두발효 추출물군은 상기한 총콜레스테롤의 경우와 마찬가지로 그다지 개선된 효과를 보여주지 못하였으나, 조성물군은 비처리군보다 혈장 HDL-콜레스테롤 농도가 1.45 배 증가한 결과를 얻어 고지혈 개선에 효과가 있는 것으로 관찰되었다.
혈장의 HDL-콜레스테롤 농도에 대한 변화는 대조군보다 비처리군에서 약 5.6 배 증가한 농도변화를 나타내 역시 고지혈 동물의 특징으로 잘 나타냈고, 먼저 나타난 총콜레스테롤 및 HDL-콜레스테롤과 마찬가지로 대두발효추출물군보다는 조성물군에서 농도의 저하가 크게 관찰되어 고지혈 증상의 개선의 측면에서 우수한 효능이 있는 것으로 확인되었다.
LDL-콜레스테롤과 HDL-콜레스테롤의 비를 산출한 결과, 대조군과 비처리군의 차는 10 배 정도의 차이를 나타내 적절한 고지혈 유도가 일어난 것으로 확인되었고, 대두발효추출물군 보다는 조성물군에서 고지혈 개선 효과가 뚜렷하게 나타난 것으로 관찰되었다.
동맥경화지수는 총콜레스테롤과 HDL-콜레스테롤의 상관관계로 지수가 높으면 동맥경화에 걸릴 확률이 큰 것으로 통용되고 있다. 본 발명의 경우 7 주간 고지혈 동물실험에서 동맥경화지수는 대조군보다 비처리군에서 약 26 배 증가한 수치를 나타내 고지혈 동물과 동맥경화 지수 증가의 양적인 관계를 잘 보여주었고, 역시 대두발효추출물군 보다는 조성물군에서 현저한 동맥경화지수의 저하를 보여주어 고지혈 개선에 뛰어난 효과가 있는 것이 확인되었다.
유리 콜레스테롤과 콜레스테롤 에스테르의 농도변화를 살펴본 결과 대조군보다는 비처리군에서 농도의 증가가 관찰되어 고지혈 동물의 특징이 확인되었고, 역시 앞선 실험 항목과 마찬가지로 대두발효추출물군 보다는 조성물군에서 수치 저하 효과가 크게 나타나 고지혈 개선에 유효성이 있다는 것이 다시 확인되었다.
상기한 결과에서 볼 때, 대조군보다 비처리군은 총콜레스테롤 수치가 약 2.9 배 증가한 것으로 나타나 고콜레스테롤 유도가 올바르게 이루어졌음을 확인할 수 있었다. 동맥경화지수 역시 대조군보다 비처리군의 경우 약 26배 증가한 것으로 나타나 혈관의 동맥경화 가능성이 상당히 높은 것으로 확인되었다.
한편, 대두발효추출물군에서는 총콜레스테롤 수치에서 비처리군보다 현저한 변화는 관찰되지 않은 반면, 조성물군에서 콜레스테롤 저하 효과가 큰 것으로 나타났으며, 동맥경화 지수 측면에서도 비슷한 결과를 보여주었다.
결과적으로 고콜레스테롤을 유도한 동물 모델에서는 대두발효추출물군의 고콜레스테롤 억제 효과는 현저하지 않지만 어느 정도 콜레스테롤 증가 억제 효과가 있는 것으로 확인되었으며, 조성물군의 경우는 혈액내 콜레스테롤 구성의 측면에서 월등한 개선 효과가 나타남을 알 수 있다.
실험예 2 : 혈소판 응집 개선 모델을 이용한 동물실험
실험동물은 200 g 정도의 흰쥐[Sprague Dawley male, (주)대한바이오링크] 를 사용하였으며, 각 실험동물은 5일 동안 시판 사료(상품명:실험동물 쥐 사료용 5057, 제조사명: 퓨리나코리아)를 급여하여 환경에 적응시킨 후 실험에 사용하였다.
실험군은 4 군으로 분류하였으며, 상기 흰쥐 10 마리에게 상기한 일반 고형사료를 곱게 간 정상식이를 급여하며 이를 대조군으로 하였다. 다른 마우스 10 마리에게는 상기 정상식이에 아스피린을 경구투여하였으며(양성대조군), 다른 마우스 10마리에게는 상기 정상식이에 상기 실시예 1에서 제조한 대두발효 추출물 분말을 경구투여하였고(대두발효추출물군), 나머지 10 마리에게는 상기 실시예 2에서 제조한 조성물을 경구투여하여(조성물군) 2 주간 실험을 수행하였다. 사육환경으로서 온도 22 ± 2.0 ℃, 습도 55 ± 5.0 %를 유지하였고, 조명주기는 12 시간으로 조절하였으며, 식이는 매일 오전 10 ∼ 11 시사이에 물과 함께 공급하였고, 식이량은 식이를 공급할 때마다 측정하였다. 각 4 군의 식이 조성은 다음 표 4와 같다.
구분(중량%) |
대조군 |
양성대조군 (아스피린군) |
대두발효추출물군 |
조성물군 |
옥수수 |
14 |
14 |
14 |
14 |
알팔파 |
2 |
2 |
2 |
2 |
소액피 |
15 |
15 |
15 |
15 |
밀가루 |
30 |
30 |
30 |
30 |
대두박 |
25 |
25 |
25 |
25 |
대용유 |
2 |
2 |
2 |
2 |
옥글루텐밀 |
2 |
2 |
2 |
2 |
어분 |
4.41 |
4.41 |
4.41 |
4.41 |
인산칼슘 |
1.91 |
1.91 |
1.91 |
1.91 |
소금 |
0.5 |
0.5 |
0.5 |
0.5 |
비타민제 |
0.495 |
0.495 |
0.495 |
0.495 |
미네랄제 |
0.704 |
0.704 |
0.704 |
0.704 |
아미노산제 |
0.181 |
0.181 |
0.181 |
0.181 |
물 |
1.8 |
1.8 |
1.8 |
1.8 |
합계 |
100 |
100 |
100 |
100 |
처리(경구투여량) |
|
100 mg/kg1)
|
25 mg/kg2)
|
55 mg/kg3)
|
1)동물 체중 1 ㎏ 당 100 ㎎ 2)동물 체중 1 ㎏ 당 실시예 1 에 따라 제조된 대두발효 추출물의 분말 25 ㎎ 3)동물 체중 1 ㎏ 당 실시예 2 에 따라 제조된 조성물 55 ㎎ |
실험동물은 희생시키기 전 12 시간동안 절식시킨 후 디에틸에테르로 마취시켜 복부대동맥으로 부터 신선한 혈액을 채취하여 전혈 혈소판 응집능 분석에 사용하였으며, 항응고제로는 시트르산 염(sodium citrate)을 사용하였다. 전혈을 채취하고 남은 혈액은 4,500 rpm에서 10 분간 원심분리하여 혈장을 얻었으며, 이는 나머지 실험의 시료로 사용하였다.
혈소판 응집 활성은 혈소판 응집계(platelet aggegometer, Chrono-log Co., USA)를 이용하여 측정하였는데, 전혈을 이용한 전기전도도 측정방법(impedance method)을 적용하였다. 총 40 마리 실험동물의 복부대동맥으로부터 조심스럽게 신선한 혈액을 채취하여 콜라겐으로 유도된 혈소판 응집 테스트(collagen-induced platelet aggegation test)를 수행하였다.
혈소판 응집 활성은 실리콘 코팅된 큐벳(silicon-coatted coagulated cuvett)을 미리 예열시켜 생리식염수 0.45 ㎖ 를 교반 막대(stirrer bar)와 함께 잘 섞은 후 37 ℃에서 3 분간 가온시켰다. 여기에 콜라겐(1 ㎎/ ㎖)를 첨가한 후 혈소판 응집계를 이용한 전기유도법(impedance)으로 혈소판 응집능을 측정하였으며, 그 결과를 다음 표 5에 나타내었다.
|
대조군 |
아스피린군 |
대두발효추출물군 |
조성물군 |
혈소판 응집능(Ω) |
88.83±6.4 |
65.17±2.8 |
70.33±4.6 |
68.86±5.1 |
상기 표 5에 나타낸 바와 같이, 정상적인 식이만을 섭취하는 대조군에 비해 각 군의 처치군들은 혈소판 응집에 있어서 개선적인 변화를 보여주었는데, 항혈소판제로 상용되는 대표적인 약물인 아스피린을 투여한 결과 대조군에 비해 혈소판 응집능이 23.66 % 정도의 유의하게 감소하였으며(p<0.05), 대두발효추출물군의 경우는 대조군에 비해 혈소판 응집능이 18.50 % 정도 유의하게 감소하였으며(p<0.05), 아스피린 군보다 낮은 혈소판 응집개선효과를 보여주었다. 또한 조성물군은 대조군에 비해 혈소판 응집능이 19.97 % 정도 유의하게 감소하였다(p<0.05).
상기와 같은 결과로 볼 때, 본 발명의 실시예 1 및 2에서 제조된 대두발효 추출물의 분말 또는 혈전용해능이 우수한 조성물은 식품에 적용하였을 경우 우수한 콜레스테롤 증가 억제와 혈소판의 응집을 저해하여 혈전의 혈성을 효과적으로 저해할 수 있으며, 또한 생성된 혈전을 용해하는 능력이 우수할 것으로 사료된다.
실험예 3 : 흰쥐에 대한 경구투여 급성 독성실험
5주령의 특정병원체부재(SPF) SD계 흰쥐를 사용하여 급성독성실험을 실시하였다. 군당 3 마리씩의 동물에 상기 실시예 1과 2에 따라 제조된 조성물을 각각 0.5% 메틸셀룰로즈 용액에 현탁하여 2 g/kg/1.2 ㎖의 용량으로 단회 경구 투여하였다. 시험물질 투여 후 동물의 폐사여부, 임상증상, 체중변화를 관찰하고 혈액학적 검사와 혈액생화학적검사를 실시하였으며, 부검하여 육안으로 복강장기와 흉강장기의 이상여부를 관찰하였다. 시험결과, 시험물질을 투여한 모든 동물에서 특기할 만한 임상증상이나 폐사된 동물은 없었으며, 체중변화, 혈액검사, 혈액생화학 검사, 부검소견 등에서도 독성변화는 관찰되지 않았다. 이상의 결과 실험에 이용된 조성물은 모두 흰쥐에서 조성물 2g/kg까지 독성변화를 나타내지 않았다.
제조예 1 : 혈전 용해능이 우수한 추출물을 포함하는 식품(껌)의 제조
대두발효 추출물 분말 10 중량%, 껌베이스 20 중량%, 당 67.0 중량%, 향료 1중량%, 물 2 중량% 을 배합하여 통상의 방법으로 츄잉껌을 제조한다.
제조예 2 : 혈전 용해능이 우수한 추출물을 포함하는 식품(발효유)의 제조
대두발효 추출물 분말 10 중량%, 발효두유 32.5 중량%, 당 EPA.DHA함유 정제 유지 2.6 중량%, 그 외 감미료 및 향료 4.4 중량%, 물 50.5 중량% 을 배합하여 통상의 방법으로 츄잉껌을 제조한다.
제조예 3 : 혈전 용해능이 우수한 조성물을 포함하는 식품(음료)의 제조
대두발효 추출물 분말 9.0 중량%, 카카오추출물의 분말 8.0 중량%, 산사자추출물의 분말 5.0 중량%, 멜리사엽 추출물의 분말 0.8 중량%, 은행잎 추출물의 분말 0.5 중량%, 옥타코사놀 0.5 중량%, 비타민 C 0.5 중량%, 젖산철 0.1 중량%, 비타민 A 0.2 중량%, 비타민 B1 0.2 중량%, 비타민 B2 0.2 중량%, 향료 0.1%, 물 74.9 중량% 을 배합하여 통상의 방법으로 음료를 제조한다.
제조예 4 : 혈전 용해능이 우수한 조성물을 포함하는 연질 캅셀제의 제조
대두발효 추출물 분말 14.0 중량%, 카카오 추출물의 분말 8.0 중량%, 산사자 추출물의 분말 6.0 중량%, 멜리사엽 추출물의 분말 0.8 중량%, 옥타코사놀 0.5 중량%, 은행잎 추출물의 분말 0.5 중량%, 레시틴 2.5 중량%, 야자경화유 10.0 중량%, 밀납 4.0 중량%, 감마리놀렌산 53.7 중량% 을 혼합하여 젤라틴 연질 캅셀로 제조한다.
제조예 5 : 혈전 용해능이 우수한 조성물을 포함하는 경질 캅셀제의 제조
대두발효 추출물 분말 48.0 중량%, 카카오 추출물의 분말 8.0 중량%, 산사자 추출물의 분말 6.0 중량%, 멜리사엽 추출물의 분말 0.75 중량%, 옥타코사놀 0.5 중량%, 은행잎 추출물의 분말 0.5 중량%, 락토스 분말 20.0%, 옥수수전분 14.75 중량%, 스테아린산 Mg 1.0 중량%, 결정셀롤로스 0.5 중량% 을 혼합하여 젤라틴 경질 캅 셀로 제조한다.
제조예 6 : 혈전 용해능이 우수한 조성물을 포함하는 정제 및 환제의 제조
대두발효 추출물 분말 14.0 중량%, 카카오 추출물의 분말 8.0 중량%, 산사자 추출물의 분말 6.0 중량%, 멜리사엽 추출물의 분말 0.8 중량%, 옥타코사놀 0.5 중량%, 은행잎 추출물의 분말 0.5 중량%, 락토스 분말 51.2 중량%, 결정셀룰로오스 14.0 중량%, 마그네슘스테아레이트 5.0 중량% 을 혼합 후 직타법(direct tableting method)을 이용하여 정제를 제조한다.