KR100986161B1 - Novel gene encoding esterase derived from tidal flat metagenome and preparation method thereof - Google Patents
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Abstract
본 발명은 갯벌 메타게놈 유래 신규 에스터라제(esterase) 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 본 발명의 방법에 의해 생산된 신규 에스터라제는 수용성 형태로 발현되므로 대량생산이 가능하고, 높은 온도에서 활성을 유지하며 우수한 에스터라제 활성을 나타냄으로써 다양한 산업에 응용될 수 있다.The present invention relates to a novel esterase derived from a mudflat metagenome and a method for preparing the same, and the novel esterase produced by the method of the present invention is expressed in a water-soluble form, which enables mass production, and is active at high temperatures. It can be applied to various industries by maintaining good esterase activity.
메타게놈, 에스터라제 Metagenome, Esterase
Description
본 발명은 갯벌 메타게놈 유래 신규 에스터라제(esterase) 및 이의 제조방법에 관한 것이다.The present invention relates to a novel esterase derived from a mudflat metagenome and a method for preparing the same.
에스터라제(esterase)는 트리글리세라이드(triglyceride)의 에스터(ester) 결합을 가수분해하는 효소로, 주로 이화과정에서 에스터 결합을 가수분해하게 되는데, pH 5 ~ 8 및 30 ~ 37℃의 온도 조건에서 가장 우수한 활성을 갖으며, 그 분해산물로는 산(무기산도 포함)과 알콜(alcohol)류 또는 페놀(phenol)류(-OH 화합물) 및 티올(thiol)류 등이 있다. 에스터라제는 에스터 결합의 분해나 합성 반응에서 테트라하이드로이소퀴놀린(tetrahydroisoquinoline), 아자비싸이클로노난(azabicyclononane), 인돌마이신(indolemycine)과 같은 생리활성물질의 광학 합성에 유용하게 이용될 수 있다. 특히, 높은 기질 특이성 및 광학활성 특이성 등의 고유한 특성에 의해 폭넓게 이용되는 주요한 효소이다.Esterase is an enzyme that hydrolyzes the ester bonds of triglycerides, and mainly hydrolyzes the ester bonds during catabolism, at pH 5-8 and 30-37 ° C. It has the best activity, and its decomposition products include acids (including inorganic acids), alcohols (alcohols) or phenols (-phenols) (-OH compounds) and thiols (thiol). Esterase may be useful for optical synthesis of bioactive substances such as tetrahydroisoquinoline, azabicyclononane, and indolemycine in the decomposition or synthesis reaction of ester bonds. In particular, it is a major enzyme widely used by its unique properties such as high substrate specificity and optical activity specificity.
상기 에스터라제를 포함한 신규 효소를 발굴하고자 하는 노력은 주로 배양이 가능한 미생물을 대상으로 이루어졌고, 이로부터 밝혀진 다양한 미생물 효소들이 산업적으로 이용되고 있다. 그러나 최근 많은 분자미생물 생태학의 연구들은 자연계에 존재하는 99%이상의 미생물들이 실험실에서 행해지는 전통적인 배양기법을 통해서는 분리 동정되지 않는다는 사실을 증명하였다(Amann et al ., Microbiol . Rev. 59: 143-169, 1995; Hugenholtz and Pace, Trends Biotechnol. 14: 190-197, 1996; Ward et al ., Nature 345: 63-65, 1990). 그에 따라 자연계로부터 배양 없이 직접적으로 추출한 모든 미생물의 유전체인 메타게놈(metagenome)을 이용하여 라이브러리를 만들어 그동안 배양되지 않아서 이용하지 못했던 많은 신규 유전자들을 발굴하고 그 유용 산물을 확보하고자 하는 새로운 연구가 진행되고 있다.Efforts to discover new enzymes, including the esterases were made mainly for microorganisms that can be cultured, and various microbial enzymes found therefrom have been industrially used. However, many recent studies of molecular microbial ecology have demonstrated that more than 99% of the microorganisms in nature are not isolated and identified through traditional culture techniques performed in laboratories (Amann et al. al . , Microbiol . Rev. 59: 143-169, 1995; Hugenholtz and Pace, Trends Biotechnol . 14: 190-197, 1996; Ward et al . , Nature 345: 63-65, 1990). As a result, a new study is underway to create a library using metagenome, a genome of all microorganisms extracted directly from the natural world without culture, and to discover many new genes that have not been used since then, and to secure useful products. have.
메타게놈은 자연계에 존재하는 모든 미생물의 유전체를 통칭하는 것으로 정의된다. 일반적으로, 메타게놈 연구는 자연계 시료로부터 미생물을 배양하지 않고 메타게놈을 분리한 후, 이들을 라이브러리로 작성하여 배양가능한 대장균에 도입하는 단계로 구성된다. 이는 배양이 불가능했던 미생물로부터 유용 산물을 확보하기 위한 방법으로, 확보한 유전자의 유래가 되는 미생물에 대한 정보를 얻기는 어려우나 미생물의 산물과 유전자를 동시에 확보할 수 있는 장점이 있다. 미국 위스콘신 대학 연구팀은 처음으로 대형의 메타게놈을 성공적으로 분리하여 BAC(bacterial artificial chromosome) 벡터에 클로닝하여 메타게놈 라이브러리를 구축하였고, 이로부터 광범위한 항생물질 및 그의 생합성에 관련된 유전자들을 분리하였다(Gillespie et al ., Appl . Environ . Microbiol . 68: 4301-4306, 2002; Rondon et al., Appl . Environ . Microbiol . 66: 2541-2547, 2000). TIGR(The Institute for Genomic Research) 연구팀에서도 해양 미생물의 총 미생물 메타게놈 라이브러리를 BAC 벡터에 구축하여 해양 생태계로부터 배양되지 않는 미생물의 유전자원 탐색을 시도하고 있다.Metagenome is defined as the genome of all microorganisms in nature. In general, metagenomic studies consist of separating metagenomes from natural samples without culturing microorganisms, and then preparing them into libraries and introducing them into cultivable Escherichia coli. This is a method for securing useful products from microorganisms that cannot be cultured, but it is difficult to obtain information on the microorganisms from which the obtained genes are derived, but there is an advantage of simultaneously obtaining the products and genes of the microorganisms. The University of Wisconsin, USA, for the first time, has successfully isolated large-scale metagenomes and cloned them into bacterial artificial chromosome (BAC) vectors to build a metagenome library from which it has isolated a wide range of antibiotics and genes involved in their biosynthesis (Gillespie et. al . , Appl . Environ . Microbiol . 68: 4301-4306, 2002; Rondon et al. , Appl . Environ . Microbiol . 66: 2541-2547, 2000). The Institute for Genomic Research (TIGR) team is also building a total microbial metagenomic library of marine microorganisms in BAC vectors to explore the genetic resources of microorganisms that are not cultured from marine ecosystems.
이에 본 발명자들은 다양한 미생물이 존재하는 갯벌의 메타게놈 라이브러리로부터 신규 에스터라제 유전자를 분리하여 상기 유전자를 포함하는 벡터를 제작하고, 상기 벡터를 대장균에 형질전환한 후 상기 형질전환체로부터 생산된 단백질이 우수한 에스터라제 활성을 나타내며, 또한 수용성 형태로 효과적으로 발현됨을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.Accordingly, the present inventors isolated a new esterase gene from a metagenomic library of tidal flats in which various microorganisms exist, to produce a vector including the gene, and transform the vector into E. coli, and then, a protein produced from the transformant. The present invention was completed by confirming this excellent esterase activity and effectively expressing in water-soluble form.
본 발명의 목적은 우수한 활성을 나타내는 신규 에스터라제(esterase) 및 이의 변이체 또는 이의 활성 단편 및 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공하는 것이다.It is an object of the present invention to provide novel esterases and variants thereof or active fragments thereof and polynucleotides encoding them which exhibit good activity.
본 발명의 다른 목적은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 발현벡터를 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a recombinant expression vector comprising the polynucleotide.
본 발명의 다른 목적은 상기 재조합 발현벡터가 형질 도입된 형질전환체를 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a transformant transformed with the recombinant expression vector.
본 발명의 다른 목적은 재조합 에스터라제의 제조방법을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a method for preparing a recombinant esterase.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 더욱 명확하게 된다.Other objects and advantages of the present invention will become apparent from the following detailed description, claims and drawings.
상기와 같은 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 에스터라제(esterase) 활성을 갖는 하기 a 내지 c 중 어느 하나의 폴리펩티드 또는 상기 폴리펩티드의 변이체 또는 이의 활성 단편 및 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다:In order to achieve the above object, the present invention provides a polypeptide of any one of the following a to c or a variant or an active fragment thereof having an esterase activity and a polynucleotide encoding the same:
a) 서열번호 1로 기재되는 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화되는 폴리펩티드;a) a polypeptide encoded by a polynucleotide set forth in SEQ ID NO: 1;
b) 서열번호 1의 폴리뉴클레오티드와 엄격한 조건에서 혼성되는 폴리뉴클레 오티드에 의해 암호화되는 폴리펩티드; 및,b) a polypeptide encoded by a polynucleotide which hybridizes under stringent conditions with the polynucleotide of SEQ ID NO: 1; And,
c) 서열번호 2로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드.c) a polypeptide having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2.
또한, 본 발명은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 발현벡터를 제공한다.The present invention also provides a recombinant expression vector comprising the polynucleotide.
또한, 본 발명은 상기 재조합 발현벡터가 숙주세포에 형질 도입된 형질전환체를 제공한다.The present invention also provides a transformant in which the recombinant expression vector is transfected into a host cell.
아울러, 1) 상기 에스터라제 및 이의 변이체 또는 이의 활성 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 발현벡터를 제조하는 단계;In addition, 1) preparing a recombinant expression vector comprising a polynucleotide encoding the esterase and its variants or active fragments thereof;
2) 상기 재조합 발현벡터를 숙주세포에 도입하여 형질전환체를 제조하는 단계; 및,2) preparing a transformant by introducing the recombinant expression vector into a host cell; And,
3) 상기 형질전환체를 배양하여 재조합 단백질의 발현을 유도하고 이를 수득하는 단계로 구성되는 재조합 에스터라제의 제조방법을 제공한다.3) culturing the transformant to induce the expression of a recombinant protein and to provide a method for producing a recombinant esterase consisting of the same.
이하, 본 발명에서 사용한 용어를 설명한다.Hereinafter, the term used by this invention is demonstrated.
본 발명에서 "재조합 발현벡터"란 적당한 숙주세포에서 목적 단백질 또는 목적 RNA을 발현할 수 있는 벡터로서, 발현벡터의 전사에 제공되는 추가단편에 작동가능하게 연결된 관심의 폴리펩티드를 암호화하는 단편으로 구성되는 선형 또는 원형의 DNA 분자이다. 그와 같은 추가단편은 프로모터 및 종료암호 서열을 포함한다. 발현벡터는 하나 이상의 복제 개시점, 하나 이상의 선택마커, 폴리아데닐화 신호 등을 또한 포함한다. 발현벡터는 일반적으로 플라스미드 또는 바이러스 DNA로부터 유도되거나, 또는 둘 다의 요소를 함유한다.In the present invention, a "recombinant expression vector" is a vector capable of expressing a target protein or RNA of interest in a suitable host cell, and is composed of a fragment encoding a polypeptide of interest operably linked to an additional fragment provided for transcription of the expression vector. It is a linear or circular DNA molecule. Such additional fragments include promoter and termination code sequences. Expression vectors also include one or more replication initiation points, one or more selection markers, polyadenylation signals, and the like. Expression vectors are generally derived from plasmid or viral DNA, or contain elements of both.
본 발명에서 "작동가능하게 연결된(operably linked)"이란 일반적인 기능을 수행하도록 핵산 발현조절 서열과 목적하는 단백질 또는 RNA를 코딩하는 핵산서열이 기능적으로 연결(functional linkage)되어 있는 것을 말한다. 예를 들어 프로모터와 단백질 또는 RNA를 코딩하는 핵산 서열이 작동가능하게 연결되어 코딩하는 핵산 서열의 발현에 영향을 미칠 수 있다. 재조합 벡터와의 작동적 연결은 당해 기술분야에서 잘 알려진 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당해 기술 분야에서 일반적으로 알려진 효소 등을 사용한다.In the present invention, "operably linked" refers to a functional linkage of a nucleic acid expression control sequence and a nucleic acid sequence encoding a protein or RNA of interest to perform a general function. For example, a promoter and a nucleic acid sequence encoding a protein or RNA may be operably linked to affect expression of the nucleic acid sequence encoding. Operational linkage with recombinant vectors can be prepared using genetic recombination techniques well known in the art, and site-specific DNA cleavage and ligation uses enzymes commonly known in the art and the like.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail.
본 발명은 에스터라제(esterase) 활성을 갖는 하기 a 내지 c 중 어느 하나의 폴리펩티드 또는 상기 폴리펩티드의 변이체 또는 이의 활성 단편 및 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다:The present invention provides a polypeptide of any one of the following a or c, or a variant or active fragment thereof, having an esterase activity and a polynucleotide encoding the same:
a) 서열번호 1로 기재되는 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화되는 폴리펩티드;a) a polypeptide encoded by a polynucleotide set forth in SEQ ID NO: 1;
b) 서열번호 1의 폴리뉴클레오티드와 엄격한 조건에서 혼성되는 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화되는 폴리펩티드; 및,b) a polypeptide encoded by a polynucleotide which hybridizes under stringent conditions with the polynucleotide of SEQ ID NO: 1; And,
c) 서열번호 2로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드.c) a polypeptide having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2.
본 발명의 구체적인 실시예에서는 우수한 활성을 나타내는 신규 에스터라제의 발굴을 위해, 배양이 불가능한 미생물을 포함하는 갯벌 토양 샘플로부터 DNA를 추출하여 제작한 메타게놈 라이브러리를 대상으로 트리뷰티린(tributyrin)을 효과적으로 분해하는 우수한 에스터라제 활성을 나타내는 콜로니를 탐색하였다. 상기 콜로니의 재조합 플라스미드를 분리하여 염기서열 분석한 결과, 서열번호 2로 기재되는 339개 아미노산[GenPept 등록번호 ACB11219(1,020개의 염기; 서열번호 1, GenBank 등록번호 EU515238)]으로 이루어지며 분자량이 약 37 kDa으로 예측되는 에스터라제의 ORF(open reading frame)를 찾을 수 있었다(도 1 참조). 상기 에스터라제의 아미노산 서열을 BLAST 프로그램을 이용하여 GenBank 및 SWISSPROT에 있는 아미노산 서열과 비교 분석한 결과, 자이렐라 파스티디오사 9a5c(Xylella fastidiosa 9a5c)와 가장 높은 유사성을 나타내었으며, 이전에 보고된 에스터라제 유전자 집단과 37~48% 정도의 낮은 상동성을 보여 에스터라제를 암호화하는 신규한 유전자로서 확인되었다(표 1 및 도 3 참조). 또한, 본 발명의 에스터라제는 글리신-X-세린-X-글리신(Gly-X-Ser-X-Gly)의 공통서열(consensus sequence) 내의 186번째 세린잔기(Ser)와 283번째 아스파라긴산(Asp), 313번째 히스티딘(His)으로 이루어진 에스터라제에 보존되는 특이적 세작용기 촉매(catalytic triad)를 갖고 있었다(도 2 참조).In a specific embodiment of the present invention, to discover novel esterases exhibiting excellent activity, tributyrin is used in a metagenomic library prepared by extracting DNA from a mud flat soil sample containing microorganisms that cannot be cultured. Colonies that exhibited good esterase activity that effectively degraded were searched for. The recombinant plasmid of the colony was isolated and subjected to sequencing. 339 amino acids (GenPept Accession No. ACB11219 (1,020 bases; SEQ ID NO: 1, GenBank Accession No. EU515238)) as set forth in SEQ ID NO: 2 and a molecular weight of about 37 An open reading frame (ORF) of the esterase predicted by kDa was found (see FIG. 1). The amino acid sequence of the esterase was compared with the amino acid sequence in GenBank and SWISSPROT using the BLAST program, and showed the highest similarity with Xylella fastidiosa 9a5c. It was identified as a novel gene encoding the esterase, showing a low homology of 37-48% with the esterase gene population (see Table 1 and FIG. 3). In addition, the esterase of the present invention is the 186th serine residue (Ser) and the 283th aspartic acid (Asp) in the consensus sequence of Gly-X-Ser-X-Glycine (Gly-X-Ser-X-Gly). ), It had a specific catalytic triad preserved in the esterase consisting of 313th histidine (His) (see FIG. 2).
본 발명의 구체적인 실시예에서는 상기 서열번호 2로 기재되는 신규 에스터라제의 활성을 측정하고자, 우선, 상기 신규 에스터라제를 암호화하는 서열번호 1의 에스터라제 유전자를 벡터에 클로닝하고(도 4 참조), 상기 벡터를 대장균에 형 질전환시킨 후, 상기 형질전환체로부터 생산된 에스터라제를 정제하였다. 상기 정제된 본 발명의 에스터라제를 SDS-PAGE 방법으로 확인함으로써 분자량이 약 37 kDa으로 효과적으로 생산되었음을 알 수 있었으며, 본 발명의 에스터라제는 수용성 형태로 발현이 이루어지고 있음을 확인할 수 있었다(도 5 참조). 이와 같이, 본 발명의 갯벌 메타게놈 유래 에스터라제는 우수한 활성을 나타내고 생산이 용이하므로, 상기 에스터라제 단백질은 유지의 전환뿐만 아니라 생물의학과 정밀화학 분야에서 생체 촉매로 유용하게 널리 활용될 수 있다.In a specific embodiment of the present invention, to measure the activity of the novel esterase described in SEQ ID NO: 2, first, the esterase gene of SEQ ID NO: 1 encoding the novel esterase is cloned into a vector (FIG. 4). After the vector was transformed into Escherichia coli, the esterase produced from the transformant was purified. By confirming the purified esterase of the present invention by the SDS-PAGE method, it can be seen that the molecular weight was effectively produced at about 37 kDa, and it was confirmed that the esterase of the present invention was expressed in a water-soluble form ( 5). As described above, since the tidal metagenome-derived esterase of the present invention exhibits excellent activity and is easy to produce, the esterase protein may be widely used as a biocatalyst in biomedical and fine chemical fields as well as in the conversion of fats and oils. .
또한, 본 발명의 에스터라제는 다음과 같은 특성을 나타낸다: pH 6.0 내지 11.0 범위에서 안정하며, pH 8.0에서 최적 활성을 나타내고(도 6 참조); 70℃까지 활성을 나타내고 50℃에서 최적활성을 나타내며(도 7 참조); 대부분 2가 금속 이온에 의해 활성이 증가되며(표 1 참조); 0.1%의 비이온성 계면활성제에 대해서만 활성이 증가하였으며, 나머지 계면활성제에 대해서는 활성이 급격하게 저해되는 것을 확인하였다(표 2 참조). 또한 여러 파라-니트로페닐 에스터(p-nitrophenyl ester) 중에서 파라-니트로페닐 카프로에이트(p-nitrophenyl caproate, C6)에 대한 활성이 가장 높았으며, 이는 파라-니트로페닐 카프레이트(p-nitrophenyl caprate, C10)에 비해 그 활성이 약 13배 정도 증가한 것으로, 상대적으로 짧은 아실 사슬을 가진 기질을 더 잘 분해하는 본 발명의 단백질은 리파제가 아니라 에스터라제임을 알 수 있었다(도 8 참조). 즉, 본 발명의 에스터라제는 활성온도가 10 ~ 70℃이며, 바람직하게는 50℃로 다른 에스터라제에 비해 상대적으로 높은 온도에서 최적활성을 나타낸다.In addition, the esterases of the present invention exhibit the following properties: stable in the pH range from 6.0 to 11.0, showing optimal activity at pH 8.0 (see FIG. 6); Activity up to 70 ° C. and optimal activity at 50 ° C. (see FIG. 7); Mostly increased activity by divalent metal ions (see Table 1); The activity was increased only for 0.1% of nonionic surfactant, and the activity was rapidly inhibited for the remaining surfactants (see Table 2). In addition, among the various para-nitrophenyl esters (p-nitrophenyl caproate (C6) was the highest activity, which is the para-nitrophenyl caprate (p-nitrophenyl caprate, C10) Compared with), the activity was increased about 13 times, indicating that the protein of the present invention, which degrades a substrate having a relatively short acyl chain, is an esterase rather than a lipase (see FIG. 8). That is, the esterase of the present invention has an activity temperature of 10 to 70 ° C, preferably 50 ° C, and exhibits optimum activity at a relatively high temperature compared to other esterases.
여기서, "엄격한 조건하에서 혼성화되는 폴리뉴클레오티드"란 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열의 폴리뉴클레오티드 또는 서열번호 2의 아미노산 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드의 전부 또는 일부를 탐침자로서 사용하여 콜로니 혼성화 기술, 플라크 혼성화 기술, 서던(southern) 혼성화 기술 등에 의해 수득된, DNA 등의 뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 상기 혼성화 방법은, 예를 들어, 문헌 [Molecular Cloning 제 3 판, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons 1987-1997] 등에 기재된 방법일 수 있다.Here, "polynucleotide hybridized under strict conditions" refers to colony hybridization using all or part of a polynucleotide of the nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or a polynucleotide encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 as a probe. Nucleotide sequences, such as DNA, obtained by techniques, plaque hybridization techniques, southern hybridization techniques, and the like. The hybridization method can be, for example, the method described in Molecular Cloning 3rd Edition, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons 1987-1997 and the like.
본원에 사용된 "엄격한 조건"이라는 용어는 낮은 엄격성 조건, 중간 엄격성 조건 또는 높은 엄격성 조건 중에서 임의로 선택될 수 있다. "낮은 엄격성 조건"은, 예를 들어, 32℃에서의 5 x SSC, 5 x Denhardt 용액, 0.5% SDS, 50% 포름아마이드이다. "중간 엄격성 조건"은, 예를 들어, 42℃ 에서의 5 x SSC, 5 x Denhardt 용액, 0.5% SDS, 50% 포름아마이드이다. "높은 엄격성 조건"은, 예를 들어, 50℃ 에서의 5 x SSC, 5 x Denhardt 용액, 0.5% SDS, 50% 포름아마이드이다. 이들 조건하에서, 상동성이 더 높은, DNA 등의 폴리뉴클레오티드는 더욱 높은 온도에서 효율적으로 수득될 것으로 예상되지만, 혼성화 엄격성에는 온도, 탐침자 농도, 탐침자 길이, 이온세기, 시간, 염 농도 및 기타를 비롯하여 복수의 요인들이 연루되므로, 당업자는 유사한 엄격성을 구현하기 위해 이들 요인들을 적절히 선택할 수 있다.As used herein, the term "strict conditions" can be arbitrarily selected from among low stringency conditions, medium stringency conditions or high stringency conditions. "Low stringency conditions" are, for example, 5 x SSC, 5 x Denhardt solution, 0.5% SDS, 50% formamide at 32 ° C. "Medium stringency conditions" are, for example, 5 x SSC, 5 x Denhardt solution, 0.5% SDS, 50% formamide at 42 ° C. "High stringency conditions" are, for example, 5 x SSC, 5 x Denhardt solution, 0.5% SDS, 50% formamide at 50 ° C. Under these conditions, polynucleotides such as DNA, which have higher homology, are expected to be efficiently obtained at higher temperatures, but hybridization stringency includes temperature, probe concentration, probe length, ionic strength, time, salt concentration, and Since a number of factors are involved, including others, those skilled in the art can appropriately select these factors to implement similar stringency.
본 발명의 서열번호 2로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드는 단백질의 기능에 영향을 미치지 않는 범위 내에서 아미노산 잔기의 결실, 삽입, 치환 또는 이들의 조합에 의해서 상이한 서열을 가지는 아미노산의 변이체 또는 단편을 본 발명의 범위에 포함한다. 분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질 및 펩티드에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다. 경우에 따라서는 인산화(phosphorylation), 황화(sulfation), 아크릴화(acrylation), 당화(glycosylation), 메틸화(methylation), 파네실화(farnesylation) 등으로 수식(modification)될 수도 있다. 따라서, 본 발명은 상기 서열번호 2로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드와 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 및 이의 변이체 또는 이의 활성 단편을 포함하며, 실질적으로 동일한 폴리펩티드란 80％ 이상, 바람직하게는 90％ 이상, 가장 바람직하게는 95％ 이상의 아미노산 서열의 상동성을 갖는 것들을 의미한다. 그러나 이에 한정되는 것은 아니며, 70% 이상의 아미노산 서열의 상동성을 가지며 동일한 생화학적 활성을 가진다면 본원 발명에 포함된다.Polypeptides having an amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2 of the present invention may be used to identify variants or fragments of amino acids having different sequences by deletion, insertion, substitution, or combination of amino acid residues within a range that does not affect the function of the protein. It is included in the scope of the present invention. Amino acid exchanges in proteins and peptides that do not alter the activity of the molecule as a whole are known in the art. In some cases, it may be modified by phosphorylation, sulfation, acrylation, glycosylation, methylation, farnesylation, or the like. Accordingly, the present invention includes a polypeptide having an amino acid sequence substantially identical to a polypeptide having an amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 2, and a variant or active fragment thereof, wherein the substantially identical polypeptide is at least 80%, preferably 90 By those having homology of at least%, most preferably at least 95%, amino acid sequences. However, the present invention is not limited thereto and is included in the present invention as long as it has homology of 70% or more of amino acid sequences and the same biochemical activity.
또한, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 바람직하게는 서열번호 1로 기재되는 폴리뉴클레오티드인 것을 특징으로 한다. 그러나, 본 발명의 에스터라제 및 이의 변이체 또는 이의 활성 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 코돈의 축퇴성(degeneracy)으로 인하여 또는 상기 에스터라제 및 이의 변이체 또는 이의 활성 단편을 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여, 코딩영역으로부터 발현되는 에스터라제 및 이의 변이체 또는 이의 활성 단편의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위 내에서 코딩영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있고, 코딩영역을 제외한 부분에서도 유전자의 발현에 영향을 미치지 않는 범위 내에서 다양한 변형 또는 수식이 이루어질 수 있으며, 그러한 변형 유전자 역시 본 발명의 범위에 포함 됨을 당업자는 잘 이해할 수 있을 것이다. 따라서, 본 발명은 서열번호 1의 유전자와 실질적으로 동일한 염기 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 및 상기 유전자의 단편을 포함한다. 실질적으로 동일한 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드란 80％ 이상, 바람직하게는 90％ 이상, 가장 바람직하게는 95％ 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다. 그러나 이에 한정되는 것은 아니며, 70% 이상의 서열 상동성을 가지며 암호화된 단백질의 동일한 생화학적 활성을 가진다면 본원 발명에 포함된다. 상술한 바와 같이, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 이와 동등한 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 한, 하나 이상의 핵산 염기가 치환, 결실, 삽입 또는 이들의 조합에 의해 변이될 수 있으며, 이들 또한 본 발명의 범위에 포함된다. 서열번호 2로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드는 바람직하게는 서열번호 1로 기재되는 폴리뉴클레오티드 서열을 갖는 핵산 분자에 의해 코딩되나, 본 발명은 이에 제한되지 않고, 동일 아미노산 서열을 갖는 본 발명의 단백질을 코딩할 수 있는 한, 서열번호 1의 염기서열과 실질적으로 동일한 다른 염기서열을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 갖는 핵산 분자에 의해 코딩될 수도 있다. 이러한 핵산 분자의 서열은 단쇄 또는 이중쇄일 수 있으며, DNA 분자 또는 RNA(mRNA)분자일 수 있다. In addition, the polynucleotide of the present invention is preferably characterized in that the polynucleotide described in SEQ ID NO: 1. However, polynucleotides encoding esterases and variants or active fragments thereof of the present invention are preferred because of degeneracy of codons or in organisms that wish to express the esterases and variants or active fragments thereof. In consideration of the codons, various modifications can be made to the coding region within the range of not changing the amino acid sequence of the esterase expressed from the coding region and the variants thereof or the active fragments thereof, and expression of the gene even in parts other than the coding region. Various modifications or modifications may be made without departing from the scope of the invention, and those skilled in the art will readily understand that such modifications are included in the scope of the present invention. Accordingly, the present invention includes polynucleotides having fragments of the same base and substantially the same nucleotide sequence as the gene of SEQ ID NO: 1. Polynucleotides having substantially the same nucleotide sequence mean those having sequence homology of at least 80%, preferably at least 90%, most preferably at least 95%. However, it is not limited thereto and is included in the present invention as long as it has at least 70% sequence homology and the same biochemical activity of the encoded protein. As noted above, one or more nucleic acid bases may be mutated by substitution, deletion, insertion or combination thereof, as long as the polynucleotide of the present invention encodes a protein having equivalent activity, and these also fall within the scope of the present invention. Included. Polypeptides having an amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2 are preferably encoded by a nucleic acid molecule having a polynucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 1, but the present invention is not limited thereto, and the protein of the present invention having the same amino acid sequence. As long as it can encode, it may be encoded by a nucleic acid molecule having a nucleotide sequence having another base sequence substantially the same as the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1. The sequence of such nucleic acid molecules may be single or double stranded, and may be DNA molecules or RNA (mRNA) molecules.
또한, 본 발명은 본 발명의 에스터라제 및 이의 변이체 또는 이의 활성 단편 및 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 발현벡터를 제공한다.The present invention also provides a recombinant expression vector comprising an esterase of the present invention and a variant thereof or an active fragment thereof and a polynucleotide encoding the same.
상기 재조합 발현벡터의 제작 시에는, 상기 에스터라제 및 이의 변이체 또는 이의 활성 단편을 생산하고자 하는 숙주세포의 종류에 따라 프로모터(promoter), 종결자(terminator), 인핸서(inhancer) 등과 같은 발현조절 서열, 막 표적화 또는 분비를 위한 서열 등을 적절히 선택하고 목적에 따라 다양하게 조합할 수 있다.In the production of the recombinant expression vector, expression control sequences such as promoters, terminators, enhancers, etc., depending on the type of host cell intended to produce the esterase and its variants or active fragments thereof. In addition, the sequence for membrane targeting or secretion can be appropriately selected and various combinations can be made depending on the purpose.
본 발명의 발현벡터는 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 박테리오파이지 벡터 및 바이러스 벡터 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 적합한 발현벡터는 프로모터, 오퍼레이터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널 및 인핸서 같은 발현 조절 엘리먼트 외에도 막 표적화 또는 분비를 위한 시그널 서열 또는 리더 서열을 포함하며 목적에 따라 다양하게 제조될 수 있다. 발현벡터의 프로모터는 구성적 또는 유도성일 수 있다. 상기 시그널 서열에는 숙주가 에쉐리키아속(Escherichia sp.)균인 경우에는 PhoA 시그널 서열, OmpA 시그널 서열 등이, 숙주가 바실러스속(Bacillus sp.)균인 경우에는 α-아밀라아제 시그널 서열, 서브틸리신 시그널 서열 등이, 숙주가 효모(yeast)인 경우에는 MFα 시그널 서열, SUC2 시그널 서열 등이, 숙주가 동물세포인 경우에는 인슐린 시그널 서열, α-인터페론 시그널 서열, 항체 분자 시그널 서열 등을 이용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한 발현벡터는 벡터를 함유하는 숙주 세포를 선택하기 위한 선택 마커를 포함할 수 있고, 복제 가능한 발현벡터인 경우 복제 기원을 포함한다. 본 발명의 발현 벡터는 관심 단백질인 에스터라제가 숙주세포에서 발현하면 그 활성을 나타내게 되므로, 숙주세포의 배양 배지에 트리뷰티린 등의 에스터라제 기질을 첨가함으로써, 별도의 선택마커 없이도 형질전환된 숙주세포의 선별이 가능하도록 할 수 있다.Expression vectors of the present invention include, but are not limited to, plasmid vectors, cosmid vectors, bacteriophage vectors, viral vectors, and the like. Suitable expression vectors include signal sequences or leader sequences for membrane targeting or secretion in addition to expression control elements such as promoters, operators, initiation codons, termination codons, polyadenylation signals and enhancers and can be prepared in various ways depending on the purpose. The promoter of the expression vector may be constitutive or inducible. The signal sequence includes a PhoA signal sequence and an OmpA signal sequence when the host is Escherichia sp., And an α-amylase signal sequence and a subtilisin signal when the host is Bacillus sp. For example, the MFα signal sequence, the SUC2 signal sequence, and the like may be used when the host is a yeast, and the insulin signal sequence, the α-interferon signal sequence, the antibody molecular signal sequence, or the like may be used when the host is an animal cell. This is not restrictive. The expression vector may also include a selection marker for selecting a host cell containing the vector, and in the case of a replicable expression vector, includes the origin of replication. Since the expression vector of the present invention expresses its activity when the esterase, a protein of interest, is expressed in the host cell, it is transformed without adding a selection marker by adding an esterase substrate such as tributyrin to the culture medium of the host cell. Selection of host cells can be enabled.
또한, 상기 재조합 발현벡터는 발현물의 정제를 용이하게 하기 위한 서열을 포함할 수 있으며, 구체적으로 본 발명의 에스터라제 및 이의 변이체 또는 이의 활성 단편을 암호화하는 유전자에 작동 가능하도록 분리정제용 태그를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 연결될 수 있다. 이때, 상기 분리정제용 태그는 GST, poly-Arg, FLAG, 히스티딘-택(His-tag) 및 c-myc 등이 단독으로 사용되거나 어느 두 개 이상을 순차적으로 연결하여 사용할 수 있다. 본 발명의 구체적 실시예에서는 히스티딘-택을 C-말단에 위치시켜 니켈-엔티에이(Ni-NTA, Ni-nitriloteiacetic acid, Qiagen, Germany) 컬럼을 이용하여 발현된 에스터라제를 정제하였다.In addition, the recombinant expression vector may include a sequence for facilitating purification of the expression, and specifically, the tag for separation and purification to be operable to the gene encoding the esterase and its variants or active fragments of the present invention. The polynucleotides encoding may be linked. In this case, the separation and purification tag may be used alone, GST, poly-Arg, FLAG, histidine-tag (His-tag) and c-myc, or any two or more of them in sequence. In a specific embodiment of the present invention, the histidine-tag was placed at the C-terminus to purify the expressed esterase using a nickel-entai (Ni-NTA, Ni-nitriloteiacetic acid, Qiagen, Germany) column.
더 나아가, 본 발명의 재조합 발현벡터의 에스터라제 및 이의 변이체 또는 이의 활성 단편을 암호화하는 유전자와 분리정제용 태그를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 단백질 절단효소 인식부위를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 연결될 수 있다. 본 발명의 에스터라제 및 이의 변이체 또는 이의 활성 단편은 생물의학과 정밀화학 분야에서 생체 촉매로 유용하게 활용되는 단백질로써, 정제용 태그에 의해 기능이 저하될 수 있으므로 제거되는 것이 바람직하다. 이때, 상기 단백질 절단효소 인식부위는 Xa 인자 인식부위, 엔테로키나제 인식부위, 제네나제(Genenase) I 인식부위 또는 퓨린(Furin) 인식부위가 단독으로 사용되거나 어느 두 개 이상을 순차적으로 연결하여 사용할 수 있다.Furthermore, a polynucleotide encoding a protein cleavage enzyme recognition site may be linked to a gene encoding an esterase and a variant thereof or an active fragment thereof of the recombinant expression vector of the present invention and a polynucleotide encoding a tag for separation and purification. Esterases and variants or active fragments thereof of the present invention are proteins that are usefully used as biocatalysts in the fields of biomedical sciences and fine chemistry. In this case, the protein cleavage enzyme recognition site may be used as the Xa factor recognition site, the enterokinase recognition site, the Genenase I recognition site, or the Furin recognition site, or any two or more of them are sequentially connected. have.
발명의 실시태양에서, 상기 에스터라제 및 이의 변이체 또는 이의 활성 단편을 암호화하는 유전자는 제한효소 부위를 통해 클로닝될 수 있고, 단백질 절단효소 인식부위를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 사용된 경우에는 상기 폴리뉴클레오티드와 틀이 맞도록(in frame) 연결되어, 상기 에스터라제 및 이의 변이체 또는 이의 활성 단편 분비 후 단백질 절단효소로 절단 시, 원래 형태의 에스터라제 및 이의 변이체 또는 이의 활성 단편이 생산될 수 있도록 할 수 있다.In an embodiment of the invention, the gene encoding the esterase and its variants or active fragments thereof can be cloned through a restriction site, and if a polynucleotide encoding a protein cleavage site is used, the polynucleotide Connected in frame so that, when secreted by the proteinase after secreting the esterase and its variants or active fragments, the original form of the esterase and its variants or active fragments may be produced. can do.
또한, 본 발명은 본 발명의 에스터라제 및 이의 변이체 또는 이의 활성 단편 및 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 발현벡터가 숙주세포에 형질 도입된 형질전환체를 제공한다.The present invention also provides a transformant in which a recombinant expression vector comprising an esterase of the present invention and a variant thereof or an active fragment thereof and a polynucleotide encoding the same is introduced into a host cell.
본 발명에 따른 상기 재조합 발현벡터를 적절한 숙주 세포, 예를 들어, 대장균 또는 효모 세포 등에 형질전환시킨 후, 형질전환된 숙주세포를 배양함으로써 본 발명에 따른 신규 에스터라제를 대량 생산할 수 있다. 숙주세포의 종류에 따른 적절한 배양 방법 및 배지 조건 등은 당해 분야의 통상의 기술자에게 알려진 공지 기술로부터 당업자가 용이하게 선택할 수 있다. 바람직하게, 상기 숙주세포는 대장균이며, 본 발명의 구체적인 실시예에서는 신규 에스터라제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 발현벡터를 제작하고(도 4 참조), 이를 대장균에 형질전환시켰다. 상기 형질전환체로부터 발현된 에스터라제는 트리뷰티린을 효과적으로 분해하여 우수한 에스터라제 활성을 나타냄을 확인하였으며, 상기 형질전환체를 2008년 2월 23일자로 한국생명공학연구원내 생물자원센터에 기탁번호 KCTC 11285BP로 기탁하였다.The recombinant expression vector according to the present invention may be transformed into an appropriate host cell, for example, Escherichia coli or yeast cell, and then cultured in a transformed host cell, thereby producing a large amount of the novel esterase according to the present invention. Suitable culture methods, media conditions, and the like according to the type of host cell can be easily selected by those skilled in the art from known techniques known to those skilled in the art. Preferably, the host cell is E. coli, and in a specific embodiment of the present invention, a recombinant expression vector comprising a polynucleotide encoding a novel esterase was prepared (see FIG. 4), and transformed into E. coli. Esterases expressed from the transformants were found to exhibit excellent esterase activity by effectively degrading tributyrin, and the transformants were transferred to a biological resource center of the Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology on February 23, 2008. Deposited with accession number KCTC 11285BP.
아울러, 1) 본 발명의 에스터라제 및 이의 변이체 또는 이의 활성 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 발현벡터를 제조하는 단계;In addition, 1) preparing a recombinant expression vector comprising a polynucleotide encoding the esterase and variants thereof or active fragments thereof of the present invention;
2) 상기 재조합 발현벡터를 숙주세포에 도입하여 형질전환체를 제조하는 단계; 및,2) preparing a transformant by introducing the recombinant expression vector into a host cell; And,
3) 상기 형질전환체를 배양하여 재조합 단백질의 발현을 유도하고 이를 수득하는 단계로 구성되는 재조합 에스터라제의 제조방법을 제공한다.3) culturing the transformant to induce the expression of a recombinant protein and to provide a method for producing a recombinant esterase consisting of the same.
상기 본 발명의 에스터라제 및 이의 변이체 또는 이의 활성 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 N-말단에는 분리정제용 태그를 암호화하는 폴리뉴클레오티드와 단백질 절단효소 인식부위가 추가로 연결될 수 있고, 이로 인해 재조합 에스터라제의 정제 또는 원래 형태의 에스터라제의 수득이 가능할 수 있다. 즉, 재조합 에스터라제를 분리정제용 태그를 이용하여 정제한 후, 상기 단백질 절단효소 인식부위를 절단할 수 있는 단백질 절단효소를 처리하는 단계를 추가로 포함함으로써 원래 형태의 에스터라제를 수득할 수 있다.The N-terminus of the polynucleotide encoding the esterase of the present invention and the variant or the active fragment thereof may further be linked to the polynucleotide encoding the separation and purification tag and the protein cleavage enzyme recognition site. It may be possible to purify terases or to obtain esterases in their original form. In other words, after the purification of the recombinant esterase using the separation and purification tag, and further comprising the step of processing a protein cleavage enzyme that can cleave the protein cleavage recognition site by obtaining an esterase of the original form Can be.
본 발명의 에스터라제는 기질 특이성 및 광학활성 특이 등의 독특한 특성이 있어 여러가지 생리 활성 키랄 의약품을 개발하는데 그 용도가 주목받고 있다. 이러한 광학활성 의약품 생산에 유용한 키랄 화합물의 생산은 의약산업의 경쟁력 확보와 국민 건강 증진에 매우 큰 영향력을 가지는 과제로 관심을 모으고 있다. 상기 정밀화학품은 특히 생리 활성 키랄 의약품의 의약품일 수 있고, 이때 효소의 광학활성을 증가시키기 위한 효소의 화학적 변형, 효소정제, 유기용매 처리, 반응조건 선택, 반응 용매 설계 등의 다양한 기술을 응용할 수 있다.The esterases of the present invention have unique characteristics such as substrate specificity and optical activity specificity, and thus their use has been attracting attention in developing various bioactive chiral pharmaceutical products. The production of chiral compounds useful for the production of such optically active drugs is attracting attention as a task that has a great influence on securing the competitiveness of the pharmaceutical industry and promoting the health of the public. In particular, the fine chemicals may be drugs of physiologically active chiral drugs, and various techniques such as chemical modification of enzymes, enzyme purification, organic solvent treatment, reaction condition selection, reaction solvent design, etc. may be applied to increase optical activity of enzymes. have.
상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 방법에 의해 생산된 신규 에스터라제는 수용성 형태로 발현되므로 대량생산이 가능하고, 높은 온도에서 활성을 유지하며 우수한 에스터라제 활성을 나타냄으로써 다양한 산업에 응용될 수 있다.As described above, the novel esterase produced by the method of the present invention is expressed in water-soluble form, so that it can be mass-produced, maintain activity at high temperature, and exhibit excellent esterase activity to be applied to various industries. Can be.
이하, 실시예에 의하여 본 발명을 상세히 설명하고자 한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail by examples.
단, 하기 실시예들은 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 내용이 실시예에 한정되는 것은 아니다.However, the following examples are intended to illustrate the present invention in more detail, but the content of the present invention is not limited to the examples.
<< 실시예Example 1> 1> 메타게놈Metagenome 라이브러리 구축 Library building
전라북도 부안금 새만금 간척지 갯벌에서 채취한 토양 시료 10 g을 50 ㎍/㎖의 프로테이나제(proteinase) K를 포함하는 동일부피의 DNA 추출용 완충액[100 mM 트리즈마 완충액(Tris-HCl, pH 8.0, sigma, USA) ; 100 mM EDTA(ethylenediaminetetraacetic acid, sigma, USA); 100 mM 인산 나트륨 완충액(sodium phosphate, pH 8.0, sigma, USA); 1.5 M 염화나트륨(NaCl, junsei, japan); 1%(w/v) CTAB(hexadecyl trimethyl ammonium bromide, sigma, USA)]에 현탁시킨 후, 음이온 계면활성제(sodium dodecyl sulfate, SDS, sigma, USA)를 최종 2%(v/v)가 되게 첨가하여 65℃에서 2시간 동안 반응시켰다. 그 후, 원심분리를 통해 획득한 상등액에 1.6 M 염화나트륨(NaCl)을 포함한 30%(v/v) 폴리에틸렌 글리 콜(polyethylene glycol)을 동일 부피만큼 첨가시켜 잘 섞어 주었다. 침전된 DNA는 원심분리를 통해 분리하여 TE 완충용액에 현탁하였고, 동일 부피의 페놀/클로로포름/이소아밀 알코올(phenol/chloroform/isoamyl alcohol)(25:24:1) 혼합액과 클로로포름/이소아밀 알코올(chloroform/isoamyl alcohol)(24:1) 혼합액을 첨가하여 두 번 추출하였다. 원심분리하여 획득한 상등액에 이소프로판올(isopropanol)을 첨가하여 DNA를 침전회수하였다. DNA 침전물을 완전히 건조시켜 멸균수에 녹인 후 불순물을 완전히 제거하고, 약 23~48 kb 정도의 DNA 단편으로 부분 절단하기 위해 PFGE(pulse-field gel electrophoresis, Bio-Rad, USA)를 이용하여 전기영동하고 Gelase(Epicentre, USA)를 사용하여 겔 용출을 수행하였다. 정제된 DNA 단편들은 CopyControl fosmid 라이브러리 제작 키트(Epicentre, USA)를 사용하여 메타게놈 라이브러리를 구축하였다.Ten grams of soil samples collected from the Tidal Flats of Buangum Saemangeum Reclaimed Land in Jeollabuk-do were buffered to extract DNA of the same volume containing 50 μg / ml proteinase K [100 mM Trisma buffer solution (Tris-HCl, pH 8.0). , sigma, USA); 100 mM EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid, sigma, USA); 100 mM sodium phosphate buffer (sodium phosphate, pH 8.0, sigma, USA); 1.5 M sodium chloride (NaCl, junsei, japan); Suspended in 1% (w / v) CTAB (hexadecyl trimethyl ammonium bromide, sigma, USA), and then added an anionic surfactant (sodium dodecyl sulfate, SDS, sigma, USA) to a final 2% (v / v) The reaction was carried out at 65 ° C. for 2 hours. Thereafter, 30% (v / v) polyethylene glycol including 1.6 M sodium chloride (NaCl) was added to the supernatant obtained through centrifugation, and the mixture was mixed well. The precipitated DNA was separated by centrifugation and suspended in TE buffer, and the same volume of phenol / chloroform / isoamyl alcohol (25: 24: 1) mixture and chloroform / isoamyl alcohol ( Chloroform / isoamyl alcohol) (24: 1) mixture was added and extracted twice. DNA was precipitated by adding isopropanol to the supernatant obtained by centrifugation. Completely dry the DNA precipitate, dissolve in sterile water, completely remove impurities, and electrophoresis using pulse-field gel electrophoresis (Bio-Rad, USA) to partially cut the DNA fragment into about 23 ~ 48 kb. Gel elution was performed using Gelase (Epicentre, USA). Purified DNA fragments were constructed with a metagenomic library using CopyControl fosmid library construction kit (Epicentre, USA).
라이브러리의 질을 검사하기 위해, 형질전환체들을 무작위적으로 선택하여 재조합 플라스미드를 추출하여 제한효소 처리한 후 전기영동으로 확인한 결과, 모두 재조합 플라스미드가 포함되어 있었으며, 삽입된 메타게놈의 평균 크기는 35 kb였다.To test the quality of the library, randomly selected transformants were extracted, recombinant plasmids were extracted and subjected to restriction enzyme treatment, followed by electrophoresis. All of them contained recombinant plasmids, and the average size of the inserted metagenome was 35 kb.
<< 실시예Example 2> 2> 에스터라제Esterase 활성을 가진 재조합 플라스미드의 탐색 및 분리 Screening and Isolation of Recombinant Plasmids with Activity
실시예 1에서 수득한 메타게놈 라이브러리로부터 에스터라제(esterase) 유전자를 탐색하기 위해, 에스터라제에 의해 분해되는 트리뷰티린(tributyrin; 이하, TBN)을 포함하는 배지에서 상기 메타게놈 라이브러리를 배양하였다.In order to search for an esterase gene from the metagenome library obtained in Example 1, incubating the metagenomic library in a medium containing tributyrin (TBN) degraded by esterase It was.
구체적으로, 상기 메타게놈 라이브러리를 TBN 에멀젼[1%(v/v) TBN, sigma, USA; 1 mM 염화칼슘(CaCl2), junsei, japan; 0.5%(v/v) 아라비아 고무(Gum arabic), sigma, USA]이 첨가된 영양 고체배지[1%(w/v) 트립톤(trypton), difco, USA; 0.5%(w/v) 이스트 추출물(yeast extract), difco, USA; 0.5%(w/v) 염화나트륨(NaCl), junsei, japan; 1.5%(w/v) 한천(agar), junsei, japan]에 도말하여 37℃에서 배양하였다. 이때, 에스터라제에 의해 트리뷰티린이 분해되어 투명환을 형성하는 콜로니를 선별하였다. 트리뷰티린 분해능이 가장 우수한 콜로니로부터 재조합 플라스미드를 분리하여 pFosEstEH112로 명명하였다.Specifically, the metagenomic library was prepared using TBN emulsion [1% (v / v) TBN, sigma, USA; 1 mM calcium chloride (CaCl 2 ), junsei, japan; Nutritional solid medium [1% (w / v) trypton, difco, USA; added 0.5% (v / v) gum arabic, sigma, USA; 0.5% (w / v) yeast extract, difco, USA; 0.5% (w / v) sodium chloride (NaCl), junsei, japan; 1.5% (w / v) agar (agar), junsei, Japan] was incubated at 37 ℃. At this time, colonies forming tricyclic ring by esterase to form a transparent ring were selected. Recombinant plasmids were isolated from colonies with the highest tributyrin resolution and named pFosEstEH112.
<< 실시예Example 3> 신규 3> new 에스터라제Esterase 유전자의 Gene 클로닝Cloning 및 염기 서열 분석 And sequencing
실시예 2에서 분리한 플라스미드 pFosEstEH112로부터 신규 에스터라제의 유전자를 클로닝하고 염기 서열을 분석하였다. The gene of the novel esterase was cloned from the plasmid pFosEstEH112 isolated in Example 2 and the nucleotide sequence was analyzed.
<3-1> 신규 <3-1> new 에스터라제Esterase 유전자의 Gene 클로닝Cloning
구체적으로, 플라스미드 pFosEstEH112를 Sau3AI 제한 효소로 절단한 다음, 포스파타제(calf intestinal phosphatase; , TaKaRa, japan)를 처리한 pUC19 벡터(Novagen, USA)에 삽입시킨 후 대장균 DH5α에 형질전환시켰다. 상기 형질전환 균주를 엠피실린(ampicillin)이 첨가된 TBN 고체배지(1% 트립톤, 0.5% 효모추출액, 0.5% NaCl, 1% TBN, 1 mM CaCl2, 0.5% 아라비아 고무, 1.5% 한천)에 도말하고, 37℃에서 24시간 동안 배양하여 TBN을 분해하여 투명환을 형성하는 콜로니를 선별하였 다. 선별된 콜로니를 배양하여 플라스미드를 분리한 결과 1.5kb 크기의 삽입체(insert DNA)를 포함한 4.2kb 크기의 플라스미드를 확인하였고, 이를 pUC112로 명명하였다. 아울러, pUC112을 동일한 방법으로 대장균 DH5α에 재 형질전환시킨 결과 생성된 콜로니들은 모두 에스터라제 활성을 나타냄을 확인하였다.Specifically, plasmid pFosEstEH112 was Sau3AI After digestion with restriction enzymes, E. coli was inserted into a pUC19 vector (Novagen, USA) treated with calf intestinal phosphatase (TaKaRa, Japan). DH5α was transformed. The transformed strain was added to TBN solid medium (1% tryptone, 0.5% yeast extract, 0.5% NaCl, 1% TBN, 1 mM CaCl 2 , 0.5% Arabian gum, 1.5% agar) to which ampicillin was added. The colonies were plated and incubated at 37 ° C. for 24 hours to decompose TBN to form transparent rings. As a result of culturing selected colonies to isolate the plasmid, a 4.2 kb plasmid containing 1.5 kb insert DNA was identified, which was named pUC112. In addition, it was confirmed that the colonies generated as a result of re-transforming pUC112 in E. coli DH5α in the same manner all showed an esterase activity.
<3-2> 신규 <3-2> new 에스터라제Esterase 유전자의 염기 서열 분석 Sequence analysis of genes
실시예 3-1에서 수득한 pUC112의 염기 서열을 샷건 시퀀싱(shot-gun sequencing) 방법으로 Big Dye DNA Sequencing kit(AppliedBiosystems, USA)를 이용하여 분석하였다. 상기 염기 서열은 NCBI(National Center for Biotechnology Information)의 ORF finder(//www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)를 이용하여 전사해독프레임(open reading frame, ORF)을 동정하였고, 블라스트엑스(BlastX; www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi)를 이용하여 전사해독프레임의 기능을 예측하였다.The base sequence of pUC112 obtained in Example 3-1 was analyzed using a Big Dye DNA Sequencing kit (AppliedBiosystems, USA) by shot-gun sequencing. The base sequence was identified by using an ORF finder (//www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html) of the National Center for Biotechnology Information (NCBI) to identify an open reading frame (ORF). , BlastX (www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi) was used to predict the function of the transcription decoding frame.
그 결과, 서열번호 2로 기재되는 339개 아미노산(서열번호 1; 1,020개의 염기)으로 이루어지며 분자량이 약 37 kDa으로 예측되는 에스터라제의 ORF(open reading frame)를 찾을 수 있었다(도 1). 상기 ORF는 에스터라제 단백질 코딩 영역으로 예상되며, 상기 유전자를 에스터라제 EstEH112로 명명하였고, NCBI에 등록하였다(GenPept 등록번호 ACB11219; GenBank 등록번호 EU515238).As a result, an open reading frame (ORF) of an esterase consisting of 339 amino acids (SEQ ID NO: 1; 1,020 bases) described in SEQ ID NO: 2 and predicted to have a molecular weight of about 37 kDa was found (FIG. 1). . The ORF is expected to be an esterase protein coding region, and the gene was named esterase EstEH112 and registered in NCBI (GenPept Accession No. ACB11219; GenBank Accession No. EU515238).
<3-3> 신규 <3-3> new 에스터라제Esterase 유전자의 Gene 상동성Homology 분석 analysis
서열번호 2의 신규 에스터라제의 아미노산 서열을 BLAST 프로그램을 이용하여 GenBank 및 SWISSPROT에 있는 아미노산 서열과 비교 분석하였다.The amino acid sequence of the novel esterase of SEQ ID NO: 2 was compared with the amino acid sequences in GenBank and SWISSPROT using the BLAST program.
그 결과, 본 발명의 에스터라제 EstEH112는 자이렐라 파스티디오사 9a5c(Xylella fastidiosa 9a5c)와 가장 높은 유사성을 나타내었으며, 이전에 보고된 에스터라제 유전자 집단과 37~48% 정도의 낮은 상동성을 보여 에스터라제를 암호화하는 신규한 유전자로서 확인되었다(표 1 및 도 3 참조). 또한, 도 2에 나타난 바와 같이 본 발명의 에스터라제는 글리신-X-세린-X-글리신(Gly-X-Ser-X-Gly)의 공통서열(consensus sequence) 내의 186번째 세린잔기(Ser)와 283번째 아스파라긴산(Asp), 313번째 히스티딘(His)으로 이루어진 에스터라제에 보존되는 특이적 세작용기 촉매(catalytic triad)를 갖고 있었다. 또한, 표 1과 도 3에 나타낸 것과 같은 EstEH112와 유사한 마린 감마 프로테오박테리움 HTCC2143(marine gamma proteobacterium HTCC2143), 자이렐라 파스티디오사 9a5c(Xylella fastidiosa 9a5c), 메틸로박테리움종 4-46(Methylobacterium sp. 4-46), 시네코싸이스티스종 PCC 6803(Synechocystis sp. PCC 6803), 알터로모나스 마클레오디 '깊은 생태형'(Alteromonas macleodii 'Deep ecotype'), 메틸로박테리움 노둘란스 ORS 2060(Methylobacterium nodulans ORS 2060), 그라눌리박터 베데스덴시스 CGDNIH1(Granulibacter bethesdensis CGDNIH1)의 에스터라제 효소들은 최근 전체 게놈 서열분석(whole genome sequencing)을 통해 밝혀진 유전자들로서, 단백질 특성들이 규명된 적이 없는 효소들이었다.As a result, the esterase of the present invention EstEH112 is Zyella Pastidiosa 9a5c ( Xylella fastidiosa 9a5c), which showed 37% to 48% homology with the previously reported population of esterase genes and was identified as a novel gene encoding esterase (see Table 1 and Figure 3). ). In addition, as shown in FIG. 2, the esterase of the present invention is the 186th serine residue in the consensus sequence of glycine-X-serine-X-glycine (Gly-X-Ser-X-Gly). And 283 aspartic acid (Asp) and 313 histidine (His). In addition, marine gamma proteobacterium HTCC2143 ( Zylella Pastiosa 9a5c ( Xylella ) similar to EstEH112 as shown in Table 1 and Figure 3 fastidiosa 9a5c), methyl tumefaciens species 4-46 (Methylobacterium sp. 4-46), the cine nose Im seutiseu species PCC 6803 (Synechocystis sp. PCC 6803 ), a Pseudomonas Alter do nucleoside D 'deep ecotype' (Alteromonas macleodii 'Deep ecotype'), a bacterium methyl Solarium nodul lance ORS 2060 (Methylobacterium nodulans ORS 2060), Granulibacter Bethesdensis CGDNIH1 ( Granulibacter Esterase enzymes of bethesdensis CGDNIH1) are genes that have recently been identified by whole genome sequencing, and enzymes have never been characterized.
<< 실시예Example 4> 형질전환체의 제조 4> Preparation of transformant
본 발명의 신규 에스터라제를 대량으로 생산할 수 있는 EstEH112 유전자를 포함하는 재조합 플라스미드를 제조하였다(도 4).Recombinant plasmids containing the EstEH112 gene capable of producing large amounts of the novel esterases of the present invention were prepared (FIG. 4).
구체적으로, 실시예 2의 방법으로 분리된 pFosEstEH112를 주형 DNA로 하고, 합성된 서열번호 3 및 4로 기재되고 각각 NdeI과 XhoI의 제한효소 절단부위를 가지는 프라이머쌍을 사용하여 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)을 수행하였다.Specifically, pFosEstEH112 isolated by the method of Example 2 was used as template DNA, and the synthesized SEQ ID Nos. 3 and 4 are described as Nde I and Polymerase chain reaction (PCR) was performed using a primer pair having a restriction enzyme cleavage site of Xho I.
서열번호 3: 5' - CCGCTCGAGTTGTAGGTGCTGCAATAGAA - 3'(NdeI 제한효소 절단부위 포함)SEQ ID NO: 5 '-CCGCTCGAGTTGTAGGTGCTGCAATAGAA-3' ( Nde I Restriction enzyme cleavage site)
서열번호 4: 5‘- GGAATTCCATATGATGACAAGCCAAGAATCAAC - 3'(XhoI 제한효소 절단부위 포함)SEQ ID NO: 5'- GGAATTCCATATGATGACAAGCCAAGAATCAAC-3 '( Xho I Restriction enzyme cleavage site)
상기 PCR 산물을 정제하여 NdeI과 XhoI의 제한효소로 절단한 후, 동일한 제한효소와 포스파타제(calf intestinal phosphatase)를 처리한 강력한 T7프로모터와 판독신호가 내재되어 있는 발현용 벡터 pET-22b(+)(Novagen, USA)의 제한효소 NdeI과 XhoI부위에 서열번호 1의 EstEH112 유전자를 클로닝하고(재조합벡터 pET22b(+)-EstEH112), 이를 대장균 C43(DE3)에 전자충격유전자전달(electroporation)을 수행하여 형질전환시켜 대장균 C43(DE3)/pET22b(+)-EstEH112를 제조하였고, 상기 균주를 한국생명공학연구원내 생물자원센터에 2008년 2월 23일자로 기탁하였다(기탁번호: KCTC 11285BP).The PCR product was purified and digested with restriction enzymes of Nde I and Xho I, followed by expression vector pET-22b (+) containing a strong T7 promoter and a readout signal treated with the same restriction enzyme and calf intestinal phosphatase. Cloning of the EstEH112 gene of SEQ ID NO: 1 into the restriction enzymes Nde I and Xho I sites of (Novagen, USA) (recombinant vector pET22b (+)-EstEH112) and electron shock gene transfer to E. coli C43 (DE3) E. coli C43 (DE3) / pET22b (+)-EstEH112 was prepared by transformation, and the strain was deposited on February 23, 2008 at the BRC of the Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology (Accession No .: KCTC 11285BP). .
<< 실시예Example 5> 5> 에스터라제의Esterase 생산 production
<5-1> <5-1> 에스터라제Esterase 발현 및 정제 Expression and Purification
실시예 4에서 수득한 대장균 C43(DE3)/pET22b(+)-EstEH112를 앰피실린 (ampicillin, 100 ㎍/㎖)이 포함된 액체 영양 배지에서 600 ㎚에서의 흡광도가 0.6이 될 때까지 37℃에서 배양한 후, 최종 농도 0.5 mM의 IPTG(isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside)를 배양액에 넣어 20℃에서 12시간 동안 추가로 배양하였다. 원심분리를 통해 대장균 C43(DE3)/pET22b(+)-EstEH112를 회수하여, 결합완충액[50 mM 트리즈마 완충액(Tris-HCl, pH 8.0), 500 mM NaCl, 10 mM 이미다졸(imidazole)]에 현탁시킨 후, 초음파 분쇄법으로 파쇄하였다. 이를 다시 원심분리하여 회수한 상층액만을 니켈-엔티에이(Ni-NTA:nitriloteiacetic acid; Qiagen, Germany) 컬럼에 가하여 이미다졸(imidazole) 농도 구배를 이용해 에스터라제를 용출시킨 후 투석농축하였다.Escherichia coli C43 (DE3) / pET22b (+)-EstEH112 obtained in Example 4 was absorbed at 37 ° C in a liquid nutrient medium containing ampicillin (ampicillin, 100 μg / ml) until the absorbance at 600 nm was 0.6. After incubation, the final concentration of 0.5 mM IPTG (isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside) was added to the culture solution and further incubated at 20 ° C. for 12 hours. E. coli C43 (DE3) / pET22b (+)-EstEH112 was recovered by centrifugation, and bound to binding buffer [50 mM Trisma buffer (Tris-HCl, pH 8.0), 500 mM NaCl, 10 mM imidazole]. After suspension, the mixture was broken by ultrasonic grinding. Only the supernatant recovered by centrifugation was added to a Ni-NTA (Ni-NTA: nitriloteiacetic acid; Qiagen, Germany) column to elute the esterase using an imidazole concentration gradient, and then dialysate concentrated.
<5-2> <5-2> 에스터라제의Esterase 확인 Confirm
실시예 5-1에서 정제한 단백질 농도는 나노드롭 스펙트로포토미터(NanoDrop Spectrophotometer, nanodrop, USA)를 이용하여 280 nm에서 흡광도를 측정한 후, 5×SDS(0.156 M Tris-HCl, pH 6.8, 2.5% SDS, 37.5% 글리세롤, 37.5 mM DTT)와 1:4로 섞어 100℃에서 10분간 끓였다. 끓인 시료를 10% SDS-PAGE 겔의 웰에 로딩하고 125 V에서 2시간 동안 시료를 전개한 다음 겔을 쿠마시 염색 방법으로 염색한 후 탈색하여 각각의 재조합 단백질의 발현량을 확인하였다.The protein concentration purified in Example 5-1 was measured by absorbance at 280 nm using a NanoDrop Spectrophotometer (nanodrop, USA), and then 5 × SDS (0.156 M Tris-HCl, pH 6.8, 2.5). % SDS, 37.5% glycerol, 37.5 mM DTT) 1: 1 and mixed and boiled for 10 minutes at 100 ℃. Boiled samples were loaded into wells of a 10% SDS-PAGE gel, the samples were developed at 125 V for 2 hours, and the gels were stained by Coomassie staining and then decolorized to confirm the expression level of each recombinant protein.
그 결과, 도 5에서 나타난 바와 같이 본 발명의 에스터라제는 발현 12 시간 후 시료 속 단백질의 분자량이 약 37 kDa으로 효과적으로 생산되었음을 알 수 있었으며, 이는 에스터라제의 아미노산 배열로부터 추론된 분자량과 상당히 근접하여 이 단백질 밴드가 본 발명의 신규 에스터라제인 것을 확인할 수 있었다. 또한 본 발명의 에스터라제는 수용성 형태로 발현이 이루어지고 있음을 확인할 수 있었다.As a result, as shown in Figure 5, the esterase of the present invention was found that the molecular weight of the protein in the sample was effectively produced at about 37 kDa after 12 hours of expression, which is quite similar to the molecular weight inferred from the amino acid sequence of the esterase. In close proximity, it was confirmed that this protein band is the novel esterase of the present invention. It was also confirmed that the esterase of the present invention was expressed in water-soluble form.
<< 실시예Example 6> 갯벌 6> tidal flat 메타게놈으로부터From metagenome 분리한 Separated 에스터라제의Esterase 특성 조사 Characteristic investigation
실시예 5-1에서 정제한 에스터라제 EstEH112의 pH 및 온도 변화에 따른 효소활성, 다양한 탄소길이를 갖는 기질에 대한 특이성 및 다양한 금속이온과 계면활성제에 대한 영향을 측정하였다. 구체적으로, 효소활성 측정을 위한 반응액은 10 mM 파라-니트로페닐 에스테르(p-nitrophenyl ester) 기질 10 ㎕, 에탄올 40 ㎕, 50 mM 트리즈마 완충액(Tris-HCl, pH 8.0) 940 ㎕, 및 실시예 5-1에서 정제한 에스터라제 효소액 5 ㎕을 첨가하여 5분 또는 60분간 반응시키면서, 기질에서 분해되어 나오는 파라-니트로페놀(p-nitrophenol)을 405 ㎚에서의 흡광도 증가율로 측정하였다. 이때, 1 유닛(U)은 분당 1 μmol의 파라-니트로페놀을 가수분해하여 생산할 수 있는 효소의 양으로 정의하였다.The enzyme activity, specificity for substrates with various carbon lengths, and effects on various metal ions and surfactants of the esterase EstEH112 purified in Example 5-1 were measured. Specifically, the reaction solution for measuring enzyme activity was 10 μl of 10 mM p-nitrophenyl ester substrate, 40 μl of ethanol, 940 μl of 50 mM Trisma buffer (Tris-HCl, pH 8.0), and 5 µl or 60 minutes of reaction was performed by adding 5 µl of the esterase enzyme purified in Example 5-1, and the para-nitrophenol released from the substrate was measured at an absorbance increase rate at 405 nm. At this time, one unit (U) was defined as the amount of enzyme that can be produced by hydrolyzing 1 μmol para-nitrophenol per minute.
<6-1> <6-1> pHpH 에 대한 For 에스터라제의Esterase 특성 characteristic
에스터라제 활성에 대한 pH의 영향을 조사하기 위해, pH 4 내지 12의 다양한 반응액에서 5분간 활성을 측정한 결과 pH 8.0에서 최대의 활성을 나타내었고(도 6a), 상기 다양한 pH에서 60분간 방치한 후 에스터라제의 잔존 활성을 측정한 결과 pH 6.0~11.0의 넓은 범위에서 안정한 것으로 나타났다(도 6b).In order to investigate the effect of pH on the esterase activity, the activity was measured for 5 minutes in various reaction solutions of
<6-2> 온도에 대한 <6-2> for temperature 에스터라제의Esterase 특성 characteristic
에스터라제 활성에 미치는 온도의 영향을 조사한 결과, 10 내지 70℃의 다양한 온도의 반응액에서 5분간 활성을 측정한 결과 50℃에서 최적 활성을 보였고(도 7a), 열에 대한 안정성을 조사하기 위해 각 온도에서 60분간 방치한 후 잔존 효소활성을 측정한 결과 50℃까지의 온도범위에서 그 활성이 유지되어 안정한 것으로 나타났다(도 7b). As a result of investigating the effect of temperature on the esterase activity, the activity was measured for 5 minutes in the reaction solution at various temperatures of 10 to 70 ℃ showed the optimum activity at 50 ℃ (Fig. 7a), to investigate the stability to heat After remaining for 60 minutes at each temperature, the residual enzyme activity was measured and found to be stable as the activity was maintained in the temperature range up to 50 ° C (FIG. 7B).
<6-3> 다양한 탄소길이에 대한 <6-3> for various carbon lengths 에스터라제의Esterase 특성 characteristic
다양한 탄소 길이를 갖는 기질에 대한 특이성을 알아보기 위하여, 상기 반응액의 파라-니트로페닐 에스테르를 C2 내지 C18[파라-니트로페닐 아세테이트(p-nitrophenyl acetate, C2), 파라-니트로페닐 프로피오네이트p-nitrophenyl propionate, C3), 파라-니트로페닐 부틸레이트(p-nitrophenyl butyrate, C4), 파라-니트로페닐 카프로에이트(p-nitrophenyl caproate, C6), 파라-니트로페닐 카프릴에이트(p-nitrophenyl caprylate, C8), 파라-니트로페닐 카프레이트(p-nitrophenyl caprate, C10), 파라-니트로페닐 로레이트(p-nitrophenyl laurate, C12), 파라-니트로페닐 미리스테이트 (p-nitrophenyl myristate, C14), 파라-니트로페닐 팔미테이트(p-nitrophenyl palmitate, C16), 파라-니트로페닐 스티어레이트(p-nitrophenyl stearate, C18)]의 기질로 대체하여 동일한 방법으로 에스터라제 활성을 비교하였다.In order to determine the specificity for the substrates having various carbon lengths, the para-nitrophenyl ester of the reaction solution was selected from C2 to C18 [para-nitrophenyl acetate (C2), para-nitrophenyl propionate p. -nitrophenyl propionate (C3), para-nitrophenyl butyrate (C4), para-nitrophenyl caproate (C6), para-nitrophenyl caprylate (p-nitrophenyl caprylate, C8), para-nitrophenyl caprate (p10), para-nitrophenyl laurate (p12), para-nitrophenyl myristate (p14), para- Esterase activity was compared in the same way by substituting substrates of nitrophenyl palmitate (C16) and para-nitrophenyl stearate (C18)].
그 결과, 도 8에서 나타난 바와 같이 여러 파라-니트로페닐 에스터(p-nitrophenyl ester) 중에서 파라-니트로페닐 카프로에이트(p-nitrophenyl caproate, C6)에 대한 활성이 가장 높았으며, 이는 파라-니트로페닐 카프레이트(p-nitrophenyl caprate, C10)에 비해 그 활성이 약 13배 정도 증가하였다. 따라서 상대적으로 짧은 아실 사슬을 가진 기질을 더 잘 분해하는 EstEH112는 리파제가 아니라 에스터라제임을 알 수 있었다.As a result, as shown in Figure 8 among the various para-nitrophenyl ester (p-nitrophenyl ester) was the highest activity for p-nitrophenyl caproate (p-nitrophenyl caproate, C6), which is para-nitrophenyl cap Compared to the rate (p-nitrophenyl caprate, C10), the activity increased by about 13 times. Therefore, it can be seen that EstEH112, which better decomposes substrates with relatively short acyl chains, is esterase, not lipase.
<6-4> 금속이온에 대한 <6-4> for metal ions 에스터라제의Esterase 영향 effect
하기의 표 2에서와 같은 다양한 농도의 다양한 금속이온에 대한 에스터라제의 활성을 측정한 결과, 대부분 2가 금속이온에 의해 활성이 비슷하거나, 미비하게 증가하는 것을 확인하였다.As a result of measuring the activity of the esterase for various metal ions of various concentrations as shown in Table 2 below, it was confirmed that the activity is similar or insignificantly increased by most divalent metal ions.
<6-5> 계면활성제에 대한 <6-5> for surfactants 에스터라제의Esterase 영향 effect
하기의 표 3과 같은 다양한 농도의 다양한 계면활성제에 대한 에스터라제의 활성을 측정한 결과, 0.1%의 비이온성 계면활성제에 대해서만 활성이 증가하였으며, 나머지 계면활성제에 대해서는 활성이 급격하게 저해되는 것을 확인하였다.As a result of measuring the activity of the esterase for various surfactants of various concentrations as shown in Table 3 below, the activity was increased only for the nonionic surfactant of 0.1%, and the activity was rapidly inhibited for the remaining surfactants. Confirmed.
이상 본 발명을 실시를 통하여 상세히 기술하였으나, 당해 분야의 통상의 지식을 가진 기술자는 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며 이로써 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아님을 이해할 수 있을 것이다.While the present invention has been described in detail through practice, it will be understood by those skilled in the art that these specific techniques are merely preferred embodiments and thus are not intended to limit the scope of the present invention.
도 1은 본 발명의 에스터라제 EstEH112의 염기서열과 아미노산 서열을 나타낸 도이다(*: 정지코돈).1 is a diagram showing the nucleotide sequence and amino acid sequence of the esterase EstEH112 of the present invention (*: stop codon).
도 2는 본 발명의 에스터라제 EstEH112의 아미노산 서열과 이와 유사한 에스터라제의 아미노산 서열사이의 상동성을 비교한 결과를 나타낸 도이다. ▼로 표시돼 있는 아미노산들은 잘 보존되어있는 에스터라제 특이적 세작용기 촉매(catalytic triad)를 나타낸 것이다.Figure 2 shows the result of comparing the homology between the amino acid sequence of the esterase EstEH112 of the present invention and the amino acid sequence of the similar esterase. The amino acids marked with ▼ indicate a well-conserved esterase specific catalytic triad.
도 3은 본 발명의 에스터라제 EstEH112와 높은 상동성을 가지는 여러 에스터라제와의 염기서열을 비교 분석한 것이다.Figure 3 is a comparative analysis of the nucleotide sequence of the various esterases having high homology with the esterase EstEH112 of the present invention.
도 4는 본 발명에 따른 갯벌 메타게놈 유래의 신규 에스터라제 유전자를 포함하는 재조합 벡터 pET22b(+)-EstEH112의 모식도이다.4 is a schematic diagram of a recombinant vector pET22b (+)-EstEH112 comprising a novel esterase gene derived from a tidal flat metagenomic according to the present invention.
도 5는 갯벌 메타게놈 유래 에스터라제 유전자로 형질전환된 대장균에서 목적하는 37 kDa의 에스터라제의 정제를 SDS-PAGE로 확인한 결과를 나타낸 도이다:5 is a diagram showing the results of confirming the purification of the desired 37 kDa esterase in E. coli transformed with the tidal metagenome-derived esterase gene by SDS-PAGE:
레인 1: 분자량 표준 마커; 및,Lane 1: molecular weight standard marker; And,
레인 2: Ni-NTA 컬럼을 통해 최종 순수 정제된 에스터라제.Lane 2: final pure purified esterase through a Ni-NTA column.
도 6은 pH에 따른 에스터라제의 활성과 안정성을 나타낸 그래프이다.6 is a graph showing the activity and stability of the esterase according to the pH.
도 7은 온도에 따른 에스터라제의 활성과 안정성을 나타낸 그래프이다.7 is a graph showing the activity and stability of esterases with temperature.
도 8은 에스터라제의 다양한 탄소 길이를 갖는 기질에 대한 분해활성을 나타낸 그래프이다.8 is a graph showing the degradation activity of the substrate having various carbon lengths of the esterase.
<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology <120> Novel gene encoding esterase derived from tidal flat metagenome and preparation method thereof <130> 8P-03-46 <160> 4 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1020 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> uncultured bacterium <400> 1 atgacaagcc aagaatcaac taccggaaat aaatcccgag aaacagtctg gcggatcggt 60 ccccgaatcc ttccgccacc gactggcggc agcgctgaac tgcgtgacgc tattgccagc 120 atcccccagc ctgatccggc aacgatgaaa atcgagcctc agagcgagga agagtggctc 180 gcggtcatcg cgcagctgga cgcgggcaag gtcgaagcca atcaggccct cagggaacag 240 ctatcggttt ccgttacaca agaagagatt gaggggatca atgtctatca tttgacccca 300 gccgaagtcg atccccggca cgaggatcat ttgttcgtct acctgcatgg cggcgccttc 360 gtgctcaacg ctggcgaagc gggtttagca gaatctatca tcatcgccca ccggctgaag 420 atgcggctga tgcatattga ctaccgcatg ccgcccaaat atcctacccc ggccggaagg 480 gacgatgtag tcaccgtgta caagcacctg ttgaaagaaa gaccggcgcg ttccatggcg 540 atgggcggca cctcaggagg cgcgaatatg accatggcga cggtgcagcg cttgattgag 600 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Asn Val Tyr 85 90 95 His Leu Thr Pro Ala Glu Val Asp Pro Arg His Glu Asp His Leu Phe 100 105 110 Val Tyr Leu His Gly Gly Ala Phe Val Leu Asn Ala Gly Glu Ala Gly 115 120 125 Leu Ala Glu Ser Ile Ile Ile Ala His Arg Leu Lys Met Arg Leu Met 130 135 140 His Ile Asp Tyr Arg Met Pro Pro Lys Tyr Pro Thr Pro Ala Gly Arg 145 150 155 160 Asp Asp Val Val Thr Val Tyr Lys His Leu Leu Lys Glu Arg Pro Ala 165 170 175 Arg Ser Met Ala Met Gly Gly Thr Ser Gly Gly Ala Asn Met Thr Met 180 185 190 Ala Thr Val Gln Arg Leu Ile Glu Leu Gly Leu Asp Val Pro Gly Val 195 200 205 Leu Tyr Leu Gly Thr Pro Gly Thr Asp Val Ser Asn Thr Gly Asp Ser 210 215 220 Trp Ile Ile Asn Glu Gly Ile Asp His Ile Leu Ile Thr Arg Glu Gly 225 230 235 240 Met Leu Glu Ala Cys Val Ala Val Tyr Ala Ala Gly Arg Asp Pro Lys 245 250 255 Asp Pro Leu Val Ser Pro Tyr Tyr Gly Asp Val His Gly Phe Pro Pro 260 265 270 Thr Leu Leu Ile Thr Gly Thr Arg Asp Met Leu Leu Ser Ser Thr Ala 275 280 285 Arg Thr His Ile Lys Leu Arg Gln Ala Gly Val Val Ala Asp Ile Leu 290 295 300 Val Tyr Asp Gly Val Ser His Gly Asp Tyr Ile Phe Val Met Asn Ala 305 310 315 320 Pro Glu Ser Ala His Ala Tyr Ala Glu Leu Asn Ala Phe Leu Leu Gln 325 330 335 His Leu Gln <210> 3 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 3 ccgctcgagt tgtaggtgct gcaatagaa 29 <210> 4 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 4 ggaattccat atgatgacaa gccaagaatc aac 33 <110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology <120> Novel gene encoding esterase derived from tidal flat metagenome and preparation method <130> 8P-03-46 <160> 4 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1020 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> uncultured bacterium <400> 1 atgacaagcc aagaatcaac taccggaaat aaatcccgag aaacagtctg gcggatcggt 60 ccccgaatcc ttccgccacc gactggcggc agcgctgaac tgcgtgacgc tattgccagc 120 atcccccagc ctgatccggc aacgatgaaa atcgagcctc agagcgagga agagtggctc 180 gcggtcatcg cgcagctgga cgcgggcaag gtcgaagcca atcaggccct cagggaacag 240 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