KR100613691B1 - 2- novel lipase from soil metagenome and method for selectively partitioning lacemic ethyl 2-bromopropionate using same - Google Patents
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Abstract
본 발명은 토양 메타게놈 유래 신규 리파제 및 이를 이용하여 라세믹 에틸 2-브로모프로피오네이트 (ethyl 2-bromo propionate)를 광학선택적으로 분할하는 방법에 관한 것으로, 구체적으로 토양 미생물의 메타게놈에서 분리한 서열번호: 3의 리파제 유전자, 이로부터 코딩되는 광학이성질체에 반응특이성을 갖는 서열번호: 4의 리파제 단백질, 및 상기 리파제 단백질을 이용하여 라세믹 에틸 2-브로모프로피오네이트로부터 한 가지 광학이성질체를 선택적으로 가수분해하여 분할하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 신규 리파제 단백질은 광학선택성이 우수하여 라세믹 에틸 2-브로모프로피오네이트를 단일 이성질체로 순수하게 분리하는데 유용하게 사용될 수 있다.The present invention relates to a novel lipase derived from soil metagenome and a method for optically dividing racemic ethyl 2-bromo propionate using the same. One optical isomer from racemic ethyl 2-bromopropionate using the lipase protein of SEQ ID NO: 3 having a reaction specificity to the lipase gene of SEQ ID NO: 3 , the optical isomer encoded therefrom, and the lipase protein It is related with the method of selectively hydrolyzing and dividing. The novel lipase protein of the present invention has excellent optical selectivity and can be usefully used to purely separate racemic ethyl 2-bromopropionate into a single isomer.
Description
도 1은 토양 메타게놈 유래 리파제 ELP182를 암호화하는 서브클론으로 형질전환된 대장균에서 목적하는 33 kDa의 리파제 ELP182의 발현을 SDS-PAGE로 확인한 결과이다. Figure 1 shows the results of confirming the expression of the target 33 kDa lipase ELP182 in Escherichia coli transformed with a subclone encoding the soil metagenome-derived lipase ELP182.
본 발명은 광학이성질체에 반응특이성을 갖는 토양 미생물의 메타게놈에서 분리한 신규 리파제 ELP182 유전자, 이로부터 코딩되는 단백질 및 상기 단백질을 이용하여 라세믹 에틸 2-브로모프로피오네이트를 광학선택적으로 분할하는 방법에 관한 것이다.The present invention provides a novel lipase ELP182 gene isolated from the metagenome of soil microorganisms having a reaction specificity to an optical isomer, a protein encoded therefrom, and optically partitioning racemic ethyl 2-bromopropionate using the protein. It is about a method.
미생물로부터 생산된 단백질을 산업적으로 이용하려는 연구는 지난 100여 년간 여러 분야에서 폭넓게 진행되어 왔다. 이러한 연구는 주로 배양이 가능한 미생물을 대상으로 이루어졌고, 이로부터 밝혀진 다양한 미생물 효소들이 산업적으로 이용되고 있다. 그러나, 배양이 가능한 미생물로부터 생산되는 효소에 대해서는 이미 많은 연구가 되어있어 현재는 다수의 미생물을 배양하여 신규한 효소를 탐색하기 위한 시도가 이루어지고 있다. Research into industrial use of proteins produced from microorganisms has been extensively conducted in various fields for the last 100 years. These studies were mainly conducted on microorganisms that can be cultured, and various microbial enzymes found therefrom are being used industrially. However, many studies have been made on enzymes produced from microorganisms that can be cultured. At present, attempts have been made to search for new enzymes by culturing many microorganisms.
그러나, 최근 분자미생물 생태학의 연구를 통해서 자연계에 존재하는 미생물의 99％ 이상이 전형적인 배지에서 배양되지 않는다는 사실이 증명되었다 (Amann et al., Microbiol. Rev. 59: 143-169, 1995; Hugenholtz and Pace, Trends Biotechnol. 14: 190-197, 1996; Ward et al., Nature 345: 63-65, 1990). 따라서, 실제로 배양되어 동정된 적이 없는 대다수 미생물들의 효소를 찾으려는 노력이 필요하며, 이는 분자생물학적인 유전자 재조합 발현을 통하여 가능하리라 여겨진다. However, recent studies of molecular microbial ecology have demonstrated that more than 99% of the microorganisms in nature are not cultured in typical media (Amann et al., Microbiol. Rev. 59: 143-169, 1995; Hugenholtz and Pace, Trends Biotechnol. 14: 190-197, 1996; Ward et al., Nature 345: 63-65, 1990). Therefore, efforts are needed to find enzymes of most microorganisms that have not been actually cultured and identified, which is thought to be possible through molecular biological recombinant expression.
이러한 접근방법의 일환으로 메타게놈 (metagenome)에 관한 연구가 시도되고 있는데, 메타게놈은 자연계에 존재하는 모든 미생물의 유전체를 통칭하는 것으로 정의된다. 일반적으로, 메타게놈 연구는 자연계 시료로부터 미생물을 배양하지 않고 메타게놈을 분리한 후, 이들을 라이브러리로 작성하여 배양가능한 대장균에 도입하는 단계로 구성된다. 이는 배양이 불가능했던 미생물로부터 유용 산물을 확보하기 위한 방법으로, 유전자의 유래가 되는 미생물에 대한 정보는 얻기가 어려우나 미생물의 산물과 유전자를 동시에 확보할 수 있는 장점이 있다.As part of this approach, research on metagenome has been attempted, which is defined as the generic name of all the microorganisms in nature. In general, metagenomic studies consist of separating metagenomes from natural samples without culturing microorganisms, and then preparing them into libraries and introducing them into cultivable Escherichia coli. This is a method for securing useful products from microorganisms that have not been cultured, but it is difficult to obtain information on the microorganism from which the gene is derived.
미국 위스콘신 대학 연구팀은 처음으로 대형의 메타게놈을 성공적으로 분리하여 세균성 인위적 염색체 (bacterial artificial chromosome, BAC) 벡터에 클로닝하여 메타게놈 라이브러리를 구축하였고, 이로부터 광범위한 항생물질 및 그의 생합성에 관련된 유전자들을 분리하였다 (Gillespie et al., Appl. Environ. Microbiol. 68: 4301-4306, 2002; Rondon et al., Appl. Environ. Microbiol. 66: 2541-2547, 2000). TIGR (The Institute for Genomic Research) 연구팀에서도 해양 미생물의 총 미생물 메타게놈 라이브러리를 BAC 벡터에 구축하여 해양 생태계로부터 배양되지 않는 미생물의 유전자원 탐색을 시도하고 있다. The University of Wisconsin, USA, for the first time, has successfully isolated large-scale metagenomes and cloned them into bacterial artificial chromosome (BAC) vectors to build a metagenome library, which isolates a wide range of antibiotics and genes involved in their biosynthesis. Gillespie et al., Appl. Environ. Microbiol. 68: 4301-4306, 2002; Rondon et al., Appl. Environ. Microbiol. 66: 2541-2547, 2000. The Institute for Genomic Research (TIGR) team is also building a total microbial metagenomic library of marine microorganisms in BAC vectors to explore the genetic resources of microorganisms that are not cultured from marine ecosystems.
한편, 자연계에 존재하는 약리활성 화합물은 대부분 키랄 구조를 가지고 있으며 한 가지 광학이성질체 (enatiomer)로 존재하는데 반해, 화학합성에 의해 생산되는 많은 약리활성 화합물은 두 가지 광학이성질체가 혼합된 형태의 라세믹 화합물 (racemate)로서 얻어지게 된다. 이때, 대부분 한 종류의 광학이성질체만이 약리 활성을 나타내며 나머지는 활성이 없거나 부작용을 일으키기도 한다. 따라서, 기존의 라세믹 화합물을 약리활성이 있는 단일 이성질체로 전환시키거나, 앞으로 개발될 약리활성 화합물 역시 순수한 단일 광학이성질체로서 생산하는 것이 바람직하다.On the other hand, most pharmacologically active compounds in nature have a chiral structure and exist as one optical isomer, whereas many pharmacologically active compounds produced by chemical synthesis are racemic in the form of a mixture of two optical isomers. It is obtained as a racemate. At this time, most of only one type of optical isomer exhibits pharmacological activity, and the rest is inactive or causes side effects. Therefore, it is desirable to convert existing racemic compounds to single isomers with pharmacological activity, or to produce pharmacologically active compounds to be developed as pure single optical isomers.
순수한 광학이성질체를 얻는 방법으로서는 라세믹 화합물로부터 얻는 방법과 키랄성을 갖지 않는 화합물로부터 촉매를 사용하여 키랄 화합물을 합성하는 비대칭 합성법 (asymmetric synthesis)이 있다. 라세믹 화합물로부터 한 가지 광학이성질체를 분리하는 방법으로서 효소를 사용한 방법이 많이 연구되고 있는데, 이는 효소 촉매가 화학촉매보다 뛰어난 광학 선택성과 온화한 반응조건을 가지기 때문이다. 또한, 효소는 기질특이성이 있어 비슷한 종류의 물질에도 폭넓은 응용이 가능하다는 장점을 가지고 있다. As a method of obtaining a pure optical isomer, there are a method obtained from a racemic compound and an asymmetric synthesis in which a chiral compound is synthesized using a catalyst from a compound having no chirality. Many methods using enzymes to separate one optical isomer from racemic compounds have been studied because enzyme catalysts have superior optical selectivity and mild reaction conditions than chemical catalysts. In addition, the enzyme has a substrate-specific advantage that can be applied to a wide range of similar materials.
이러한 효소촉매로 이용되는 것 중의 하나가 리파제 (lipase)이다. 리파제는 트리글리세라이드 (triglyceride)를 가수분해하는 효소로 유지의 전환뿐만 아니라 수용액에서의 가수분해 및 유기용매 내에서의 (트랜스)에스터화 반응에 의해 다양한 정밀화학품, 특히 광학활성 의약품의 생산에 유용한 효소로 알려져 있다. 리파제는 다른 효소들에 비해 상대적으로 저렴하게 생산할 수 있으며 조효소를 필요로 하지 않아 산업적으로 큰 장점이 있어 최근에는 생물의약분야에서 생체촉매로 널리 활용되면서 그 중요성이 부각되고 있다. One of the enzymes used in such enzymes is lipase. Lipase is an enzyme that is useful for the production of a variety of fine chemicals, especially optically active pharmaceuticals, by the conversion of fats and oils into an enzyme that hydrolyzes triglycerides, as well as by hydrolysis in aqueous solutions and (trans) esterification in organic solvents. Known as Lipases can be produced relatively cheaply compared to other enzymes, and do not require coenzymes. Therefore, the lipase has a great industrial advantage, and recently, the lipase has been widely used as a biocatalyst in the biopharmaceutical field, and its importance has been highlighted.
이에 본 발명자들은 기질에 대한 우수한 광학선택성과 반응성을 갖는 신규한 리파제 유전자를 토양 메타게놈으로부터 분리한 후 이로부터 생산된 리파제 단백질을 이용하여 라세믹 에틸-2 브로모프로피오네이트로부터 한 가지 광학이성질체를 선택적으로 생산하는 방법을 개발함으로써 본 발명을 완성하였다.Therefore, the present inventors have isolated a novel lipase gene having excellent optical selectivity and reactivity to a substrate from soil metagenome, and then used one optical isomer from racemic ethyl-2 bromopropionate using the lipase protein produced therefrom. The present invention has been completed by developing a method of selectively producing.
따라서, 본 발명의 목적은 신규 리파제 유전자 및 이에 의해 코딩되는 신규 리파제를 제공하는 것이다.It is therefore an object of the present invention to provide novel lipase genes and novel lipases encoded thereby.
본 발명의 다른 목적은 상기 리파제를 이용하여 라세믹 에틸-2 브로모프로피오네이트로부터 단일 광학이성질체를 선택적으로 생산하는 방법을 제공하는 것이 다.
Another object of the present invention is to provide a method for selectively producing a single optical isomer from racemic ethyl-2 bromopropionate using the lipase.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 토양 메타게놈 유래 신규 리파제 유전자를 제공한다.In order to achieve the above object, the present invention provides a novel lipase gene derived from soil metagenome.
또한, 본 발명은 상기 리파제 유전자에 의해 코딩되는, 기질에 대해 우수한 광학선택성과 반응성을 갖는 단백질을 제공한다.In addition, the present invention provides a protein having excellent optical selectivity and reactivity with respect to a substrate, encoded by the lipase gene.
아울러, 본 발명은 상기 리파제 단백질을 이용하여 라세믹 에틸-2 브로모프로피오네이트를 선택적으로 가수분해하여 분할함으로써 약리활성을 갖는 단일의 광학이성질체를 생산하는 방법을 제공한다.In addition, the present invention provides a method for producing a single optical isomer having pharmacological activity by selectively hydrolyzing and cleaving racemic ethyl-2 bromopropionate using the lipase protein.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail.
본 발명은 토양 메타게놈으로부터 분리한 서열번호: 3의 염기서열을 갖는 리파제 유전자 및 그의 단편을 제공한다. The present invention provides a lipase gene having a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 isolated from soil metagenome and fragments thereof.
본 발명자들은 신규한 리파제 유전자를 토양으로부터 동정하기 위하여, 토양 미생물로부터 메타게놈을 분리한 후 포스미드 (fosmid)를 이용하여 대장균에 메타게놈 라이브러리를 작성하였다. 상기 라이브러리로부터 트라이뷰티린 (tributyrin)의 가수분해 여부를 통해 리파제 활성을 갖는 메타게놈 클론을 선별하였다. 리파제 활성관련 유전자를 다시 작게 재분리하여 유전자 부위를 결정하였고 이의 염기서열을 분석하였다. 그 결과, 토양 메타게놈으로부터 서열번호: 3으로 기재되는 1,866 bp의 염기서열 (GenBank 등재번호 제AY496581호)을 갖는 유전자를 분리하였다. In order to identify the novel lipase gene from the soil, the present inventors have isolated a metagenome from soil microorganisms and prepared a metagenomic library in E. coli using fosmid. Metagenome clones with lipase activity were selected from the library through the hydrolysis of tributyrin. The lipase activity-related genes were again smallly separated to determine the gene sites and their nucleotide sequences were analyzed. As a result, a gene having a nucleotide sequence of 1,866 bp (GenBank Accession No. AY496581) described in SEQ ID NO: 3 was isolated from the soil metagenome.
서열번호: 3의 염기서열에서, 뉴클레오티드 번호 921 내지 1856 부위 (1854-1856: 종결코돈)에 해당하는 전사 해독 프레임 (open reading frame)은 리파제 단백질 코딩 영역으로 이로부터 유도되는 아미노산 서열을 서열번호: 4로 기재되는 311개 아미노산으로 구성되어 있다. 본 발명에서는 상기 단백질을 리파제 ELP182로 명명하였다. 상기 서열번호: 3의 리파제 유전자는 이전에 보고된 리파제 유전자 집단과 32∼46％ 정도의 낮은 상동성을 보여 리파제를 암호화하는 신규한 유전자로서 확인되었다.In the nucleotide sequence of the 3, nucleotide numbers 921 to 1856 parts: SEQ ID NO: (1854-1856: stop codon) transferring decrypted frame corresponding to the (open reading frame) is an amino acid sequence derived therefrom by lipase protein coding region SEQ ID NO: It consists of 311 amino acids described as 4 . In the present invention, the protein is named lipase ELP182. The lipase gene of SEQ ID NO: 3 has been identified as a novel gene encoding lipase, showing a low homology of 32-46% with previously reported lipase gene population.
그러나, 코돈의 축퇴성 (degeneracy)으로 인하여 또는 상기 리파제 유전자를 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여 본 발명의 리파제 유전자는 코딩영역으로부터 발현되는 리파제 단백질의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위 내에서 코딩영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있고 코딩영역을 제외한 부분에서도 유전자의 발현에 영향을 미치지 않는 범위 내에서 다양한 변형 또는 수식이 이루어질 수 있으며, 그러한 변형 유전자 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서, 본 발명은 상기 서열번호: 3의 리파제 유전자와 실질적으로 동일한 염기 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 및 상기 유전자의 단편을 포함한다. 실질적으로 동일한 폴리뉴클레오티드란 80％ 이상, 바람직하게는 90％ 이상, 가장 바람직하게는 95％ 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.However, due to the degeneracy of the codon or in consideration of the preferred codons in the organism to express the lipase gene, the lipase gene of the present invention does not change the amino acid sequence of the lipase protein expressed from the coding region. In the coding region, various modifications may be made, and various modifications or modifications may be made within a range that does not affect the expression of genes in portions other than the coding region, and such modified genes are also included in the scope of the present invention. Accordingly, the present invention encompasses polynucleotides having fragment sequences that are substantially identical to those of the lipase gene of SEQ ID NO: 3 . By substantially identical polynucleotides are meant those having sequence homology of at least 80%, preferably at least 90%, most preferably at least 95%.
본 발명의 리파제 유전자로부터 발현되는 리파제 단백질 ELP182는 311개의 아미노산으로 이루어져 있고 서열번호: 4와 같은 아미노산 서열을 가지며 크기는 약 33 kDa이다. 그러나, 상기 리파제 단백질의 아미노산 서열에서도 역시 단백질의 기능에 영향을 미치지 않는 범위 내에서 아미노산의 치환, 부가 또는 결실이 이루어질 수 있으며, 목적에 따라 단백질의 일부만이 사용될 수도 있으며 이와 같이 변형된 아미노산 서열 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서, 본 발명은 상기 리파제 단백질과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 및 그의 단편을 포함하며, 실질적으로 동일한 폴리펩티드란 80％ 이상, 바람직하게는 90％ 이상, 가장 바람직하게는 95％ 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.The lipase protein ELP182 expressed from the lipase gene of the present invention consists of 311 amino acids, has an amino acid sequence as SEQ ID NO: 4, and is about 33 kDa in size. However, even in the amino acid sequence of the lipase protein, substitution, addition or deletion of amino acids may be made within a range that does not affect the function of the protein. Depending on the purpose, only a part of the protein may be used, and thus the modified amino acid sequence may also be used. It is included in the scope of the present invention. Accordingly, the present invention encompasses polypeptides and fragments thereof having substantially the same amino acid sequence as said lipase protein, wherein substantially identical polypeptides have at least 80%, preferably at least 90%, most preferably at least 95% homology It means things that have.
본 발명의 리파제 유전자 및 단백질은 토양의 메타게놈으로부터 분리하거나, 공지의 DNA 또는 펩티드 합성 방법에 따라 합성할 수도 있다. 또한, 이렇게 제조된 유전자를 당 분야에 공지된 미생물 발현용 벡터에 삽입하여 발현벡터를 제조한 후 이를 적절한 숙주 세포, 예를 들어, 대장균 또는 효모 세포 등에 도입시킬 수 있다. 이와 같이 형질전환 된 숙주를 이용하여 본 발명의 유전자의 DNA를 대량으로 복제하거나 단백질을 대량 생산할 수 있다. 벡터의 제작 시에는, 상기 리파제 유전자 또는 단백질을 생산하고자 하는 숙주 세포의 종류에 따라 프로모터 (promoter), 종결자 (terminator) 등과 같은 발현 조절 서열, 자가-복제 서열 및 분비 시그날 등을 적절히 선택하고 조합할 수 있다.Lipase genes and proteins of the present invention may be isolated from metagenome of soil or synthesized according to known DNA or peptide synthesis methods. In addition, the gene thus prepared may be inserted into a microorganism expression vector known in the art to prepare an expression vector and then introduced into an appropriate host cell, for example, E. coli or yeast cell. Using the transformed host as described above, the DNA of the gene of the present invention can be replicated in large quantities or a large amount of protein can be produced. In the construction of the vector, appropriate expression and control sequences, such as promoters and terminators, self-replicating sequences and secretion signals, etc. are appropriately selected and combined according to the type of host cell to produce the lipase gene or protein. can do.
본 발명의 서열번호: 3의 유전자로부터 코딩되는 단백질의 리파제 활성을 조사한 결과, 상기 유전자를 포함하지 않는 pUC119 벡터로만 형질전환된 대장균은 p-나이트로페닐 뷰티레이트 (nitrophenyl butyrate)를 전혀 분해하지 못한 반면, 본 발명의 리파제 ELP182 서브클론으로 형질전환된 대장균은 p-나이트로페닐 뷰티레이트를 효과적으로 분해하여 강한 리파제 활성을 나타내었다. 이로부터 토양 메타게놈에서 분리한 리파제 유전자가 대장균 형질전환체에서 발현되고 배지로 분비되어 우수한 리파제 활성을 나타냄을 확인하였다.As a result of examining the lipase activity of the protein encoded from the gene of SEQ ID NO: 3 of the present invention, E. coli transformed with only the pUC119 vector not containing the gene did not degrade p-nitrophenyl butyrate at all. In contrast, Escherichia coli transformed with the lipase ELP182 subclone of the present invention exhibited strong lipase activity by effectively degrading p-nitrophenyl butyrate. From this, it was confirmed that the lipase gene isolated from the soil metagenome was expressed in E. coli transformants and secreted into the medium to exhibit excellent lipase activity.
이에, 본 발명자들은 상기에서 확인된 토양 메타게놈 유래 리파제 단백질 ELP182에 대하여 라세믹 화합물로부터 단일의 광학이성질체를 선택적으로 가수분해할 수 있는 효소촉매로서의 가능성을 검정하였다. Thus, the present inventors assayed the potential as an enzyme catalyst capable of selectively hydrolyzing a single optical isomer from a racemic compound with respect to the soil metagenomic-derived lipase protein ELP182 identified above.
라세믹 에틸 2-브로모프로피오네이트에 대한 본 발명의 리파제 단백질 ELP182의 광학선택적 반응 특이성을 조사하였다. 그 결과, 본 발명의 토양 메타게놈 유래 리파제 단백질 ELP182가 S-형 에틸 2-브로모프로피오네이트에는 반응하지 않고 R-형 에틸 2-브로모프로피오네이트에만 선택적으로 작용하여 이를 에틸 2-브로모프로피온산으로 가수분해시키는 우수한 키랄 선택성을 가짐을 확인하였다. 따라서, 본 발명의 리파제 단백질 ELP182가 라세믹 화합물에서 R-형 에스터에만 광학선택적으로 작용하여 이를 유기산으로 가수분해시킴으로써 라세믹 화합물을 효율적으로 분할할 수 있음을 확인하였다.The optical selective reaction specificity of the lipase protein ELP182 of the present invention against racemic ethyl 2-bromopropionate was investigated. As a result, the soil metagenome-derived lipase protein ELP182 of the present invention selectively reacted only with R-type ethyl 2-bromopropionate without reacting with S-type ethyl 2-bromopropionate, which was reacted with ethyl 2-bromine. It was found to have good chiral selectivity to hydrolyze with morphopionic acid. Therefore, it was confirmed that the lipase protein ELP182 of the present invention can efficiently partition the racemic compound by optically acting only on the R-type ester in the racemic compound and hydrolyzing it with an organic acid.
이에 본 발명은 상기 토양 메타게놈 유래 리파제 단백질 ELP182를 이용하여 라세믹 에틸-2 브로모프로피오네이트를 광학선택적으로 분할하는 방법을 제공한다.Accordingly, the present invention provides a method for optically partitioning racemic ethyl-2 bromopropionate using the lipase protein ELP182 derived from soil metagenome.
본 발명의 방법은 하기 반응식 1에 예시한 바와 같이, 우수한 광학선택성을 갖는 토양 메타게놈 유래 리파제 단백질 ELP182를 사용하여 라세믹 에틸-2 브로모프로피오네이트에서 R-형 에스터 (R-1)에만 선택적으로 작용하여 이를 R-형 유기산 (R-2)으로 가수분해할 수 있으므로, 라세믹 에틸-2 브로모프로피오네이트로부터 단일의 이성질체를 효과적으로 분리할 수 있다. The method of the present invention uses only the soil metagenome-derived lipase protein ELP182 with excellent optical selectivity, as illustrated in Scheme 1 below, to R-type esters (R-1) in racemic ethyl-2 bromopropionate only. It can act selectively to hydrolyze it to R-type organic acid (R-2), thus effectively separating the single isomer from the racemic ethyl-2 bromopropionate.
리파제 단백질 ELP182의 광학선택적 가수분해 반응은 pH 6 내지 8의 완충용액 존재하에서 상온, 바람직하게는 5 내지 50℃에서 5 내지 48시간 동안 수행한다. 또한, 본 발명의 리파제 ELP182는 라세믹 에틸-2 브로모프로피오네이트의 총 중량에 대해 0.1 내지 10 중량％의 양으로 첨가할 수 있다.The optically selective hydrolysis reaction of lipase protein ELP182 is carried out at room temperature, preferably 5 to 50 ° C. for 5 to 48 hours in the presence of a buffer solution of pH 6 to 8. In addition, the lipase ELP182 of the present invention may be added in an amount of 0.1 to 10% by weight relative to the total weight of the racemic ethyl-2 bromopropionate.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail by way of examples.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.However, the following examples are merely to illustrate the invention, but the content of the present invention is not limited to the following examples.
<실시예 1> 토양 메타게놈 DNA의 분리Example 1 Isolation of Soil Metagenome DNA
대전시 유성구 일대의 산림에서 채취한 토양 시료를 메타게놈 라이브러리의 작성에 사용하였다. 채취한 토양을 메쉬 직경이 1.4 ㎜인 체에 걸러서 직경 1.5 ㎜ 이상의 입자와 식물 잔재물 등을 제거한 후, 메타게놈 추출을 위하여 5 g씩 사용하였다. 토양 시료 5 g을 15 ㎖ 완충용액 (100 mM Tris-HCl [pH 8.0], 100 mM EDTA [pH 8.0], 100 mM 인산염 나트륨 (sodium-phosphate) [pH 8.0], 1.5 M NaCl 및 1％ CTAB)에 현탁하였다. 상기 현탁액에 100 ㎎/㎖ 농도의 단백질 분해효소 (proteinase) K (Sigma)를 100 ㎕ 첨가한 후 37℃ 진탕 배양기에서 150 rpm의 속도로 30분간 진탕하였다. 여기에 20％ SDS를 1.5 ㎖ 첨가하고 잘 흔들어 섞어주었다. Soil samples from the forests of Yuseong-gu during Daejeon were used for the preparation of the metagenome library. The collected soil was filtered through a sieve having a mesh diameter of 1.4 mm to remove particles and plant residues having a diameter of 1.5 mm or more, and 5 g each was used for metagenome extraction. 5 g soil samples were taken in 15 ml buffer (100 mM Tris-HCl [pH 8.0], 100 mM EDTA [pH 8.0], 100 mM sodium-phosphate [pH 8.0], 1.5 M NaCl and 1% CTAB) Suspended in. 100 µl of 100 mg / ml proteinase K (Sigma) was added to the suspension, followed by shaking for 30 minutes at a speed of 150 rpm in a 37 ° C shaking incubator. 1.5 ml of 20% SDS was added thereto, and the mixture was shaken well.
상기 혼합물을 65℃ 항온수조에서 30분마다 한번씩 섞어주면서 2시간 동안 유지하였다. 이후에 7,000 rpm에서 10분간 원심분리하여 상등액을 분리하였고, 동일한 부피의 클로로폼/아이소아밀 알콜 (24:1)을 첨가하여 섞어준 후 8,000 rpm에서 5분간 원심분리하여 DNA가 포함된 상등액만을 새 튜브로 옮겼다. 상등액 부피의 0.6배에 해당하는 아이소프로판올을 첨가하여 섞어준 후 11,000 rpm에서 5분간 원심분리하여 DNA 침전물을 얻었다. 상기 DNA 침전물을 70％ 에탄올로 세척한 후 원심분리로 에탄올을 제거하였다. 이로부터 얻은 침전물을 건조시켜서 0.5 ㎖의 TE 완충용액 (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA [pH 8.0])에 용해시킨 후 4℃에 보관하면서 라이브러리 작성에 이용하였다. 분리된 DNA의 양과 크기 결정은 PFGE (pulsed field gel electrophoresis)로 확인하였다. PFGE는 6 V/㎝에서 120°고정각 (fixed angle)으로 1 내지 6초의 교대시간 (switch time) 조건에서 6시간 동안 수행하였다. The mixture was maintained for 2 hours while mixing once every 30 minutes in a 65 ℃ constant temperature water bath. Thereafter, the supernatant was separated by centrifugation at 7,000 rpm for 10 minutes, and the same volume of chloroform / isoamyl alcohol (24: 1) was added and mixed, followed by centrifugation at 8,000 rpm for 5 minutes. Transfer to tube. Isopropanol corresponding to 0.6 times the volume of the supernatant was added and mixed, followed by centrifugation at 11,000 rpm for 5 minutes to obtain a DNA precipitate. The DNA precipitate was washed with 70% ethanol and centrifuged to remove ethanol. The precipitate obtained therefrom was dried, dissolved in 0.5 ml of TE buffer (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA [pH 8.0]) and stored at 4 ° C. for use in library preparation. The amount and size of the isolated DNA was confirmed by PFGE (pulsed field gel electrophoresis). PFGE was carried out for 6 hours at a switch time of 1 to 6 seconds at a fixed angle of 120 ° at 6 V / cm.
이로부터 토양 시료 1 g당 약 1 내지 1.5 ㎍의 메타게놈 DNA를 회수하였고, 분리된 DNA 크기는 20 내지 100 kb 정도임을 확인하였다. From this, about 1 to 1.5 μg of metagenomic DNA was recovered per 1 g of soil sample, and the size of the isolated DNA was confirmed to be about 20 to 100 kb.
<실시예 2> 메타게놈 라이브러리의 작성 및 리파제 활성 클론의 선별Example 2 Preparation of Metagenome Library and Screening of Lipase Activation Clones
DNA 전기영동, 플라스미드 분리, DNA 절단 등은 통상적인 분자생물학적 방법 (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, ed. 2, 1989)에 따라 수행하였고, 시약 및 제한효소는 제조사의 지침에 따라 사용하였다.DNA electrophoresis, plasmid isolation, DNA cleavage, etc. were performed according to conventional molecular biological methods (Sambrook et al., Molecular Cloning : A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, ed. 2, 1989). Reagents and restriction enzymes were used according to the manufacturer's instructions.
상기 실시예 1에서 토양 시료로부터 추출한 메타게놈을 저융점 아가로스 겔 (low melting point agarose gel)에서 전기영동을 한 후 20 kb 이상의 DNA를 포함하는 아가로스 겔 블록 (block)만을 회수하였다. 회수된 겔 블록에 겔레이즈 (GeLase, Epicentre, USA)를 처리하여 DNA를 순화하였고, 이 과정을 통해 휴믹산 (humic acid) 등을 제거하였다. 순화된 DNA 조각의 양끝 말단을 DNA 말단-리페어 (end-repair) 효소로 처리하여 무딘 말단 (blunt end)을 갖는 20 kb 이상의 메타게놈 DNA를 얻었고, 이를 제한효소 Eco72I로 처리한 포스미드 벡터 pEpiFOS-5 (Epicentre, USA)에 라이게이션하고 라이게이션 혼합물을 상업적인 패키징 시스템 (packagene extract, Epicentre. USA)을 이용하여 E. coli에 도입한 후 50 ㎍/㎖ 의 클로람페니콜 (chloramphenicol)이 첨가된 LB 한천배지에서 자라는 형질전환체 들을 선별하였다. 선별된 형질전환체들로부터 SDS-알칼리 용혈 (alkali lysis) 방법으로 분리한 플라스미드 DNA를 제한효소 BamHI으로 절단한 후 전기영동을 수행한 결과, 선별된 80개의 형질전환체들 모두 재조합 플라스미드를 포함하고 있는 것으로 확인되어 라이브러리가 잘 작성되었음을 확인하였다. 삽입된 메타게놈 DNA의 평균 크기는 35 kb 이상이었다. The metagenome extracted from the soil sample in Example 1 was subjected to electrophoresis on a low melting point agarose gel, and only agarose gel blocks containing 20 kb or more of DNA were recovered. The recovered gel block was treated with gelase (GeLase, Epicentre, USA) to purify DNA, and in this process, humic acid was removed. Both ends of the purified DNA fragment were treated with DNA end-repair enzymes to obtain more than 20 kb of metagenome DNA with blunt ends, which were treated with the restriction enzyme Eco 72I. LB agar ligated to -5 (Epicentre, USA) and ligation mixtures were introduced into E. coli using a commercial packaging system (packagene extract, Epicentre. USA) and added 50 μg / ml of chloramphenicol Transformants growing in the medium were selected. Plasmid DNA isolated from the selected transformants by SDS-alkali lysis was digested with restriction enzyme Bam HI and subjected to electrophoresis. As a result, all 80 transformants selected contained recombinant plasmids. It was confirmed that the library was well written. The average size of the inserted metagenome DNA was at least 35 kb.
이렇게 작성된 메타게놈 라이브러리로부터 리파제 활성을 나타내는 클론을 선별하기 위하여, LB 배지에 1％의 트라이뷰티린 (tributyrin)을 첨가하여 유화한 후 각 클론들을 상기 배지에 도말하였다. 이를 37℃에서 2일간 배양하여 콜로니 주위에 투명한 후광 (halo)을 보이는 콜로니를 선발하였다. 선발된 활성 클론의 리파제 활성을 상기 방법에 의해 재검정하여 최종적으로 8종을 분리하였고, 이들을 -80℃에 보관하였다. In order to select clones showing lipase activity from the metagenome library thus prepared, 1% tributyrin (tributyrin) was added to LB medium to emulsify, and then each clone was plated on the medium. This was incubated at 37 ° C. for 2 days to select colonies showing a halo around the colonies. The lipase activity of the selected active clones was retested by the above method to finally isolate 8 species and stored them at -80 ° C.
<실시예 3> 리파제 활성 유전자 부위 결정 및 염기서열 결정Example 3 Lipase Activation Gene Site Determination and Base Sequence Determination
토양으로부터 분리된 메타게놈에서 리파제 활성 유전자 부위를 결정하기 위하여, 리파제 활성을 보이는 8개의 클론중에서 우수한 활성을 보이는 pELP18으로부터 플라스미드 DNA를 대량으로 분리하였고, 플라스미드 DNA를 제한효소 BfuCI으로 부분 절단하여 DNA 크기를 2 내지 5 kb로 만들었다. 상기 DNA 절편들을 BamHI으로 절단한 pUC119 (Vieira and Messing, Methods Enzymol. 153: 3-11, 1987)에 라이게이션하여 2차 숏건 라이브러리 (shot gun library)를 작성하였다. 작성된 라이브러리를 암피실린 (ampicillin)과 트라이뷰티린이 첨가된 LB 배지에 도말하고 37℃ 에서 2일간 배양하여 리파제 활성 서브클론을 분리하였다. 분리한 활성 서브클론중 삽입 DNA가 가장 작은 서브클론을 선발하고 염기서열을 결정하여 서브클론을 pELP182로 명명하였다. In order to determine lipase active gene sites in metagenome isolated from soil, plasmid DNA was isolated in large quantities from pELP18 showing excellent activity among eight clones showing lipase activity, and the plasmid DNA was partially digested with restriction enzyme Bfu CI. The size was made from 2 to 5 kb. The DNA fragments were ligated to pUC119 (Vieira and Messing, Methods Enzymol . 153: 3-11, 1987) digested with Bam HI to prepare a secondary shot gun library. The prepared library was plated in LB medium supplemented with ampicillin and tributyrin and incubated at 37 ° C. for 2 days to separate lipase active subclone. Among cloned active subclones, the smallest subclonal DNA was selected and the nucleotide sequence was determined to name the subclonal pELP182.
서브클론에 삽입된 DNA의 염기서열 중 리파제 활성부위를 결정하기 위하여, in vitro 트랜스포존 삽입변이 (insertional mutagenesis)를 유발한 후 염기서열 분석을 통해 리파제 단백질을 코딩하는 유전자를 분석하였다. 트랜스포존 삽입변이는 전이효소 (transposase)와 GPS3 트랜스포존을 함유하는 pGPS3 (New England Biolabs)을 이용하여 제조사의 지침에 따라 수행하였다. 이로부터 BamHI, HindIII, EcoRI 및 EcoRV 절단 다형성을 평가하여 서로 다른 부위에 트랜스포존이 삽입된 변이체들을 분리하였고, 이들의 리파제 활성을 재검정하여 활성을 상실한 변이체를 다수 선별하였다. In order to determine the base sequence of the lipase active sites of the DNA inserts in subclones analyzed the gene was induced in vitro transposon insertion mutant (insertional mutagenesis) with the nucleotide sequence encoding the lipase protein analysis. Transposon insertion mutations were performed according to the manufacturer's instructions using pGPS3 (New England Biolabs) containing a transposase and a GPS3 transposon. From this, Bam HI, Hind III, Eco RI and Eco RV cleavage polymorphisms were evaluated to isolate variants in which transposons were inserted at different sites, and their lipase activity was re-assayed to select a large number of variants that lost activity.
리파제 활성을 상실한 변이체들의 트랜스포존 삽입부위의 DNA 염기서열을 결정하기 위하여, GPS3 트랜스포존의 염기서열에 기초하여 제작된 서열번호: 1 및 2의 프라이머 N과 S (New England Biolabs)를 사용하고 (주)제노텍에서 자동염기서열 분석기 ABI3700을 이용하여 염기서열을 분석하였다. 그 결과, 리파제 활성을 가지는 서브클론이 서열번호: 3으로 기재되는 1,866 bp의 염기서열을 가짐을 확인하였고, 상기 염기서열을 포함하는 서브클론을 pELP182로 명명하였다. 리파제 활성을 상실한 변이체들의 트랜스포존 삽입부위가 서열번호: 3의 1,866 bp 부위에서도 코딩부위인 951 bp 와 1856 bp 사이에 위치하여 리파제 활성 부위가 확인되었다. 서열번호: 3의 염기서열을 갖는 리파제 활성 유전자를 기존에 보고된 리파제 유전자 집단과 비교한 결과, 32∼46％ 정도의 낮은 상동성을 보여 리파제를 암호화하는 신규한 유전자로서 확인되었다. 토양 메타게놈으로부터 분리한 리파제 활성을 나타내는 서열번호: 3의 유전자는 2004년 5월 1일자로 GenBank에 등재되었고 (등재번호 제AY496581호), 상기 염기서열로부터 코딩되는 서열번호: 4의 311개 아미노산 서열로 구성된 리파제 단백질을 리파제 ELP182로 명명하였다. In order to determine the DNA sequence of the transposon insertion site of the variants that lost lipase activity, primers N and S (New England Biolabs) of SEQ ID NOs: 1 and 2 prepared based on the base sequence of the GPS3 transposon were used. The genome was analyzed by Genotech's automatic base sequence analyzer ABI3700. As a result, it was confirmed that the subclone having lipase activity had a nucleotide sequence of 1,866 bp described as SEQ ID NO: 3 , and the subclone containing the nucleotide sequence was named pELP182. The transposon insertion sites of the variants that lost lipase activity were located between the coding sites 951 bp and 1856 bp even at the 1,866 bp site of SEQ ID NO: 3 , thereby confirming the lipase activity site. Comparing the lipase active gene having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 with the previously reported lipase gene population, it was identified as a novel gene encoding lipase with low homology of about 32 to 46%. The gene of SEQ ID NO: 3 showing lipase activity isolated from soil metagenome was listed on GenBank as of May 1, 2004 (registration no. AY496581), and 311 amino acids of SEQ ID NO: 4 encoded from the base sequence The lipase protein consisting of the sequence was named lipase ELP182.
<실시예 4> 리파제 활성 유전자 부위를 포함하는 형질전환체의 제조Example 4 Preparation of a Transformant Comprising a Lipase Active Gene Site
상기 서브클론 pEPL182를 콤피턴트 대장균 세포 DH5α 50 ㎕와 혼합한 후 얼음에서 20분간 정치시키고, 42℃에서 45초간 열처리하여 서브클론을 콤피턴트 세포내로 도입한 후, LB 배지 400 ㎕를 가하여 37℃에서 45분 동안 배양하였다. 이로부터 형질전환체를 선별하기 위하여 1％의 트라이뷰티린과 암피실린이 100 ㎍/㎖ 함유된 LB 플레이트에 도말하여 37℃에서 16시간 배양하였다. 배양된 플레이트로부터 트라이뷰티린을 가수분해하여 강한 후광을 보이는 콜로니들을 선별하고 pELP182 도입여부를 플라스미드 분리 키트 ( Qiagen)를 이용하여 플라스미드 DNA를 분리하고 제한효소 BamHI EcoRI, HindIII, PstI 및 SmaI의 절단양상을 판별하여 확인하였다. 이와 같이 강한 리파제 활성을 유지하는 pELP182를 함유한 대장균 DH5α 세포를 글리세롤 스톡으로 -80℃에 보관하면서 리파제 단백질 실험에 이용하였다. After mixing the subclonal pEPL182 with 50 μl of competent Escherichia coli cell DH5α, it was left standing on ice for 20 minutes, and heat-treated at 42 ° C. for 45 seconds to introduce the sub clone into the competent cells, and then 400 μl of LB medium was added thereto at 37 ° C. Incubate for 45 minutes. In order to select transformants therefrom, LB plates containing 100 µg / ml of 1% tributyrin and ampicillin were plated and incubated at 37 ° C for 16 hours. Hydrolysates tributyrin from the cultured plates to select colonies showing strong halo, and plasmid DNA was isolated using plasmid separation kit (Qiagen) for pELP182 introduction and restriction enzymes Bam HI Eco RI, Hin dIII, Pst I and The cleavage pattern of Sma I was discriminated and confirmed. E. coli DH5α cells containing pELP182 maintaining such strong lipase activity were used for lipase protein experiments while stored at −80 ° C. with glycerol stock.
<실시예 5> 리파제 활성 측정Example 5 Lipase Activity Measurement
신규한 리파제 단백질을 코딩하는 서브클론 pELP182를 포함하는 대장균 형질 전환체를 LB 액체배지에 2일간 현탁 배양하였다. 배양액을 14,000 rpm에서 원심분리하여 상등액만을 분리한 후 다시 막 여과를 거쳐 균체가 제거된 배양액을 확보하였다. 상기 배양액은 농축하지 않은 상태로, 상기에서 분리된 대장균체는 10배로 농축한 후 12％ SDS-PAGE 전기영동을 통해 단백질의 발현을 분석하였다. 그 결과, 도 1에 나타난 바와 같이, 예상되는 크기의 33 kDa 단백질이 pUC119 벡터만 가진 대장균에 비해 강하게 발현되었고 배지로도 잘 분비됨을 확인하였다 E. coli transformants comprising subclonal pELP182 encoding novel lipase protein were suspended in LB liquid medium for 2 days. The culture solution was centrifuged at 14,000 rpm to separate only the supernatant, followed by membrane filtration to obtain a culture medium from which the cells were removed. The culture medium was not concentrated, and the isolated E. coli cells were concentrated 10-fold and analyzed for protein expression by 12% SDS-PAGE electrophoresis. As a result, as shown in Figure 1 , 33 kDa protein of the expected size was confirmed to be strongly expressed compared to Escherichia coli with only pUC119 vector and well secreted into the medium.
또한, 상기 대장균 형질전환체로부터 발현된 단백질의 리파제 활성을 p-나이트로페닐 뷰티레이트 (nitrophenyl butyrate)를 이용하여 검정하였다. 먼저, 대장균 형질전환체를 LB 액체배지에 접종하고 37℃에서 1일간 배양한 후 원심분리하여 상등액을 분리하였다. 2 mM의 p-나이트로페닐 뷰티레이트를 포함하는 기질용액 0.1 ㎖을 1.8 ㎖의 0.1 M 인산 완충용액 (pH 7.25)과 혼합한 후 상기에서 분리된 상등액에 0.1 ㎖ 첨가하여 상온에서 매 분당 반응의 진행을 분광학적으로 모니터링 하였다. 리파제 활성은 반응 생성물인 p-나이트로페놀 (nitrophenol)을 400 ㎚에서 분광학적으로 정량하여 결정하였고, 그 결과를 하기 표 1에 나타내었다. 효소 활성 1 단위 (unit, U)는 1분당 1 μmole의 p-나이트로페놀을 생성하는 데 필요한 효소의 활성으로 정의하였다. In addition, lipase activity of the protein expressed from the E. coli transformants was assayed using p-nitrophenyl butyrate. First, E. coli transformants were inoculated in LB liquid medium, incubated at 37 ° C. for 1 day, and centrifuged to separate supernatants. 0.1 ml of the substrate solution containing 2 mM p-nitrophenyl butyrate was mixed with 1.8 ml of 0.1 M phosphate buffer (pH 7.25), and 0.1 ml was added to the supernatant separated from the above to react each minute at room temperature. Progress was monitored spectroscopically. Lipase activity was determined by spectroscopically quantifying the reaction product p-nitrophenol at 400 nm, the results are shown in Table 1 below. One unit of enzyme activity (unit, U) was defined as the activity of the enzyme required to produce 1 μmole of p-nitrophenol per minute.
그 결과, pUC119 벡터만 포함하는 대장균은 리파제 활성을 전혀 나타내지 않 은 반면, 본 발명의 리파제 ELP182 서브클론으로 형질전환된 대장균은 강한 리파제 활성을 나타내었다. 이로부터 토양 메타게놈에서 분리한 리파제 유전자가 대장균 형질전환체에서 발현되고 배지로 분비되어 우수한 리파제 활성을 나타냄을 확인하였다.As a result, E. coli, which contains only the pUC119 vector, showed no lipase activity, whereas E. coli transformed with the lipase ELP182 subclone of the present invention showed strong lipase activity. From this, it was confirmed that the lipase gene isolated from the soil metagenome was expressed in E. coli transformants and secreted into the medium to exhibit excellent lipase activity.
<실시예 6> 리파제 ELP182의 광학선택적 반응 특이성Example 6 Optical Selective Response Specificity of Lipase ELP182
본 발명에 따라 토양 메타게놈으로부터 분리된 서열번호: 2의 리파제 활성 유전자로부터 코딩된 리파제 단백질 ELP182가 광학 선택적인 가수분해 반응에서 키랄 선택성을 갖는지를 다음과 같이 조사하였다. The lipase protein ELP182, encoded from the lipase active gene of SEQ ID NO: 2 isolated from soil metagenome according to the present invention, was examined as follows for chiral selectivity in the optical selective hydrolysis reaction.
먼저, 키랄 유기산 에스터인 라세믹 에틸 2-브로모 프로피오네이트 (ethyl 2-bromo propionate) 54 ㎎을 헥산 3 ㎖에 용해시켜 기질용액을 준비하였다. 효소액은 리파제 서브클론 pEPL182를 포함하는 대장균을 LB 액체배지에서 배양한 후 균체를 제거하여 얻은 배양액을 사용하였고, 상기 효소액 2 ㎖을 완충용액 (pH 7.0, Aldrich) 2 ㎖과 함께 상기 기질용액에 가하고 상온에서 24시간 동안 교반하였다. 이때, 이용한 리파제 ELP182를 포함하는 배양액에서 리파제의 농도는 8 ㎍/㎖으로 결정되었다. First, 54 mg of racemic ethyl 2-bromo propionate, a chiral organic acid ester, was dissolved in 3 ml of hexane to prepare a substrate solution. The enzyme solution was obtained by culturing Escherichia coli containing lipase subclonal pEPL182 in LB liquid medium and removing the cells. Stir at room temperature for 24 hours. At this time, the concentration of the lipase in the culture medium containing the lipase ELP182 used was determined to be 8 μg / ml.
광학선택성의 반응 여부는 키랄 컬럼으로 시클로실-B (Ψ=0.25 ㎜, 30 m, 애질런트사)를 사용하는 가스 크로마토그래피로 확인하였다. 이때, 컬럼은 초기 온도를 80℃에서 5분간 유지한 후 5 ℃/분의 속도로 200℃까지 상승시켜 5분간 유지하였다. 음성 대조군으로는 기질 용액에 리파제 효소액을 첨가하지 않은 것을 사 용하였고, 양성 대조군으로는 기존에 광학이성질체의 가수분해 활성을 갖는 것으로 알려진 칸디다 안타르티카 (Candida antartica) 유래 리파제 (노보디스크사), 리조무코 미헤이 (Rhizomucor miehei) 유래 리파제 (노보디스크사) 및 칸디다 루고사 (Candida rugosa) 유래 리파제 (시그마사)를 0.5 ㎎/㎖ 농도로 사용하였다. The reaction of optical selectivity was confirmed by gas chromatography using cyclosyl-B (Ψ = 0.25 mm, 30 m, Agilent) as a chiral column. At this time, the column was maintained at 80 ° C. for 5 minutes and then raised to 200 ° C. at a rate of 5 ° C./min for 5 minutes. As a negative control, a lipase enzyme solution was not added to the substrate solution, and as a positive control, Candida antartica- derived lipase ( Novodisk ), which is known to have hydrolytic activity of the optical isomer, Lipases derived from Rhizomucor miehei ( Novodisk Corporation) and Candida rugosa derived Lipase (Sigma Corporation) were used at a concentration of 0.5 mg / ml.
상기 표 2에 나타난 바와 같이, 기존에 상업적인 리파제들이 키랄 선택성 없이 R-형 및 S-형 에틸 2-브로모 프로피오네이트 이성질체 모두를 에틸 2-브로모 프로피온산으로 가수분해한 반면, 본 발명의 리파제 ELP182는 S-형 에틸 2-브로모 프로피오네이트에는 반응하지 않고 R-형 에틸 2-브로모 프로피오네이트에만 선택적으로 작용하여 이를 R-형 에칠 2-브로모 프로피온산으로 효율적으로 가수분해함을 알 수 있다. As shown in Table 2 above, while conventional lipases hydrolyzed both R- and S-type ethyl 2-bromo propionate isomers with ethyl 2-bromo propionic acid without chiral selectivity, the lipase of the present invention ELP182 does not react with S-type ethyl 2-bromo propionate but selectively acts only on R-type ethyl 2-bromo propionate to efficiently hydrolyze it to R-type ethyl 2-bromo propionic acid. Able to know.
상기에서 전술한 바와 같이, 본 발명의 토양 메타게놈 유래 리파제 단백질은 우수한 광학선택성을 갖고 R-형 이성질체만을 특이적으로 가수분해하여 분할함으로써 라세믹 에틸 2-브로모 프로피오네이트로부터 약리활성을 갖는 단일의 이성질체 를 효과적으로 생산할 수 있다. As described above, the soil metagenomic derived lipase protein of the present invention has excellent optical selectivity and has pharmacological activity from racemic ethyl 2-bromo propionate by specifically hydrolyzing and cleaving only the R-type isomer. Single isomers can be effectively produced.
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|---|---|---|---|---|
| KR102026836B1 (en) * | 2018-09-12 | 2019-09-30 | 한국화학연구원 | Novel lipase gene Lip-1420 derived from soil metagenome and use thereof |
| KR102088811B1 (en) * | 2018-11-12 | 2020-03-16 | 한국화학연구원 | Novel alkaline lipase/esterase gene Lip-1447 derived from soil metagenome and use thereof |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4601987A (en) * | 1985-02-27 | 1986-07-22 | Massachusetts Institute Of Technology | Enzymatic production of optical isomers of 2-halopropionic acids |
| US4668628A (en) * | 1985-04-01 | 1987-05-26 | Stauffer Chemical Company | Resolution of racemic mixtures of aliphatic acid esters |
| US5753495A (en) * | 1993-08-23 | 1998-05-19 | Basf Aktiengesellschaft | Process for the preparation of (L)-2-chloropropionic acid and its salts using lipase from pseudomonas |
-
2004
- 2004-09-07 KR KR1020040071131A patent/KR100613691B1/en not_active IP Right Cessation
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4601987A (en) * | 1985-02-27 | 1986-07-22 | Massachusetts Institute Of Technology | Enzymatic production of optical isomers of 2-halopropionic acids |
| US4668628A (en) * | 1985-04-01 | 1987-05-26 | Stauffer Chemical Company | Resolution of racemic mixtures of aliphatic acid esters |
| US5753495A (en) * | 1993-08-23 | 1998-05-19 | Basf Aktiengesellschaft | Process for the preparation of (L)-2-chloropropionic acid and its salts using lipase from pseudomonas |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
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Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR100860083B1 (en) | 2007-03-30 | 2008-09-24 | 한국생명공학연구원 | Novel gene encoding lipase from tidal flat metagenome and a lipase protein encoded by it |
| KR101293757B1 (en) | 2011-11-07 | 2013-08-07 | 대한민국 | Novel lipase ES2-1 from Dokdo marine sediment and its usage |
| KR101403540B1 (en) | 2012-10-29 | 2014-06-03 | 대한민국 | Novel lipase ES2-2 from Dokdo deep-sea sediment and its usage for the hydrolysis of oil compounds thereof |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR20060022339A (en) | 2006-03-10 |
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