KR100604258B1

KR100604258B1 - 당단백질의 생체내 활성을 증가시키는 방법

Info

Publication number: KR100604258B1
Application number: KR1019990065494A
Authority: KR
Inventors: 박지숙; 이동억; 하병집; 오명석; 고형곤; 정종상
Original assignee: 씨제이 주식회사
Priority date: 1999-12-30
Filing date: 1999-12-30
Publication date: 2006-07-31
Also published as: KR20010065579A

Abstract

본 발명은 당단백질을 생산하는 세포주의 시알리다제(sialidase) 유전자를 변형시켜 시알리다제 생산을 최소화시키고, 생산된 당단백질중 시알릭산(sialic acid)이 유리된 당단백질에 특정 효소를 사용하여 시알릭산을 재결합시킴으로써, 당단백질이 갖는 시알릭산의 함량을 최대화시켜 당단백질의 생체내 활성을 증가시키는 방법에 관한 것이다.

Description

당단백질의 생체내 활성을 증가시키는 방법{Method for enhancing in vivo activity of glycoproteins}

도 1은 Sial36 및 Sial78의 클로닝을 나타내는 도면; 및

도 2는 본 발명에서 상동적 재조합을 일으키기 위해 사용되는 벡터(pKO-ZDSial7836)의 작제도.

본 발명은 당단백질(glycoprotein)이 갖는 시알릭산(sialic acid)의 함량을 최대화시킴으로써, 당단백질의 생체내 활성을 증가시키는 방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 당단백질 생산 세포주의 시알리다제(sialidase) 생산을 최소화시키는 한편, 시알릭산이 유리된 당단백질에 특정 효소를 사용하여 시알릭산을 재결합시킴으로써, 당단백질이 갖는 시알릭산의 함량을 최대화시켜 당단백질의 생체내 활성을 증가시키는 방법에 관한 것이다.

당단백질은 자연계에 존재하는 수많은 당화합물중의 하나로서, 아미노산으로 연결된 폴리펩타이드 사슬에 하나 이상의 당사슬이 결합된 구조를 이루고 있다. 이러한 당구조는 단백질의 성질, 용해성, 수명 및 활성에 영향을 준다. 단백질의 당쇄화(glycosylation)는 유전자에 의해 직접 조절되지 않고 단백질의 번역(translation)이 완료된 후 여러 가지 효소의 수식(modification)에 의해 일어난다. 이들 당단백질중 일부는 생물공학적 방법에 의해 인위적으로 대량 생산될 수 있으며 인간을 위한 귀중한 의약품으로 사용되고 있다.

보통 당사슬은 단백질의 아스파라긴, 세린 또는 트레오닌에 결합하거나, 때때로 카복시 말단에 결합하기도 한다. 단백질중 아스파라긴에 결합하는 당구조를 N-결합 당구조라 하고, 2 개의 N-아세틸 글루코사민(N-acetyl glucosamine)과 3 개의 만노스로 구성된 5당구조(pentasaccharide core)를 공통적으로 갖는다. 이 5당구조에 여러 개의 만노스가 더 결합하여 이루어진 구조를 올리고만노스형(oligo-mannose type) 당구조라 하고, N-아세틸 락토사민(N-acetyl lactosamine unit)이 더 결합하여 이루어진 구조를 컴플렉스형(complex type) 또는 N-아세틸 락토사민형이라고 한다. 또한, 5당구조에 만노스 구조와 락토사민 구조가 함께 결합되어 있는 것을 하이브리드형(hybrid type)이라 한다. 컴플렉스형의 당사슬은 여러 개의 가지(antenna)를 갖는 경우가 있는데, 보통 2 내지 5 개의 가지를 가질 수 있고 끝부분에는 시알릭산, 갈락토스, 또는 퓨코스가 결합되어 있을 수 있다.

시알릭산은 여러 종류의 뉴라민산(neuraminic acid)을 총칭하는 것으로서, 당단백질에서 흔히 나타나는 시알릭산은 N-아세틸 뉴라민산(N-acetyl neuraminic acid(Neu5Ac)) 또는 N-글리코실 뉴라민산(N-glycosyl neuraminic acid(Neu5Gc))이고, 보통 α2-3 또는 α2-6 결합을 하며, 설페이트, 포스페이트, 2-아미노에틸 포 스페이트, 알킬, 아실 그룹과 같은 당이 아닌 물질들이 결합되기도 한다.

폴리펩타이드 사슬중 세린이나 트레오닌에 당사슬이 결합되는 O-결합 당쇄의 경우, N-아세틸 갈락토사민(GalNAc)에 의해 결합되는 뮤신형(mucin type)만이 존재한다. GalNAc에 Gal, GlcNAc, GalNAc 또는 시알릭산이 차례로 결합한다. 당단백질의 당사슬은 단백질이나 핵산과는 다른 요소에 의해 형성되는데, 예를 들면 당사슬이 결합되는 주위의 폴리펩타이드 3차 구조, 수식하는 효소의 활성도, 당 공여체(sugar donor)의 농도 또는 효소가 접근할 수 있는 구조 여부가 당쇄의 최종 구조를 결정한다. 보통 N-결합 당쇄는 폴리펩타이드중 Asn-X-Ser/Thr 서열에 결합되는데, 가능한 Asn-X-Ser/Thr 서열중 1/3 가량만이 실제로 당쇄와 결합한다. 때때로 Asn-X-Cys 서열이 당쇄와 결합하는 경우도 있다. 당사슬에 추가되는 가지의 수는 N-아세틸글루코사미닐 트랜스퍼라제(N-acetylglucosaminyl transferase)의 활성도에 따라 결정된다. 뮤신형의 O-결합 당쇄는 활면 소포체(smooth endoplasmic reticulum)와 골지(Golgi)체에서 생성된다.

당사슬의 형태는 세포의 종류에 따라 각각 다르게 나타난다. 서로 다른 종류의 세포에서 동일한 당단백질을 발현시키면 각각 독특한 당사슬 형태를 나타낸다. 박테리아 세포는 단백질에 당사슬을 형성하지 못한다고 알려져 있었으나, 최근 들어 몇몇 종류의 박테리아 세포는 당사슬을 형성할 수 있는 것으로 밝혀졌다. 효모 세포의 경우, 당쇄화가 일어나며 만노스를 포함하는 O- 및 N- 결합 당쇄를 갖는다. 곤충 세포는 β1-4 갈락토실 트랜스퍼라제(galactosyl transferase) 활성을 갖지 아니하므로 N-결합 당쇄의 맨끝에 만노스 또는 GlcNAc만을 갖는 것이 대부분 이다. 식물 세포를 이용하여 재조합 당단백질을 생산하는 경우, 5당구조에 β1-2 결합된 자일로스 또는 α1-3 결합된 퓨코스가 결합되어 있는 것이 발견된다.

세포배양중 여러 가지 환경적인 요소들로 인하여 당쇄화가 영향을 받기도 하는데, 보통 비정상적으로 짧아진 당쇄가 결합되기도 하고 당 공여체의 농도가 낮아져 단백질의 일부만 당쇄화가 진행되어 단백질의 3차 구조나 용해도에 영향을 미치기도 한다. 배지내 포도당의 감소에 따른 영향은 세포의 종류에 따라 각각 다르게 나타나고, 보통 만노스의 첨가에 따라 이러한 영향은 감소되나 프럭토스, 갈락토스, 이노시톨, 피루베이트 또는 글루타민의 첨가는 별다른 영향을 미치지 못하는 것으로 알려져 있다. 세포의 밀도나 성장속도가 Glc₃Man₉GlcNAc₂ 전구체 생성에 영향을 미쳐 단백질의 당쇄화에 영향을 줄 수도 있다. 호르몬이나 디메틸설폭사이드, 포볼 에스테르(phorbol ester) 또는 레티노익 산(retinoic acid)과 같은 시약은 전사에 작용하여 글리코실 트랜스퍼라제나 글리코시다제와 같은 당쇄화 효소의 농도에 영향을 준다. 호르몬은 소포 트래픽킹(vesicle trafficking)을 방해하여 당단백질이 조면 소포체(rough endoplasmic reticulum)에서 골지체로 옮겨가 가공(processing)되는 것을 방해한다. 암모니아는 아미노산 대사의 부산물로서 세포성장 및 세포활성에 영향을 줄 뿐 아니라 단백질의 당쇄화에도 영향을 준다. 배지에 사용되는 아민이나 EDTA는 pH나 이온 농도를 변화시켜 소포 트래픽킹에 영향을 준다.

당단백질의 생체내 활성은 당쇄구조 말단에 시알릭산의 존재 유무와 큰 상관관계가 있다. 즉, 당단백질에서 시알릭산을 제거하였을 때 당단백질의 생체내 활 성이 사라지는 것을 관찰할 수 있는데, 이는 당단백질에서 시알릭산이 떨어지면서 당쇄구조에서 노출된 갈락토스가 간세포의 갈락토스 결합 단백질에 결합하여 당단백질이 간에서 급속히 분해되기 때문이다.

당단백질을 생산하는 여러 가지 동물세포는 세포내에 시알리다제를 갖고 있는데, 이 효소는 당단백질의 당쇄 부분으로부터 시알릭산을 분리시킬 수 있다. 당단백질 생산을 위한 동물세포 배양시 당단백질은 세포 외부로 방출되므로 세포내 시알리다제의 영향을 받지 않을 것으로 예상되나, 실제로는 당단백질 생산시 많은 수의 시알릭산이 당단백질로부터 유리된다. 최근 문헌에 의하면, 동물 세포의 시알리다제가 세포 외부로 방출되는 것은 회분배양 동안 사멸되는 세포의 세포질로부터 유리되는 것으로 보고되어 있다. 따라서, 장시간에 걸쳐 동물 세포의 회분배양을 수행하는 동안 배양액내의 시알리다제 활성이 점차 증가하는 것을 관찰할 수 있다.

시알리다제로부터 당단백질을 보호하기 위한 몇가지 방법이 알려져 있으나, 가장 근본적인 방법은 동물 세포의 시알리다제를 원천적으로 불활성화시키는 것일 것이다.

본 발명자들은 최근 유전자 조작기술의 발달로 인해 세포 염색체내의 특정 유전자를 불활성화시키는 것이 가능해짐에 따라, 이 기술을 당단백질을 생산하는 세포내의 시알리다제 유전자를 불활성화시키는데 적용할 수 있으리라는 점, 및 특정 효소를 사용하여 시알릭산이 유리되어 노출된 갈락토스에 시알릭산을 재결합시 킬 수 있으리라는 점에 착안하고, 당단백질내 시알릭산의 함량을 최대화시켜 당단백질의 생체내 활성을 증가시킬 수 있는 새로운 방법을 개발해내기 위하여 지속적인 연구를 수행한 결과, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

따라서, 본 발명의 목적은 세포 염색체내의 시알리다제 유전자를 불활성화시켜 세포내 시알리다제 역가가 저하된 당단백질 생산 세포주를 제조하는 방법, 상기 방법에 의해 제조되는, 세포내 시알리다제 역가가 저하된 당단백질 생산 세포주, 및 상기 세포주를 배양하여 당단백질을 수득하는 생체내 역가가 증가된 당단백질의 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또다른 목적은 상기와 같은 방법에 의해 제조된 당단백질중 시알릭산이 유리된 당단백질에 특정 효소를 사용하여 시알릭산을 재결합시킴으로써 생체내 활성이 증가된 당단백질의 제조방법을 제공하는 것이다.

상기한 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 첫째, 본 발명은 불활성화된 시알리다제 유전자를 세포내로 도입하여 염색체내의 시알리다제 유전자와 상동적 재조합(homolous recombination)을 유도하고, 상기 상동적 재조합에 의하여 세포내 시알리다제가 불활성화된 세포를 선별하는 것을 특징으로 하는, 세포내 시알리다제 역가가 저하된 당단백질 생산 세포주의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 방법에 있어서, 상기 불활성화된 시알리다제 유전자는 클로닝된 시알리다제 유전자에 식별 마커(selectable marker)를 삽입함으로써 제조되는 것이 바람직하다.

둘째, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조되는 것을 특징으로 하는, 세포내 시 알리다제 역가가 저하된 당단백질 생산 세포주에 관한 것이다.

셋째, 본 발명은 상기 세포주를 배양하여 당단백질을 수득하는 것을 특징으로 하는, 생체내 활성이 증가된 당단백질의 제조방법에 관한 것이다.

넷째, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 당단백질중, 시알릭산이 유리된 당단백질에 시알릴 트랜스퍼라제(sialyl transferase)를 사용하여 시알릭산을 재결합시키는 것을 특징으로 하는, 생체내 활성이 증가된 당단백질의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 방법에 있어서, 상기 시알릭산은 CMP-시알릭산 합성효소(CMP-sialic acid synthetase)에 의하여 시알릭산과 CTP로부터 형성되는 CMP-시알릭산 형태인 것이 바람직하다.

또한, 본 발명에 따른 방법들에 있어서, 상기 당단백질이 에리트로포이에틴(erythropoietin), 난포 성선자극 호르몬(FSH) 및 조직형 플라스미노겐 활성인자(tPA)로 구성된 그룹으로부터 선택되는 것이 바람직하다.

이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.

본 발명은 분리·정제된 당단백질이 갖는 시알릭산의 함량을 최대화시킴으로써 생체내 활성이 증가된 당단백질을 제조하는 방법에 관한 것이다. 즉, 당단백질을 생산하는 세포주의 시알리다제 생산을 최소화시키고 생산된 당단백질중 시알릭산이 유리된 당단백질에 특정 효소를 사용하여 시알릭산을 재결합시키는 방법에 관한 것이다.

본 발명에 따르면, 먼저 당단백질 생산 세포주의 시알리다제 유전자를 클로닝(cloning)하고(도 1), 식별 마커를 삽입하여 불활성화시킨다. 이와 같이 시알리 다제 유전자내에 이종의 리포터(reporter) 서열를 삽입하여 효소의 발현을 저해한다. 이를 적당한 벡터에 삽입한 후, 이 단편을 당단백질 생산 세포주내로 도입하여 염색체내의 시알리다제 유전자와 상동적 재조합을 유도한다. 식별 유전자에 대한 분석과 시알리다제 활성 분석을 통하여 시알리다제가 불활성화된 세포주를 선별한다.

또한, 본 발명에서는 시알릴 트랜스퍼라제가 시알릭산이 유리되어 노출된 갈락토스에 시알릭산을 재부착시킬 수 있다는 사실을 이용하여, 정제된 당단백질에 시알릴 트랜스퍼라제를 사용하여 시알릭산의 함량을 증가시킴으로써, 수율을 증대시키고 생체내 역가가 낮아(시알릭산의 함량이 낮아) 폐기되는 당단백질을 효소반응을 통해 다시 회수할 수 있게 한다. 시알릭산은 CMP(cytidine 5-monophosphate)와 결합되어야 시알릴 트랜스퍼라제의 기질로 사용될 수 있으나, CMP-시알릭산은 고가의 물질이므로 시알릭산과 CTP로부터 CMP-시알릭산 합성효소를 사용하여 리사이클링(recycling)하는 방법을 시도하였다. CMP로부터 CTP를 생성하기 위해서는 포스포에놀피루베이트(phosphoenolpyruvate(PEP)), 피루베이트 키나제(pyruvate kinase(PK)), 미오키나제(myokinase(MK)) 및 ATP의 첨가가 필요하다. 효소의 반응속도는 기질의 농도에 비례하므로, 당단백질의 용해도와 점도가 허용하는 한 농도를 높게 하는 편이 유리하다.

[실시예]

이하, 본 발명을 바람직한 실시예에 의거하여 보다 구체적으로 설명하고자 하나, 이는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위를 어떤 식으로든 제한하고자 하는 것은 아니다.

[실시예 1] 염색체 DNA의 분리

CHO 세포로부터 시알리다제 유전자를 분리하기 위하여 염색체 DNA를 하기와 같이 추출하였다.

CHO 세포를 배양한 후 세포를 1×10⁸개되도록 모은 후 차가운 PBS로 2 회 세척하였다. 세포를 원심분리관에 가하여 얼음에 채웠다. 500g로 10 분간 4 ℃에서 원심분리한 후, PBS를 가하여 10⁷ 세포/㎖이 되도록 세포를 현탁하였다. 10 ㎖의 세포현탁액에 냉각된 완충용액 C(320 mM 수크로스, 5 mM MgCl₂, 10 mM Tris-HCl, 1% Triton X-100, pH 7.5) 10 ㎖와 냉각된 증류수 30 ㎖를 가하고 여러 번 흔든 후, 얼음속에 10 분간 방치시켰다. 4℃, 1300g에서 15 분간 원심분리하고 상등액을 제거하였다. 다시, 냉각된 완충용액 2 ㎖와 냉각된 증류수 2 ㎖를 가하여 흔들어준 후 4℃, 1300g에서 15 분간 원심분리하였다. 10 ㎖의 완충용액 G2(800 mM GuHCl, 30 mM EDTA, 30 mM Tris-HCl, 5% Tween-20, 0.5% Triton X-100, pH 8.0)를 가하고 10∼30 초간 강하게 흔들어 주었다. 여기에 200 ㎕의 프로티나제(proteinase) K 용액(20 mg/㎖)을 가하였다. 50℃에서 30∼60 분간 방치한 후 키아진 팁(Qiagene tip)을 이용하여 게놈 DNA를 정제하였다.

추출된 DNA를 주형으로 하여 PCR을 시행하였다. 2 개의 PCR 산물을 얻었으며, 각각의 단편들을 "Sial36"{(2.3 Kb)과 "Sial78"(562 bp)로 명명하였다. Sial36은 5' 말단에 HindⅢ 위치, 3' 말단에 KpnⅠ 위치를 포함하고 있으며, Sial78은 5' 말단에 BamHⅠ 위치, 3' 말단에 EcoRⅠ 위치를 포함하도록 하였다. 제한효소로 처리하여 pGEMT 벡터내의 다중클로닝 위치(multicloning site)에 sial36과 sial78을 각각 클로닝하였다(도 1 참조). 다시 pZeoSV2(+) 벡터에 AscI 효소를 처리하여 제오신(Zeocine) 유전자(1236 bp)를 분리하고, pKO Select DT 벡터에 RsrII를 처리하여 DT(디프테리아 독소(Diphteria Toxin)) 유전자(1184 bp)를 각각 분리하여 pGEMT 벡터내에 삽입하였다. 완성된 pKO-ZDSial7836 벡터는 약 7247 bp의 크기를 갖는다. 상기한 바와 같은 벡터의 작제과정을 도 2에 나타내었다.

[실시예 2] 트랜스펙션(transfection)

60 mm 세포배양 디쉬에서 세포를 키워 20∼40% 컨플루언트(confluent)하게 한 후(1∼4×10⁵ 세포/60 mm 디쉬), pKO-ZDSial7836 플라스미드를 준비하였다(0.1 ㎍/㎕ 이상). 준비한 플라스미드 DNA와 세포배지(무혈청, 무항생제) 150 ㎕를 잘 혼합하였다. 수퍼펙트 형질감염 시약(Superfect Transfectin Reagent) 20 ㎕를 가하여 잘 혼합하였다. 실온에서 5∼10분간 반응시킨 후 1 ㎖의 세포배지와 잘 혼합하였다. 상기 혼합물을 CHO 세포가 함유되어 있는 세포배양 디쉬에 가하고 2∼3 시간 동안 37℃, 5% CO₂ 항온기에서 반응시켰다. PBS로 4회 세척한 후 새로운 배지를 5 ㎖ 첨가하였다. 2∼3 일 동안 배지를 교체해주며 배양한 후 세포들을 1:4 스플릿(spilit)하고 제오신을 50 ㎍/㎖ 되게 첨가하였다. 약 7∼10일 동안 제오신이 첨가된 배지로 교체하여 제오신 내성 유전자를 갖지 않는 세포와 음성 대조군(negative control)의 세포들을 모두 사멸시켰다.

[실시예 3] 시알리다제 음성 세포의 선별

제오신 배지에서 선별된 세포들을 400 세포/100 mm 디쉬가 되도록 배양한 후 멸균된 와트만지로 세포 표면을 덮어주었다. 약 11∼14 일간 배양한 후(3∼4 일에 한 번씩 배지 교환) 종이를 꺼내어 PBS로 2 회 세척한 후 건조시켰다. 0.1 mM 4MU NAcNeu (0.1 M 소듐 아세테이트내) 용액에 종이를 담궈 상온에서 1 시간 동안 반응시켰다. 종이를 꺼내어 UV 조사기에 올려놓고 형광 발색을 관찰한 후 사진을 찍었다(660/0.5 sec). 종이를 다시 쿠마시 블루(Coomassie Blue) 용액에 담궈 염색시켰다. 두 개의 사진을 서로 비교하여 형광 발색을 하지 않는 콜로니를 선별하였다. 원래의 세포배양 플레이트로부터 해당하는 콜로니를 트립신 처리하여 분리한 후 별도로 배양하였다.

[실시예 4] 아시알로(asialo)-당단백질의 시알릴화(sialylation)

완충용액으로 50 mM MOPS(4-morpholinepropanesulfonic acid)(pH 7.4)를 사용하고, 반응조건을 30℃, 20∼40 시간으로 하여, 하기와 같이 반응을 진행하였다.

아시알로-EPO(59.4 mg, 0.165 mmol)에 PEP 일칼륨염(34 mg, 0.165 mmol), CMP(2.84 mg, 8.79μmol), 시일릭산(51 mg, 0.165 μmol) 및 ATP(0.532 mg, 0.879 μmol)를 가하고 pH 7.4, 최종 부피 2.2 ㎖로 맞춘 후, 최종농도 30 mM이 되도록 MnCl₂를 가하였다. 또한, 13.2 유닛의 미오키나제(myokinase) 및 19.8 유닛의 피루베이트 키나제(pyruvate kinase)(Boehringer Manheim)를 가하고, 1 유닛의 시알릴 트랜스퍼라제를 가하여 실온에서 반응을 시작하였다. 24시간 및 48시간 후에 각각 샘플을 얻어 IEF 겔 전기영동을 통하여 반응 정도를 관찰하였다.

본 발명에 따르면, 당단백질을 생산하는 세포주의 시알리다제 생산을 최소화시키고 생산된 당단백질중 시알릭산이 유리된 당단백질에 특정 효소를 사용하여 시알릭산을 재결합시킴으로써, 당단백질이 갖는 시알릭산의 함량을 최대화시켜 당단백질의 생체내 활성을 획기적으로 증가시킬 수 있게 된다.

Claims

불활성화된 시알리다제(sialidase) 유전자를 세포내로 도입하여 염색체내의 시알리다제 유전자와 상동적 재조합(homolous recombination)을 유도하고, 상기 상동적 재조합에 의하여 세포내 시알리다제가 불활성화된 세포주를 배양하여 생체내 활성이 증가된 당단백질을 수득하는 단계; 및

전 단계에서 수득한 당단백질 중, 시알릭산이 유리된 당단백질에 시알릴 트랜스퍼라제(sialyl transferase) 및 CMP-시알릭산을 사용하여 시알릭산을 재결합시키는 단계를 포함하되,

상기 CMP-시알릭산은 CMP-시알릭산 합성효소(CMP-sialic acid synthetase)에 의해 시알릭산과 CTP로부터 형성되는 것을 특징으로 하는 생체내 활성이 증가된 당단백질의 제조방법.
제 1 항에 있어서, 상기 불활성화된 시알리다제 유전자가 클로닝된 시알리다제 유전자에 식별 마커(selectable marker)를 삽입함으로써 제조되는 것인 방법.
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제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 당단백질이 에리트로포이에틴, 난포 성선자극 호르몬(FSH) 및 조직형 플라스미노겐 활성인자(tPA)로 구성된 그룹으로부터 선택되는 것인 방법.