JPH05504480A - 糖タンパク質、糖脂質上の、又は遊離分子としてのオリゴ糖構造の合成のための、並びにこれらの構造を決定するクローン化した遺伝配列の単離のための方法及び生成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 糖タンパク質、糖脂質上の、又は遊離分子としてのオリゴ糖構造の合成のための 、並びにこれらの構造を決定するクローン化した遺伝配列の単離のための方法及 び生成物 技術分野 本発明は、糖タンパク質、糖脂質上の、又は遊離分子としてのオリボラ又は多糖 構造の合成のだめの方法及び生成物に関する。

背景技術 炭水化物は、生物学的な化合物の重要なりラスである。細胞において、炭水化物 は、粘度を調節し、エネルギーを貯蔵し、又は細胞表面のキーコメント（ｋｅｙ ｃｏａｎｅｎｔ）である構成成分として機能する。はとんど全ての位置特異的細 胞内作用は、細胞表面の炭水化物に関係する。例えば、***及び卵子の結合、並 びに受精卵の着床には、いずれも細胞表面炭水化物が介在する。同様に、細胞結 合分子として機能する多くのタンパク質、例えばＧＭＰ−１４０、ＥＬＡＭ−１ 、及びＭｅｌ−１４のようなリンパ球結合分子は、レクチンを模倣し、特定の細 胞表面炭水化物構造を結合すると考えられる構造的性質を示す（Ｓｔｏｏｌｍａ ｎ、　Ｃｅ１ｌ　（１９８９）５飢９０７−９１０）。現在、腫瘍関連抗原のよ うなグリコジル化タンパク質が、多くの癌の存在を確認するために使用されつつ ある。単離されたオリゴ糖類でさえ、それら自身について生物学的活性を示すこ とが見出された。

特定のガラクトースグリコ糖類が、赤血球細胞による尿路病原性大腸菌の凝集反 応を抑制することが知られている（米国特許第４．５２１．５９２号）。他のオ リゴ糖類は、プラスミノーゲンアクチベーターのレベルを増加することにより、 潜在的な抗トロンビン活性を有することが示されてきた（米国特許第４．８０１ ．５８３号）。

この同じ生物学的活性は、オリゴ糖類をアミノ糖タンパク質と繋げて治療用具に 結合することにより、抗凝固作用を育する治療表面を与えるために使用されてき た（米国特許第４．８１０．７８４号）。さらに、他のオリゴ糖類については、 ゲノム陽性菌抗生物質及び殺菌剤としての用途が見出されてきた（米国特許第４ ．８５１．３３８号第４．６６５．０６０号）。さらに、オリゴ糖類は、特定の 細菌の診断及び同定における細菌レセプター部位として使用されてきた（米国特 許第４．６５７．８４９号及び第４、７６２．８２４号）。

オリゴ糖類が、それらが結合するタンパク質又は脂質に対する影響を育すること も良く認識されている（Ｒａｄｅｏｍｃｈｅｒ　ｅｔ　ａｌ、　Ａｎｎ、　Ｒｅ ｖ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、、　（１９８８）、　５７：７８５）。特定のオリゴ糖 類が、タンパク質、安定性、タンパク質分解速度、１ｎｖｉｖｏでの血流からの クリアランス速度、熱安定性及び溶解性に影響を与えることが示されてきた。細 胞表面炭水化物のオリゴ糖部分における変化が、癌化してきた細胞内において注 目されてきた。他のオリゴ糖の変化は細胞の分化の間に検出されてきた（Ｔｏｏ ｎｅ　ｅｔ　ａｌ、　Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｒｅｐｏｒｔ　（１９８９）　 ４５（１７）：５３６５−５４Ｚ２）B このように、生物学的機能についてのオリゴ糖類の重要性は枚挙にいとまがない 。

これらの材料の分子生物学における基本的な役割は、多大な研究の目的となり、 特にこれらの材料を合成する肴機合成においてかなりの努力がなされてきた。炭 水化物を製造する合成アプローチは極めて発達しているが、この技術は、可能な 合成経路において要求される選択的保護及び脱保護段階に関して、顕著な困難性 を有している。これらの困難性は、炭水化物を単離及び生成し、それらの構造を 決定することに関する困難性と相伴って、合成有機化学において価値ある炭水化 物を経済的に製造することを実質的に不可能にしている。

酵素媒介触媒合成は、炭水化物（例えばオリゴ糖類及び／又は多糖釦を、非常に 高い収率で、経済的に、水溶液内で緩和な条件下で、望ましくない副生成物を確 認しうる量で生成することなく製造するという、旧来の有機合成経路を上回る劇 的な効果を与えつる。そのような酵素には、グリコジルトランスフェラーゼも含 まれるが、これらのタンパク質はほんの低濃度で見出されるにすぎず、しかも膜 結合しているので、特に、真核、例えば哺乳類の供給源から単離することが困難 である。

今日までに、アミノ酸配列の情報又は抗グリコジルトランスフェラーゼ抗体を要 求する標準的な分子クローニングの試みは、β（１，４）ガラクトシルトランス フェラーゼ（ｉｎ　＋９８６）及びａ　（２，６）シアリル（ｓｉａｌＹｌ）　 トランスフェラーゼ（ｉｎ　１９８７）に対応する真核細胞、例えば哺乳類のグ リコジルトランスフェラーゼｃＤＮＡの二つの単離にのみ成功して使用されてい る。従って、上記の炭水化物の多大な価値に鑑みれば、さらに別のグリコジルト ランスフェラーゼ遺伝子及びｃＤＮＡの単離についての改良方法、並びに炭水化 物合成におけるそれらの使用が強く望まれている。

発明の開示 従って、本発明の目的は、真核細胞、例えば哺乳類のグリコジルトランスフェラ ーゼ遺伝子及びｃＤＮＡを容易に単離する方法を提供することにある。

本発明の別の目的は、これらに関連する遺伝子及びｃＤＮＡを修飾して対応する 修飾されたグリコジルトランスフェラーゼを得ることにある。本発明の別の目的 は、これらの未修飾の及び修飾された単離された遺伝子及びｃＤＮＡを提供する ことにある。これらは、例えば細胞表面オリゴ糖構造を、遺伝子トランスファー アプローチ（ｇｅｎｅ　ｔｒａｎｓｆｅｒ　ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ）により又は ｉｎ　ｖｉｔｒｏでのグリコジル化反応により修飾することに使用される。

本発明者らは、本発明において、本発明の上記目的の全て、並びに下記に示す本 発明の記載かられかる他の目的を満足する遺伝子トランスファーアプローチを発 見した。本発明の方法論には、グリコジルトランスフェラーゼの基質及びアクセ プターの性質についての情報が存在するという利点があり、これらの酵素の細胞 表面発現オリゴ糖生成物に特異的な多数の抗体及びレクチン試薬を利用する。

図面の簡単な説明 第１図は、第２図及び第３図は、本発明により提供さね、グリコジルトランスフ ェラーゼをコードする三つのＤＮＡ配列（配列（１）　、（ＩＩ）及び（１１■ ））を提供する。

第４図及び第５図は、ＧＤＰ−ＦｕＣ：　［β−Ｄ−Ｇａｌ　（１，４）　）− Ｄ−ＧｌｃＮａｃ　ａ　（１，３）−７Ｄジルトランスフェラーゼをコードする ＤＮＡ配列を提供する。

本発明を実施するためのベストモード 一般的に、本発明は、細胞の翻訳後の性質を用いることによる、細胞からの遺伝 子及び／又はｃＤＮＡの単離方法を提供する。この遺伝子及び／又はｃＤＮＡが 単離されうる細胞は、単細胞生物又は多細胞生物からの細胞のいずれでもよい。

本発明の内容において、特定の細胞の翻訳後の性質とは、タンパク質又は脂質に １種又はそれ以上の単糖類を共有結合させる酵素的方法により、又はタンパク質 又は脂質分子からそのような置換基を特異的に除去する酵素的方法により、タン パク質又は脂質を修飾する細胞の能力と定義される。

一つの実施態様において、本方法は、下記の四つの基本的ステップを含む。

（１）有益な翻訳後の性質、即ち、特定の膜結合オリゴ糖類又は多糖類（即ち、 糖タンパク質又は糖脂質）、又は溶解性オリゴ糖類又は多糖類、又は特別な酵素 活性（ｖｉｄｅ　１ｎｆｒａ）を育するドナー真核細胞（例えば哺乳類の）を単 離すること。

（１１）ドナー真核細胞（例えば哺乳類の）の遺伝材料からｃＤＮＡ又はゲノム ＤＮＡのいずれかの遺伝子ライブラリーを製造すること。

（ｉｉｉ）真核細胞（例えば哺乳類の）である宿主細胞をこの遺伝子ライブラリ ーで形質転換すること：並びに （ｌい形質転換された宿主細胞を、有益な翻訳後の性質を有する宿主細胞につい てスクリーニングすること。

現在この翻訳後の性質を有する宿主細胞は、有益な翻訳後の性質に関連する遺伝 情報を含む。その後、下記に示す技術を用いて、遺伝情報（遺伝子）を形質転換 された宿主細胞から回収して、標準的なアプローチ、即ち、Ａｘｅｌ　ｅｔ　ａ ｌ　（米国特許第４．６３４．６８５号）又はＧ１１ｂｅｒｔ　ｅｔ　ａｌ（米 国特許第４．４１１．９９４号）により使用して、大量の遺伝子生成物、即ち翻 訳後の性質の原因となるグリコジルトランスフェラーゼを製造することができる 。

上記の工程（ｉ）において、ドナー真核細胞（例えば哺乳類の）は、細胞の抽出 物において特異的な酵素活性を検出すること、又は細胞の膜結合又は溶解オリゴ 糖類又は多糖類を検出することに基づいて単離される。

従って、一つの実施態様において、細胞抽出物中で検出される酵素活性は、翻訳 後にグリコジル化又はグリコジル修飾によりタンパク質を修飾する動物の酵素に 起因する酵素活性でありうる。この酵素活性は、これらの酵素の一つの基質特異 性を用いて検出されつる。そのような基質は知られている。

別の実施態様においては、上記の工程（ｉ）において、細胞は、特定の細胞膜結 合オリゴ糖類及び／又は多糖類の検出に基づいて単離される。

別の実施態様においては、工程（ｉ）における細胞は、細胞抽出物中の溶解オリ ゴ糖類及び／又は多糖類の検出に基づいて単離される。

本発明は、遺伝子生成物についてのアミノ酸配列の情報を得ること、又は遺伝子 生成物に特異的な抗体が入手可能であることを要求することのない、生物からの 遺伝子を単離することを目的とする新規な遺伝子トランスファーアプローチを提 供する。例えば、特定の酵素をコードする遺伝子がめられている場合に、細胞培 養物は公知且っ標準的な方法によりスクリーニングされて、発現可能な目的の遺 伝子を含む細胞が、細胞抽出物中で特異的な酵素活性（有益な酵素に対応し、従 って、細胞はめられている酵素に対する遺伝子を含む）を検出することにより確 認される。細胞のオリゴ糖類又は多糖類の膜成分が有益である場合には、そのよ うな膜特性を有する細胞か単離される。溶解オリゴ糖類又は多糖類が有益である 場合には、その細胞抽出物中で検出可能な溶解オリゴ糖類又は多糖類を有する細 胞か単離される。

そのような細胞が一度単離されれば、この単離した細胞をベースとする遺伝子ラ イブラリーが得られる。この遺伝子ライブラリーは、ｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡ のいずれでもよい。好ましい実施態様において、単離された細胞を特定の試薬と 接触させることによりその有益な翻訳後の性質を強化しうることが知られた場合 には、この試薬をこの細胞中のｆｆｌＲＮＡシグナル、及び／又は遺伝子それ自 体の強化を達成し、続いて特定の遺伝子に対応する増輻されたｃＤＮＡ、又は増 輻された遺伝子断片を製造するために使用する。一方、ｃＤＮＡＥｔびゲノムＤ ＮＡ遺伝子ライブラリーのいずれも公知技術を用いて得ることができる。一度遺 伝子ライブラリーが得られれば、これは、公知技術（例えば、リン酸カルシウム 沈澱法、リポソームトランスフェクション、ＤＥＡＥデキストラントランスフエ クショスマイクロインジエクション等）を用いて宿主細胞を形質転換するのに使 用される。

本発明において使用されうる宿主細胞は、好ましくは所望の翻訳後の性質のレク チン又は抗体検出が可能なものである。即ち、膜結合オリゴ糖類、多糖類、又は 形質転換された宿主細胞において製造される糖タンパク質又は糖脂質のレクチン 又は抗体検出が可能なものである。しかしながら、そのようなレクチン又は抗体 検出が可能でない宿主細胞のスクリーニングは、本発明による酵素活性のスクリ ーニングにより達成してもよい。

（Ａ）宿主細胞は、酵素（グリコジルトランスフェラーゼ）の触媒機能を可能に し且つ保持するために真核細胞（例えば、哺乳類の）であるべきである。（Ｂ） 宿主細胞は所望のものと同様のグリコジルトランスフェラーゼ活性及び同起源の 生酸物を発現すべきではない。グリコジルトランスフェラーゼ関連遺伝子を用い て宿主細胞の形質転換が成功したことは、細胞抽出物中の対応する酵素活性を検 出することにより決定されうる。（Ｃ）別の性質において、宿主細胞は適当な糖 ヌクレオチド物質の合成及びそのゴルジ体（ここにグリコジルトランスフェラー ゼ触媒ドメインが存在し、機能する）への輸送ができるべきである。実質的には 、全ての野性株の動物細胞がこの機能を有する。ＣＤ）宿主細胞は、所望のグリ コジルトランスフェラーゼが要求する適当なアクセレーター物質（オリゴ糖類、 脂質又はタンパク質）を合成する能力を有するべきであり、該細胞は細胞表面に 該構造を示さなければならず、細胞環境／培地中にそれを放出しなければならな い。（Ｅ）宿主細胞は、所望のグリコジルトランスフェラーゼの発現をコードす るか、さもなければ決定するトラスフェクションされた配列の発現を可能にする か、それを提供すべきである。これは真核細胞の（例えば哺乳類の）において、 真核細胞（例えば哺乳類の）ゲノムＤＮＡ　トランスファーに固有のものである か、または公知の技術を用いてｃＤＮＡ発現システムに対して選択されるベクタ ーシステムに固有のものである。（Ｆ）宿主細胞は、関連するグリコジルトラン スフェラーゼの発現をコードするか、さもなければ決定するトランスフェクショ ンされた配列のレスキュー（ｒｅｓｃｕｅ）を可能にすべきである。

野性株の真核細胞（例えば哺乳類の）は、これらの遺伝的な性質を有する。上記 で定めた基準（３）又は（Ｄ）を有しないいかなる特定の育益な野性株の真核細 胞も、標準的な技術を用いて突然変異を起こし、これらの基準のいずれかを有す る突然変異細胞を得てもよい。酵素分析に基づく選択方法が使用される場合には 、上記基準（Ｃ）及び（Ｄ）は必要ない。

一度宿主細胞が形質転換されてしまうと、その集団は目的の遺伝材料を有する宿 主細胞についてスクリーニングされる。これは、宿主細胞か目的とする翻訳後の 性質を有するかどうか決定することにより、即ち、形質転換された宿主細胞の抽 出物中の酵素活性を検出するか、細胞上の膜結合オリゴ糖類又は多糖類を検出す るか、又は細胞抽出物中の溶解オリゴ糖類又は多糖類を検出することにより行わ れる。試験に陽性の宿主細胞は単離され、これらの形質転換された細胞から目的 の遺伝子が回収されつる。

宿主細胞かゲノムＤＮＡトランスフエフシコンにより形質転換される場合には、 遺伝子レスキューは、下記のように行われうる。・（ａ）種特異性の繰り返し配 列によるトランスフェクションされたゲノム配列のタゲノム配列のタギング。

ｃＤＮＡが宿主細胞の形質転換に使用される場合には、遺伝子／ｃＤＮＡレスキ ューは下記のように行われつる。

（ａ）Ｈｉｒｔ法によるエビソマルレスキュー、又は（ｂ）プラスミドタグによ る挿入されたコピーレスキュー適当な宿主細胞の例には、下記のものが含まれる ：（１）ヒト血液ｕ（Ｈｕｍａｎ　Ｂｌｏｏｄ　Ｇｒｏｕｐ）　Ｈα（１，２） フコシル−トランスフエラーＡ）Ｌ細胞宿主−マウス株 Ｂ）α（１，２）フコシルトランスフェラーゼ活性を発現しない。細胞表面上で Ｆｕｃａ（１，２）　Ｇａｌ構造を発現しない。

Ｃ）　ＧＤＰ−フコース、α（１，２）フコシルトランスフェラーゼの糖ヌクレ オチド基質の合成を行う。

Ｄ）酵素のためのアクセプター物質であるＧａｌβ（１，４）ＧｌｃＮＡｃ−Ｒ 分子を合成し、細胞表面でそれらを発現する。

Ｅ）マウス細胞はヒト遺伝子を発現しうることが知られている。

Ｆ）マウス細胞はヒトＡｌｕ繰り返しＤＮＡ配列と同様のＤＮＡ配列を含まない 。これらのＡｌｕ配列（種特異性繰り返し配列）は、マウストランスフエクタン ト細胞系からヒト遺伝子を同定し、最終的にレスキューするために使用された。

Ａ）　ＳＶ４０ウィルスラージＴ抗原を発現する腎臓細胞系−〇〇Ｓ−１細胞系 、サル種Ｂ）　α（１，３）ガラクトシルトランスフェラーゼ活性を発現しない 。細胞表面上てＧａｌ　α（１，３）　Ｇａｌ構造を発現しない。

Ｃ）　ＵＤＰ−ガラクトース、α（１，３）ガラクトシルトランスフェラーゼの 基質の合成を行う。

Ｄ）酵素のためのアクセプター物質であるＧａｌβ（１，４）ＧｌｃＮＡｃ−Ｒ 分子を合成し、細胞表面でそれらを発現する。

Ｅ）　ｃＤＮＡライブラリーのためのｃＤＮＡ／ｃＯ３−１細胞発現系−桿準技 術Ｆ）　ｃＤＮＡライブラリーのためのｃＤＮＡ／ＣＯ５−１細胞発現系−標準 技術ＣｌＩＤヒトルイス血液Ｗ（Ｈｕｍａｎ　Ｌｅｗｉｓ　Ｂｌｏｏｄ　Ｇｒｏ ｕｐ）　ａ（１，３／１．４）フコシルトランスフェラーゼ−Ｊ、Ｆ、Ｋａｋｏ ｗｓｋａ−Ｌａｔａｌｌｏ　ｅｔ　ａｌ、　Ｇｅｎｅ　ａｎｄ　Ｄｅｖｅｌｏｐ ｍｅｎｔ　（＋９９０j ４：　１２８８−１３０３ Ａ）　ＳＶ４０ラージＴ抗原を発現する腎臓細胞系−ＣＯＳ−１細胞系、サルＢ ）　α（１，３）フコシルトランスフェラーゼ活性を発現しない。細胞表面Ｇａ ｌβ（１，４）［Ｆｕｃ　α（１，３）］Ｇｌｃ　ＮＡｃ−Ｒ構造を発現しない 。

Ｃ）ＧＤＰ−フコース、α（１，３）フコシルトランスフェラーゼの基質の合成 を行う。

Ｄ）酵素のためのアクセプター物質であるＧａｌβ（１，４）ＧｌｃＮＡｃ−Ｒ 分子を合成し、細胞表面でそれらを発現する。

Ｅ）　ｃＤＮＡライブラリーのためのＣＤＭ　７／ＣＯ３−１細胞発現系−標準 技術Ｆ）　ｃＤＮＡライブラリーのためのＣＤＭ　７／ＣＯ５−１細胞発現系− 標準技術この遺伝子の選択の後の方の工程においては、ｃＤＮＡクローンのプー ルはそれらをＣＯ３−１細胞にトランスフェクションし、その後、トランスフェ クションされた細胞から製造された抽出物を直接分析することによりα（ｌ、３ ）フコシルトランスフェラーゼ活性についてスクリーニングされたため、基準Ｃ 及びＤは必要ではないであろう。

その実施態様の一つにおいて、本発明は、グリコジルトランスフェラーゼをコー ドする遺伝子を単離する方法、並びにこれにより単離された遺伝子を提供する。

このグリコジルトランスフェラーゼは、フコシルトランスフェラーゼ、シアリル トランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、ガラク トシルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ 、マンノシルトランスフェラーゼ、スルホトランスフェラーゼ、グルコシルトラ ンスフェラーゼ、アセチラーゼ、又は別のグリコジルトランスフェラーゼであり うる。

個々のグリコジルトランスフェラーゼは、特に、酵素によりトランスファーされ る異なるタイプの糖に関連するものとして知られている（Ｂａｙｅｒ　ｅｔ　ａ ｌ、　Ａｄｖ、　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　（１９８２）　５２：　２３−１７５ ．ここに参考文献として挿入されル）。従ッテ、細胞内又は細胞上のオリゴ糖類 、糖タンパク質又は糖脂質に見出される特定の種類の糖結合は、特定のグリコジ ルトランスフェラーゼに関連する。方法は、そのような連結（Ｂａｙｅｒ　ｅｔ 　ａｌ、前掲書参町を確認するために知られており、本発明により対応するグリ コジルトランスフェラーゼをコードする遺伝子を単離するために使用することが できる。

シアリルトランスフェラーゼは、本発明により提供されるグリコジルトランスフ ェラーゼの−っであり、下記のシアル酸連結に関連する：（１）Ｓｉａα２→６ Ｇａｌ；（２）Ｓｉａα２　＋３Ｇａｌ；　（３）Ｓｉａα２−＋６ＧａｌＮａ ｃ；　（４）Ｓｉａ　ａ２−＋６Ｇ１ｃＮＡｃ；　（５）Ｓｉａ　ａQ −＋８Ｓｉａ：　（６）Ｓｉａα２−＋４Ｇａｌ及び（７）Ｓｉａα２−＋４Ｇ ｌｃＮＡｃ　。

フコシルトランスフェラーゼは、本発明により提供される別のタイプのグリコジ ルトランスフェラーゼであり、下記の連結に関連する：（１）Ｆｕｃａ（ｌ→２ ）Ｇａｌ　β−：　（２）　Ｇａｌβ（１→３）［Ｆｕｃｃｚ（１→４）］Ｇ１ ｃＮＡｃβ−；　（３）　Ｇａｌβ（１＝４）［Ｆｕｃａ（１−＋３）］Ｇｌｃ ＮＡｃβ−：　（４）　Ｇａｌβ（１−４）［Ｆｕｃａ（１→３）］Ｇｌｃ；　 （５）−ＧｌｃＮＡｃβ１−＋４）［Ｆｕｃａ　（１→６）　］Ｇ１ｃＮＡｃβ −Ａｓｎ：　（６）−Ｇ１ｃＮＡｃβ（１−４）、　［Ｆｕｃ　α（１→３）］ Ｇ１ｃＮＡｃβｉ　−Ａｓｎ；（７）Ｆｕｃａ（１−＝６）Ｇａｌβ→：（８） Ｆｕｃ　α（１−＋３）Ｇａｌβ−：（ａ）Ｇｌｃβ１−ｅ３Ｆｕｃα−＋０− Ｔｈｒ及１ｕｃ　（２１−＋０−Ｔｈｒ／Ｓｅｒ：　（１０）　Ｆｕｃｌ　＋セ ラミド：及び０１）Ｆｕｃ　ａｌ　−ｅ３Ｆｕｃ。

さらに本発明により提供されるＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ は、下記の連結に関連する：　（１）ＧｌｃＮＡｃβ１−４ＧｌｃＮＡｃ；（２ ）Ｇ１ｃＮＡｃβ１−＋Ａｓｎ：（３）ＧｌｃＮＡｃβ１−２Ｍａｎ：（４）Ｇ １ｃＮＡｃβ１　→４Ｍａｎ：（５）ＧｌｃＮＡｃβ１−６Ｍａｎ：（６）Ｇ１ ｃＮＡβ１→３Ｍａｎ：（７）ＧｌｃＮＡｃαｌ　−３Ｍａｎ：（８）Ｇ１ｃＮ Ａｃβ１−３Ｇａｌ（９）Ｇ１ｃＮＡｃβ１　→４Ｇａｌ　；（１０）Ｇ撃■ ＮＡｃβＩ　−”６Ｇａｌ：（１１）ＧｌｃＮＡｃ　ａｌ−４Ｇａｌ：（１２） ＧｌｃＮＡｃ　ａｌ　−”４Ｇｌｃ？ＪＡｃ：（１３）ＧＩモmＡｃ βＩ　→６ＧａｌＮＡｃ：（１４）ＧｌｃＮＡｃβ１　→３ＧａｔＮＡｃ；（＋ ５）Ｇ］ｃＮＡｃβ１　→４ＧＩｃＵＡ：（１６）Ｇ１ｃＮ`ｃ αｌ→４ＧｌｃＵＡ　：（１７）Ｇ１ｃＮＡｃαｌ→４１ｄＵＡ。

さらに本発明により提供されるガラクトシルトランスフェラーゼは、下記の連結 に関連する：　（１）Ｇａｌβｌ−４Ｇ１ｃ；（２）Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡ ｃ；（３）Ｇａｌβ１　→３ＧｌｃＮＡｃ、（４）ＧａｌβＩ　−６Ｇ１ｃＮＡ ｃ：（５）Ｇａｌβ１−Ｇａ１ＮＡｃ：（６）Ｇａｌβ１−＋６ＧａｌＮＡｃ： （７）Ｇａｌαｌ　−３ＧａｌＮＡｃ：（８）Ｇａｌαｌ　−”３Ｇａｌ：（９ ）Ｇａｌ　ａｌ　−４Ｇａｌ：（１０）Ｇａｌβ３１−３Ｇａｌ：（＋１）Ｇａ ｌ■■ −４Ｇａｌ：（１２）Ｇａｌβ１−＝６Ｇａｌ：（１３）Ｇａｌβ１　→４ｘｙ １ｏｓｅ；（１４）Ｇａｌβ１４１’スフィンゴシン：（１５）Ｇａｌβ１−１ ’セラミド：（＋６）Ｇａｌβ１→３ジグリセリド：（１７）Ｇａｌβ１→０− ヒドロキシリシン、及び（１８）Ｇａｌ−Ｓ−システィン。

さらに本発明により提供されるＮ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラー ゼは、下記の連結に関連する （ｌＸＧａｌＮＡｃαｌ　→３）［（Ｆｕｃ　ａｌ−２）］Ｇａｌβ−＋（２） ＧａｌＮＡｃ　ａｌ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ：（３）ＧａｌＮＡｃβ１　→４Ｇａｌ　 ：（４）ＧａｌＮＡｃａｌ　−３Ｇａｌ：（５）ＧａｌＮＡｃａｌ−３ＧａｌＮ ａｃ：（６ＸＧａｌＮＡｃβｌ→４ＧｌｃＵＡβ１−３）、　；（７ＸＧａｌＮ Ａｃβ１−４ｄＵＡαｌ　−３−）　、　：（８）−Ｍａｎβ−＋６ａｌＮＡｃ −”Ｇ１．ｅm ａｃ→Ａｓｎ。

本発明により提供される他のグリフジルトランスフェラーゼは、下記の連結に関 連する。

Ｇａ１ＮＡｃに Ｇａｌβｌ−３ＧａｌＮＡｃ Ｇａｌβ１−４ＧａｌＮＡｃ Ｇａｌ　ａ　１−３ＧａｌＮＡｃ Ｇａ１ＮＡｃβｌ−３Ｇａ　１ＮＡｃ Ｇ１ｅＮＡｃｌβ１−６ＧａｌＮＡｃ ＧａｌＮＡｃβｌ−３０ａｌＮＡｃ Ｓｉａα２−３ＧａｌＮＡｃ Ｓ　ｉａ　ａ　２−６Ｇａ　１ＮＡｃ Ｇａｌに Ｇａｌβｌ−３Ｇａｌ Ｇａｌαｌ−３０ａｌ Ｆｕｃαｌ−２Ｇａｌ ＧＩｃＮＡｃβｌ−３Ｇａｌ ＧｌｃＮＡｃβ１−４Ｇａｌ Ｇ１ｃＮＡｃβ１−６Ｇａｉ Ｇ１ｃＮＡｃαｌ−４Ｇａｌ ＧａｌＮＡｃａｌ−３Ｇａｌ ＧａｌＮＡｃａｌ−３Ｇａｌ ＧａｌＮＡｃβ１−３Ｇａｌ Ｇａ１ＮＡｃβ−４Ｇａｌ Ｓ　ｉａ　ａ　２−３Ｇａ　Ｉ Ｓ　ｉａ　ａ　２−６Ｇａ　Ｉ Ｇｌｃに Ｍａｎαｌ−６Ｇｌｃ Ｉｍｎａｌ−４Ｇｌ１ 一６ＧｌｃＩに Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ Ｇａｌβｌ−３Ｇ１ｃＮＡｃ Ｆｕｃ　ａ　ｌ−３ＧｌｃＮＡｃ Ｆｕｃ　ａ　１−４Ｇ１ｃＮＡｃ Ｇｌｃａｌ−４０ＩｃＮＡｃ ＧｌｃＮＡｃαｌ−４Ｇ１ｃＮＡｃ Ｓｉａα２−４ＧｌｃＮＡｃ Ｓｊａに Ｓ　ｉａ　ａ　２−８Ｓ　ｉａ タンパク質に Ｇａ１ＮＡｃ　ａ　ｌ−０−Ｓｅｒ／Ｔｈｒさらに、本発明により提供される他 のグリコジルトランスフェラーゼは下記のものを含む：β１．４−ＧｌｃＮＡｃ −β１−３−グルクロニルトランスフェラーゼ、グルクロン酸−β１．４−Ｎ− アスパラギンＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、アスパラギンＮ −アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、セリンβ−キシロシルトランス フェラーゼ、キシロースβ１．４−ガラクトシルトランスフェラーゼ、ガラクト ースβ１．３−ガラクトシルトランスフェラーゼ、ガラクトースβ１．３−グル クロニルトランスフェラーゼ、グルクロン酸β１．４−Ｎ−アセチルガラクトサ ミニルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルガラクトサミンβ１．３−グルクロニ ルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルガラクトサミン−４−スルホトランスフェ ラーゼ、Ｎ−アセチルガラクトサミン−６−スルホトランスフェラーゼ、了スバ ラギンーβ−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、セリン／スレオ ニン−α−Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルグ ルコサミンβｌ、４−ガラクトサミニルトランスフェラーゼ、ガラクトース−β １．３−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルグルコ サミン−６−スルホトランスフェラーゼ、ガラクトース−６−スルホトランスフ ェラーゼ、グｌレクロン酸−α１．４−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフ ェラーゼ、ガラクトース１．６−Ｎ−アセチルガラクトジルトランスフエラーゼ 、Ｎ−アセチルグルコサミンβｌ。

４−グルクロニルトランスフェラーゼ、ヘパリン−Ｎ−アセチル−グルコサミン Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ、ヘパリンＮ−アセチルグルコサミンスルホト ランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミン−Ｇ１，４−グルクロニルエピメ ラーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−スルホトランスフェラーゼ、Ｎ−アセ チルグルコサミン−Ｎ−スルホトランスフェラーゼ、グルクロニル−Ｇ１，４− Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、イズロニルー２−スルホトラ ンスフェラーゼ、イズロニルーβ１，４−Ｎ−アセチルガラクトサミニルトラン スフェラーゼ、及びＮ−アセチルガラクトサミン−Ｇ１，３−グルクロニルエピ メラーゼ。

これらの酵素は、結合組織多糖類における以下の結合およびオリゴ糖構造と関連 かある（ロデンら（Ｒｏｄｅｎ、　Ｌ、”５ｔｒｕｃｔｕｒｅ　ａｎｄ　Ｍｅｔ ａｂｏｌｉｓｍ　ｏｆ　Ｃｏｒｒｅｃｔｉｖｅ　Ｔｉ５ｓｕｅ　Ｐｒｏｔｅｏｇ ｉｙｃａｎｓ、”　ｉｎ　Ｔｈｅ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ｏｆ　Ｇｌｙｃ ｏｐｒｏｔｅｉｎｓ　ａｎｄ　Ｐ窒盾狽■盾■奄凾■ ａｎｓ、　Ｗｍ、　Ｌｅｎｎａｒｚ、　ｅｄ、　ｐｐ、　２６７−３７１　Ｐｌ ｅｎｕｍ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ）　ｏこれらのL載、 特に２６９．２７０および２７１頁の表は、本明細書に参考のため引用する。

上述したグリコジルトランスフェラーゼ遺伝子及び／若しくはｃＤＮＡｓは、同 種中の翻訳後特性マニフェスト及び適切な上述した特徴的な結合を使用して、本 発明に従って、クローン化された分子として得られるか、若しくは宿主細胞系へ 転移され、それからその後に前記の遺伝子若しくはｃＤＮＡライブラリーが作製 され、かつ、前記の遺伝子若しくはグリコジルトランスフェラーゼをコードする ｃＤＮＡが単離される。

マンノシルトランスフェラーゼ群のメンバーを含有する追加の酵素としては、以 下に例示するような、（およびコーンフェルト（Ｋｏｒｎｆｅｌｄ）ら、アニュ アル　レビュー　バイオケミストリー（Ａｎｎ、　Ｒｅｖ、　Ｂｉｏｃｈｅ＋ｎ 、）　１９８５年、第５４巻、６３１−６６４頁に概説されるような）アスパラ ギンが結合したオリゴ糖に形成される結合の構築と関係する、α（ｌ、２）マン ノシルトランスフェラーゼ、α（ｌ、３）マンノシルトランスフェラーゼ、α（ １，６）マンノシルトランスフェラーゼ、及びβ（１１４）マンノシルトランス フェラーゼを挙げることができる。

他の物としては、セラミドグルコシルトランスフェラーゼ及びセラミドガラクト シルトランスフェラーゼ、オリゴサッカジルトランスフェラーゼ、及び０−アセ チレートＮ−アセチルノイラミン酸（シアル酸）の０−アセチラーゼを挙げるこ とがＳｉａニジアル酸 Ｇａｌ；Ｄ−ガラクトース Ｇａ１Ｎａｃ；　Ｄ−Ｎ−アセチルガラクトサミンＧｌｃ：叶グルコース ＧｌｃＮＡｃ；　Ｄ−Ｎ−アセチルグルコサミンＦｕｃ　：　Ｌ−フコース Ｍａｎ：叶マンノース １ｄＵＡ：Ｌ−イデュロニック酸（Ｌ−ｉｄｕｒｏｎｉｃ　ａｃｉｄ）ＧＩｃＵ Ａ：Ｄ−グルクロン酸 他の態様においては、本発明は溶解性、若しくは固相のオリゴ糖若しくは多糖を 得る方法を提供するものである。本方法はオリゴ糖、多糖、脂質、若しくはタン パク前駆体を融合タンパクと接触させることを含むものである。使用する酵素は 、本発明によって提供されるが、グリコジル化されないグリコジルトランスフェ ラーゼ若しくは２つの部分、すなわち第一の部分として、少なくともグリコジル トランスフェラーゼの触媒として機能するドメイン（本文参照）：及び第二の部 分として、固体支持体に結合したタンパク様スペーサー若しくは親和性のリガン ドを含有するタンパク様の成分を含有する融合タンパクのいずれかである。本発 明の酵素は前駆体を、それによっ得られる所望のオリゴ糖、多糖、糖脂質、若し くは糖タンパクに変換する。

本発明の注目すべき効果としては、−態様において、グリコジル化されないグリ コジルトランスフェラーゼを提供することにある。天然由来のグリコジルトラン スフェラーゼは、糖タンパクである。それらの物を使用してオリゴ糖／多箇前駆 体からオリゴ箇若しくは多糖を製造する場合、前記の酵素はそれ自身がグリコジ ル化され易い。この望ましくない活性によって、出発材料が消費されてしまい、 その結果酵素活性が早期に失われる。本発明のグリコジル化されないグリコジル トランスフェラーゼはこのような顕著な不利益を享受しない。それらは、グリコ ジル化されない酵素として得られるが、それは関連するグリコジル化機構が欠落 した微生物中若しくはグリコジルトランスフェラーゼのグリコジル化が抑制され た動物細胞中で産生される生成物として得られるからである。動物細胞における グリコツルトランスフェラーゼのグリコジル化の抑制は、単離したグリコジルト ランスフェラーゼ遺伝子を公知の技術を用いて変異させ、グリコジルトランスフ ェラーゼのグリコツル化サイトを除去することによって得られる。

本発明の非グリコジル化グリコジルトランスフェラーゼは、少なくともグリコジ ルトランスフェラーゼの触媒として機能するドメイン（本文参照）に対応し、ま たグリコジルトランスフェラーゼをコードする完全な遺伝子に対応する非グリコ シル化タンパクであり得る。

もう一つのり様においては、本発明は前述した二つの部分、すなわち、第一の部 分として、グリコジルトランスフェラーゼの触媒として機能するドメイン、及び 、第二の部分として、固体支持体に結合させることができるタンパク様のスペー サー若しくは、親和性リガンドを有するタンパク様成分を含有する融合タンパク を提供するものである。

グリコジルトランスフェラーゼは、酵素をコードする遺伝子の３つの異なった領 域に対応する３つのドメインを有することが知られている。遺伝子の３゛−末端 に見出される遺伝子領域は触媒として機能するドメインをコードすることが知ら れている（ボールソン（ｐａｕｌｓｏｎ）等、ジャーナルオブバイオロジカルケ ミストリ−（Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅａ）１９８９年、第２６４（３０）巻、 １７６１５−１７６１８）頁）。本発明の融合タンパクは、少なくともこの触媒 として機能するドメインを含むが、その全タンパク配列まで含有し得る。本タン パクは、公知の技術を使用して第二の部分を融合して製造される。

第二の部分は、固体支持体重で触媒として機能するドメインを固定したり、若し くは第二の部分に特異的に親和性を有するリガンドの存在を利用することによっ てその回復を許容するように使用できる。第二の部分としては、５ｔａｐｈ、タ ンパクＡのＩｇＧ結合ドメインが使用できる。そのような融合タンパクは、［ｇ Ｇ−セファロースのような、［ｇＧを含有する面相マトリックスに結合される。

多くの他の代わりのタンパクもグリコジルトランスフェラーゼの触媒として活性 なセグメントに融合して固体マトリックスへの結合を生じさせることができる。

その様なタンパク及び、それらの代表的なマトリックス結合レセプターとしては 、ストレブタビジンービオチン（ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−ｂｉｏｔｉｎ）　 、［ｇＧ　！鎖タンパクＡ、及び実質的にいかなる他の公知のタンパク、若しく は抗体が存在する、若しくは作製できるペプチドセグメントを挙げることができ る。

もう一つの態様においては、本発明は組換え糖タンパク、糖脂質、若しくは例え ば本発明によって得られる酵素若しくは本発明によって得られる組換え生物のい ずれかを使用して遊離のオリゴ糖を製造する方法を提供するものである。例えば 、特定の翻訳後グリコジル化の能力は次に記載する工程によって宿主細胞に添加 することができる。最初に、所望の遺伝子若しくは単離されたｃＤＮＡを標準的 な形質転換若しくはトランスフェクション技術を使用し、トランスフェクトされ たクローン化遺伝子産物の発現を可能とする生物を得るような方法で、細胞中へ 導入する。宿主細胞はトランスフェクション以前にはその能力を有しないが、ト ランスフェクトされた遺伝子によって決定される翻訳後の能力を得る。あるいは また、前述した方法は実行できるが、翻訳後の能力を決定する単一のクローン化 遺伝子を使用するかわりに、クローン化しない遺伝子セグメント（例えば、高分 子量のゲノムＤＮＡ）、若しくはクローン化されたゲノムＤＮＡフラグメントラ イブラリー又はｃＤＮＡ分子を使用することもできる。本方法でトランスフェク トされた細胞をその後、新たに得られた所望の翻訳後の能力を検出することに基 づく選別方法にかけ、その能力を発現するクローナルセルラインを分離する。

もうひとつの態様では、本発明に従って得られた酵素を試験管中の反応に使用し て、細胞表面のオリゴ糖分子を修飾することもできる。例えば、本発明者は精製 した血液ＬＡ　ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ　トランスフェラーゼ及びその基質である ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃを使用して、試験管中で、マウス細胞上の血液型Ｈオリゴ 糖決定基を血液量Ａ決定基へと変換した（エルンスト（Ｅｒｎｓｔ）等、ジャー ナルオブバイオロジカルケミストリー（Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、）、１９ ８９年、２６４巻、３４３１３４４７頁）。類似のスキームを使用して、本発明 に従って得られた酵素を単独で若しくは他の入手可能なグリコジルトランスフェ ラーゼ及びグリコハイドロラーゼ（ｇｌｙｃｏｈｙｄｒｏｌａｓｅｓ）とともに 使用して、死亡した、若しくは生きた機能性真核細胞若しくは原核細胞上に存在 する細胞表面オリゴ糖を、所望の特性に関係するそれらの細胞表面のオリゴ糖構 造にするような方法で、修飾することができる。

追加された特定の翻訳後グリコジル化能力を備えた上記のような宿主細胞は、糖 タンパク、糖脂質、若しくは遊離のオリゴ糖を得る公知の組換え技術に従って使 用される。この細胞は組換えタンパク、糖脂質、苦しく遊離のオリゴ糖を産生す る能力と同様、翻訳後のグリコジル化能力の両者を有することによって特徴付け られる。

上述した後の態様は、また、例えば、新規なオリゴ糖分子を、治療若しくは診断 に使用するため、それらを特定の組織若しくは体内の他の場所に向かわせる目的 で、特定種の哺乳類細胞（例えば、特定若しくは一般的な免疫機能を有する細胞 ）の表面に付加することを可能とするものである。特に、そのように改質された 細胞は改質された細胞の表面に付加された特定のオリゴ糖構造を特異的に認識す るレクチン様の細胞接着性分子を発現する組織を標的とすることができた。

もう一つの態様においては、本発明は細胞中のグリコジル化活性を抑制する方法 を提供するものである。この態様において、特定の翻訳後グリコジル化能力が宿 主細胞から除去される。この結果は、（１）遺伝子を不活性化し、及び（２）そ 托若しくはそれに近接する一つ以上の遺伝子的に選択可能なマーカーを挿入する 、試験管中での改質の後に、特定のクローン化された試薬を細胞中にトランスフ ェクション技術の標準的な形質転換によって、導入することによって達成するこ とができる。この改質された不活性な遺伝子の導入は、標準的な技術を使用して 同種組換え（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）によって内 因性の機能性遺伝子を効果的に置換する。

必要であれば、この方法を２ラウンド行って、二倍体生物の野性型の両遺伝子を 不活性化することもできる。この結果、排除することが好ましい翻訳後の能力の 決定が現時点では不可能な二つの非機能性遺伝子を育するセルラインが得られる 。あるいはまた、本発明に従って得られる遺伝子は、標準的な方法を用いて、ア ンチセンス方向に発現された状態で、形質転換若しくはトランスフェクションに よって細胞中に導入される。これは、同系列の野性嬰の遺伝子の発現を標準的な アンチセンス発現方法で排除する。その配列が本発明に従って得られた遺伝子に 由来する、アンチセンス合成オリゴヌクレオチドで細胞を処理することによって 、また同系列の野性型遺伝子の発現を再び、標準的な方法で排除することができ る。

あるいはまた、本発明に従って得られる遺伝子は、形質転換若しくはトランスフ ェクションによって細胞中へ導入ざ顛その結果、新規な翻訳後修飾の発現は望ま しくないものの発現を防止、もしくは排除する。このアプローチは、ある種のグ リコジルトランスフェラーゼの共通のアクセプター基質に対する作用が互いに排 除する観察に変わる。例えばフコシル化は、α（２，３）シアル化を妨害するこ と及びその逆ができ、また、α（１，３）ガラクトシル化はαに３）シアル化を 妨害すること及びその逆が可能である。

（グリコジル化も含む）細胞の翻訳後の能力の付加及び削除は、例えば、それら は診断若しくは治療に利用できる脂質、タンパク、若しくは遊離オリゴ糖を製造 するために使用でき、グリコジル化を含む、その特異的な翻訳後修飾はその機能 に影響する宿主セルラインを作製させる。例えば、組織プラスミノーゲンアクチ ベーター若しくはエリスロボイエチンのような組換えタンパクは通常、糖タンパ クとして存在する。これらの糖タンパク上の特異的オリゴ糖の構造は、それらの 生合成、血清の半減期、レセプター相互作用、若しくは他の機能に対して有益な 効果を有することが示されており、本発明で提供される試薬及び工程を使用して 、特定の、かつ機能的に最適化したオリゴ糖構造を有する組換えタンパクを産生 ずる宿主を構築することができる。

この後者の態様ではまた、通常の生理学的組織、若しくは体内の他の場所を標的 化することを妨げることを目的として、例えば特定のオリゴ糖分子を特定の種類 の哺乳類細胞（例えば特定、若しくは一般的な免疫機能を有する細胞）の表面か ら消去することを可能とし、従って、治療若しくは診断上の使用のために、それ らを他の非生理学的な標的に向けることができる。特に、そのように改質された 細胞はその後、それらが通常作用する組織から、他の種類の細胞に対して特異性 を有するレクチン様の細胞接着性分子を発現する組織へと押しやられる。

もう一つの態様では、本発明はこれまで入手できない量の遺伝子産物を提供する 。上述の遺伝子産物、グリコジルトランスフェラーゼ酵素は、酵素リアクター中 で使用して、関心のある糖タンパク、糖脂質、オリゴ糖、若しくは多糖を製造す ることができる。この態様では、クローン化したグリコジルトランスフェラーゼ 遺伝子セグメ：ノトを、標準的な組換えタンパク発現系とともに使用して、遺伝 子によってコードされた大量の酵素を製造することかできる。これらの酵素は、 試験管中で、拡大スケールで、オリゴ糖若しくは糖脂質の合成、又はタンパク及 び糖タンパクのグリコンド修飾のためにバイオリアクター中で使用することがで きる。

そのようなスキームにおけるアクセプターオリゴ糖は次に示す何れからも得るこ とができる。

（ａ）天然原料若しくは化学合成で製造された市販の千ノー、ジー、若しくはよ り高次の糖。

（ｂ）この処理によって製造された他の組換え酵素によって試験管中で製造され たノー若しくはより高次のオリゴ糖、若しくは（Ｃ）翻訳後の能力が上述したよ うに工作されたセルラインから製造若しくは精製されたジー若しくはより高次の オリゴ糖。

この態様では、二つの試験管内でのバイオリアクター型のアプローチが使用でき る。−態様ではオリゴ糖アクセプター及びヌクレオチド糖基質が、触媒として活 性なグリコジルトランスフェラーゼと結合される固相マトリックスを含有するり アクタ−に導入される。このマトリックスは、グリコジルトランスフェラーゼの 溶解性セグメントとして、触媒活性部分を含有し、融合タンパクを固相マトリッ クスに結合させるために使用できるタンパクセグメントに融合される、上記した 融合タンパクを使用して、作製することができる。そのような融合タンパクの特 別な例は、５ｔａｐｈ、タンパクＡのドメインに結合したＩｇＧのセグメントに 融合したマウスα（ｌ、３）ガラクトシルトランスフェラーゼである（ジーセン （Ｌａｒｓｅｎ）等）、プロシーディングオブナショナルアカデミーオブサイエ ンス（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｅａｄ。

Ｓｃｉ、Ｘ米国’）　、１９８９年、第８６巻、８２２７−８２３１頁）。

アクセプター及びヌクレオチド糖基質は、そのようなりアクタ−中で、適当な温 度、ｐＨ１及び他の公知の条件で、所望量のオリゴ糖若ｔべは多糖生成物を得る のに充分な時間、培養される。生成物は、その後公知の技術を用いて回収される 。

変法においては、ヌクレオチド糖基質及び溶解性のグリコジルトランスフェラー ゼ触媒ドメインを含有する融合タンパクを、固相マトリックスに共有結合させた （すなわち、固定化した）オリゴ糖アクセプター分子を含有するリアクターへ導 入する。結合は酵素的に改質したいオリゴ糖アクセプター分子の一部を反応媒質 に役立たせると言った方法で、公知の技術を使用して行われる。

本発明は、クローン化された遺伝子、クローン化された相補的なｃＤＮＡ、及び それらのｍＮＡを単離する方法と同様に、それらが産生ずるタンパクの翻訳後修 飾の特定の能力を育する動物セルラインを作製する方法を提供するものである。

これによって真核細胞（例えば哺乳類のような動物）のタンパクの翻訳後修飾に 応答する酵素の発現若しくは生合成が、特に（限定はされないが）（例えば哺乳 類のような動物）真核細胞の糖結合を構築するそれらの翻訳後過程が、これらの 遺伝子のタンパク生成物を最初に単離する必要なく、決定される。これは、クロ ーン化された遺伝子、クローン化された相補的なｅＤＮＡ、及びそれらのｍＲＮ Ａを含有するものてあって、それらは真核細胞（例えば哺乳類のような動物）の 、リン酸（［Ｚ。

メチル（Ｌ脂肪族アソル化、及びグリコジル修飾（グリコハイドロラーゼ）と同 様に、グリコジル化及び硫酸化によりタンパクを翻訳後修飾する酵素をコードす る。

従って、本発明の応用には下記のものが含まれる。

（１，）特定の翻訳後の能力を有する動物セルラインの構築（診断薬及び治療薬 の製造のための）。

この方法は、その有用性もしくは効果か特定の翻訳後修飾に依存する診断若しく は治療用物質の製造に適した宿主細胞である動物セルラインを構築するために使 用できる。例えば、はとんどの治療上のタンパク若しくはペプチド、組み換え体 または他のものの生物学的有効性は、しばしば共有結合的にそれらに結合してい るオリゴ糖の構造に非常に依存する。これらのオリゴ糖の構造は、第一に、これ らの治療用の製造物を導入するために使用した細胞中に見出されるグリフジルト ランスフェラーゼ酵素の数及び種類に関係する。

動物細胞及び酵母は、これらのグリコジル化反応を行うことができるが、しかし ながら、全てのグリコノルトランスフェラーゼ酵素が全ての動物細胞若しくは酵 母によって産生されるわけではなく、従って、ある種のオリゴ糖構造はそれらに よって生成されない。その逆もまた真であり、すなわち、作製された細胞は、効 果的な生物活性を阻害するオリゴ糖構造を作製するある種のグリコジルトランス フェラーゼを発現するかもしれない。本発明は細胞を作製する際に、特定のグリ コジルトランスフェラーゼの能力の生成若しくは排除を提供するものであり、そ の結果、細胞によって製造される産物の治療上の効果か最適化され得る。

この処理に使用されている従来の方法としては、組み換え体若しくは天然産物の 製造に大変適したセルラインを同定する経験的な方法を挙げることかできる。

これは通常、最適ではない。というのは、好適な翻訳後修飾能力を有するセルラ インが天然には存在しないかもしれず、若しくは適切に改質された産物を高水準 に産生ずるのに特に適していないかもしれないからである。あるいはまた、経験 的に同定された動物セルラインにより産生された治療用物質に存在する望ましく ない翻訳後修飾は、化学的に若しくは酵素的に除去できるが、その処理はコスト か高く、また非効率であり、若しくはその両者であるかもしれない。

従来の方法に対する本方法の利点としては、特異的な翻訳後修飾の能力を有する セルラインを製造できる能力を挙げることができ、適切に構築された場合には、 これらのセルラインは、治療用若しくは診断用物質に化学的若しくは酵素的な処 理を施して、望ましくない翻訳後修飾を除去する必要性を排除する。さらには、 翻訳後修飾の能力か適切ではないが、生産に対して良好な細胞であるセルライン は、生成物の正しい翻訳後修飾を達成するように改質されるかもしれない。

この方法は、動物細胞によって産生される特定の診断用若しくは治療用生成物の 特殊な必要に正確に合わせた翻訳後修飾の能力を有する動物セルラインを構築す ることを可能とするものである。

（比）効果的な酵素合成に適した試薬の単離とオリゴ糖の製造（例えば酵素リア クター中における）。

オリゴ糖は、臓器移植の分野で免疫調節荊としての治療上の有用性があり得る。

特に、可溶性及び固相のオリゴ糖は、レート（ｌａｔｅｄ）　シた抗体の阻害若 しくは改善、又は臓器提供者と受容者の主要な血液型抗原システムの相違による 不適合を含む場合における臓器移植の拒絶反応に対する治療用薬剤としての用途 を見出すかもしれない。同様に、可溶性のオリゴ糖は、これらの病原体が侵入す る動物組織の表面に見られる糖結合レセプターに対する細菌性、ウィルス性、若 しくは寄生性の病原体の付着を阻害するように機能する治療用薬剤としての用途 を見出すことができる。

さらには、糖結合は発生及び分化の過程における、細胞間、及び細胞とその環境 との間の接着イベントの調節に関係している。これらのイベントとしては、*** の卵子への結合、及び着床の初期における受精卵の子宮壁への間接的な結合の初 期的なイベントを挙げることができる。これらの観察は、例えば、（生物学的に “天然の′）オリゴ糖分子を避妊薬として使用する可能性があることを示す。

近年、構造の決定されたオリゴ糖か、化学合成（非効率的でコストの高い方法で ある）若しくは天然資源からの単離によって（しばしば大量の動物及び植物材料 の処理、および混在している他のオリゴ糖からの所望のオリゴ糖の精製を必要と するコストが高く、非効率的な方法を使用して）１２造されている。

本発明は、クローン化されたグリコジルトランスフェラーゼ遺伝子配列を単離す る機構を提供するものであり、これを用いて、逆に多量の精製されたグリコジル トランスフェラーゼ酵素を経済的に合成することができる。これらはこれらの構 造を酵素的に合成することが可能な酵素バイオリアターを構築するために使用で きる（溶液状の酵素若しくは固相マトリックス上に固定化された酵素）。

これは、オリゴ糖の化学合成若しくは天然資源からのそれらの精製を含むアプロ ーチよりも、種々の理由から、より効率的である。ひとつには、唯一の必要な化 学製品は酵素基質であり、はとんどの場合、これらは容易に得られるか、若しく は合成される。二つには、酵素合成は、所望の生成物、及び基質の加水分解のヌ クレオチドモノフすスフエート若しくはヌクレオチドシフオスフェート生成物の みが生成される。後者の二種の化学製品は、動物細胞中でのこれらの反応の天然 の副生成物として見出されるものであり、本質的に無毒性で、オリゴ糖合成生成 物から容易に分離することができる。

対照的に、化学合成法は、典型的には、除去しなければならず、また同時に毒性 でもあり得る数多くの副反応の生成物を生ぜしめる。同様に天然資源からのオリ ゴ糖のｆ’ＲＨは、天然材料に存在する他の混在しているオリゴ糖の除去を必要 とする。

第三に、酵素的な触媒作用は非常に効果的で、事実上、基質の生成物への完全な 変換を達成できる。対照的に、これらの構造の化学合成は多段階の工程からなり 、各段階の収率が１００％よりはるかに低い可能性があり、現在の化学合成法の 累積的な効率は酵素的な合成で可能な効率には到達していない。同様に、天然材 料からオリゴ糖を精製するのは、所望のオリゴ糖の非効率的な単離により、混在 する関係ない及び／若しくは望ましくないオリゴ糖から所望のオリゴ糖を分離す るのに要求される精製法に固有の重大な損失を伴い得る。

合成に使用するグリコジルトランスフェラーゼは、動物組織から精製してもよい が、これらの精製はそれ自体か非効率的で、これは第一に酵素が典型的には非常 に低い割合で存在するためである。本発明はこれらの酵素を大量に製造する２つ の機構を提供するものである。

まず、これは、比較的大量なこの酵素を産生ずる動物細胞を構築および選択する ことにより行われる。あるいはまた、これは、これらの酵素をコードするクロー ン化されたｃＤＮＡを単離するか、若しくはそのようなりローン化ｃＤＮＡ若し くは遺伝子から得た情報によってこれらの酵素をコードした合成遺伝子を構築す る機構を提供するものである。これらのクローン化された核酸配列はその後、標 準的な組換えＤＮＡ技術によって、大量のグリコジルトランスフェラーゼを製造 するために使用できる。

（ｉｉｉ、）直接探索試薬として使用する、若しくは探索への適用のための抗グ リコジルトランスフェラーゼ抗体を作製するために使用する組換えグリコジルト ランスフェラーゼを製造するのに適した試薬の単離。

本発明は、オリゴ糖類及び糖タンパク類の構造及び機能を研究するための探索試 薬として用いることができるこれらの酵素を、大量に製造する２つの方法（上記 （ｉ　ｉ、　）を参照のこと。すなわち特別に構築された動物細胞、若しくはこ れらの酵素をコードする天然又は合成の遺伝子を媒介とする方法）を提供するも のである。同様に、この方法により製造される該酵素、若しくはこの方法により 提供される核酸配列及び誘導されたタンパク配列を、（その配列がクローン化さ れた酵素ｃＤＮＡまたは遺伝子に由来する合成ペプチドによる免疫を介して、ま たは組み換え酵素による直接免疫により）これらの酵素に対する抗体を生成させ るために用いてもよい。これらの抗体は、これらの酵素の生合成及びプロセッシ ングを研究するための探索試薬として用いることもでき、さらに本開示中に記載 されたあらゆる使用のために酵素を精製する補助剤として使用することもできる 。

（ｉｖ、）診断試薬としてのグリコジルトランスフェラーゼに対する抗体これら のグリコジルトランスフェラーゼには、体液中の腫瘍マーカーとして関与してい るものがある。典型的には、該酵素はこれらの体液中では活性評価法により検定 されているが、この方法は競合するグリコジルトランスフェラーゼ活性のために 、非特異的になることがある。不活性な酵素が腫瘍マーカーとして有用であるか もしれず、一方、酵素活性評価法では検出されないという可能性もあり得るので 、上記の検定法は感度が鈍いものでもある。

本発明は、これらの酵素に対する抗体（クローン化されたグリコジルトランスフ ェラーゼｃＤＮＡまたは遺伝子由来の情報から構築された合成ペプチド、組み換 えグリコノルトランスフェラーゼにより製造される酵素、または本方法により構 築された動物細胞により製造される酵素に対するモノクローナル及びポリクロー ナル抗体）を製造する方法を提供する。特定のグリコジルトランスフェラーゼに 特異的な抗グリコリルトランスフエラーゼ抗体は、本方法によって製造すること ができ、酵素活性評価法をしのぐ特異性と感度をもって体液中のグリコジルトラ ンスフェラーゼを検出し定量するために用いることができる。

（Ｖ、）分泌ないしは細胞に結合されたグリココンジュゲート体上の新規グリコ コンジュゲート構造を発生させるためのグリコジルトランスフェラーゼ基質特異 性操作 本発明は試薬（クローン化されたグリコジルトランスフェラーゼ遺伝子またはｅ ＤＮＡ）ならびに適当な公知の突然変異法とともに用いた場合に野生型酵素によ り生成されるグリコジル結合とは異なるグリコツル結合を生成する変異体グリコ ジルトランスフェラーゼを発生させることができる遺伝的選択方法を提供するも のである。これらの新規結合は天然由来あるいは非天然由来のものでもよく、そ れらか結合されている分子の生物活性を促進する部分として有用性がある。さも なくば、優勢ネガティブファッション（ｄｏ（Ｉｌｉｎａｎｔ　ｎｅｇａｔｉｖ ｅ　ｆａｓｈｉｏｎ）で挙動する変異体酵素を産生するために突然変異及び選択 手法を用いることができる。このような酵素の生成物（類）が望ましいものでは ない場合、内生的グリコジルトランスフェラーゼ活性を不活化するためにそのよ うにして産生された優勢ネガティブ変異体を用いることができる。

本発明は、酵素の表面発現生成物を同定するように工夫された方法により、標準 的分子クローニング法で要求されるような酵素の精製を必要とせずに（すなわち 、その酵素の一次構造についてのなんらの情報なしに、またその酵素に対して反 応する抗体なしに）、グリコジルトランスフェラーゼ遺伝子（及び、翻訳後の修 飾をつかさどる酵素の合成に関与する遺伝子）の単離を可能にする。

本方法を行った結果として、グリコジル化に対して特異的能力を有する細胞が生 成する。この方法の詳細な実施の一態様は、本発明者による以下の文献　ジャー ナル・才ブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ−） 、１９８９．２６４（６）３４３６−３４４７　、及びジャーナル・才ブ・バイ オロジカル・ケミストリー、　１９８９．２６４（１９）：　１１１５８−１１ １６７に記載されており、両者を参照として本開示に含める。

おおまかに言えば、該方法の上記態様は、所望の酵素を確かに発現する細胞由来 の遺伝子材料を用いて、所望のグリコジルトランスフェラーゼ及びその生成物を 発現しない細胞中に細胞外遺伝子材料を導入することにより、所望のグリココン ジュゲート構造を構築する特異的能力を育する培養動物細胞を産生ずることを含 んでいる。その後にポジティブ選択方法を行い、細胞の表面上に酵素生産物を発 現するトランスフェクト細胞を同定する。そして、遺伝子ライブラリーの構築と 核酸ハイブリッド化を含む標準的手法により、この新規表現梨を担うトランスフ ェクトされた遺伝子配列を単離する。この方法によれば、酵素の精製を必要とせ ずに、グリコジルトランスフェラーゼの発現を決定する遺伝子材料を単離するこ とができる。

遺伝子が単離されたことを例証するためには、分散された反復ヒトＤＮＡ配列（ Ａｌｕ）を含むハイブリッド化法によるこれらの配列の検出及び単離方法を用い るが、核酸ハイブリッド化又は遺伝子選択法により所望の遺伝子を同定し単離す ることを可能にするＤＮＡ標識（例えば、５ｕｐＦ又はＧ４１８耐性″Ｎｅｏ” 配列）をトランスフェクトされたＤＮＡに結合（これらに限定されることはない ）することを含む他の方法を用いて、トランスフェクトされた配列を“標識”し てもよい。適当な表現型を有するトランスフェクトされた細胞を選択するための ３種の方法を以下に記す一フロー・サイトメトリー、“ロゼッティング（ｒｏｓ ｅｔ　ｔ　ｉｎｇ）″、及び°バンニング（ｐａｎｎｉｎｇ）″。実施例では酵 素生産物に特異的な抗体を用いているが、植物及び動物レクチン類等の表面発現 酵素生産物を特異的に認識する非抗体試薬を用いてもよい。

本発明により提供される酵素は、対応する天然酵素に比べである特異な特性を合 わせ持っている。天然由来のグリコジルトランスフェラーゼが精製さね、得られ た生産物の単一性についである主張がなされている。しかしながら、単一性につ いてのそのような主張は、５ＯＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法による標 本の分析を基にしてなされたものである。より古い文献（すなわち１９８２年以 前）においては、単→素はコマジ−ブルー（Ｃｏｏａｍｓｓｉｅ　ｂｌｕｅ）染 色または他の染色法によりゲル中で同定されていたのであり、これは現代の銀染 色法に比べて著しく低感度である。従って、そのような標本が単一ではないこと はまず確実である。

より現代的な文献では、３種のグリコジルトランスフェラーゼが銀染色法により 分析されている（すなわち、ラットシアリル−Ｔ、　ＧｌｃＮＡｃ−丁−［、及 びＧｌｃＮＡｃ−Ｔ−ＩＩ）。これらには実質的にタンパクの混入がないようで ある。しかしながら、これらの精製方法を用いて得られた最終精製タンパクの少 量を高感度な銀染色法を用いて分析しており、得られた少量の精製タンパク中に ある５ないし１０重１％程度のレベルの混入物を検出するために十分に高感度で はない。従って、本発明以前には、少なくとも９５重１％、好ましくは少なくと も９８重量％の純度レベルを有するグリコツルトランスフェラーゼは得られてい ない。クローン化されたグリコジルトランスフェラーゼＤＮＡ配列を用いて、大 量に、可溶化形態で、若しくはアフィニティー精製可能なタンパク部分に結合さ れて得られる本発明の組み換えグリコジルトランスフェラーゼは、今までには得 られなかったような完全な単一状態で得ることができる。

本発明により提供されるタンパクは、上記のとおり、それらがグリコジル化され ていないという事実によっても現在までに入手可能なタンパクと区別することが できる。天然由来のグリコジルトランスフェラーゼは糖タンパクであり、すなわ ち１以上のＮ−結合及び／又は〇−結結合オリゴ槽構造それ自体に含むものであ る。

これらの構造はそれ自体、例えば酵素リアクター中で酵素自体によりグリコジル 化されるが、これは反応効率を減少させて成熟酵素活性低下の一因となる競合受 容体基質に相当するものである。この“自動グリコノル化”現象は、酵素及びバ イオリアクターの触媒効率を不活化させるか、あるいは低下させる可能性かある 。

クローン化されたグリコツルトランスフェラーゼは、この問題を回避する途を提 供する。まず第一に、クローン化されたグリコツルトランスフェラーゼを、これ らの酵素をグリコノル化することができない大腸菌等の細菌宿主の内部で発現さ せると、大量の非グリコジル化グリコリルトランスフェラーゼが産生される。

これらの組み換えタンパクはバイオリアクター中で使用することができ、それら 自体かグリコジル化されていないので、上記の理由により天然由来のグリコジル 化された酵素よりも性能が優れている。

一方、組み換え酵素をグリコジル化することができる動物細胞宿主中でこれらの 酵素を発現することか必要な場合には、動物細胞に該酵素をグリコジル化させる アミノ酸シグナルを組み換えタンパクから除去するために標準的な部位指向性突 然変異法を用いることかできる。これらの公知のシグナルとしては、アスパラギ ン連関グリコジル化を可能にするＮ−Ｘ−Ｔ又はＮ−Ｘ−５モチーフに包含され るある種のアスパラギン部位を挙げることができ、さらに及び〇一連連関グリコ モ化化基質である成る種のセリン及びスレオニン部位を挙げることができる。

グリコジルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡ配列を変化させて、これらの Ｎ、Ｓ、またはＴ部位をコードするコドンを除去するか、あるいは各々のコドン を、類似の物理特性を育する力市一連関または〇一連連関グリコモ化化支持する ことができないアミノ酸を決定するコドンに変えるために、標準的突然変異法を 用いることかできる 本発明は独特な変異体組み換えグリコジルトランスフェラーゼも提供する。グリ コジルトランスフェラーゼ遺伝子及びｃＤＮＡ類を単離し発現させることにより 、天然由来の酵素が本来的に育する一定の特性よりも優れた特性を有する変異体 グリコジルトランスフェラーゼが生成する機会が提供される。ある種の具体的特 性を有する変異体グリコジルトランスフェラーゼを得るために、部位指向性ない しはランダム突然変異に基づく標準的手法を用いることができる。

（１）最小触媒領域、グリコジルトランスフェラーゼタンパクからアミノ酸の連 続的除去を行うことかでき、得られた変異体グリコジルトランスフェラーゼの活 性について試験することができる。これらの分子の異なる部分の既知の機能に基 づいて、（ａ）可溶性（酵素を不溶化し、従ってバイオリアクターには不適当に なる天然グリコジルトランスフェラーゼ上のトランスメンブレン部分を欠損する ）であって、及び（ｂ）（触媒活性にはどちらも必要のないトランスメンブレン 部分及び“ステム′領域を保持する）天然グリコツルトランスフェラーゼよりも かなり小さい、触媒的に活性な変異体グリコジルトランスフェラーゼが製造でき ることか予測可能である。

タンパク量基準では、変異されたグリコジルトランスフェラーゼ遺伝子またはｃ ＤＮＡ類由来の小さな触媒活性領域は、触媒的に非活性なトランスメンブレン及 び／又はステム領域タンパク“バゲージ”を育する、より大きな天然由来のグリ コノルド元ノスフエラーセよりも、触媒的にさらに活性である。従って、組み換 え変異体由来の触媒領域は、例えばリアクターによるオリゴ糖類のインビトロ合 成で用いると、はるかに効率的である。

グリコジルトランスフェラーゼに対するｍＲＮＡの増幅方法グリコジルトランス フェラーゼ遺伝子を単離するための遺伝子トランスファー用に遺伝子材料源（ｃ ＤＮＡライブラリー構築のためのｍＲＮＡ、またはゲノム性ライブラリー構築あ るいはゲノム性ＤＮＡ）ランスフエクションのためのゲノム性ＤＮＡ）として用 いた細胞株を処理して、この方法を至適化することができる。この細胞株を選択 操作に付して、グリコジルトランスフェラーゼｍＲＮＡの定常状態濃度を高め、 及び／又はその各々の遺伝子を増幅してこのドナー細胞中にその多数のコピーが 存在するようにできる。これは、細胞株を、例えば細胞表面により大量のグリコ ジルトランスフェラーゼオリゴ糖生産物を発現する異型細胞を選択する選択方法 に（化学的、放射線照射、または他の突然変異法を行った後あるいはそれらなし に）付すことにより行うことができる。

オリゴ糖生産物分子の数が増加することは、その細胞内にある同起源グリコジル トランスフェラーゼ（類）酵素分子の数が増加し、ならびにグリコジルトランス フェラーゼｍＲＮＡの定常状態濃度が増加することに関連がある。このグリコシ ルト元ノスフエラーゼｍＲＮＡがより高濃度であるとは、それぞれのｃＤＮＡの コピーか高発現異型細胞株から調製されたｃＤＮＡライブラリー中により多量に 存在しており、従って、これらグリコジルトランスフェラーゼｃＤＮＡを該ライ ブラリーから釣り上げる可能性か増加することを意味している。ある場合には、 特定のｍＲＮＡの濃度がより高くなると同村源グリコジルトランスフェラーゼ遺 伝子のコピー数の増加を伴うこともある。このように増幅されたグリコジルトラ ンスフェラーゼ遺伝子は細胞ゲノム中に他の非関連遺伝子よりも多量にあり、ま た親株である非選択細胞株内よりも多量にあるので、ゲノム性ＤＮＡライブラリ ー若しくはゲノム性トランスフェクノヨン法により単離するほうがより容易であ る。

トランスフェクションによる研究により、ある種の腫瘍遺伝子の発現かある種の グリコジルトランスフェラーゼの発現を増加し得ることが示される。従って、細 胞系を１種以上の腫瘍遺伝子で修飾することができ、得られるトランスフェクト されたクローンは増加したグリコジルトランスフェラーゼレベルについてアッセ イすることができる。このようなりローンはまた、上記に概説したようなＦＡＣ ８またはレクチン選択により同定または選択できる。これらのクローンはさらに 上記のｃＤＮＡライブラリーの調製に使用することができる。

いくつかの化学薬剤か細胞系においてグリコジルトランスフェラーゼの発現を誘 起し、または発現を増強することが示されている。これは通常インビトロにおけ る細胞系の分化に関連しており、そのような薬剤にはレチノイン酸があり、また ヒト及びマウスの造血前駆体のジメチルスルホキシド誘起分化にも関連しており 、ある種のグリコジルトランスフェラーゼの発現における増加を伴う。これは問 題となっているグリコジルトランスフェラーゼについてのｍＲＮＡの安定状態レ ベルの上昇により起こるものであり、ｃＤＮＡライブラリーを介したトランスフ ェクションによる方法を使用して同族の（ｃｏｇｎａｔｅ）クローン化されたｃ ＤＮＡを単離する能力を増強するのに使用し得る。

細胞表面における酵素生成物の検出による方法であり、その酵素を精製する必要 がない、動物グリコジルトランスフェラーゼ（あるいはその他の翻訳後修飾酵素 ）をコードする遺伝子またはクローン化されたｃＤＮＡを単離する別の方法は以 下の通りである。即ち、所望の酵素を発現する細胞または組織から調製したｍＲ ＮＡを使用して、哺乳動物または酵母宿主中でクローン化されたｃＤＮＡを発現 するプラスミドまたはファージベクター中でｃＤＮＡライブラリーを構築する。

次にこのｃＤＮＡライブラリーについて、当該酵素またはその表面発現生成物を 発現しないか必要な酵素基質分子を有しておりその酵素生成物をその表面に提示 し得る宿主細胞系に導入して所望のｃＤＮＡをスクリーニングする。ｃＤＮＡラ イブラリーを取り込んだ宿主細胞を、その酵素生成物に特異的な試薬を用いてフ ローサイトメトリー、ロゼッティング、あるいはパンニングによりスクリーニン グする。所望の酵素の発現に向（ゴられたクローン化ｃＤＮＡはその後標準方法 により選択された細胞から単離することができる。

この方法は以下のような技術を使用する。

１　動物細胞への安定なトランスフェクション、選択、使用したベクターに応じ て核酸ハイブリダイゼーション法あるいはＣＯ８融合法によるその後の所望のク ローンｃＤＮＡの回収 ２、ＣＯ３またはＷＯＰ細胞への一時的なトランスフェクション、選択、その後 の５ｅｅｄ、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ’　１．　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　（ＵＳＡ ）　（＋９８７）　８４：　３３６５−３３６９の方法によ髀■ 望のクローンｃＤＮＡの回収 ３、酵母細胞のトランスフォーメーション、選択、その後の核酸ハイブリダイゼ ーション法による所望のクローンｃＤＮＡの回収さらに、関連するグリコジルト ランスフェラーゼ（または翻訳後修飾に関連するその他の酵素）をコードするク ローン化ｃＤＮＡを含むｃＤＮＡ分子のプールを検出する酵素アッセイを使用し て、哺乳動物ｃＤＮＡ発現ライブラリーをｓｉｂ選択によりスクリーニングする ことができる。特に、適当なグリコジルトランスフェラーゼを発現する細胞から 調製したｍＲＮＡを使用して、哺乳動物発現ベクター（プラスミドまたはファー ジ）中にｃＤＮＡライブラリーが構築される。

このライブラリーは次に、それぞれがライブラリーのある種のフラクションから のものであり合わせたものが全体のライブラリーを示すものである、クローンを 含む細菌細胞のプールにまず分けることによりスクリーニングされる。各プール の一部を貯蔵し、残部（貯蔵されたクローンのｓｉｂを含む）をｃＤＮＡ−ベク ターＤＮＡに加工する。各プールから調製したＤＮＡを別々に前記した適当な宿 主細胞（ｌ、２及び３参照）の一つに導入し、適当な発現時間を与えた後、トラ ンスフェクトまたトランスフオームした宿主細胞から抽出物を作成し、これらの 抽出物を適当なグリフジルトランスフェラーゼ活性についてアッセイする。

このようにして適当な酵素の合成に向けられたプラスミドを含むことか判った最 小のプールを貯蔵から取り出し、さらに分割する。再びこれらのプールからの部 分を貯蔵し、それぞれの残部（やはり貯蔵されたクローンのｓｉｂを含む）をプ ラスミドＤＮＡに加工し、トランスフェクションまたはトランスフォーメーショ ン、発現、抽出物調製及び酵素アッセイを行う。この工程は関連するグリコジル ）・ランスフェラーゼの発現に向けられた単一のクローンが単離されるまで反復 する。このように、この方法は適当なりローン化ｃＤＮＡまたは遺伝子の単離に おいて酵素生成物の表面発現に依存しない。

本発明で使用される手順は、宿主の遺伝的相補性（ｇｅｎｅｔｉｃ　ｃｏｍｐｌ ｅｍｅｎｔ）により制限される必要はなく、本発明の遺伝子転移の形態は通常は 発現されないか、あるいは受容細胞に存在さえしない遺伝子の発現を可能とする 。本明細書は特にグリコジルトランスフェラーゼへの応用を説明しているが、硫 酸（ＩＺ、　リン酸（Ｌ　メチル（［Ｚ、脂肪族アシル化、及びグリコジル修飾 の除去（グルコヒドロラーゼ）を含む翻訳後修飾のその他の形態を制御する酵素 及び遺伝子に応用できる。

この点について記載した方法は、優勢なグリコジル化特性についての選択による グリコジルトランスフェラーゼ遺伝子またはＣＤＮＡの単離を含んでいる。ＣＯ ３またはＷＯＰ細胞における使用について記載した一時的な発現系は、ＣＯ８ま たはＷｏＰ宿主中に存在するグリコジルトランスフェラーゼ転写物に相同なＣＤ ＮＡを同定しクローン化するのに使用することができる。

特に、「アンチセンス」方向に転写されたクローン化ｃＤＮＡはＣＯ８またはＷ ＯＰ宿主中での同族グリコジルトランスフェラーゼの発現を排除し、結果として 退行したグリコジル化特性をもたらす。これらのＤＮＡ配列はその後、やはり上 述した方法（フローサイトメトリー、　「ロゼッティング」及び「バンニング」 ）により、その発現が排除されたグリコジルトランスフェラーゼにより認識され るすりゴサッカライド結合の表面発現について選択して単離することが可能であ る。

あるいは、酵素アッセイで測定して、内在的グリコジルトランスフェラーゼの発 現を減少または排除するクローン化ｃＤＮＡ分子を同定するのにｓｉｂ選択法を 使用することができる。

また別の実施態様においては、本発明は以下に記載するＤＮＡ配列を提供する。

本発明のグリコジルトランスフェラーゼは以下に対応する：ｉＩＭＥ列（））の 少なくともアミノ酸位ｆ６３から３６１及び配列（１）の全体まで：（２配列（ ＩＩ）の少なくともアミノ酸位置４３から３６１及び配列（Ｉ［）の全体まで＝ （３配列（Ｉ）の少なくともアミノ酸位置３３から３６５を含む、配列（ＩＩ［ ）の少なくともヌクレオチド位１１４７８２から５７８０、及び、配列（Ｉ［Ｉ ）の全体、または（４）少なくともヌクレオチド位置２０８９からヌクレオチド 位置３１５６　（即ち、アミノ酸位置５０から４０５）及び配列（ＩＶ）の全体 まで。

配列（１）は、ＧＤＰ−Ｆｕｃ：　［β−Ｄ−Ｇａｌ　（１，４／１．３）　］ −Ｄ−ＧｌｃＮＡｃ（／Ｇｌｃ）　ａ　（１，３／１．４）| フコジルトランスフエラーゼとして機能するタンパク配列をコードする。このタ ンパクは、参考文献として本明細書の一部とする１９９０年ｌＯ月５日出願の本 出願人の同時係属米国特許出１ｍｏ、　０７／６０３．０１８に記載される内皮 白血球接着分子−１（ＥＬＡＭ−１）に対するオリゴサツカライド「リガンド」 の構築に使用できる酵素である。

このリガンドはおそらくシアリル−Ｌｅｗｉｓ　ｘ分子である。またこの酵素は 、ここに記載したクローン化ＤＮＡ配列により発現された場合、哺乳動物細胞内 でこれらの細胞上で特異的な細胞表面グリココンジュゲート構造の新たな発現を 発生するように機能する。構造は、以下の細胞表面グリココンジュゲート構造に 対する抗体により認識される。

５ＳＥＡ−１またはＬｅｗｉｓ　ｘ　Ｇａｌβ（１，４）［Ｆｕｃａ（１，３） ］］ＧｌｃＮＡｃシアリルーＬｅｗジル　Ｘ　ＮｅｕＡｃ　ａ　（２，３）Ｇａ ｌβ（１，４）［Ｆｕｃａ（１，３）］ＧｌｃＮＡＬｅｗｉｓ　ａ　Ｇａｌβ（ １，３）［Ｆｕｃａ（１，４）］ＧｌｃＮＡｃノアリルーＬｅｗｉジルａ　Ｎｅ ｗＡｃα（２，３）Ｇａｌβ（１，３）　［Ｆｕｅ　ａ　（１，４）　］Ｇｌｃ ＮＡｃ上記ＤＮＡ配列（Ｄにおいては、アミノ酸位置４３からアミノ酸位置３６ １に対応する配列か機能を有するが、示した全体の配列までのより大きな配列を 使用することができる。

この酵素は、ここに記載したクローン化ＤＮＡ配列により発現された場合、該Ｄ ＮＡ配列を発現する細胞から調製した抽出物においてアッセイしたときに、その 名前に示される酵素的形態の機能を果たす。この酵素のオリゴサツカライド生成 物は、以下の形態のα１．３配置で中性のα（２，３）シアリル化「タイプＩ［ Ｊ受容体に結合したこのフコース、またはα１．４配置で中性またはα（２，３ ）シアリル化「タイプＩ」受容体に結合したフコースを示す。

５ＳＥＡ−１またはＬｅｗｉｓ　Ｘ　Ｇａｌβ（ｌ、４）　［Ｆｕｃ　ａ　（１ ，３）　］］ＧｌｃＮＡｃシアリルーＬｅｗジルＸ　ＮｅｗＡｃα（２，３）Ｇ ａｌβ（１，４）　［Ｆｕｃ　ａ　（１，３）］ＧｌｅＮＡｅＬｅｗｉｓ　ｙ　 Ｆｕｃ　ａ　（１，２）Ｇａｌβ（１，４）［ＦＬＩＣ（Ｚ（１，３）］ＧＩＣ ＮＡＣＬｅｗｉｓ　ａ　Ｇａｌβ（１，３）　［Ｆｕｃ　ａ　（１，４）　］］ Ｇ１ｃＮＡｃシアリルーＬｅｗジルａ　ＮｅｕＡｃα（２，３）Ｇａｌβ（１， ３）　［Ｆｕｃ　ａ　（１，４）　］ＧｌｃＮＡｃＬｅｗｉｓ　ｂ　Ｆｕｃａ（ １，２）Ｇａｌβ（１，３）［ＦＩＩＣ（Ｚ（１，４）］ＧＩＣＮＡＣ以降、本 明細書においてはこれらの生成物をサブ末端α（１，３）及びα（１，４）フコ ース残基と指称する。

この酵素の触媒領域も発現の研究により位置決定された。上記に記載した特性の それぞれの概略を以下に記載する。このｃＤＮＡによりコードされた酵素の酵素 的特性及び染色***置決定の研究は、このｃＤＮＡはヒトＬｅｗｉｓ血液壓遺伝 子座の生成物であることを示している。

このＤＮＡ配列及び対応するタンパクは以下の用途を有する。

（ｉ、）この酵素の生成物を示すサブ末端α（１，３）及びα（１，４）フコー ス残基による細胞表面または細胞内で、または分泌されたタンパクまたは脂質に おけるオリゴサツカライドの翻訳後修飾に関して特異的な能力を有する動物細胞 系の構築（診断物及び治療物の製造のため）。

特に本発明のクローン化ＤＮＡ配列は標準法により、通常は同族の酵素またはそ の生成物（オリゴサツカライドにおけるサブ末端α（１，３）及びα（１，４） フコース残基）を発現しない哺乳動物細胞系に導入し、その細胞において「セン ス」方向に転写させ、細胞表面、細胞内で、または分泌タンパクもしくは脂質上 でオリゴサツカライドにサブ末端α（１，３）及びα（１，４）フコース残基を 発現できる細胞系を産生ずることができる。

あるいはこのクローン化ＤＮＡ配列は標準法により、同族の酵素またはその生成 物（サブ末端α（１，３）及びα（ｌ、４）フコース残基）を発現する哺乳動物 細胞系に導入し、その細胞において「アンチセンス」方向に転写させ、細胞表面 、細胞内で、または分泌タンパクもしくは脂質上でオリゴサツカライドにサブ末 端α（１，３）及びα（１，４）フコース残基を発現できない細胞系を産生ずる ことができる。

あるいは、１種以上の内在ＧＤＰ−Ｆｕｃ：　［β−叶Ｇａ１（１，４）／１． ３）　］−Ｄ−ＧｌｃＮＡｃ（／Ｇｌ　ｃ）−α（１，３／１．４）−フコシル トランスフェラーゼは、１種以上の同族酵素を発現する哺乳動物細胞において、 相同組換え法により、または本明細書に記載したＤＮＡ配列に基づいた「アンチ センス」オリゴヌクレオチド法により、または１種以上の内在ＧＤＰ−Ｆｕｃ　 ：　［β−Ｄ−Ｇａｌ　（１、４）／１．３）　］−Ｄ−ＧｌｃＮＡｃ（／Ｇｌ ｃ）　ａ　（１，３／１．４）−７Fｌジルト ランスフェラーゼを不活性化する優勢なネガティブ変異体フコシルトランスフェ ラーゼ配列であって、本明細書中の配列情報を利用して突然変異と遺伝子遺体手 順を介して誘導できる配列により、本明細書中に記載したＤＮＡ配列で不活性化 され得る。

この方法は、このクローン化ＤＮＡ配列とその同族酵素により決定される特異的 な翻訳後修飾に応した有用性と効率を有する診断または治療材料の製造のために 適した宿主動物細胞系を構築するのに使用することができる。例えば、組換体あ るいはそうではない、多くの治療用タンパクあるいはペプチドの生物学的有効性 はそれらに共存結合したオリゴサツカライド構造に臨界的に依存し得ることか知 られている。これらのオリゴサツカライドの構造は主としてこれらの治療用生産 物を製造するのに使用する細胞に見られるグリコツルトランスフェラーゼ酵素の 数と種類の関数である。

動物細胞及び酵母は、これらのグリコジル化反応を行う能力かある。しかし、必 ずしも全てのグリコジルトランスフェラーゼ酵素が、各動物細胞又は酵母で産生 されるわけではない。従って、ある種のオリゴ糖構造（ここで記述するＤＮＡ配 列によってコードされる酵素によって生じるサブ末端α（１，３）及びα（１゜ ４）フコース残基を含む）は、それらによって産生されない。

逆もまた同様である。即ち、その産生細胞は、ここで記述するＤＮＡ配列によっ てコードされるＧＤＰ−Ｆｕｃ：　［β−Ｄ−Ｇａｌ（１，４／１．３）］−Ｄ −ＧｌｃＮＡｃ（／Ｇｌｃ）　α（１，３／１．４）−フコシルトランスフェラ ーゼに類似の又は同一のグリコジルトランスフェラーゼを発現するかもしれない 。サブ末端α（１，３）及び（１，４）フコース残基は、哺乳類又は他の真核宿 主によって産生された、天然又は組換え治療剤又は診断剤（糖蛋白質又は糖脂質 ）の生物活性を変える（よかれあしかれ）と考えられる。これらの組換え剤を製 造するのに使用する真核宿主細胞は、ここに記述するＤＮＡ配列情報又はそれに 関連する情報によって変更して、所望の宿主において、ここで記述するクローン 化配列の全て又は一部を発現させることによって、サブ末端α（１，３）及びα （１，４）フコース残基を組換え産物上のオリゴ糖に付加させることができる。

別に、サブ末端α（１，３）及びα（１，４）フコース残基は、先に説明した、 トランスフェクトした「アンチセンス」ベクター構造物、組換えに基づく遺伝子 不活性イシ「アンチセンス」オリゴヌクレオチド法、又は優性ネガテブ（ｄｏｍ ｉｎａｎｔ　ｎｅｇａｔｉｖｅ）変異体フコシルトランスフェラーゼの使用によ って、これら宿主細胞において産生される産物から脱離させることができる。

この方法に使用される古い「方法」には、適当に変性した組換え体又は天然産物 を産生ずるために、この特定な酵素又は同様な又は同一の態様で機能する酵素を 発現する又は発現しない細胞系を特定する経験的な手法が含まれる。このことは 、この特定の翻訳後変性能力を育する細胞系が天然に存在しないかもしれないた め又は適当に変性した産物の高いレベルでの生産に特に適していないために、必 ずしも最適ではない。別に、経験的に同定された動物細胞系によって産生された 治療材料上に存在する、不要なサブ末端α（１，３）及びα（１，４）フコース 残基は、コストの掛かる又は効率の悪い方法によって、化学的又は酵素的に除去 しなければならない。

上記の技術とともに、ここで記述するクローン化した機能的ＤＮＡ配列を使用す ることの、これらのオーダー法に対する利点としては、例えば、糖蛋白質又は糖 脂質のオリゴ槍玉にサブ末端α（１，３）及びα（１，４）フコース残基を形成 する能力を具体的に欠如している細胞系を構成できること、及び適切に構成され ると、これらの細胞系が、治療材料又は診断材料を化学的又は酵素的に処理して 、不必要なサブ末端α（１，３）及びα（１，４）フコース残基を除去する必要 がないことが挙げられる。更に、サブ末端α（１，３）及びα（ｌ、４）フコー ス残基が、動物細胞によって産生された特別な診断的又は治療的産物に対して望 ましいと分かった場合には、ここで記述したクローン化されたＤＮＡ配列によっ て細胞系を加工して、これらの残基を産生させることができる。

（ｉｉ）　（例えば、酵素リアクターにおける）オリゴ糖の効率的な酵素合成及 び生産に適した試薬の分離 オリゴ糖は、この分野及び臓器移植における免疫調整剤として治療上の有用性を 有している。ルイス（Ｌｅｗｉｓ）血液壓系を含め、臓器提供者と受容者との主 要血液壓抗原系の相違による不適合性を含む場合において、抗体介在臓器移植拒 絶をブロックし又は改善する治療剤として、特に、可溶性及び固相オリゴ糖は有 用である。同様に、可溶性オリゴ糖は、病原体が侵入する動物組織の表面に見出 される糖液合体（ｇｌｙｃｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ）　ｒ受容体」に対する、細菌 、ウィルス又は寄生病原体の接着をブロックすることによって機能する治療剤と しての有用が考えられる。

例えば、（サブ末端α（１，３）及びα（１，４）フコース残基を含む）ルイス 血液型オリゴ糖分子の部分が、沁尿器病原性細菌（ｕｒｏｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ ）のある種の形態に対する「受容体」として作用するという証拠がある。更に、 サブ末端α（１，３）及びα（１，４）フコース残基を含む糖液合体は、メント ロフィル（ｍｅｎｎｔｒｏｐｈｉｌ）　Ｅｌ７．ＡＭ−１相互作用のような、細 胞間の接着現象に、及び成長及び分化過程における細胞とその環境との間の接着 現象を調節するのに関与している。

、−れらの現象には、***の卵子への結合及び着床の初期における受精卵子の子 宮壁への接着を介在する初期現象が含まれる。、：れらの観察から、例えば、（ 生物学的（ユ「天然」の）オリゴ糖分子に対する避妊剤か存在しうることを示唆 している。この酵素によって短縮されるオリゴ糖分子は、メントロフィル−ＥＬ ＡＭ相互作用を破壊し、その結果、抗炎症剤どして機能し得る。

現在、づブ末端α（１，３）及びα（１，４）フコース残基を有するオリゴ糖は 、化学合成（この方法は、効率か悪いか又はコストが高く、又はその両方である ）によって製造さＩ］るか、又は天然源からの分離（この分解は、多量の動物又 は植物材料を加工し、所望のオリゴ糖を他の汚染性オリゴ糖から精製することを しばしば要求する、コストのかかるかつ効率の悪い操作を使用する）によって製 造される。

本発明は、精製ＧＤＰ−Ｆｕｅ　：　［β−Ｄ−Ｇａｌ（１，４）］−Ｄ−Ｇｌ ｅＮＡｃ（／Ｇｌｃ）　α（１，３／１．４）−フコシルトランスフェラーゼを 多量に合成する機構を提供する。この発明は、サブ末端α（１，３）及びα（１ ，４）フコース残基を含む構造体を酵素的に合成できる酵素バイオリアクター（ 酵素は、溶液中にあっても、また例えば、添付の書類で記述したように、酵素の 触媒領域に結合した蛋白−Ａ部分を介して固相マトリックス上で固定化してもよ い）を構成することかできる。

この手法は、種々の理由により、サブ末端α（１，３）及びα（１，４）フコー ス残基を含む構造体を化学合成する場合又は天然源から精製する場合よりも効率 がよい。一つには、必要な唯一の化合物は、酵素基質であろう。これらの基質は 、容易に得られるし、合成することができる。二つ目としては、かかる構造体を 酵素的に合成することによって、所望の産品及び基質加水分解のヌクレオチドジ ホスフェートだけが生成する。後者の化学品は、動物細胞におけるこれらの反応 の天然副産物であり、相対的に非毒性であり、しかもオリゴ糖合成製品から容易 に分離することができる。これとは対照的に、化学合成手法は、一般に、除去さ れなければならない副反応の多くの産物を生じ、これらは毒性があるかもしれな い。同様に、天然源からのオリゴ糖の精製には、天然材料に存在する他の汚染性 オリゴ糖を除去する必要がある。

三番目に、酵素触媒反応は、非常に効率的であり、基質の生産物へのほとんど完 全な変換が達成される。これに対して、アミド上でのサブ末端α（１，３）及び α（１，４）フコース残基の化学的合成は、多段工程であり、各工程における収 量は、１００％より遥かに低いであろうし、現在の化学合成操作の積算効率は、 酵素合成で可能な効率に達しない。同様に、天然源からのザブ末端α（１，３） 及びα（１，４）フコース残基を有するオリゴ糖の精製は、汚染性の不必要なオ リゴ糖から所望のオリゴ糖を分離するための精製操作に基づく大きな損失があり 、所望のオリゴ糖は十分には分離されない。

ここで記述するＤＮＡ配列によってコードされるＧＤＰ−Ｆｕｃ　：　［β−Ｄ −Ｇａｌ　（１，４／１．３）　］−Ｄ−ＧｌｃＮＡｃ（／Ｇｌｃ）α（１，３ ／１．４）−フコシルトランスフェラーゼは、合成のだめの使用に対しては、動 物組織からのものでもよいか、一般に酵素が非常に低量で存在するので、これら の精製はそれ自体効率が悪い。

本発明は、この酵素の豊富な製造のための２種類の機構を提供する。第一に、相 対的に多量の酵素を産生ずる動物細胞の構成及び選択（ｖｉｅｅｄ　５ｅｌｅｃ ｔｉｏｎ）によって行われる。これとは別に、このクローン化された核酸配列は 、標準組換えＤＮＡ技術とともに使用して、酵母又は真核宿主において多量のグ リコジルトランスフェラーゼを産生させることができる。更に、この酵素をコー ドする配列は、標準の分子クローン手法又は突然変異生成手段を介して修飾し、 野性型酵素よりも更に好ましい酵素とする新規な特性を有する組換えフコシルト ランスフェラーゼを得ることができる。

例えば、修飾は、その酵素に対して行い、その酵素を更に安定化したり、またバ イオリアクターにおける固定化に更に適したものにする。

（ｉｉｉ）研究試薬として直接使用する、又は研究用途のためにＧＤＰ−Ｆｕｃ 　：　［β−叶Ｇａ１（１，４／１．３）］−Ｄ−ＧｌｃＮＡｃ（／Ｇｌｃ）　 α（１，３／１．４）−フコシルトランスフェラーゼに対する抗体を産生させる のに使用する、組換えＧＤＰ−Ｆｕｃ：　［β−Ｄ−（１ｉａｌ（１，４／１． ３）］−Ｄ−ＧＩＣＮＡｃ（／Ｇｌｃ）α（１，３／１．４）−フコシルトラン スフェラーゼを製造するのに好適な試薬の分離 本発明は、オリゴ糖及び糖脂質の構造及び機能を研究するための研究手段として 使用できる、大量のこの酵素（上記（１１）を参照。即ち、特に、構成された動 物細胞、又はこれらの酵素をコードする天然又は合成遺伝子を通して）を製造す る二種類の１！！横を提供する。同様に、この方法によって製造する酵素、又は この方法によって提供される核酸配列及び誘導蛋白配列を使用して、この酵素に 対する抗体を産生ずることができる（クローン化遺伝子又はｃＤＮＡから由来す る配列を育する合成ペプチドで免疫化すること、又は組換え酵素それ自体で免疫 化する過程を経て）。

これらの抗体は、研究試薬として使用して、これらの酵素の生合成及びプロセシ ングを研究することかでき、またこれらの酵素をここで記述する全ての用途にお けるそれらの精製における助剤として使用することもできる。

（ｉｖ）ｉＧ断試薬としてのグリコジルトランスフェラーゼに対する抗体ＧＤＰ −Ｆｕｃ　：　［β−Ｄ−Ｇａｌ（１，４／１．３）］−Ｄ−ＧｌｃＮＡｃ（／ Ｇｌｃ）　ａ　（１，３／１．４）−フコシルトランスフェラーゼの異常な発現 は、人間における悪性腫瘍と組み合わせることができ、この酵素が多くの人間組 織を含む悪性腫瘍の早期検出のための腫瘍マーカーとして作用し得ることを示唆 している。酵素腫瘍マーカーは、一般に、活性分析によって体液中で分析される 。この活性分析は、拮抗するグリコジルトランスフェラーゼ活性のために、非特 異性であるかもしれない。不活性酵素は腫瘍マーカーとして有用であろうが、酵 素活性分析によっては検出できないであろうから、これらの分析は、感度か優れ ていないであろう。

本発明は、この酵素に対する抗体（ＧＤＰ−Ｆｕｃ：　［β−Ｄ−Ｇａｌ（１， ４／１．３）］−Ｄ−Ｇ１ｃＮＡｅ（／Ｇｌｃ）α（１，３／１．４）−フコシ ルトランスフェラーゼをコードするクローン化ＤＮＡ配列から由来する情報から 構成した合成ペプチドに対するモノクローナル又はポリクローナル抗体、又は真 核又は原核宿主によって産生される組換え酵素に対するモノクローナル又はポリ クローナル抗体）を製造する機構を提供する。この生成したＧＤＰ−Ｆｕｃ：　 ［β−Ｄ−Ｇａｌ（１，４／１．３）］−Ｄ−（１ｉ１ｃＮＡｅ（／Ｇｌｃ）　 （Ｚ（１，３／１．４）−７：ｌWルト ランスフェラーゼに対して特異性を有する抗体は、体液中のこのグリコジルトラ ンスフェラーゼを検定又は定量するのに使用できるであろう。その場合、特異性 及び感度は、酵素活性分析を超え、悪性腫瘍の早期検出に対する腫瘍マーカーと して作用し得る。

（いフコシルトランスフェラーゼ阻害剤又は不活性剤に対する天然又は合成化合 物のスクリーニングに使用するための組換え酵素多くの研究は、細胞のオリゴ槍 玉の細胞表面サブ末端α（１，３）及びα（１゜４）フコース残基の増大した数 と、その細胞の悪性状態における転移能力との間の相互作用を報告している。も し因果関係かあれば、ここで記述する配列によってコードされる酵素を阻害する 薬剤は、抗腫瘍剤として活性であろう。本明細書で記述する試薬は、クローン化 した配列が標準操作とともに使用して相対的に多量な純粋のフコシルトランスフ ェラーゼを産生できるので、抗フコシルト・ランスフェラーゼ活性に対する化合 物をスクリーニングするのに有用である。潜在的な阻害剤の効果は、全細胞抽出 物において又は部分的に精製した酵素で生ずるかもしれない混乱効果なしに、純 粋な酵素で試験されるので、スクリーニングを容易にする。

（ｖｉ）分泌又は細胞関連糖接合体上の新規な糖接合体構造を産生するグリコツ ルトランスフェラーゼ基質特異性の作出 本発明は、試薬（クローン化されたＧＤＰ−Ｆｕｃ　：　［β−〇−Ｇａｌ（１ ，４／１．３）］−Ｄ−ＧｌｃＮＡｅ（／Ｇｌｃ）α（１，３／１．４）−フコ シルトランスフェラーゼｃＤＮＡ）及びそれを分離するのに使用される遺伝子選 択法を提供する。この試薬は、適当な突然変異生成手法とともに使用すると、野 性壓酵素によって生成されるグリコシド結合と異なる結合を形成する、変異型Ｇ ＤＰ−Ｆｕｃ：　［β−Ｄ−Ｇａｌ　（１，４／　１．３）　］−Ｄ−ＧｌｃＮ Ａｃ（／Ｇｌｃ）　ａ　（１，３／１．S）− フコシルトランスフェラーゼを産生させる。これら新規な結合は、天然のもので も、そうでなくてもよく、それらが結合する分子の生物活性を高める部位として 有用である。

また、突然変異生成及び選択手法は、優性ネガチプ形式（ｄｏｍｉｎａｎｔ　ｎ ｅｇａｔｉｖｅｆａｓｈｉｏｎ）で作用する、変異’ＪＩ　ＧＤＰ−Ｆｕｃ：　 ［β−Ｄ−Ｇａｌ（１，４／１．３）］−Ｄ−Ｇ１ｃＮＡｃ（／Ｇｌｃ）α（１ ，３／１．４）−フコシルトランスフェラーゼを生成するのに使用することかで きる。

そのように生成した優性ネガテブ変異体は、内因性グリコジルトランスフェラー ゼの産生物か望ましくない場合に、その酵素の活性を不活性化するのに使用する ことかできる。変異型ＧＤＰ−Ｆｕｃ：　［β−Ｄ−Ｇａｌ（１，４／１．３） ］−Ｄ−Ｇ１ｃＮＡｃ（／Ｇｌｃ）　ｃｒ（１，３／１゜４）−フコシルトラン スフェラーゼは、例えば、インビトロ及びインビボでオリゴ糖から種々の糖結合 （フコース、マンノース、その他）を加水分解するフコシダーゼとしてのその作 用のために、産生させることができる。

（ｖｉｉ）ルイス遺伝子座による遺伝子Ｙ特定このクローン化ｃＤＮＡに対応す る遺伝子内又はそれに連結した、制限フラグメントの多形性を使用して、ルイス 遺伝子座により個人の遺伝子蟹を特定することができる。これは、臓器移植操作 に関して、又は侵入（例えば、尿道感染のような）に対する受容体としての血液 型構造を使用できる、病原体によって起こされる感染に対する感受性の尺度とし て有用である。

配列（１１［）は、マウスＵＤＰ−Ｇａｌ　β−Ｄ−Ｇａｌ（１，４）−Ｄ−Ｇ ｌｃＮＡｃα（１，３）−ガラクトジルトランスフェラーゼをコードする。配列 （ＩＩＩ）は、ヒトＧＤＰ−Ｆｕｃ：　［β−Ｄ−ガラクトシドーα（１，２） −フコシルトランスフェラーゼをコードする。これらの各蛋白に対する用途は、 一般に、配列（Ｉ）に関してここで記述するものと同一である。

配列（Ｉ［［）でコードされる酵素の具体的な用途には、ラクトースアミン又は ネオラクト型β−Ｄ−ガラクトシド上の鎖終結ガラクトースのα−２−Ｌ−フコ ース残基への酵素的フコシル化が挙げられる。かかる修飾は、精製したα（１， ２）Ｆｒ又はその誘導体及びその基質ＧＤＰ−フコースを使用して、またβ−Ｄ −ガラクトシド残基で終わるアシアログリカンを使用して、インビトロで行うこ とができる。

このようなアシアログリカンは、天然に存在し、シアル酸で置換された末端ガラ クトース部位を有するグリカンから、インビトロ消化ノイラミニダーゼによって も構成することができる。同様に、かかるフコシル化は、グリカンがα（１，２ ）　ＦｒｃＤＮＡ又は遺伝子フラグメントでトランスフェクトした哺乳類細胞で 発現すると、生じると期待することができる。α（１，２）フコシル化グリカン は、向上した溶解特性を有し、長期化した原形質半減期（肝臓のアシアロ糖蛋白 質受容体によって糖蛋白質クリアランスを通常調節する末端ガラクトース残基が 今やフコース残基によって覆われているという事実によって）を有し、天然の槍 形Ｌ！１．　（ｇｌｙｃｏｆｏｒωから分化し、かつ生物活性を増大するかもし れない。

本発明の他の特徴は、実施例の以下の説明から明瞭になろう。この実施例は本発 明の説明のために使用され、本発明の範囲を限定するのに使用されるものではな い。

ヒトα（ｌ、２）フコシルトランスフェラーゼ遺伝子転移のための宿主としての マウスＬ細胞 マウスＬ細胞を遺伝子転移のための宿主として試験した。これらの細胞は、この 目的に広く使用されている。ゲノムＤＮＡは、高効率でＬ細胞に導入できる。

また、これらの細胞によって、外国性遺伝子配列の安定な導入体を選択するため に幾つかの代謝及び抗生物質耐性戦略を使用することができる。

タイプＵＨ構造を認識するモノクローナル抗体及び蛍光活性化細胞分類法を使用 して、Ｌ細胞を、ＨＦｕｃα（１，２）Ｇａｌ結合の表面発現に関して測定した 。この抗Ｈ抗体で染色した細胞は、コントロールのマウスＩｇＭモノクローナル 抗体で染色した細胞によって生じる特徴、及びＦ［ＴＣ−接合第二抗体でのみ染 色した細胞によって生じる特徴と実質的に同一のＦＡＣ３特徴を示した。これら の結果から、Ｌ細胞が、抗Ｈ抗体で検出できる表面局在Ｆｕｃα（１，２）Ｇａ 　ｌ結合を発現しないことが分かる。

本発明者は、Ｌ７細胞抽出物を分析して、表面発現Ｈ決定子の不存在がα（１， ２）フコシルトランスフェラーゼ活性の欠如によることを確認した。フェニルβ −Ｄ−ガラクトシドを、α（１，２）フコシルトランスフェラーゼの分析用の受 容体として使用した。この化合物は、α（１，２）フコシルトランスフェラーゼ に対する特異的な受容体である。この化合物は、これらの酵素によって効率的に 使用されるか、α（１，３）、α（１，４）又はα（１，６）結合を生じさせる フコシルトランスフェラーゼに対する受容体としては機能しない。Ｌ細胞抽出物 は、抽出物の量を増大させて分析しても、また長期に培養しても、検出できるα （１，２）フコシルトランスフェラーゼ活性を示さなかった。Ａ４３１細胞抽出 物との混合実験によって、阻害剤が、検出できる酵素活性の明らかな欠如をもた らさないことが分かった。

本発明者はまた、Ｎ−アセチルラクトースアミン（Ｇａｌβ（１，４）ＧｌｃＮ Ａｃ）末端基を有する接接合体の表面発現についてこれらの細胞を検討した。こ れらは、補完的ヒトα（１，２）フコシルトランスフェラーゼ活性に対する潜在 的な受容体分子を示し、これよって、得られた表面発現Ｆｕｃα（１，２）Ｇａ ｌ結合が抗Ｈ抗体によって検出できる。Ｅｒｙｔｈｒｉｎａ　ｃｒｉｓｔａｇａ ｌｌｉ　（ＥＣＡ）からの凝集素をこの分析に使用した。

このレシチンは、１以上の未置換Ｎ−アセチルラクトサミン末端基を有するオリ ゴ糖に対して高い親和性を示す。Ｌ細胞は精製したＦ［ＴＣ−標識ＥＣＡによっ て、又はハブテンＮ−アセチルラクトサミンで予め培養し、ＦＡＣＳ分析にかけ たＦＩＴＣ−標識ＥＣＡによって染色された。この結果は、実質的量のＥＣＡが これらの細胞と結合し、この結合かハブテンＮ−アセチルラクトサミンによって 効果的に阻害されることを示した。これらの結果は、Ｌ細胞がＮ−アセチルラク トサミン部位を含むオリゴ糖を合成するという予想と一致し、これらの接接合体 のあるものが、修飾されずに残り、細胞表面で発現されたことを示唆する。

本発明者は、更に、フコツルトランスフェラーゼ基質ＧＤＰフコースを合成する 能力に関して、Ｌ細胞を試験した。これらの分析によって、　（２−’Ｈｌマン ノースで標識した細胞からｒ１４１ｊ１シた水性抽出物中で、ＧＤＰ−［’Ｈ］ フコース及びＧＤＰ−［’Ｈ］マンノースの両者か同定された。これらの細胞に おけるＧＤＰ−［３Ｈ］フコースの細胞下（ｓｕｂｃｅｌ　Ｌｕ１ａｒ）位置は 、これらの実験からは決定することはできない。効果的なゴルジ体フコシルトラ ンスフェラーゼ活性は、たぶんゴルジ体のルーメン内で叩Ｐ−フコースの基質濃 度の存在を必要とするであろう。これらの細胞は、フコース代謝において欠陥が あるものとして選択されなかったので、細胞質的に合成された化合物をゴルジ体 ルーメンに移送する能力があろう。このことは、これらの細胞が放射性標識フコ ースを膜種接合体に導入することかできるを示すことによって確認することがで きた。この殆どは、ある種のＮ−結合オリゴ糖のアスパラギン−結合Ｎ−アセチ ルグルコサミンへのα（１，６）結合中にフコースを示すかもしれない。

上記のことから、これらの結果は、Ｌ細胞が、α（１，２）フコシルトランスフ ェラーゼ活性を決定するヒトＤＮＡ配列の導入及び発現の後に、表面局在ＨＦｕ ｃα（１，２）Ｇａｌ結合を示す能力があることを示している。

α（１，２）フコシルトランスフェラーゼＤＮＡ配列のための、供与体としての ヒトＡ４３１細胞 このヒトＡ４３１細胞系について、これらの細胞がタイブエ及び■血液型Ｈ構造 を発現することから、遺伝子転移のためのＤＮＡ源として検討した。Ａ４３１細 胞から調製した抽出物は、フェニル−β−Ｄ−ガラクトシドを使用して分析した 場合に、α（１，２）フコシルトランスフェラーゼ活性を有することが分かって いる。Ａ４３１抽出物によって作成された放射性標識物を、ヒト血清Ｈα（１， ２）フコシルトランスフェラーゼにって産生されかつ認証された（”Ｃ）フコシ ル化フェニル−β−Ｄ−ガラクトシドとともにクロマトグラフィーにかけた。Ａ ４３１産物をα−Ｌ−フコシダーゼで消化すると、定量的な収率でＬ−フコース が生じた。これらの結果は、Ａ４３１細胞が１以上の機能的なα（１，２）フコ シルトランスフェラーゼ遺伝子を含み、従って遺伝子転移のためにヒトＤＮＡの 適当な源を提供することを示す。

モノクローナル抗Ｈ抗体によって認識される表面分子を発現するマウストランス フエクタントの分離 ヒトα（１，２）フコシルトランスフェラーゼの発現を決定するＤＮＡ配列を含 むマウス細胞を分離するために、Ｌ細胞の単一層培地を、Ａ４３１細胞によって 調製された高分子ゲノムＤＮＡと、ｐｓＶ２−ｎｅｏプラスミドと（３０対ｌの 比）で共トランスフェクションした。ｐＳＶ２−ｎｅｏでの共トランスフェクシ ョン後に、０４１８を含む媒体中でトランスフェクション細胞を成長させること によって、安定に導入された外因性ＤＮＡ配列を有する形質転換体を選択した。

この操作によって、本発明者は、約６０．０００の独立６４１８耐性トランスフ エクタントを提供する細胞群を形成した（表１）。この方法は、輿望的に、約１ ０００ｋｂのトランスフェクトされた配列を、受容細胞のゲノムに導入する。ヒ トゲノムの大きさは約３Ｘ１０’ｋｂであるので、本発明者は、約２０コピーの ハブロイドヒトゲノムが一次トランスフェクタントの「ライブラリー」内に提供 されたと評価した。

トランスフェクタントは、選別（ｐａｎｎｉｎｇ）及び不実細胞分離（ｓｔｅｒ ｉｌｅ　ｃｅｌｌ　ｓ。

ｒｔｉｎｇ）の組み合わせによって、Ｈ抗原発現について選択した。トランスフ ェクションされた細胞の全体を示す一群の細胞を、タイプＩ［Ｈ構造を認識する マウス１ｇＭモノクローナル抗体と反応させた。結合した抗Ｈ抗体を有するトラ ンスフェクタントに対して、ヤギ抗マウス［ｇＭを被覆した滅菌皿上で選別する ことによって、初期選択を行った。この段階で、本発明者は、この操作が、より 多くの数のトランスフエクタントを迅速にかつ容易に処理できるので、フローサ イトメトリーによる選択よりも効果的であることが分かった。選別によって選択 されたトランスフエクタントを、培地に戻し、続く選択のサイクルのために増幅 した。この第１回の選択の後に存在する細胞のＦＡＣ５特性は、抗Ｈ抗体と結合 する細胞の明瞭なピークを示さなかった。しかし、ＦＡＣ５度数分布図の分析か ら、細胞の約０．１３％がコントロールの抗体で染色したものよりも、明るく染 色したことが分かった。全数の最も明るい３〜５％を示す細胞を、無菌的に採集 し、１４日間培地に戻し、そして同一の操作により再度選択した。３回の選択の 後、ＦＡＣＳ分析は、抗Ｈ抗体で明るく染色された細胞の明瞭な一群の存在を示 した。これらの細胞を収集し、そして培地に帰した。試行錯誤的な理由によって 、トランスフエクタントに対して、ＦＡＣＳ選択と平行して、選別による選択も 行った。本発明者は、この選別操作が細胞群を更に効率良く富化することを見出 した。

表１ ６種の独立ライブラリーにおけるＨ抗原陽性トランスフェクシントの予想頻度頻 度は、分離された１つの独立のＨ発現トランスフェクシント／スクリーニングし たトランスフェクタントのプレートの数として表現した。細胞分離又は選別によ ってスクリーニングしたライブラリーに対して、これらの免疫選択操作は、Ｈ発 現姉妹（ｓｉｂ）と、独立に誘導されたＨ陽性トランスフェクシントとの間に差 を生じないので、これは最少の見積りである。すくなくとも１つの独立なＨ発現 トランスフェクシントが、これらの各ライブラリー中に存在する。この−次ライ ブラリ−ｍＨ１、及び二次ライブラリーｍＨｓｌＳｍＨｓ３、ｍＨｓ４及びｍＨ ｓ５に対して、それぞれのプレートは、トランスフェクション効率評価（実験操 作を参照）から測定した時に、約２０００の独立トランスフェクシントを含んで いた。ｍＨｓ２の二次ライブラリーに対しては、スクリーニング前にプレートを 調べると、約５０のコロニーが各プレートに存在することを示した。クローン５ ２−１及び３２−２を、２つのプレートからロゼツト操作で単離した。クローン ５２−３は、約６５０の独立なトランスフェクタントコロニーを示す細胞群を選 別することによって単離した。

ライブラリー名　トランスフェクト　添加された　Ｈ決定基を発現してされたＤ ＮＡの由来　選択プラスミド　いるトランスフェクシントの分画 ｍＨＩ　（−次）　Ａ４３１細胞　ｐＳＶ２−ｎｅｏ　＊　１／３０皿ｍＨｓｌ （二次）　ｍＨｌ−１２ｐＳＶ２−ｎｅｏ＊　ｌ／３０皿ｍＨｓ３（二次）　ｍ Ｈｌ−１２ｐＳＶ２−ｎｅｏ＊　１／１０皿ｍＨｓ４（二次）　ｍＨｌ−１２ｐ ＳＶ２−ｎｅｏ＊　１／１０皿ｍ１ｓ５（二次）　ｍＨｌ−１２ＰＳＶ２−ｎｅ ｏ＊　１／１０皿ｍ１ｓ２（二　次）　ｍＨｌ−１２無し　１／−６５０コロニ ーこれは、おそらく、ＩｇＭ抗Ｈ抗体抗体陽性トランスフェクシントの凝集を誘 導し、ＦＡＣＳによる選択を妨害したためであろう。従って、引き続く選択は全 てパニング（ｐａｎｉｎｉｎｇ）法によって行われた。パニングをさらに３ラウ ンド行った後（合計７回の選択に相当）、選択された集団の内の９０％以上が抗 Ｈ抗体によって明瞭に染色された。クローン化された単離物が前述の集団から作 製され、またそれぞれのサブクローン（ｓｕｂｃｌｏｎｅｓ）は、ＦＡＣＳによ るＨ抗原の発現で分析された。

はとんどのクローンは、Ｈ−発現及び非発現トランスフエクタントからなる表現 型の混在した細胞集団を生しさせた。この理由は、明確な表現型の不安定性が知 られていないことによる。安定で明確なＨ抗原陽性の表現型を示す１種のクロー ンがさらに分析された（クローンｍＨＴ−１２）。クローンｍｌ江−１２の表現 型はＨ発現を選択しなくとも９力月以上安定であった。

本発明者はムリン（α−１，２）フコシルトランスフェラーゼ遺伝子がＬ細胞集 団中の稀な突然変異体中で活性であるか、若しくはトランスフェクション法がそ れ自体か前述の遺伝子を活性化する、及び選択工程が上述した望ましくないイベ ントを高める可能性について言及したい。従って、平行した対照実験ではＬ細胞 は高分子量のゲノムＤＮＡであってＬ細胞から調製されたものをｐＳＶ２−ｎｅ ｏを好適な選択マーカーとして使用してトランスフェクトした。そのトランスフ エクタントについて、その後に正に上述した通りにＨ抗原発現の選択を行った。

本発明者は、同時に単相ムリン遺伝子の１５以上のコピーの等価物を組み込んだ 独立したトランスフエクタントの集団（少なくとも４０．０００）から、Ｈ発現 細胞を検出若しくは単離することはできなかった。

プライマリ−（−次）トランスフエクタント発現細胞表面タイプＩＩ血液二■抗 原及び（α−１，２）フコシルトランスフェラーゼ活性−クローンｍＨ１−１２ を、タイプ１１血液型Ｈ構造（Ｆｕｃａ（１，２）Ｇａｌβ（１，４）ＧｌｃＮ Ａｃ−Ｒ）を認識するモノクローナル抗Ｈ抗体を使用して選択した。ｍ）ＩＩ− １２細胞に結合した上述の抗体は、抗体がタイプＩＩＨハブテン２−フコシルラ クトース（Ｆｕｃ　ａ　（１，２）Ｇａｌβ（１，４）Ｇｌｃ）とともに予備培 養した際に阻害される。対照的に励抗体をし一フコース、若しく（州−アセチル ラクトサミン若しくはラクトースとともに予備培養した場合には、同一の濃度で もｍｌ任−１２ｊＢ胞に対する抗体の結合は阻害されない。これらの実験に先に タイプＩＩＨ構造に特異的である事を示した異なったモノクローナル抗Ｈ抗体（ ＢＨ３）を使用した場合には、発明者はまた、２゛−フコシルラクトースに対す る結合の阻害を観測したが、他のハプテンでは観測されなかった。この検討は、 ｍＨｌ−１２ｊＢ胞が末端Ｆｕｃ　α（１，２）Ｇａｌ結合との細胞表面糖結合 （ｇｌｙｃｏｃｏｎ　ｊｕｇａｔｅｓ）を発現していることを示している。

この結合の存在のさらなる証拠は、ヒトの血漿から精製した結合特異的血液量Ａ （α−１，３）ＧａｌＮＡｃ　トランスフェラーゼを使用することによって得ら れた。このグリコジルトランスフェラーゼは、フコシル（α（１，２）ガラクト シドを末端非還元基として含有する血液ｆｆ１Ｈレセプターを絶対的に必要とす るものである。それは、本構造のガラクトース成分へのＮ−アセチルガラクトサ ミンのα−１，３結合での付加反応を触媒して、Ｇａ１ＮＡｃα（１，３）Ｇａ １塁の血液ＩＵＡ反応性分子を構成する。血液型Ａグリコジルトランスフェラー ゼの作用によるｍＨｌ、−１２Ｊｕｌ胞表面上での血液量Ａ反応性決定基の生成 は、（Ｉ型ハブテン阻害の検討の結果により推論される、末端ＦｕＣα（１，２ ）Ｇａｌ結合の存在を確証するものである。

ホルマリンで固定したｍＨｌ−１２細胞を、血液ｆｆ１Ａ（α−１，３）Ｇａｌ ＮＡｃ　）ランスフェラーゼ及びそのヌクレオチド糖基質（ＵＩＩＰ−ＧａｌＮ Ａｃ、　ＩｍＭ、　ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃに対して約２０倍以上のＫｍ）の調製 物とともにこの酵素の活性を維持するバッファー中で培養した。

その細胞は、モノクローナルＡ抗体を使用して、間接蛍光抗体法により、その後 新規に合成された表面に局在する血液型Ａ決定基の存在を検査された。

（α−１，３）ＧａｌＮＡｃ　ｌ−ランスフェラーゼとその基質とともに４時間 培養した後、血液量Ａ決定基か細胞表面に検出された。抗Ａ抗体による染色は、 ＵＤＰＧａｌＮＡｃ若しくはグループハトランスフェラーゼの何れか一方の存在 しない対照反応では観測されなかった。Ｌ細胞は、抗Ｈ若しくは抗Ａに上述のい かなる条件でも結合しなかった。

発明者はまた、抗Ｈ抗体でＡ酵素処理細胞を染色し、表面−発現Ｈ構造の欠損を 試験した。これらは、Ａ酵素によりＦｕｃａ（１，２）Ｇａｌ結合のガラクトー スに結合するＮ−アセチルガラクトサミンをマスクしなければならない。Ａ酵素 とその基質と共に４時間培養した後、抗Ｈ抗体によって行った染色はわずかに減 少した。しかし、変換反応を２４時間進めた後、細胞表面８反応性の本質的に完 全な消失が観察された。これは続いて起こる強いＡ反応性の発現と同時に生じる 。Ａ酵素を含有するが基質を含有しない対照反応混合物で２４時間処理した細胞 は強い抗Ｈ染色性を示した。このことは、２４時間の反応後に観察されたＨ反応 性の欠損がグループＡ酵素調製物を汚染するグルコハイドロラーゼまたはプロテ アーゼ活性によるＨ構造の破壊によるものではなかったことを示している。従っ て、長時間の培養後のＨ反応性の欠損は、Ａ酵素か触媒する、α−１，３−結合 Ｎ−アセチルガラクトサミンの結合によるＨ構造の“マスキング″を示す。これ らのデータは、ｍＨｌ−１２細胞か真正のＨＦｕｃｃｒ（］、、２）Ｇａｌ結合 で終結する細胞表面糖結合を発現することを示している。

ｍＨｌ−１２細胞から調製した抽出物のアッセイにより、これらの細胞が（α− １，２）フコシルトランスフェラーゼ活性を発現することが確認された。これら の反応のフコツル化された生成物のα−フコシダーゼ消化により、結合したフコ ースのアノマー結合か確認された。

プライマリートランスフェクタントにおけるヒトＤＮＡ配列の分析サザンブロノ ト分析を使用して、ｍＨＴ−１２セルラインがヒトＤＮＡ配列を含むか否かを決 定した。ＢＬＵＲ８Ａｌυ配列をヒト配列を検出するのに使用した。ハイブリダ イゼーションと使用した洗浄条件によって、ヒトＡｌｕプローブはマウス配列と はクロスハイブリッド化しないが、マウスＬ細胞ＤＮＡ（１０マイクログラム） に添加したＡｌｕ配列のいくつかのコピーの等価物を検出することができる。比 較により、このＡ４３１ＤＮＡサンプル（３ｎｇ）は反復頻度の高い点在したＡ ｌｕ配列と推測される拡散しているが比較的強度の高いハイブリダイゼーション シグナルを示す。これらの条件下で、本発明者はｍＨｌ−１２細胞（５００ｎｇ ）のゲノム中にかなりの量のヒト配列を検出することができた。この分析は、予 想した通り、ｍＨｌ−１２細胞のゲノムがほぼ１０００ｋｂのヒトＤＮＡを含む ことを示す。

細胞表面ＩＩＷＨ抗原および（α−１，２）フコシルトランスフェラーゼ活性を 発現するマルチプルセカンダリ−（二次）トランスフエクタントの単離本発明者 は、Ｈ陽性表現型の発現を媒介して外米ヒトＤＮＡの量を減少させる特異的なヒ ト配列をｍＨｌ−１２細胞のゲノム中の多数のヒト配列内で同定できることを望 み、ｍＨｌ−１２セルラインから調製したＤＮＡを使用して“セカンダリ−（二 次）”トランスフエクタント“ライブラリー″を作製し、これらのライブラリー からＨ構造を発現するトランスフエクタントをスクリーニングした。

本発明者は、このように同定したＨ発現セカンダリートランスフエクタントの各 々がそのゲノム内で同定できる少数のヒトＤＮＡ制限フラグメントを有するであ ろうと予想した。決定遺伝子に結合したヒト配列が、Ｈ発現セカンダリートラン スフェクタントに各々独立に由来する同一サイズの特徴的な制限フラグメントと 同定できるこれらのヒトフラグメントのサブセットであると予想できるため、本 発明者は、いくつかの独立なセカンダリートランスフエクタントを単離しようと した。

ｍＨｌ−１２細胞から調製したゲノムＤＮＡをｐＳＶ２−ｎｅｏと共にＬ細胞中 でコトランスフエクトした。４つの異なるセカンダリ−ライブラリーをこの方法 で作製した（表１）。各々について独立に、パニング法を用いてＨ発現トランス フェクシントをスクリーニングした。３ラウンド目のパニングの前に、ＦＡＣ３ 分析はこれらのライブラリーの各々がＨ抗原−陽性細胞を含有することを示した （ｌ〜６０％の細胞が抗Ｈ抗体と結合した）。５０〜９０％の細胞がＨ陽性表現 型を示すまで、パニングによる配列の選択を続けた。その後、ｍＨｓｌおよびｍ Ｈｓ２ライブラリー由来の集団からクローン化されたセルライン（ｓｌ−１１お よびＳ３−６）を確立したところ、これらのライン中、９５％以上の細胞か抗Ｈ 抗体で明瞭に染色された。ｍＨｓ４およびｍＨｓ５ライブラリーについては細胞 クローニング法を施さなかったが、代わりにパニングによるさらなる選択を行っ た。合計１１ラウンドの選択の後、約９５％（ｍＨｓ４ライブラリーから選択さ れた）および５０％（ｍＨｓ５ライブラリーから選択された）のこれらの細胞は Ｈ抗原の発現を示した。

本発明者がｍＨｌ−１２セルラインを構築するために使用したリン酸カルシウム トランスフェクション法は、時として、望ましい表現型を決定するトランスフェ クトされたゲノムＤＮＡ配列を育する選択可能なプラスミド配列の物理的結合を 生ぜしめる。ｍＨｌ−１２ブライマリートランスフエクタントにおける、Ｈ陽性 表現型を決定するヒトＤＮＡ配列へのｐｓＶ２−ｎｅｏ配列の結合は、Ｈ発現セ カンダリートランスフエクタントの同定を簡易化し、゛トランスフェクトされた 関連配列の分子クローニング法による単離を容易にするであろう。そのような結 合の試験として、本発明者は、Ｌ細胞をｍＨｌ−１２ブライマリートランスフエ クタントから調製したＤＮＡでトランスフェクトすることにより第２のライブラ リー、ｍＨ９２を作製した。このトランスフェクションは、外来ｐＳＶ２−ｎｅ ｏ　ＤＮＡを添加せずに行った。この方法により、１５個の１０ｃｍＭＬの各々 に、約５０個の独立なＧ４１８トランスフエクタントが作製された。これは、ｐ ＳＶ２−ｎｅｏ　ＤＮＡの添加により第２ライブラリーを作製した時に生じる数 に対して、得られた０４１８耐性コロニー数の４０倍の減少を示す（−２０００ ０４１８耐性細胞／皿）。

このｍＨｓ２ライブラリーは、始めに、その場ロゼツト法（ｉｎ　５ｉｔｕ　ｒ ｏｓｅｔｔｅｐｒｏｃｅｄｕｒｅ）によりスクリーニングして、抗Ｈ抗体と結合 するトランスフェクタントのコロニーを速やかに同定した（“実験法”を参照の こと）。約５０コロニーを含む培養皿の各々をトランスフェクションの１６日後 、他の操作の前に、この方法でスクリーニングした。試験された１５皿の２つに おいて、単一のロゼツト陽性のコロニーが同定された。これらの２つの独立なＨ 陽性コロニーヲクローニングリングで単離し、Ｈ発現セルライン（ｓ２−１およ び５２−２）を各々から確立した。さらに、独立のクローナルＨ発現トランスフ ェクタント（ｓ２−３）を、他の１３皿上のコロニーを回収し、これらの細胞を パニングにより選択し、その後細胞クローニングすることにより、単離した。

結合していない単一コピーマーカーのコトランスフェクションは、１％未満の頻 度で生じた。本発明者がｍＨｓ２ライブラリー（表■）中で観察したＧ４１８耐 性とＨ表現型の共発現（ｃｏｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）の頻度は、２つのマーカー がブライマリートランスフェクタントと結合する可能性と一致する。あるいはま た、これらの頻度はブライマリートランスフェクタント中に多重コピーで存在す る未結合マーカーのコトランスフエクションにより説明することができるであろ う。いずれにしろ、プライマリ−およびセカンダリ−ライブラリー（表１）中に 観察されるＨ発現トランスフェクシントの頻度は、これらのトランスフエクタン トにより発現されるＨ陽性表現型が単一のトランスフェクトされた遺伝子座によ り決定されることを示している。

代表的なＨ発現セカンダリートランスフェクタント（クローン５２−２）上の抗 Ｈ反応性表面分子は、Ｈ抗原陽性ブライマリートランスフェクタントＭＨＩ−１ ２に使用されたものと同じ分析を使用して、真正のＨＦｕｃａ（１，２）Ｇａｌ 結合であることが示された。５２−２細胞から調製された抽出物が（α−１゜２ ）フコシルトランスフェラーゼ活性を有することが発見された。（α−１，２） フコシルトランスフェラーゼ活性はまた、他のＨ発現セカンダリートランスフエ クタントの各々から調製された抽出物にも見い出された。

独立なＨ発現セカンダリートランスフェクタントはヒトＤＮＡ配列を含む共通の 制限フラグメントを有する 本発明者は、各Ｈ陽性セカンダリートランスフェクタントのゲノムが比較的少量 のヒトＤＮＡを含むであろうこと、およびこのＤＮＡが各々に見出された（α− １，２）フコシルトランスフェラーゼの発現を制御するヒト配列を含むであろう ことを予想した。原則としては、これらの配列により生じた１以上の特徴的な制 限フラグメントが各トランスフエクタントにおいて同定できるはずである。逆に 、無関連のヒト配列はセカンダリートランスフェクタントにおいてランダムな制 限パターンを示すはずである。従って、本発明者は、各トランスフェクタントか らゲノムＤＮＡを単離し、これらのＤＮＡを種々の制限酵素で消化させ、これら の消化物をサザンプロット分析にかけた。ヒトＤＮＡ配列を含む制限フラグメン トをＢＬＵＲ８Ａｌｕプローブにより検出した。多くのＤＮＡ制限フラグメント が各クローナルセカンダリートランスフェクタント中に存在し、これらの細胞中 に存在するヒトゲノムＤＮＡの総量は２５〜５５ｋｂであると見積もられる。

各クローナルセカンダリートランスフェクタントのゲノムは、２．７および３． ４ｋｂの大きさを有する、特徴的な対のヒトＤＮＡ　ＥｃｏＲＩ制限フラグメン トを含む。これらのフラグメントはまた、ライブラリーｍＨｓ４およびｍＨｓ５ からパニングすることにより選択した細胞のプール中で明白である。同様の分析 により、各Ｈ発現セカンダリートランスフェクタントのゲノムが共通の１．　５ および１．９ｋｂ　Ｐｓｔ１７ラグメントと共通の２．８ｋｂ　ＰｖｕｌＩヒト ＤＮＡ制限フラグメントを含むことを示している。これらの観察は、これらの特 徴的なヒト制限フラグメント内のまたはこれに結合したＤＮＡ配列がこれらのト ランスフェクタントを選択するのに使用する細胞表面ＨＦｕｃａ（１，２）Ｇａ ｌ結合の発現と関連すること、およびこれらの細胞中に見出される（α−１，２ ）フコシルトランスフェラーゼの発現に関係していることを暗示している。

この３．４ｋｂのＥＣ０ＲＩフラグメントに相当するクローン化されたＤＮＡセ グメントは、遺伝子転移発現実験において機能的なα（１，２）フコシルトラン スフェラーゼを産生ずることか観察された。このフラグメント、この２．７Ｅｃ ｏＲＩフラグメント、および３．４ｋｂフラグメントの近傍のＤＮＡは配列（Ｉ 　Ｉ　Ｉ）を与えるように配列されていた。また、以下に詳述する他の２つのグ リコジルトランスフェラーゼｃＤＮＡに対して記載した方法と本質的に同じ方法 で、これらのＤＮＡフラグメントに相当するｃＤＮＡを単離し、活性なタンパク Ａ融合タンパクを作製するのに使用した。

他の態様において、本発明はＧＤＰ−Ｆｕｃ：　Ｃβ−Ｄ−Ｇａｌ　（１，４） ）−Ｄ−ＧｌｃＮＡｃα（１，３）−フコシルトランスフェラーゼとして機能す ることのできるタンパク配列をコードするＤＮＡ配列（ＩＶ）（図４に記載した ）を提供する。この酵素は、クローン化されたＤＮＡ配列（ＩＶ）により発現さ れた時、哺乳類細胞内で機能して、それらの細胞の特異的細胞表面糖結合構造の 新規な発現を生せしめる。

本ＤＮＡ配列（Ｖ）（それがｐＦＴ−３ＤＮＡと同じ場合には、図５に記載した ）はＤＮＡ配列（ＩＶ）＋：含マレル。即ち、配列（Ｖ）　は、配列（ＩＶ）の １９４２位のヌクレオチドから始まる（＋９４２−１９４４）位のヌクレオチド のコドンであることかわかっている。

本発明のこの態様において提供されるＤＮＡ配列および対応するペプチドは、図 ４に記載の配列（ＩＶ）の２０８９から３１５６位のヌクレオチド、好ましくは １９４２から３１５６位のセグメントに少なくとも相当しなければならない。

これらのＤＮＡ配列は任意に各末端と結合するさらなるＤＮＡ配列を有すること ができる。これらのペンプントＤＮＡ配列（ｐｅｎｄｅｎｔ　ＤＮＡ　５ｅｑｕ ｅｎｃｅｓ）は、図４に記載のものに相当する長さ以下のいかなる長さも取り得 る。

好ましい態様においては、本発明のこの態様は、配列（ＩＶ）における少なくと も２０８９から３１５６位、好ましくは１９４２から３１５６位のヌクレオチド 間の配列に対応し、任意に、各末端に結合し、図４に記載のものに相当するさら なるＤＮＡ配列を有する、ＤＮＡ配列、およびその対応するタンパクを提供する 。この場合、ペンプントＤＮＡ配列、および対応するタンパクは、図４に記載の 長さ以下のいかなる長さも取り得る。

この酵素により部分的に構成されたこれらの糖結合構造は、期特異的胚抗原Ｉに 対する抗体（ＳＳＥＡ−１またはルイスＸ；構造Ｇａｌβ（１，４）（Ｆｕｃａ 　（１，３））ＧｌｃＮＡｃ）により、またＶＩＭ−２決定基ＮｅｕＡｃａ　（ ２゜３）Ｇａｌβ（１，４）ＧＩｃＮＡｃβ−（１，３）Ｇａｌβ（１，４）　 （Ｆｕｃａ（１，３））ＧｌｃＮＡｃに対する抗体により認識される。この酵素 は、ＤＮＡ配列（ＩＶ）により発現された場合、そのＤＮＡ配列を発現する細胞 から調製した抽出物でアッセイする時には、その名前に暗示される酵素的な方法 で機能する。

この酵素のオリゴ糖生成物は、“ＩＩ型”ラクトサミンアクセプターのＧｌｃＮ ＡＣ残基にＧ１，３の配置で結合したフコースで代表される。本明細書の開示の 残りにおいて、これらの生成物は、サブターミナルα（１，３）フコース残基と いうこととする。

細胞表面、細胞内、または分泌タンパク若しくは脂質上のオリゴ槍、（バイオテ クノロジー産業による診断用薬および治療薬用の）この酵素の生成物を示すサブ ターミナルα（１，３）フコース残基による翻訳後修飾に関する特別な能力を有 する動物セルラインを構築することができる。

本発明のクローン化されたＤＮＡ配列を標準的な手法で、同系列の酵素またはそ の生成物（オリゴ糖のサブターミナルα（１，３）フコース残基）を通常発現し ない哺乳類セルラインに導入し、その細胞中で“センス″方向に転写し、細胞表 面、細胞内、または分泌タンパク若しくは脂質上のオリゴ槍玉にサブターミナル α（１，３）フコース残基を発現できるセルラインを作製することができる。

あるいはまた、これらのクローン化されたＤＮＡ配列を、標準的な手法で、同系 列の酵素またはその生成物（サブターミナルα（１，３）フコース残基）を発現 する哺乳類セルラインに導入し、その細胞中で“アンチ−センス″方向に転写し 、細胞表面、細胞内、または分泌タンパク若しくは脂質上のサブターミナルα（ １゜３）およびフコース残基を発現できないセルラインを作製してもよい。

ある態様において、同系列の酵素を発現する哺乳類細胞中の内因性ＧＤＰ−Ｆｕ ｃ　〔β−Ｄ−Ｇａ　ｌ　（１，４））Ｄ−ＧＩＣＮＡＣ（Ｚ　（１，３）−７ ：Ｉジルトランスフェラーゼ遺伝子は、同種組み換え法（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ 　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ　ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）により、若しくは本明 細書に記載したＤＮＡ配列に基づいた“アンチ−センス″オリゴヌクレオチド法 により、または内因性のＧＤＰ−Ｆｕｃ・　〔β−Ｄ−Ｇａｌ　（１，４））Ｄ −Ｇ１ｃＮＡｃα（１，３）−フコシルトランスフェラーゼを不活性化し、突然 変異生成により、および本明細書の記載における配列情報とともに遺伝子選択ス キームから生じてもよい優性の陰性変異型フコシルトランスフェラーゼ配列によ り、ＤＮＡ配列（ＩＶ）で不活性化されてもよい。

この方法を用いて、有用性または効果が、このクローン化されたＤＮＡ配列およ びその同系列の酵素により決定される特定の翻訳後修飾に依存する、診断用また は治療用物質の製造に適した、宿主細胞となる動物セルラインを構築することが できる。例えば、多くの治療用タンパクまたはペプチド、組み換え体その他の生 物学的効果は、これらに共有結合で結合するオリゴ糖構造に非常に依存し得る。

これらのオリゴ糖の構造は、主に、これらの治療用生産物を産生ずるために使用 する細胞中に見出される多種のグリコジルトランスフェラーゼ酵素の作用を有す る。動物細胞および酵母はこれらのグリコジル化反応を起こす能力があるが、す べてのグリコジルトランスフェラーゼ酵素があらゆる動物細胞および酵母により 産生されるわけではなく、従って、いくつかのオリゴ糖構造（本明ｌに記載した ＤＮＡ配列によりコードされた酵素により生じたサブターミナルα（１，３）フ コース残基を含む）がそれらによって産生されない。

逆もまた真である。すなわち、産生細胞は、本明細書に記載したＤＮＡ配列によ りコードされたＧＤＰ−Ｆｕｃ：　（β−Ｄ−Ｇａｌ　（１，４））−Ｄ−Ｇｌ ｅＮＡｃα（１，３）−フコシルトランスフェラーゼと類似の、または同一のグ リコジルトランスフェラーゼを発現するかもしれない。哺乳類または他の真核宿 主により産生された天然または組み換え治療用または診断用薬剤（糖タンパクま たは糖脂質）の生物学的活性を（良い方にも悪い方にも）変化させるかもしれな い。

バイオテクノロジー産業において、これらの組み換え薬剤を製造するのに使用さ れる真核宿主細胞は、望ましい宿主において、本明細書に記載したクローン化さ れた配列のすべてまたは一部を発現することによって、組み換え生成物上のオリ ゴ糖にサブターミナルα（１，３）フコース残基を付加するために、本発明にお いて記載されたＤＮＡ配列情報および関連する情報により改変され得る。あるい はまた、サブターミナルα（１，３）フコース残基を、前に概説したように、ト ランスフェクトされた“アンチ−センス″ベクター構築物、組み換えを基にした 遺伝子不活性（Ｌ　“アンチ−センス“オリゴヌクレオチド法、または優性の陰 性変異型フコシルトランスフェラーゼを使用して、これらの宿主細胞中に産生さ れた生成物から除去してもよい。

この方法に使用する“旧式の“方法としては、適当に改変された組み換え体また は天然物の製造に対して、同様のまたは同じ方法で機能する酵素またはこの特定 の酵素を発現するまたは発現しないセルラインを同定する経験的な方法が挙げら れる。この方法はいつも最適であるわけではない。というのは、この特定の翻訳 後修飾の能力を有するセルラインは天然には存在しないかもしれず、また適当に 修飾された生成物を多量に生産するには特に適していないかもしれないからであ る。

あるいはまた、実験的に同定された動物セルラインにより産生された治療用物質 に存在する望ましくないサブターミナルα（１，３）フコース残基は化学的また は酵素的に除去しなければならず、そういった方法は費用かかかり効率的でない かもしれない。

本明細書に記載したクローン化された１機能的なりＮＡ配列を前に概説した手法 とともに使用することの利穀としては、従来の方法と比較した場合、糖タンパク および糖脂質のオリゴ槍玉のサブターミナルα（１，３）フコース残基を形成す る能力を明確に欠くラインを構築する能力が挙げらね〜適当に構築されたこれら のセルラインは、望ましくないサブターミナルα（１，３）フコース残基を除去 するための治療用または診断用物質の化学的または酵素的な処理を必要としない 。さらに、サブターミナルα（１，３）フコース残基が動物細胞によって産生さ れた特定の診断用または治療用生成物に対して望ましいことがわかっている場合 には、セルラインを本明細書に記載したクローン化したＤＮＡ配列を用いて工作 してこれらの残基を生じさせてもよい。

もうひとつの態様においては、本発明は、（例えば、酵素リアクターにおいて） オリゴ糖の効率的な酵素的合成および製造に適した薬剤の単離を可能にする。

オリゴ糖は、臓器移植の分野において、免疫調節剤として治療上の有用性があり 得る。特に、溶解性の固相オリゴ糖には、臓器提供者と被移植者の主要血液塁抗 原システムの違いによる不適合性を含む場合における、抗体が媒介する臓器移植 拒絶反応を遮断するかまたは改善する治療用薬剤としての使用法があり得る。

同様に、溶解性のオリゴ糖には、細菌の、ウィルスの、または寄生の病原体の、 これらの病原体が侵入する動物組織の表面上に見出される糖結合“レセプター′ への結合を阻害することよって機能する治療用薬剤としての使用法かあり得る。

例えば、（サブターミナルα（１，３）フコース残基を含む）ルイス血液型オリ ゴ糖分子の一部が、ある梨の尿病原体細菌（ｕｒｏｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ　ｂａ ｃｔｅｒｉａ）に対して″レセプター”として働くことを示す証拠がある。さら に、サブターミナルα（１，３）フコース残基を含む糖結合が、発生と分化の過 程において、細胞間および細胞とその環境間の接着イベントの調節に関係してい る。同様に、サブターミナルα（１，３）フコース残基はＥＬＡＭ−１に対する オリゴ糖リガンドの重要な部分である。これらのイベントしては、***の卵子へ の結合、および着床の初期における子宮壁への受精卵の間接的な結合の初期的な イベントが挙げられる。

これらの観察は、例えば、（生物学的に“天然の”）オリゴ糖分子を避妊に使用 する可能性があることを示唆している 現在、サブターミナルα（１，３）フコース残基を含むオリゴ糖は、化学合成（ この方法は非効率的で費用かかかる）により、または（しばしば、多量の動物ま たは植物材料の処理、および他の混在するオリゴ糖からの望ましいオリゴ糖の精 製を必要とするコスト高で非効率的な方法を使用して）天然資源からの単離によ り製造される。本明細書に記載した本発明は、多量の精製したＧＤＰ−Ｆｕｃ〔 β−Ｄ−Ｇａ　Ｉ　（１，４））−ｄ−ＧＩｃＮＡｃｃｚ　（１，３）−フコシ ルトランスフェラーゼを合成する機構を提供する。これは、サブターミナルα（ １゜３）フコース残基を含む構造を酵素的に合成することができる酵素バイオリ アクター（例えば、酵素の触媒ドメインに融合したタンパクＡ部分を介して、本 発明者が既に公表した原稿に記載したように、固相マトリックス上に溶解したま たは固定した酵素）を構築するのに使用することができた。

これは、サブターミナルα（１，３）フコース残基を有する構造の化学的合成又 は天然源からのそれらの精製を含む研究方法よりも、種々の理由から優れている 。

第一に、唯一の必要な化学物質は酵素の基質であろうということである。第二に 、そのような構造の酵素的合成は所望の生成物及び基質の加水分解のヌクレオチ ドニリン酸生成物のみを製造するであろうということである。この後者の化学物 質は動物細胞におけるこれらの反応の副生成物として天然に見出されへ比較的非 毒性でありオリゴ糖類合成生成物から容易に分離されつる。対照的に、化学合成 方法は典塁的には、除去しなければならず、その上毒性でありうる副反応生成物 を大量に生じさせる。同様に、天然源からのオリゴ糖類の精製は、天然材料中に 存在する不純物である他のオリゴ糖類の除去を要求する。第三に、酵素触媒は並 外れて優れており、基質から生成物への殆と完全な転化を達成しうる。対照的に 、オリゴ糖類上のサブターミナルα（１，３）フコース残基の化学合成は、多段 階の方法であり、各工程での収率は１００％よりはるかに低いと考えらね、現在 の化学合成方法の漸増的な効率は、酵素的合成で可能な効率には達しない。同様 に、天然材料からのサブターミナルα（１，３）フコース残基を有するオリゴ糖 類の精製は、不純物である非関連オリゴ糖類から所望のオリゴ糖類を分離するた めに要求される精製操作に面前の著しい損失を伴いうるちのであり、所望のオリ ゴ糖類の単離が非効率的となる。

ここに記載されたＤＮＡ配列によりコードされるＧＤＰ−Ｆｕｃ　：　［β＋Ｇ ａ１（１，４）］−Ｄ−Ｇ１ｃＮＡｃα（＋、、３）−フコシルトランスフェラ ーゼは部分的には合成用途のために動物組織から精製されてもよいが、酵素は典 型的には非常に低い量で存在するので、これらの精製は本来的にはそれ自体非能 率的である。本発明はこの酵素を大量の製造するために提供されうる二つの機構 を提供する。第一に、これは、比較的大量の酵素を製造する動物細胞の構築及び 選択によりなされつる。または、このクローン化された核酸配列を、標準的な組 み換えＤＮＡ技術を用いて使用して、酵母又は原核細胞宿主中で大量のグリコジ ルトランスフェラーゼを生産させつる。さらに、この酵素をコードする配列を、 標準分子クローニングスキーム（ｓｔａｎｄａｒｄｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｃｌｏ ｎｉｎｇ　ｓｃｈｅｍｅｓ）又は突然変異誘発により修飾し、野性株の酵素より 望ましいものとする新規な性質を有する組み換え体フコシルトランスフェラーゼ を生成させうる。例えば、修飾は、酵素をより安定にするか、又はバイオリアク ターにおいて固定するのにより適したものとすることでありうる。

別の実施態様において、本発明は、研究用試薬として直接使用されるべき、又は 研究用途のために、ＧＤＰ−Ｆｕｃ　：　［β−Ｄ−Ｇａｌ　（１，４）　］− Ｄ−Ｇ１ｅＮＡｃ　ａ　（１，３）−フコシルトランスフェラーゼに対する抗体 を発生させるのに使用されるべき組み換え体ＧＤＰ−Ｆｕｃ：［β−Ｄ−Ｇａｌ （１，４）］−Ｄ−ＧｌｃＮＡｃ　α（１，３）−フコシルトランスフェラーゼ の製造に適する試薬を単離することを可能にする。

本発明は、該構造を研究するための研究手段して使用されうろこの酵素を大量に 生産するための二つのメカニズム（上記のｌｉ参照、即ち特別に構築された動物 細胞、又はこれらの酵素をコードする天然又は合成の遺伝子による）を提供し、 該方法により製造される酵素、又は該方法により提供される核酸配列及び誘導さ れたタンパク質配列は、この酵素に対する抗体を発生させるために使用されつる （合成ペプチドを介して）。これらの抗体も、これらの酵素の生合成及び加工を 研究するための研究試薬として使用することができ、この開示に記載された全て の使用のためのそれらの精製における助剤として使用されつる。

別の実施態様においては、本発明は診断試薬としてのグリコジルトランスフェラ ーゼに対する抗体を得ることを可能にする。ＧＤＰ−Ｆｕｃ：　［β−Ｄ−Ｇａ ｌ　（１，４）　］−Ｄ−ＧｌｃＮＡｃα（１，３）−フコシルトランスフェラ ーゼの異常な発現は、ヒトにおける悪性腫瘍（ｍａｌ　ｉｇｎａｎｃｙ）に関連 づけられており、これが多くのヒトの組織に影響を与える悪性腫瘍の早期検出の ための腫瘍マーカーとして適していることが提案されている。酵素腫瘍マーカー は、典型的には、体液中で、活性の分析により分析８ｔｌ。

これはグリコジルトランスフェラーゼ活性と競合することにより、非特異性にさ れつる。不活性な酵素は腫瘍マーカーとしては有用でありうるが、酵素活性分析 により検出されないという可能性があるため、これらの分析は非感受性でもあり うる。

本発明は、この酵素に対する抗体を生成させるメカニズムを提供する（ＧＤＰ− Ｆｕｃ、［β−Ｄ−Ｇａｌ（１，４）］−Ｄ−ＧｌｃＮＡｃ　α（１，３）−フ コシルトランスフェラーゼをコードするクローン化したＤＮＡ配列から誘導され る情報から構築される合成ペプチドに対する、又は真核細胞もしくは原核細胞に より製造される組み換え体酵素に対するモノクローナル抗体及びポリクローナル 抗体）。そのように製造されたこのＧＤＰ−Ｆｕｃ　：　［β十〇ａｌ（１，４ ）］−Ｄ−Ｇ１ｃＮＡｃ　（Ｚ（１，３）−フコシルトランスフェラーゼに特異 的な抗体は、体液中で、このグリコジルトランスフェラーゼを検出し定量化する のに使用することができ、酵素活性分析を超える特異性及び感受性を有し、悪性 腫瘍の早期検出のための腫瘍マーカーとして供給されうる可能性を有する。

別の実施態様において、本発明はフコシルトランスフェラーゼ抑制剤又は不活性 化剤のための天然及び合成化合物のスクリーニングに使用するための組み換え体 酵素を提供する。例えば、多くの研究において、細胞のオリゴ糖類上の増加した 数の細胞表面サブターミナルα（１，３）フコース残基と、該細胞が悪性の形態 で転移する可能性との関係が注目されてきた。もしこれに因果関係があれば、こ の開示中の配列によりコードされる酵素を抑制する薬剤が抗腫瘍剤として活性で ありうることが予想されつる。

クローン化された配列は標準技術を用いて比較的大量の純粋なフコシルトランス フェラーゼを製造するのに使用されつるので、この開示において記載されている 試薬は、抗フコシルトランスフェラーゼ活性について化合物をスクリーニングす るために製薬会社に有用であろう。潜在的な抑制因子の効果は、全細胞抽出物中 に生じうる混乱させる効果のない純粋な酵素について、又は部分的にｒ＃製され た酵素により試験されるので、これは、スクリーニングの助けとなるであろう。

別の実施態様において、本発明は、グリコジルトランスフェラーゼの基質特異性 を操作して、分泌された、又は細胞に関連した糖結合に、新規な糖結合構造を発 生させることを可能にする。本発明は、適当な突然変異誘発及び遺伝的選択スキ ームを用いて使用すると、舒性株の酵素が生産したものとは異なる糖結合を生し させる突然変異体ＧＤＰ−Ｆｕｃ：　［β−Ｄ−Ｇａｌ（１，４）］−Ｄ−ＧＩ ｃＮＡｃ　α（１，３）−フコシルトランスフェラーゼの発生を可能とする試薬 （クローン化したＧＤＰ−Ｆｕｃ・［β−Ｄ−Ｇａｌ（１、４）　］−Ｄ−Ｇ　 １ｃＮＡｃα（１，３）−フコシルトランスフェラーゼ遺伝子断片）を提供する 。

これらの新規な結合は天然に生じうるちのでもそうでなくてもよく、それらが結 合する分子の生物学的活性を強化する部分としての用途を見出しつる。

または、突然変異誘発及び選択の研究は、優性陰性塁（ｄｏｍｉｎａｎｔ　ｎｅ ｇａｔｉｖｅ　ｆａｓｈｉｏｎ）で作用する突然変異体ＧＤＰ−Ｆｕｃ：　［β −Ｄ−Ｇａｌ（１，４）］−Ｄ−Ｇ１ｃＮＡｃ　（Ｚ（１，３）−フコツルトラ ンスフェラーゼを生じさせるために使用されうる。そのように生じる優性陰性望 突然変異体は、そのような酵素の生成物が望まれない場合に内因性のグリコジル トランスフェラーゼ活性を不活性化するために使用されつる。例えば、オリゴ糖 類から種々の糖結合（フコース、マンノース等）をｉｎ　ｖｉｔｒｏ及びｉｎ　 ｖｉｖ。

で加水分解するフコシダーゼとして機能する突然変異体ＧＤＰ−Ｆｕｃ：　［β −Ｄ−Ｇａｌ（１，４）］−Ｄ−Ｇ］ｅＮＡｃα（ｌ、３）−フコシルトランス フェラーゼも生じうる。

別の実施態様において、本発明はフコシルトランスフェラーゼ部位で個体をジェ ノタイピングすること（ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ）を可能とする。ここにおいて詳 細に説明されるＤＮＡ配列によりコードされるものと同様又は同一のフコシルト ランスフェラーゼがないことは、一つの家族における腎臓部の異常と関連づけら れてきており、そして、この家族及び他の者において異常の原因となると考えら れる。このクローン化遺伝子断片に対応する遺伝子の範囲内又はこれに連結され た制限断片長多形は、この位置における個体のジェノタイピングに、遺伝子カウ ンセリングの目的で使用されうる。同様に、このような異常についての分子的な 基礎は、それが異常の病原体に因果関係があると思われるため、ここで記載した 遺伝子断片の研究によって明らかとされるであろう。

材料。

テキストの全体に渡って使用される“Ｌ細胞”という語はマウスのＬａｐｒｔ− ｔｋ−細胞系（′−言及している。

ラクトース、Ｎ−アセチルラクトサミン、２゛−フコシルラクトース（Ｆｕｃα （１，２）Ｇａｌβ（１，４）Ｇｌｃ）　、ＩＪＤＰ−ＧａｌＮＡｃ、フェニル −β−Ｄ−ガラクトシド、及びフイ：＋−Ａ（Ｆｉｃｏｌｌ）４００はシグマか ら得た。Ｌ−フコースはＰｆａｎｓｔｉｅｈｌ　Ｌａｂｓ（Ｗａｕｋｅｇａｎ、 　ＩＬ）から得た。ＵＤＰ［１−”Ｈ］Ｎ−アセチルガラクトサミン（８，７Ｃ ４／ａｎｏｌ）及ｎ−［［Ｊ−１４０］　マンノース（２３９ａ＋Ｃ１１０ｎｏ 　１）をＤｕｐｏｎｔ−Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｎｕｃｌｅａｒから得た。Ｄ −［２−’Ｈ］７：／ノース（１６，３Ｃｉ／ｍｍｏｌ）　、Ｌ−［６−’Ｈ］ フコース（７２Ｃｉ１０ｎｏｌ）　、Ｌ−［１−１４Ｃｌフコース（５８，７ｍ Ｃｉ／謝１）　、ＧＤＰ［Ｕ−”Ｃ１８−し−フコース（２６誠ｉ／罰ｌ）、及 び［α−１宜円ｄＣＴＰ（３０００Ｃｉ／ａｎｏｌ）をＡｍｅｒｓｈａｍ　Ｃｏ ｒｐ、から得た。非放射性ＧＤＰ−フコースはｆ）ｒ、　ｘリックホルメス（Ｄ ｒ、Ｅｒ１ｃ　Ｈｏｌｍｅｓ）　（シアトル）から快く提供された。Ｆ［ＴＣ− ＥＣＡはＥ−Ｙ　Ｌａｂｓ（Ｓａｎ　Ｍａｔｅｏ、　ＣＡ）から得た。プラスミ ドｐＳＶ２−ｎｅｏは、Ｄｒ、　デビットチャツプリン（Ｄｒ、Ｄａｖｉｄ　Ｃ ｈａｐｌｉｎ）　（ワシントン大学、セントルイス）から得た。制限酵素（Ｎｅ ｏ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ又はＢｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉ ｍ）を製造業者使用説明書に従って使用した。

抗血清・ モノクローナル抗Ｈ１抗Ａ、及び抗Ｂ抗体（マウスの［ｇＭ）はＣｈｅｍｂｉｏ ｍｅｄ、　Ｌｔｄ。

（アルバート、カナ灼から購入した。モノクローナル抗Ｈ抗体はＢＥ２ハイブリ ドーマ細胞培養上滑（以下参照）から製造した。抗−マウス［ｇＭ　ＥｌｃＦＦ ＩＴＣ標識抗マウスＩｇＭ　（ともに抗原親和性により精製されている、ヤギ） をシグマから得た。

細胞系及び培養 マウスＬａｐｒｔ−ｔｋ−細胞は叶、デビットチャツプリンから得た。ヒトＡ４ ３１細胞はＤｒ、ブライアンホワイトレー（Ｄｒ、　Ｂｒ１ａｎ　Ｔｈｉ　ｔｅ ｌｅｙ）及びＤｒ、ルイスグレーサー（Ｄｒ、Ｌｕ１ｓ　Ｇｌａｓｅｒ）　（ワ シントン大学、セントルイス）から得た。ＢＥ２細胞はＡＴＣＣから得た。細胞 はｌＯ％ウシ胎児血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ、　Ｌｏｇａｎ　５ＬＩＴ）を補ったダ ルベッコ改質イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’　ｓ　ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅａ ｇｌｅ’　ｓ　ｍｅｄｉｕｍＸＧ［ＢｃＯ）中で培養した。

トランスフェクションした細胞を、４００μｇ／ｍｌ（活性薬剤）のＧ４１８　 （Ｇ　［ＢｃＯ）を含む培地中で培養した。

ゲノムＤＮＡの製造： 培養した細胞から高分子量ゲノムＤＮＡを標準的な方法により製造した。ゲノム ＤＮＡのサンプルを、トリス−酢酸−ＥＤＴＡ中に緩衝した０、３％アガロース ゲルで電気原動し、それらの安全性を確認し、製造における分子の平均径を推定 した。

トランスフェラーゼ〉 リン酸カルシウム沈澱方法を用い、ヒトゲノムＤＮＡでマウスＬ細胞をトランス フェクションした。細胞（５×１０Ｉ／１ｏ−皿）をゲノムＤＮＡ２０〜３０μ ｇ及びｐＳＶ２−ｎｅｏ　１μｇからなるＤＮＡ沈澱物と一晩インキユベートし た。外来ｐＳＶ２−ｎｅ。

ＤＮＡは、ｍＨｓ２の二次ライブラリーを生じたトランスフェクションしたもの に含まれていなかった。細胞を新しい培地に翌日供給し、その次の田こＧ４１８ セレクシヨンに置いた。トランスフェクション効率（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ 　ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｉｅｓ）を、ＤＮＡの添加の後、ｌＢｉこトランスフェク ションした細胞を採取することにより、及び細胞懸濁液の複製物の連続希釈液（ ｓｅｒｉａｌ　ｄｉｌｕｔｉｏｎｓ）をプレート化すること（ｐｌａｔｉｎｇ） により推定した。−組の希釈液をＧ４１８セレクシヨンで培養し、他を抗生物質 の存在なしに培養し、得たトランスフェクション効率をプレート化効率に補正し た。培養の２週間後、５０％メタノール中の０．２％メチレンブルーで染色した 後、コロニーの数を数えた。約２０００の非依存性トランスフェクシントを、一 般的に】００ｍ皿上の５刈ｏＳ細胞をトランスフェクションすることにより得た 。

Ｈ−発現トランスフェクシントの免疫選択性３ｍＭＥＤＴＡを含むＰＢＳとそれ らをインキュベートすることにより、トランスフエクタントを培地皿から取り出 した。取り出した細胞を洗い、染色培地（ｓｔａｉｎｉｎｇｍｅｄｉｕｍ）に再 懸濁した（ダルベツコ改質イーグル培地中のＩＯＩＩＩＭヘペス、ｐＨ７，４， ０，１％アジ化ナトｌＪ’７ム、２％ウシ胎児血清）。細胞をパンニングするこ と（ｐａｎｎｉｎｇ）又は細胞選別方法を通じて４°Ｃで保持した。低い密度で 細胞をプレート化すること、各細胞をコロニー形成可能にすること、及びクロー ニングシリンダー（ｃｌｏｎｉｎｇ　ｃｙｌｉｎｄｅｒ）で各コロニーを単離す ることにより細胞のクローニングを行った。

パンニング 細菌学的培養皿（Ｆａｌｃｏｎ　１００７．６０ｏｎ）をパンニングのために製 造した。ヤギ抗マウス（Ｇｏａｔ　ａｎｔｉｍｏｕｓｅ）ＩｇＭを、それらを５ ０蘭１−リス緩衝液ｐＨ９，５中に１０ｕｇ／ｍｌに希釈した抗体溶液４ｍｌと ４°Ｃで一晩インキユベートすることにより皿に合わせた。抗体溶液を吸引し、 皿をＰＢＳで２回洗った。その後、ウシ血清アルブミン１■／ｍｌを含むＰＢＳ とそれらを少なくとも１時間室温でインキュベートすることにより、皿をブロッ クした。その後、すぐに皿を使用するか、４°Ｃで無期限に貯蔵した。皿を前で 使用したＰＢＳを用いて３回洗った。

パンニングした細胞を抗Ｈ抗体１０μｇ／ｍｌを含む染色培地に１０７／ｍｌの 濃度で再懸濁した。細胞を３０分間、４°Ｃでインキュベートし、１ｍＭＥＤＴ Ａ、０．１％アジ化ナトリウム、及び２％フィコール４００を含むＰＢＳ　１０ ｍ１により細胞をペレット化することにより、結合していない抗体を取り出した 。遠心分離の後、上澄みを注意深く吸引し、細胞を染色培地に１０’／ｍｌで再 懸濁した。この細胞懸濁液の３ｍｌのアリコートを、ヤギ抗−マウスＩｇＭで覆 った６０ａｒｙ＜ンニング皿に筐った。その後、皿を１時間、４°Ｃでインキュ ベートし、その後無血清のダルベツコ改質イーグル培地で５回すすぎ、非付着細 胞を取り出した。新鮮な血清レブリート培地（ｓｅｔｕｍ−ｒｅｐｌｅｔｅ　ｍ ｅｄｉａ）を皿に加え、それらを組織培養インキュベーターに戻した。次の日、 付着細胞をトリプシン−ＥＤＴＡで取り除き、標準的な組織培養皿に再び筒布し た。これらの細胞を次の選択に先立って１０〜１８日間培養した。

細胞選別 モノクローナル［ｇＭ抗Ｈ抗体（染色培地中１０μｇ／＋ｎｌ）を用いるか、又 はコントロールモノクローナル［ｇＭ抗Ｂ抗体（染色培地中１０μｇ／ｍｌ）を 用い、４°Ｃで３０分間それらをインキュベートすることにより、トランスフエ クタントをＦＡＣＳ分析用に製造した。その後細胞を、氷冷した染色培地で洗い 、フルオレセイン結合ヤギ抗マウス［ｇＭ　４０ｕ　ｇ／ｍｌを含む染色培地中 で３０分間４°Ｃでインキュベートした。細胞を洗い、染色培地に再懸濁し、Ｆ ＡＣＳ（Ｃｏｕｌｔｅｒ　Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ　ｍｏｄｅｌ　ＥｐｉｃｓＣ ）による分析にかけた。サンプルをゲートの前に置き、９００の光散乱にがけ、 分析物から死んだ細胞を除いた。Ｈ−発現細胞を無菌的に染色培地に集め、その 後追加的な選択の前に１０〜１８日間培養に戻した。

ロゼツト方法 ロゼツト方法を用い、抗Ｈ抗体を結合するトランスフェクシントのコロニーを同 定した。約１００〜３００の細胞を含む単離したコロニーを含む１００　ｍｍ皿 上で行った。まずコロニーのプレートをＰＢＳで２回すすぎ、その後ＰＢＳ中の １０ｕｇｍｌのマウスＩｇＭモノクローナル抗Ｈ抗体４　ｍｌ、　２％ウシ胎児 血清、０．１％アジ化ナトリウムを用いて、４°Ｃで１時間インキュベートした 。その後プレートをＰＢＳで３回すすぎ、ヤギ抗マウスＩｇＭと結合したヒト赤 血球４ｍｌを用いて３０分間、４°Ｃでインキュベートした。

（塩化第ニクロムを用いて、ヤギ抗マウスＩｇＭをヒト血液梨ｏ赤血球と対にし た。

結合の後、赤血球をＰＢＳで洗い、ＰＢＳ　、２％ウシ胎児血清、０．１％アジ 化ナトリウム中の０．２％Ｖ／Ｖ懸濁液に希釈し、すぐに使用した。）その後、 赤血球の懸濁液を注意深く吸引し、プレートをＰＢＳで完全にすすぎ、ライトボ ックスで検査した。抗Ｈ抗体に結合したコロニーは、コロニーへの赤血球付着か らなる“ロゼツト”として目にみえるものである。

血液型Ａ（α−１，３）ＧａｌＮＡｃ　トランスフェラーゼの精製。

セファロース４Ｂ（シグマ、ロフトｎｏ、　１０４ＦＯ３３４）を用いたアフィ ニティクロマトグラフィにより、Ａｕのトランスフェラーゼをヒト血液ＷＡの血 漿から単離した。酵素活性のピークを含むカラム画分を集め、マウス血清アルブ ミン（ベーリングダイアグノスティックス（Ｂｅｈｒｉｎｇ　Ｄｉａｇｎｏｓｔ ｉｃｓ）　＞９８％）を１％濃度になるまで加え、アリコートは使用するまで一 ８ｏ″Ｃで貯蔵した。最終の標本をｅ４準的な放射化学方法により測定した。１ 酵素単位は１時間当たりｌｎｍｏｌのＧａ１ＮＡｃを２−フコジルラクトース受 容体に変換するものとして定義している。

ベーパークロマトグラフィー 下降ベーパークロマトグラフィー（ｄｅｓｃｅｎｄｉｎｇ　ｐａｐｅｒ　ｃｈｒ ｏｍｔｏｇｒａｐｈｙ）は、ワットマン（ＩＩ／ｈａｔ＋ｍｎ）　Ｎｏ、３　ｒ ｍ又はワットマンＮｏ、　１を用いて、以下の溶媒系において行った。溶媒Ａ、 酢酸エチル／ピリジン／水（１０：４：３）：溶媒Ｂ　ピリジン／水／酢酸エチ ル（１０゜１１・５・３６）、上層。乾燥したクロマトグラムをＩｃｍの小片に 切断し、放射線標識した化合物を水で溶出した。各溶出液のアリコートにおける 放射能をシンチレーションカウンティングで測定した。

Ｌ細胞ＧＤＰ−フコース含有量の分析 マウスＬ細胞におけるＧＤＰ−フコースを同定するために、細胞（２，５刈０’ ）を完全培地３０ｍ１中、２５０μＣｉのＤ−［２−’Ｈｌマンノースを用いて ３日間標識した。細胞を集め、沸騰した水浴中、６０％エタノールで５分間抽出 した。ヌクレオチド糖を含む水性抽出物を真空下で濃縮し、少量の水に再懸濁し た。５０菌酢酸アンモニウムに保持させたセファデックスＧ−２５カラム（０， ９ｘ　４２−ｃｍ）におけるゲル濾過クロマトグラフィーに混合物をかけた時、 標識していないＧＤＰ−マンノース（２７０ｎｍｏｌ）及びＧＤＰ−フコース（ １３０ｎｍｏｌ）を内部標準物として加えた。溶出液を２６８ｎｍでモニターし 、ＧＤＰ−フコース及びＧＤＰ−マンノースを含むフラクションを集め、真空下 で濃縮し、２００　ｍｌの水に再懸濁した。これを弱アニオン交換カラム（ＡＸ ３００．４　ｍｍＸ２４ｃ＠。

Ｐｉｅｒｃｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、）でのＨＰＬＣによる分別にかけた。

このサンプルを１００−酢酸トリエチルアミン、ｐＨ７，０に保持させたＨＰＬ Ｃカラムに用い、流量２ｍｌ／ｗｉｎで５０分間、１００〜３０〇−酢酸トリエ チルアミン、ＰＨ７，０の直線勾配で溶出した。溶出液を２６８ｎｍでモニター し、少量（０，５ｍｌ　）をシンチレーションカウンティング用及び次の分析用 に集めた。非標識ヌクレオチド糖内部標準物をそれらの特徴的な溶出時間（ＧＤ Ｐ−７：ｌ−ス、３５．５分、約８００ｃｐｍ　；　ＧＤＰ−マンノース、３３ ．０分、約１０１０００ｃｐにより同定した。非標識のＧＤＰ−フコース及びＧ ＤＰ−マンノースで共に溶出した部分に相当する放射能ピークを、Ｏ，ＩＮ　Ｈ ＣＩを用いて、１００°Ｃで４５分間、加水分解にかけた。その後、これらをＬ −［１４Ｃ］フコース及びＤ−［１４Ｃ］マンノース襟準物と共に２０時間、溶 媒Ｂ中でのワットマンＮα漉の下降ベーパークロマトグラフィーにより分別した 。それぞれの場合において、加水分解したカウントの約３０％を適当なモノサッ カライドとして回収した。

フコース標識グリコペプチドの分析 放射能標識したグリコペプチドを製造し、分析した。マウスし細胞（２刈０″） を、２０ｍ１の完全培地中、２００μＣｉのし−［６−’Ｈｌフコースで３日間 標識した。細胞を集め、クロロホルム、及びその漬水で抽出し、最終抽出の後に 残ったペレットをプロナーゼ（ベーリングダイアグノスティックス（Ｂｅｈｒｉ ｎｇ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ））を用いた徹底的な消化にかけた。その後、セ ファデックスＧ−２５−８０でのゲル濾過クロマトグラフィーにより脱塩した。

この物質を真空下で濃縮し、了りコートを１００°Ｃで４５分間、０．　ＩＮ　 ＨＣｌ中で加水分解した。その後、氷解物、Ｌ−［１４Ｃ］フコース標準物と共 に、溶媒Ｂ中で２０時間、ワットマンＮ１１３ａｎを用いた下降ペーパークロマ トグラフィーにかけた。高分子材料に存在するカウントの約２６％が遊離し、放 射能標識したフフース標準物を用いてコクロマトグラフィを行った。

培養細胞をＰＢＳで洗い、遠心分離でベレット化し、０．５％のトリトンＸ−１ ００を含む少量の５繭リン酸ナトリウム、ｐＨ６，１中に再懸濁した。容量を調 整し、タンパクの濃度が約５　ｍｇ／ｍｌに達するようにした（ＢＣＡ法、Ｐｉ ｅｒｃｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、）。製造後、すぐに抽出物を一般的に分析 した。憬準検定は、４０μｌの２５−リン酸ナトリウム、０．１％ＨトンＸ−１ ００，３ｕＭ　ＧＤＰ−［”Ｃｌ　７：ｌ：Ｉ−ス、２５ｍＭ　７　ｓ　ニルー β−Ｄ−ガラクトシド、及びＳ　ｍ　ＡＴＰ中に５〜２０μｌの酵素溶液（一般 ＋：３０−１００μｇの細胞抽出タンパク又は１５μｌの血清）を含んだ。反応 混合物のｐＨを、最終的に測定したｐＨ６，１ｌ：ｔｌｌ整した。適当な時間の 後、エタノール２０Ｌｌｌの添加により分析を終わらせた。その後、混合物を１ ５．ＯＯＯＸｇで５分間、遠心分離した。上澄みを集め、ワットマンＮ１１ｌに スポットし、溶勧中で４時間、下降クロマトグラフィーによる分別にかけた。そ の後、上述したように放射能を測定した。すべての場合において、フェニル−β −叶ガラクトシト受容体の添加なしに同様の反応を行い、内因性受容体分子（ｅ ｎｄｏｇｅｎｏｕｓ　ａｃｃｅｐｔｏｒ　ＩＩＩｏｌｅｃｕｌｅｓ）について補 正した。フコシル化したフェニル−β−Ｄ−ガラクトンドでコクロマトグラフィ ーを行った内因性受容体分子の生成物を、いずれのサンプルも同定しなかった。

α−フコシダーゼの消化 ［”Ｃｌフコノルフェニル−β−Ｂ−ガラクトシド（約１０．０００ｃｐｍ）を ペーパークロマトグラフィーによりフコシルトランスフェラーゼ分析物から単離 し真空下で水溶出液から濃縮し、水５μｌに再懸濁した。５酬クエン酸ナトリウ ム、ｐＨ６，０を含む最終容量２０μｍ中、これを０．０２５ユニツトのウシ腎 臓α−し一フコシダーゼ（ＥＣ３，２，１，５１）の３７°Ｃ１１時間で消化し た。その後、この混合物を溶隔中で、４時間、ワットマンＮｃｌを用いた下降ペ ーパークロマトグラフィーにより分別した。

消化の生成物を、Ｌ−［”Ｃｌフコース標準品、及びヒト血漿ボα−１，２）フ コシルトランスフェラーゼにより合成した精製した［目Ｃ１フコシルフェニルー β−Ｄ−ガラクトシドを並行分離して比較することにより同定した。

間接免疫蛍光法 免疫蛍光法を８−ウェル組織培養チャンバースライド（Ｌａｂ−Ｔｅｋ）をプレ ート化した細胞上で行った。細胞を、分析の２４時間前に５　ＸＩＯ’／ウェル の密度でプレート化した。励及び抗Ａの一次抗体を、ウシ血清アルブミン２　ｍ ｇ／ｍｌを含むＰＢＳに希釈し、最終濃度１０μｇ／ｍｌにした。細胞定着−次 抗体を、２　ｍｇ／ｍｌのウシ血清アルブミンを含むＰＢＳで４０μｇ／ｍｌに 希釈した、Ｆ［ＴＣ結合ヤギ抗マウスＩｇＭで検出した。

ハブテン阻害 プレート化した細胞をＰＢＳ　”（−２回洗い、異なるオリゴサツカライドハブ テンをそれぞれ２加−の濃度で含む、希釈した抗Ｈ抗体１００μｌ又は希釈した 抗体１００μＩを用い、３０分間、４°Ｃでインキュベートした。その後、チャ ンバーを２回洗い、ＦＩＴＣ結合ヤギ抗−マウスＩｇＭ　１００μｌを加えた。

３０分間、４℃の後、チャンバーをＰＢＳで３回洗い、細胞を室温で１０分間、 ＰＢＳ中の３．７％ホルムアルデヒドで固定した。細胞をＰＢＳで２回洗い、チ ャンバーを取り除き、５％グリセロールを含むＰＢＳ中でスライドを標本にした 。細胞を蛍光エビイルミネーション（ｅｐｉｉｌｌｕｍｉｎａｔｉｏｎ）を備え たシースアキジオフォトフォトミクロスコープ（Ｚｅｉｓｓ　Ａｘｉｏｐｈ。

ｔ　ｐｈｏｔｏｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ）を用いた蛍光顕微鏡により検査した。

ヒト血ＫＩＡ聾（α−１，３）ＧａｌＮａｃ　トランスフェラーゼを用いた完全 な細胞（ＩｎｔａｃｔＣｅｌｌＳ）の標識 培養スライドチャンバーにプレート化した細胞を１５０　ｄａｃｌで２回洗い、 その後１５０ｒｆｊｋＣ１中の３．７％ホルムアルデヒド中で、１ｏ分間、室温 で固定した。細胞を１５０　ｍＪａｃｌで３回洗い、その後１００μｌの完全な トランスフェラーゼ反応混合物又はコントロール混合物でインキュベートした。

完全なトランスフェラーゼ混合物は、１５０ｍＭ　ＮａＣＬ　１５繭ＭｎＣ１， ，５０ｍ１Ｊカコジル酸ナトリウム、ｐＨ６，８，０，２％ウシ血清アルブミン 、Ｉ　ｍＭ　ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ　、及び１．１４単位のヒト血液Ａ型（α− １，３）ＧａｌＮＡｃ　）ランスフェラーゼから構成された。コントロール混合 物は、ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ又は血液型Ａ（α−１，３）ＧａｌＮＡｃ　トラン スフェラーゼのいずれかを省略したこと以外は、同じ成分から構成した。インキ ュベーションを３７°Ｃで行い、チャンバーを２回ＰＢＳで洗うことにより４又 は２４時間のいずれかの後に終わらせた。その後、ハブテン阻害研究について上 述したように、細胞をマウスモノクローナル力又はｔｉ抗体を用いた間接免疫蛍 光法により分析した。

サザーンブロツティング 制限酵素でゲノムＤＮＡを完全に消化した（８ユニットμｇＤＮＡ、−夜消化） 。

該制限フラグメントをトリス−ホウ酸塩−ＥＤＴＡ中で緩衝化した０、６％アガ ロースゲルでの電気泳動によって分別した。次いで、該フラグメントを標準的な サザーンプロット法に従ってナイロン膜〔ハイボンド（Ｈｙｂｏｎｄ）−Ｎ、ア マ−ジャム社製〕に移した。該プロット物を、５０％ホルムアミド、５ｘＳＳＣ （ＩｘＳＳＣは＋５０ｍＭＮａＣ１，１５−クエン酸ソーダ、ｐＨ７，０であり 、Ｉ　ＸＰＥは５０−トリス、ｐＨ７，５，０，１％ピロリン酸ソーダ、１％ド デシル硫酸ソーダ、０．２％ポリビニルピロリドン（Ｍｒ４０．０００）、０． ２％フィコール（Ｆｉｃｏｌｌ）（Ｍｒ４００．０００）、及び５ｍＥＤＴＡで ある〕及び１５０μｇ／ｍｌ変性サケ***ＤＮＡ中で、少なくとも２時間、３９ °Ｃで予備ハイブリダイズした。同じ溶液中で、少なくとも１６時間、３９゛Ｃ てハイブリダイゼーションを行った。該プロット物を、２ＸＳＳＣ１０，１％ド デシル硫酸ソーダ中で、室温で４回洗浄し、次いで、０．７５ＸＳＳＣ１０，５ ％ドデシル硫酸ソーダ中で、６５°Ｃで３０分間、もう１度洗浄した。３００塩 基対ＢａｍＨＩセグメントからなるＢＬＵＲ８プローブをＢＬＵＲ８プラスミド から単離した。プラスミド配列か混入していないことを確保するために、このフ ラグメントをラベル化前に２サイクルのゲルｒＲ製に付した。プローブは、ラン ダムブライミング法を使用して、少なくとも５ＸＩＯ”Ｃｐｍμｇの特異的活性 に対して〔α”ｐ）ｄＣＴＰでラベル化した。

クローン化された機能的なβ−Ｄ−ガラクトシルー１．４−Ｎ−アセチル−Ｄ− グルコサミニド　α−１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼｃＤＮＡを単離 するだめの遺伝子伝達法。　表面に局在した末端Ｇａ１（αｌ−３）Ｇａｌ結合 の組織及び細胞特異的発現は、ＵＤＰ−Ｇａ　ｌとＮ−アセチルラクトサミンと のトランスグリコジル化反応を触媒する同種の（α１−３）ＧＴの発現と関係し ている。ＣＯ３−１細胞は、表面に発現したポリラクトサミン分子を構成する。

それは、　（α１−３）ＧＴに対する受容体基質として機能することができるが 、この酵素またはその表面に局在した生成物を発現しない（以下を参照のこと） 。それゆえ、本発明者は、（α１−３）ＧＴをフードするクローン化されたｃＤ ＮＡが、もしもＣＯ３−１細胞中で発現されるなら、その酵素〔末端Ｇａ１（α １−３）Ｇａｌ結合結合表面に局在したオリゴサツカライド生成物を生成するで あろうと予想したのである。更に、これら個々の形質移入体（トランスフェクト ント）は、末端Ｇａ　ｌ　（α１−３）　Ｇａ　Ｉ結合と特異的に結合するレク チン（ＧＳ　Ｉ−Ｂ、）で被覆されたプレートに対する付着力によって単離でき た。この方法には標準的な一過性発現系を使用した。というのは、それがＣＯ５ −１細胞上での細胞表面分子の発現を決定する形質移入（トランスフェクト）さ れたｃＤＮＡの解放に供し、哺乳動物の発現ベクター中での大きなｃＤＮＡライ ブラリーの軽便な構築を可能にするからである。

形質移入されたＣＯ５−１細胞中でＧＳ　Ｉ−Ｂ、結合活性の発現を決定するク ローン化されたｃＤＮＡの単離。　マウスＦ９テラトカルシノーマ細胞はＷｌ（ α１−３）ＧＴを発現し、この酵素活性はこれら細胞のレチノイン酸誘発分化と 相伴って増加する。それゆえ、本発明者は、レチノイン酸分化Ｆ９細胞からＣＤ ＮＡ発現ライブラリーを調製し、このライブラリーを形質移入されたＣＯ５−１ 細胞中でＧＳ　Ｔ−Ｂ、結合活性の発現を決定するｃＤＮＡについて、スクリー ニングした。ＣＯ３−１細胞中に形質移入したときにＧＳ　Ｉ−Ｂ、で被覆され た培養皿に対する細胞の特異的付着性を統制する表面分子の発現を決定する１つ のプラスミド（ｐＣＤＭ７−ＸＧＴ）を単離した。蛍光励起細胞分離分析によっ て、これら観察を確認した。ｐＣＤＭ７で形質移入した細胞ではなく、ｐＣＤＭ ７−αＧＴで形質移入したＣＯ３−１細胞は、フルオレセインイソチオシアネー ト結合Ｃｐｓ　Ｔ−Ｂ、で鮮やかに染色した。この染色は、このレクチンのハブ テンであるラフィノースによって阻害され得た。これら結果は、ｐＣＤＭ７−α ＧＴがＧＳ　Ｉ−Ｂ、によって認識された表面に局在した分子の新規な発現、従 って、細胞表面オリゴサツカライド上での末端Ｃｏａｌ（α１−３）Ｇａｌ結合 の発現を決定しているということを示している。

ｃＤＮＡ配列分析は膜内外トポロジーを有するタンパクを予見する。　ｐＣＤＭ ７−ａＧＴ中でのｃＤＮＡ挿入物は１５００塩基対長であり、ｐＣＤＭ７プロモ ーター配列に関して、その感知（ｓｅｎｓｅ）方向において単一の長いオーブン リーディングフレームを含有している。このリーディングフレームの最初の１５ コドン内には３つのメチオニンコドンが見られ：本発明者は、嘩乳動物の翻訳開 始点についてのコザック（Ｋｏｚａｋ）の規則に基づいて、これらの最も近い部 分を開始コドンとした。このリーディングフレームは、４６．４７２ダルトンの 分子量を有する３９４アミノ酸長のタンパクを予想させる。水治療分析（ｈｙｄ ｒｏｐａｔｈｙ　ａｎａｌｙｓｉｓ）は、このタンパクが、２つの他の鴫乳動物 のグリコジルトランスフェラーゼについて予想されるものとトポロジー的に同一 であるタイプ■の膜透過分子の特徴を有していること示している。このトポロジ ーは、４１アミノ酸の、細胞質的に方向付けられたＮＨｔ末端セグメント、塩基 性残基によって側面を固められた１９アミノ酸の疎水性セグメントからなる単一 の膜透過領域、及び最終的にゴルジのルーメンに対する標的になるであろう大き な（多分、触媒的な）ＣＯＯＨ−末端領域を予想させる。２つの可能なＮ−グリ コジル化部位が存在し、それは、このタンパクが他のグリコジルトランスフェラ ーゼのように糖タンパクとして合成され得ることを示している。このｃＤＮＡ配 列は−９０及び−２５１でＡＴＧコドンを有する長い５°非翻訳領域を含有して おり、このことは、翻訳制御機構がこの配列の発現の調節において関係し得るこ とを示唆している。これは、その転写物も上流にＡＴＧコドンを含有している他 の哺乳動物のグリコジルトランスフェラーゼを暗示している。このタンパクの推 定上のＮＨ２末端部は、マウスのβ−１゜４−ガラクトシルトランスフェラーゼ の一形態において存在することのできる特徴的な開裂可能シグナル配列を欠いて いる。

現在入手可能なタンパク及び核酸のデータベース（プロティン・アイデンティフ ィケイション・リソース、リリース２１，０及びジエンバンク、リリース６０． ０）の調査は、マウスのβ−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ及びラッ トのα−２，６−シアリルトランスフェラーゼの配列を含む（α１−３）ＧＴ　 ＤＮＡ配列との有意な類似性を有する配列が存在しないことを示した。

触媒的に活性な、分泌されたタンパクＡ−（α１−３）ＧＴ融合タンパクの発現 。　本発明者は、このｃＤＮＡが（α１−３）ＧＴをコードするということを確 認し、カリ、同時にそれか内因性遺伝子、転写物、またはタンパクとの相互作用 によって（α１−３）ＧＴ活性を誘発するトランス作用性分子を代わりにコード するという形式的可能性を除外することを望んだ。それゆえ、このタンパクの推 定上の触媒領域に対応する配列を、ベクターｐＰＲＯＴＡ−αＧＴ、を生成する 哺乳動物の発現ベクターＰＰＲＯＴＡ中の黄色ブドウ球菌タンパクＡのＩｇＧ結 合領域の分泌可能型とイン−フレーム（１ｎ−ｆ　ｒａｍｅ）で融合した。次い で、このベクターを、触媒的に活性な、分泌された可溶性タンパクＡ−（α１− ３）ＧＴ融合タンパクを発現するその能力について試験した。

ｐＣＤＭ７ベクターまたはＰＰＲＯＴＡベクターで形質移入されたＣＯ５−１細 胞は、検出可能な、細胞に付帯したかまたは放出された（α１−３）ＧＴ活性を 生じなかった。これに対し、ｐＣＤＭ７−αＧＴまたはｐＰＲＯＴＡ−αＧＴｅ ベクターで形質移入されたＣＯ５−１細胞から調製した抽出物は、それぞれ４５ ７４及び２０．５００総ユニツトの（α１−３）ＧＴ活性を含有した。更に、ｐ ＣＤＭ７−αＧＴまたはｐＰＲＯＴＡ−αＧＴ、で形質移入された細胞から調製 した馴化培地は、それぞれ４．１５５ユニツトまたは５０，４３８ユニツトに及 ぶ可溶性の（αｌ−３）ＧＴ活性を含有した。重要なことは、ｐＣＤＭ７−αＧ Ｔによって生成した放出された活性はこの親和性吸着剤とは相互作用しないのに 対して、ｐＰＲＯＴＡ−αＧＴ、によって生成した放出された活性はＩｇＧ−セ ファロースマトリックスに特異的に結合できたことである。これらの結果は、こ のクローン化されたｃＤＮＡが（α１−３）ＧＴをコードすることを示しており 、触媒的に活性な（α１−３）ＧＴを生成するのに充分な情報が推定上の膜透過 セグメントに対して末端の３３２アミノ酸内に存するということを示しており、 かつ、その触媒的領域は、酵素的に活性な状態において二連融合タンパクからな るタンパクとして親和精製（ａｆｆｉｎｉｔｙ　ｐｕｒｉｆｙ）され得るという ことを示している。

（αｌ−３）ＧＴのトリサツカライド生成物の構造決定。　組み換え酵素によっ て生成したオリゴサツカライド生成物について予想されたα−アノマー結合を確 認するために、エキソグリコシダーゼ消化を用いた。ｐＰＲＯＴＡ−αＧＴｅに よって生成したＩｇＧ−セファロース結合酵素活性を使用することによって、Ｕ ＤＰ−［”Ｃ）Ｇａ１とＮ−アセチルラクトサミンから放射線ラベル化トリサツ カライド生成物を調製した。該トリサツカライドは６−ガラクトシダーゼ消化に 対して完全に抵抗力があるのに対して、ＨＰＬＣ精製トリサツカライド生成物の ガラクトシダーゼでの消化は（”Ｃ）Ｇａ　１の定量的放出をもたらした。

Ｎ−アセチルラクトサミン受容体中のガラクトースの炭素３か組み換え酵素によ って形成されたグリコシド結合中に包含されているということを確認するために 、本発明者は（’Ｈ）Ｇａ　Ｉラベル化部−アセチルラクトサミン受容体を調製 し、標準的な（α１−３）ＧＴ反応条件下でＩｇＧ−セファロース結合タンパク Ａ−（αｌ−３）ＧＴ活性及び１蘭ＵＤＰ−Ｇａ　Ｉと共にそれをインキュベー トした。この反応のトリサツカライド生成物を精製し、メチル化分析に付した。

放射性の２．４．６−トリメチルガラクトースが同定された。同時に、これらの 結果は、該組み換え酵素がＵＤＰ−Ｇａ　］と］Ｎ−アセチルラクトサミを、構 造Ｇａ１（（２１−３）Ｇａｌ　（αｌ−４）ＧｌｃＮＡｃを有するトリサツカ ライド生成物を構成するための基質として利用できることを示している。

ノーザンブロノト分析。　（α１−３）ＧＴｃＤＮＡは、Ｆ９テラトカルシノー マ細胞中の単一の３．６キロベース転写物に対してハイブリダイズする。コロニ ーハイブリダイゼーションによって単離されたもう１つのクローン化された（α ｌ−３）ＧＴｃＤＮＡについての本発明者のＤＮＡ配列分析は、ｐＣＤＭ７−ａ ＧＴ中の挿入物がこの転写物の５゛末端を表していることを示している。この転 写物の残りの２．１キロベースは、該発現クローニング操作によっては解放され ない３゛非非翻訳列からなっている。

レチノイン酸分化Ｆ９テラトカルシノーマ細胞中の（αｌ−３）ＧＴの特異的活 性は、未処理Ｆ９細胞中のものよりもおよそ４倍高い。ノーザンプロット分析は 、（α１−３）ＧＴ転写物の定常状態レベルも、Ｆ９テラトカルシノーマ細胞の レチノイン酸誘発分化と並行して増加することを示している。これらの結果は、 β−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼを有するＦ９細胞において報告さ れているものと類似しており、このセルラインのインビトロでの分化を伴うこと が知られている細胞表面オリゴサツカライド構造中のダイナミックな変化が、グ リコジルトランスフェラーゼ遺伝子発現における重要な変化と関係していること を示唆している。

Ｆ９細胞ｃＤＮＡライブラリーの構築　シード（Ｓｅｅｄ）及びアルフｔ　（Ａ ｒｒｕｆｆｏ）の操作及び哺乳動物の発現ベクターｐＣＤＭ７を使用することに よって、レチノイン酸分化マウスＦ９テラトカルシノーマ細胞から単離したポリ （Ａ）　ＲＮＡから、ｃＤＮＡライブラリーを調製した。ｐＣＤＭ７はベクター ｐＣＤＭ８の祖先であり；ｐＣＤＭ７はｐＣＤＭ８に存在するポリオーマ配列を 欠いているが、他は実質的に同一である。該ライブラリーは、３×１０１の独立 の組み換え体を含有していた。

マウス（αｌ−３）ＧＴｃＤＮＡクローンの単離　該ライブラリーの増幅部分か らプラスミドＤＮＡを調製し、ＤＥＡＥデキストラン操作を使用することによっ てＣＯ３−１細胞に形質移入した。（１００ａｎ皿中の）５Ｘ１０’のＣＯ５− １細胞の４０サンプルを、それぞれ５０μｇのプラスミドＤＮＡで形質移入した 。

７２時間の発現時間か経過した後、形質移入されたＣＯ３−１細胞の単層を採取 し、グリフォニア・シンブリシフｔリア（Ｇｒｉｆｆｏｎｉａ　ｓｉｍｐｌｉｃ ｉｆｏｌｉａ）イソレクチンＩ　Ｂ、（ＧＳ　Ｉ−Ｂ、）で被覆された皿の上で パンニングした。レクチンバンニング皿は、０．１ｍＭＣａ”及び０．１ｍＭＭ ｎ”を含有するリン酸塩緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中でｍｌ当たり１０μｇのＧ Ｓ　Ｉ−Ｂ、を使用することによって調製した。付着性細胞からプラスミドＤＮ Ａ分子を解放し、大腸菌宿主ＭＣｌ０６１／Ｐ３中に形質転換した。これら形質 転換体からプラスミドＤＮＡを調製し、同じ操作によって追加のスクリーニング に付した。続いて、ＣＯ３−１細胞中でＧＳ　Ｉ−Ｂ、結合活性の発現を決定す るプラスミドをスクリーニングするため（こ、同胞（Ｓｉｂ）選択法を用いた。

第２回目のスクリーニングから解放したプラスミド分子を含有する大腸菌形質転 換体を各１００〜５０００のコロニーを含有する１６のプールができるように配 分した。プラスミドＤＮＡをレプリカプレートから調製し、別々にｃｏｓ−を細 胞内に形質移入し、該形質移入体をＧＳ　Ｉ−Ｂ４被覆皿上でのパンニングによ ってスクリーニングした。これらの実験は、１０００のうち約１のコロニーがＧ Ｓ　ｌ−８４結合表現型を決定するクローン化されたｃＤＮＡを含有しているこ とを示した。１つの「活性なＪ　１０００コロニーのプールを幾らかのより小さ なプールに小分けし、これらをそれぞれＩ−Ｂ。

結合活性について試験した。次々と小さい活性プールでの同胞選択を３回続けて 行い、ＣＯ５−１細胞中でのＧＳ　Ｉ−Ｂ、結合活性の発現を行う単一のプラス ミド（ｐＣＤＭ７−αＧＴ）を同定した。

フロー・サイトメトリー　プラスミドＤＮＡで形質移入したＣＯ３−１細胞を形 質移入後４８〜７２時間して採取した。これらを、染色媒体中でｍｌ当たり１０ ｕｇのフルオレセインイソチオノアネート結合ＧＳ　Ｉ−Ｂ、で染色するか、ま たは５０ｍＭラフィノースで予めインキュベートされたフルオレセインイソチオ シアネート結合ＧＳ　１−Ｂ、で染色するかした。次いで、上記したようにして 細胞を蛍光励起細胞分離捕集法によって分析した。

ノーザンブロソト及びＤＮＡ配列分析　ノーザンプロット物を、ハイブリダイゼ ーソ３ン溶液中、放射性ラベル化したｐＣＤＭ７−αＧＴｃＤＮＡ挿入物で４２ °Ｃでハイブリダイズした。ｃＤＮＡ挿入物内の配列に従って合成したオリゴデ オキシヌクレオチドを使用することにより、鎖末端法（ｃｈａｉｎ　ｔｅｒｍｉ ｎａｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄ）でＤＮＡの配列決定を行った。配列データベースの 調査及び分析を、ライスコンシン大学のジェネチックス・コンピューター・グル ープによって公表された配列分析ソフトウェア−・パッケージで行った。

（α１−３）ＧＴの分析及び生成物の特性付け　形質移入したＣＯ３−１細胞か ら抽出物をＩＩ製した。細胞抽出物、形質移入した細胞からの馴化培地、または ＩｇＧ−セファロース結合酵素を（α１−３）ＧＴについて分析した。（αｌ− ３）ＧＴ活性の１ユニツトは、時間当たりにＮ−アセチルラクトサミン受容体に 伝達されたＧａｌのＩｐｍｏｌとして定義される。

ＨＰＬＣ精製した、放射性ラベル化オリゴサツカライド反応生成物を、α−ガラ クトシダーゼ（シグマ社製、２０Ｉ［１Ｌｌ）かβ−ガラクトシダーゼ（シグマ 社製、１ｍ１Ｊ）のいずれかで、メーカーによって推奨された緩衝液中で３７° Ｃで１時間消化に付した。次いで、反応生成物をＨＰＬＣで分別した。反応生成 物のメチル化分析は標準操作に従って行った。

■での消化によってｐＣＤＭ７−αＧＴから切り取った。これを二本鎖リンカ− （５’　−ＡＣＧＧＡＡＴｒＣＣＧＴ−３”）　’ｆ：使用すルコとによッテｐ 　Ｐ　ＲＯＴ　Ａ　ノＥ　ｃ　ｏ　ＲＩ部位の中にクローン化して、プラスミド ｐＰＲＯＴＡ−αＧＴ、を生成する正しいリーディングフレームを維持した。

プラスミドｐＰＲＯＴＡ−αＣＴｃ、ｐＣＤＭ７−αＧＴ、及びｐＰＲＯＴＡを 別々にＣＯ５−１細胞中に形質移入した。７２時間の発現時間が経過した後、該 培地を採取し、低速（３００Ｘｇ、８分間）及び高速（１００，ＯＯＯｘｇ、１ 時間）遠心分離に付した。次いで、上溝を０．０５％ツイーン２０に馴染ませ、 １００μｍの予備平衡化したＩｇＧ−セファロースまたはセファロース６Ｂで、 ４℃で一夜回分式でインキュベートした。次いで、マトリックスを完全に洗浄し 、直接、（α１−３）ＧＴ分析に用いた。

ＧＤＰ−Ｆｕｃ：　Ｃβ−Ｄ−Ｇａ　１　（１，，４／Ｌ　３）］　−Ｄ−Ｇ１ 　ｃＮＡｃ　（／Ｇ］ｃ）α（１，３／１．４　’）−フコシルトランスフェラ ーゼをコードするクローン１つの態様において、本発明は、機能的なα（１，３ ）フコシル−トランスフェラーゼまたはα（１，４）フコシル−トランスフェラ ーゼ〔α（１，４）ＦＴ）分子をコードするクローン化されたｃＤＮＡの単離を 可能にするか、または、最初に酵素を精製することを必要とせずに、他の方法で 、α（１，３）ＦＴまたはα（１゜４）ＦＴの発現を決定する遺伝子伝達系を提 供する。この系は、これら酵素の細胞表面に発現したオリゴサツカライド生成物 の検出を可能にし、かつ、それらの酵素活性の特異的分析に供する現存の試藁を 代わりに利用するものである。

この方法は、適当なりローン化したｃＤＮＡ分子の選択を可能にする特異的特性 を有する宿主細胞を必要とする。該宿主は、α（１，３）ＦＴも同種の表面Ｇａ １β（１，４）（Ｆｕｅα（１，３））ＧＩ　ｃＮＡｃ結合（ＳＳＥＡ−］構造 ）も発現してはならない。しかしながら、この宿主は５ＳＥＡ−１分子の表面表 示のための適当な基質を合成しなければならない。これら基質は、ヌクレオチド 糖ＧＤＰ−フコース、及びトランスグリフシル化反応のためのオリゴサツカライ ド受容体として役立つことのできる表面に発現した箇複合分子を包含する。これ ら特性の各々は、ｃｏｓ−を細胞によって満たされる。

蛍光励起細胞分離捕集（ＦＡＣＳ）分析は、ＣＯ３−１細胞は表面に局在した５ ＳＥＡ−１決定基を発現しないことを示した。ＣＯ３−１抽出物で行った酵素分 析から、５ＳＥＡ−１発現の欠如はα（１，３）ＦＴ活性の欠如によることが確 認された。本発明者は、一定のレクチン−抵抗性突然変異株セルラインを除いて 、実質的に全ての哺乳動物細胞はＧＤＰ−フコースを合成しそれをゴルジルーメ ンの中に移動させるので、ＣＯ３−１胞はそれらのゴルジ内にＧＤＰ−フコース の基質レベルを含有しているであろうと予測した。ＣＯ５−１細胞も、形質移入 されたｃＤＮＡによって決定されたα（１，３）ＦＴ活性のための可能なオリゴ サツカライド受容体を表す未置換のポリラクトサミン部分を含有する表面に発現 した糖複合体を構成している。本発明者は、本発明者か以前α（１，２）ＦＴの 発現を決定するために示したクローン化されたヒト遺伝子フラグメントでの形質 移入後のＣＯ３−１細胞上での異なる末端結合フコース結合［ＨＦｕｃα（１， ２）Ｇａ　Ｉ）の発現を証明することによって、これら基質か表面に発現した末 端フコース結合の構築に使用できるということを確認した。それゆえ、本発明者 は、ＣＯ３−１細胞か、α（１，３）ＦＴ決定ｃＤＮＡでの形質移入に続いて、 表面で発現した５ＳＥＡ−１分子を構築できるということを観察したのである。

α（１，３）ＦＴ及び表面に局在したＳＳＥＡ−１構造の発現を決定するクロー ン化されたｃＤＮＡの単離 ヒトＡ４３１セルラインか、α（１，４）ＦＴの生成物を表す細胞表面ルイス血 液型ａ及びｂ構造を発現することは示されている。Ａ４３１抽出物で行った酵素 分析により、細胞も対応するα（１，３）ＦＴ活性を発現するということが確認 された。それゆえ、哺乳動物の発現ベクターｐＣＤＭＴ中で、Ａ４３１細胞ｍＲ ＮＡでｃＤＮＡライブラリーを構築し、ＣＯ３−１細胞内に形質移入した。該形 質移入された細胞は、５ＳＥＡ−１決定基に特異的なモノクローナル抗体を使用 してシードの操作によってスクリーニングした。

選別操作の間、α（１，３）ＦＴ決定ｃＤＮＡの豊富化を追跡するために、２− フッシルラクトースが受容体基質として使用される分析法を採用した。この受容 体は、ルイスα（ｌ、３／１．４）ＦＴと非対立ヒトα（１，３）ＦＴを識別す ることかできる。というのは、それは前者の酵素によって有効に使用されるが、 後者によっては使用されないからである。この分析で、本発明者は、Ａ４３１　 ｃＤＮＡライブラリーで形質移入したＣＯ３−１細胞中でも、最初の選別から単 離した増幅したプラスミドＤＮＡで形質移入した細胞中でも、いかなる酵素活性 も検出することができなかった。しかしながら、第２回目の選別で得られた増幅 したプラスミドＤＮＡでは、ＣＯ５−１細胞内に形質移入したときに低レベルの 酵素活性を示すことが見出された。バンニングによる第３回目の選別後、酵素活 性は適度な増加を示した。この段階で「同胞選択法」を採用し、クローン化した α（１，３）ＦＴｃＤＮＡを同定し単離した。第３回目のパンニング選別から単 離したクローンのプールを、形質移入されたＣＯ３−１細胞中でα（１，３）Ｆ Ｔ活性を生ずるそれらの能力について試験した。これらの実験から、５００クロ ーン中の約１つがα（１，３）ＦＴ発現を決定するプラスミドを表すということ が推定された。約４００クローンのうちの１つの「活性な」プールを更に小分け し、形質移入した細胞中で酵素活性を生ずるそれらの能力について、得られたプ ールを試験した。

活性な１６クローンのプール中の１つのクローン（ｐＣＤＭ７−α（１，３／１ ．４）ＦＴ）は、非常に高いレベルのα（１，３）ＦＴの発現を行うということ か見出された。このプラスミドも５ＳＥＡ−１決定基の表面発現を行うというこ とを確認するために、ＦＡＣ３分析法を用いた。このプラスミドで形質移入され たＣ０８−１細胞は、抗５ＳＥＡ−１抗体で鮮やかに染まるが、コントロールの ＩｇＧ抗Ｈ抗体抗体染まらない。これに対し、ｐＣＤＭ７ベクターで形質移入さ れた細胞だけは両方の抗体でバックグランド染色を示す。

クローン化したｃＤＮＡの減少したタンパク配列は膜内外トポロジーを予測させ る ｐＣＤＭ７−ａ　（１，３／１．４）ＦＴ中のｃＤＮＡ挿入物（配列工）は、２ ０２２ヌクレオチドの長さであり、７２塩基対の５′非翻訳領域、１０８３塩基 対の連続したオープンリーディングフレーム、及びポリ（Ａ）テールによって終 結している８６７塩基対の３゛非翻訳領域からなる。

このクローン化されたｃＤＮＡはＡ４３１細胞中の単一の顕著な２．３ｋｂ転写 物で、この挿入物か実質的に完全長であることを示している。追加の弱い７．５ ｋｂ転写物の本質は現時点では不明である。長いす一ブンリーディングフレーム の始まりの開始コドンは、コザソク・コンセンサス開始配列と類似の配列内に埋 まっており、２つのイン−フレーム停止コドンがその先に位置している。また、 該割り当てられた開始暗号から上流に単一の追加のＡＴＧが存在している。この ＡＴＧもコザック・コンセンサス配列に適合するが、非常に短いイン−フレーム 配列を起こす。該長いす一ブンリーディングフレームはＭｒ　４２．０６９ダル トンの３６１アミノ酸タンパクを予想させる。該最後のＤＮＡとタンパク配列デ ータベース（プロティン・アイデンティフィケイション・リソース、リリース２ １．０、及びジエンバンク、リリース６００）との配列比較からは、ヒトＡｌｕ 配列と類似する３１の非翻訳配列内のセグメントを除いては、この配列と有意な 類似性を有する配列を同定することはできなかった。３′非翻訳領域も未知の機 能的な意義のある１６ヌクレオチド配列の２０の縮退したコピーを含有する。

ｐＣＤＭ７−α（１，３／１．４）ＦＴ中の挿入物によって予想された配列と４ つの異なるクローン化された哺乳動物のグリコジルトランスフェラーゼとの比較 は、明らかな一次配列の類似性がないことを明らかにした。これら後者の酵素も 広い一次配列の類似性を持たないが、それらは類似の総合的構造組織を示す。具 体的には、これら酵素はタイプ■膜透過タンパクの典型であり、それぞれは短い ＮＨ。

末端の細胞質領域、単一の膜透過セグメント、及びゴルジルーメンを最終的に阻 害するより大きなＣ００Ｈ−末端触媒領域からなる。予想したタンパク配列の検 査及び水治療分析は、このタンパクが類似の構造組織を維持していることを示唆 している。アミノ末端の近くに、１９アミノ酸からなり、塩基性残基によって側 面を固められている単一の疎水性セグメントがある。この推定上のシグナル−ア ンカー配列は、細胞質ゾル区画内に１５残基を残しているが、ゴルジルーメン内 に３２７アミノ酸を配置している。

ｐＣＤＭ７−α（１，３／１．４）ＦＴによってコードされたタンパクはフコシ ルトランスフェラーゼである 発現データと他のグリコジルトランスフェラーゼに対するこの配列の予想したト ポロジーの類似性は、このｃＤＮＡがα（１，３）ＦＴをコードすることを示し ている。それにもかかわらず、これらのデータも、このｃＤＮＡ配列が、内因性 遺伝子、転写物、またはタンパクとの相亙作用によってα（１，３）ＦＴ活性を 決定する分子を代わりにコードするという可能性と形式的に一致している。酵素 活性は直接この分子と関連しているということを証明するために、予想したポリ ペプチドの推定上の触媒領域を、哺乳動物の発現ベクターｐＰＲＯＴＡ中の黄色 ブドウ球菌タンパクＡのＩｇＧ結合領域の分泌型と融合し、ベクターｐＰＲＯＴ Ａ−α（１，３／１．４　ＦＴ）ｃを生成した。この融合タンパクはフコシルト ランスフェラーゼの推定上の膜透過アンカーセグメントを欠いているであろうか ら、それはＩｇＧ含有マトリックス上で親和精製され得る分泌された分子として 合成されるであろうと予想され、続いてα（ｌ、３）ＦＴについて試験した。コ ントローターｐＣＤＭ７またはＰＲＯＴＡで形質移入されたＣＯ３−１細胞は、 検、な、細胞に付帯したかまたは放出された酵素活性を生じなかった。しかし、 ｐＰＲＯＴＡ−ａ　（１，３／１．４）ＦＴｃまたはｐＣＤＭ７−ａ　（１，３ ／ＦＴで形質移入されたＣＯ３−１細胞から調製した馴化培地は、有意な量１． ３）ＦＴ活性を含有した。重要なことは、ｐＰＲＯＴＡ−α（１，３／１゜Ｔ、 によって生成した実質的に１００％の放出された活性はＩｇＧ−セフ・スマトリ ックスによって特異的に保持さ托この活性の約２４％は徹底的？した後にマトリ ックスから回収できたことである。対照的に、ｐＣＤＭ７ｒｔ、３／１．４）Ｆ Ｔによって生成した放出された活性は、親和性吸着剤と相１しなかった。これら の結果は、このクローン化されたｃＤＮＡによってコ；れたタンパクがフコシル トランスフェラーゼをコードするということを示タリ、α（１，３）ＦＴ活性を 生ずるのに充分な情報が酵素のＣ００Ｈ−末端！アミノ酸の中に存在しているこ とを証明しており、かつ、この方法が、二）タンパクからなるタンパクとして酵 素的に活性な状態で、触媒領域を親和「るのに使用できることを示すものである 。

ノルトランスフェラーゼはグリコジル化された膜透過タンパクである：について 予想された膜透過トポロジーを確認するために、フコシルトラン−ラーゼｃＤＮ Ａを調製し、一連のインビトロでの翻訳実験による分析に付これら実験で生成し た”Ｓ−メチオニン−ラベル化−次翻訳生成物は、約５００ダルトンの分子量に 泳動した。この測定した分子量と予想した分子量、０６９ダルトン）との相違は 、膜スパンニングタンパクはしばしば可溶性くり分子量マーカーに関して、５Ｄ Ｓ−ポリアクリルアミドゲル中を変則的；泳動することがあるという事実によっ て説明できる。この放射性ラベル化くりが犬の膵ＩＲミクロソームの存在下での インビトロの翻訳によって生成し１、それは約４２．０００ダルトンのＭｒに泳 動した。翻訳をミクロソームのＦで行った場合に見られる〜６．０００の分子量 の増加は、２つの中心グリコジル化が、ミクロソーム膜を横切る同時翻訳的（ｃ ｏ−ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ）移動の間に、ミクロソームのオリゴサッカジ ルトランスフエラーゼによって、２つの可能なアスパラギン一連結グリコジル化 部位に付は加えられていることを示唆している。この生成物もミクロソームで共 沈殿し、このことは、該タンパクがミクロソーム膜内に同時翻訳的に挿入された かまたはミクロソーム膜を横切って移動したことを示唆している。この放射性ラ ベル化ミクロソーム−付帯タンパクをエンドグリコシダーゼＨで限定消化（ｌｉ ｍｉｔ　ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ）に付した場合、その分子量は該−次翻訳生成物の 分子量と実質的に同一ものに減少した。部分的なエンドグリコシダーゼＨ消化は 、単一の残留中心グリコジル化ユニットを含有する分子からなっているらしい中 間の大きさの追加のバンドを生じた。これらの結果は、中心オリゴサツカライド 構造の追加が同時翻訳実験で観察されたタンパクを大きくした原因であるという ことを示している。これらの観察は、予想したフコシルトランスフェラーゼアミ ノ酸配列の中に見出された２つの可能なＮ−グリコジル化部位はミクロソーム膜 を横切って移動する間にグリコジル化されることを示している。

プロテアーゼ保護実験の結果から、フコシルトランスフェラーゼの予想したトラ ンスメンプラン　トポロジーについての追加のサポートが得られた。ミクロソー ムの存在下におけるコトランスレーションにより、プロテアーゼによる消化に対 して抵抗を示す４２，０ＯＯＤａのポリペプチドが得られる。該プロテアーゼ消 イ眸戒物は、未消化のミクロソーム会合ポリペプチドよりも若干早く移動し、こ の違いは、ミクロソームの外側に位置すると予想される１５ＮＨ２−末端アミノ 酸の幾つか又は全ての除去によるものであろうと思われる。トランスレーション 後にミクロソームを加えると、プロテアーゼ感応性で非グリコジル化放射性ラベ ル化生成物が生じ、これは、蛋白質の膜挿入がコトランスレーション的であり、 とにかくポストトランスレーション（翻訳後）ではないことを示している。プロ テアーゼ感応性でグリコジル化された３４ＫＤａのポリペプチドの少量も、これ らの実験で同定できる。この蛋白質の正確な性質は未知であるが、これは、プロ テイナーゼに濃度依存形懇にあると思われる。従って、本発明者は、これが、幾 つかのミクロソーム小胞の本来の状態を壊した時に生成する完全な蛋白質の蛋白 性断片を示すのではないかと思っている。全体として、これらの実験は、このポ リペプチドの本体がコトランスレーン３ン的なトランスロケーションプロセスに よりミクロソーム内腔に隔離することができ、最終的にＮ−グリコジル化生成物 を生じる。これらの結果は、フコノルトランスフェラーゼ配列により予想される タイプＩ　Ｉ　ｌ−ランスメンプラン　トポロジーに合致するものである。

フコシルトランスフェラーゼは、２つの異なったグリコシド結合を構築できる。

一般的に、個々のグリコジルトランスフェラーゼは、単一のトランスグリコジル 化反応を行うことができ、次いで単一のグリコシド結合を形成すると信じられて いる。ところが、遺伝子研究及び生化学研究により、ヒトＬｅｗｉｓ血液盟遺伝 子座が、種々のタイプＩ及びタイプＴＩアクセプター基質上にサブターミナルＦ ｕｃα（１，３）及Ｆｕｃα（１，４）結合を生成できる単一フコシルトランス フェラーゼの発現を決定できることが示されている。特に、Ｌｅｗｉｓ酵素は、 アクセプター２１−フコシルラクトースを用いることができる唯一のヒトフコシ ルトランスフェラーゼであると考えられている。プラスミドｐＣＤＭ７−α（１ ，３／１．４）Ｆｒは、このアクセプター基質に基づく酵素検定を伴う濃縮手順 により単離されたので、そのｃＤＮＡインサートは、Ｌｅｗｉ　ｓ酵素をコード しているように思われる。この点を確認するために、本発明者は一連の分析をお こない、組み換え酵素のアクセプター特性を決定した。

ＧＤＰ−［”Ｃ１フコースとタイプＩアクセプター　ラクト−Ｎ−ビオースＩと の間のトランスグリフシ１．−ジョン又はタイプＴＩアクセプター　ラクトース とＮ−アセナルラクトースアミンとの間のトランスグリコシレージョンを触媒で きる能力について、ｐｃｏｒ−α（１，３／１．４）ＦＴでトランスフェクトし たＣＯ３−１細胞の抽出物を試験した。公知のヒトフコツルトランスフェラーゼ によりこれらのアクセプターのそれぞれから形成できるモノフコジル化生成物に は、２つの可能なりラスが存在するのみである。これらは、これらの分子の末端 Ｇａｌ上にＦｕｃα（１，２）結合を含むＨ−活性生成物、又はモノサッカライ ドの０４ヒドロキシ（タイプＩアクセプター）又はその０３ピドロキソ（タイプ ＩＮアクセプター）のいずれかを介してこれらのアクセプターのサブターミナル モノサッカライドに対してアルファーアノマー配置で結合したフコースを含むＬ ｅｗｉｓ　ｘ−又はＬｅｗｉｓ　ａ−活性生成物である。

従って、本発明者は、個々のアクセプターと可能な反応生成物の２つのクラス間 で区別できる降下（ｄｅｓｃｅｎｄｉｎｇ）ペーパークロマトグラフィー法を用 いて反応生成物を分別し、酵素の特性を決定した。

本発明者は、組み換え酵素によりラクトースを利用して、Ｌｅｗｉｓ　ｘ−トリ サツカライド　３−フコシルラクトースのクロマトグラフィー性移動特性を有し 、かつ他の可能な生成物、タイプＩＩ　Ｈトリサツカライドとは区別できる放射 性ラベル化化合物を形成したことを見いだした。同様に、これらの抽出物は、又 、Ｎ−アセチルラクトースアミンをアクセプターとして使用すると、３−フコシ ル−Ｎ−アセチルラクトースアミンを生成する。放射性ラベル化フコースは、α −フコシダーゼによる消化により個々の生成物から定量的に放出さＬこのことは 酵素がこれらのアクセプター基質に対してフコースをアルファーアノマー配置に 結合させていることを示している。これらの結果は、フローサイトメトリー（ｆ ｌｏｗｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）Ｉｌ察に合致スルモノテアリ、ｐＣＤＭ７−ａ（１ ，３／１．４）Ｆｒが５ＳＥＡＩ−１決定基を示すＧａｌβ（１，４）　［Ｆｕ ｃα１．３］Ｇａ１ｃＮＡｃ結合の発現を決定することを示している。

さらに、タイプＩアクセプター　ラクト−Ｎ−ビオース■の放射性ラベル化生成 物を、Ｈ活性標準２゛−フコシルラクト−Ｎ−ビオースＩとは区別でき、かっＬ ｅｗｉｓ　ａ−）−リサッカライド　４−フコシルラクト−Ｎ−ビオースＩの特 性に合致する移動度でクロマトグラフにかけた。この生成物は、又、α−フコシ ダーゼで消化されやすかった。アフィニティー精製蛋白質Ａ−フコシルトランス フェラーゼをこれらの実験で使用した場合に、３つのジザッヵライドアクセブタ ーの全てについて、同様の結果が得られた。これらを−緒にしてみると、これら の結果は、組み換えフコシルトランスフェラーゼが、それぞれタイプＨ及びタイ プニジサツカライドアクセプター上にＦｕｃα（１，３）及１ｕｃα（１，４） グリコシド結合の両方を構築できることを示している。

−組の補完しあう分析において、フコシルトランスフェラーゼｃＤｆｉＪＡによ りコードされている酵素のアクセプターとして、タイプＩ及びタイプＩＩ血液ｆ ｆ１Ｈトリサツカライドを試験した。血液型Ｈα（１，２）−Ｆｒ及びＧＤＰ− ［”Ｃｌフコースを含む細胞抽出物を用い、それらの末端ガラクトース残基の０ ２ヒドロキシにそれらのジサッカライドプレカーサーをフコシル化することによ り、放射性ラベル化タイプＩ及びタイプＴＩ　Ｈ分子を調製した。次に、これら のＨＰＬＣ精製放射性ラベルうタイプＩ及びタイプＩＩ　Ｈアクセプターのそれ ぞれを未うベル化ＧＤＰ−フコースを含む反応中で使用し、ｐＰＲＯＴ計α（１ ，３／１．４）ＦＴＣによりアフィニティー精製フコシルトランスフェラーゼ活 性か生じた。これらの反応のＨＰＬＣ分析により、それぞれタイプＩ又はタイプ ＩＩアクセプターについて生成した、Ｌｅｗｉｓ　ｂ−テトラサツカライドとＬ ｅｗｉｓ　Ｙ−テトラサツカライドについて予想されるクロマトグラフィー性移 動度を持った新しい放射性ラベル化化合物を同定した。ｐＣＤＭ７−α（１，３ ／１．４）Ｆｌ″でトランスフェクトしたＣＯ５−１細胞から調製された抽出物 について、事実上、同様の結果か得られた。三番目の一連の実験において、本発 明者は、この酵素は、その末端ガラクトース残基かシアル酸とび（１，２）結合 で置換されているタイプＩ又はタイプＩＩ上で作動でき、シアル（ＥＬｅｗｉｓ 　ｘ及びシアル化Ｌｅｗｉｓ　ａテトラサツカライド決定基を生成することを実 証した。ｐＣＤＭ７−α（１，３／１．４）Ｆｒでトランスフェクトし、モノク ローナル抗−シアリルＬｅｗｉｓ　ｘ抗体で染色したＣＯ５−１細胞のフローサ イトメトリー分析から、このプラスミドがシアリルＬｅｗｉｓ　Ｘ　ｆｉｔ原、 つまり、その末端ガラクトース残基かシアル酸とα（２，３）結合で置換されて いるタイプＴＩアクセプター上にα（１，３）ＦＴ作用した生成物、の表面発現 を決定できることがわかった。同様に、ｐｃＤＭ７−α（１，３／１．４）Ｆｒ でトランスフェクトし、モノクローナル抗−シアリルＬｅｗｉｓ　ａ抗体で染色 したＣＯ５−１細胞は、このプラスミドがシアリルＬｅｗｉｓ　ａ抗原、つまり 、その末端ガラクトース残基がシアル酸とα（２，３）結合で置換されているタ イプＩアクセプター上にα（１，４）Ｆｒ作用した生成物、の表面発現を決定で きることがわかった。

三番目の一連の実験において、本発明者は、この酵素は、その末端ガラクトーズ 残基がシアル酸とα（２，３）結合で置換されているタイプＩ又はタイプＩＩ上 で作動でき、シアル化Ｌｅｗｉｓ　Ｘ及びシアル化Ｌｅｗｉｓ　ａテトラサツカ ライド決定基を生成することを実証した。ｐｃＤＭｌ−α（１，３／１．４）Ｆ ｒでトランスフェクトし、モノクローナル抗−シアリルＬｅｗｉｓ　Ｘ抗体で染 色したＣＯ３−１細胞のフローサイトメトリー分析から、このプラスミドかシア リルＬｅｗｉｓ　ｘ抗原、つまり、その末端ガラクトース残基かシアル酸とα（ ２，３）結合で置換されているタイプＩＩアクセプター上にα（２，３）ＦＴ作 用した生成物、の表面発現を決定できることがわかった。同様に、ｐＣＤＭ７− α（１，３／１．４）ＦＴでトランスフェクトし、モノクローナル抗−シアリル Ｌｅｗｉｓ　ａ抗体で染色したＣＯ５−１細胞は、このプラスミドがシアリルＬ ｅｗｉｓ　Ｘ抗原、つまり、その末端ガラクトース残基がシアル酸とα（２，３ ）結合で置換されているタイプＩアクセプター上にα（１，４）ＦＴ作用した生 成物、の表面発現を決定できることがわかった。

これらの分析から、ｐＣＤＭ７−α（１，３／１．４）Ｆｒによりコードされる フコシルトランスフェラーゼは、タイプＩ又はタイプＩＩアクセプターのサブタ ーミナルＧｌｃ又はＧｌｃＮＡｃ上に２つの異なったグリコシド結合を構築でき ること、及びこれは、これらのアクセプター上の末端ガラクトースのα（１，２ ）フコシル化又はα（２，３）シアリル化状態に依存しないことがわかった。こ れらの性質は、ヒトＬｅｗｉｓ血液蟹遺伝子座により決定されるフコツルトラン スフェラーゼ活性について報告されたものを反映しており、単一フコシルトラン スフェラーゼは、２つの異なったグリコシド結合の形成を触媒できることを確認 した。

フコシルトランスフェラーゼｃＤＮＡは、ヒトＬｅｗｉｓ血液盟遺伝子座に対し てシンテニツク（ｓｙｎｔｅｎｉｃ）なヒトゲノム配列を同定した。

遺伝子データにより、ヒトＬｅｗｉｓ血液盟が染色体１９上の遺伝子座により決 定されることをしめす。従って、フコシルトランスフェラーゼｃＤＮＡは、ヒト 染色体１９が存在するかしないかの違いのみしかない一対のヒト−マウス体細胞 ハイブリッドのサザンプロット分析に使用された。その結果、高度の緊縮性で、 フコシルトランスフェラーゼｃＤＮＡは、染色体１９上に位置するクロスハイブ リダイズ配列を同定することか示された。酵素分析の結果とともに考えると、こ れらのデータは、このクローン化ｃＤＮＡは、ヒトＬｅｗｉｓ血液盟遺伝子座の 生成物を示すことを強く示唆している。

実験操作 ｃＤＮＡライブラリーの構築 ｃＤＮＡライブラリーを、標準操作及び哺乳類発現ベクターｐＣＤＭ７を用い、 ヒトＡ４３１細胞から単離したポリ（Ａ）−プラスＲＮＡから調製した。ｐＣＤ Ｍ７は、ベクターｐＣＤＭＢ中に存在しているポリオーマ配列を欠いているが、 事実上同一である。このライブラリーは、２．６　ＸＩＯ’の独立の組み換え体 を含んでいた。

セルライン マウス３Ｔ３−ヒトハイブリッドセルラインＫＬＥＪ−４７及ＵＬＥＪ−４７／ Ｐ−１をＤｒ　ＨｏｗａｒｄＧｒｅｅｎ　（Ｈａｒｖａｒｄ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉ ｔｙ、　Ｂｏｓｔｏｎ）から入手した。マウス３Ｔ３細胞をＤｒ、　Ｖｉｓｈｖ ａ　Ｄｉｘｉｔ　（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｍｉｃｈｉｇａｎ、　Ａｎｎ 　Ａｒｂｏｒ）から入手した。他ノセルラインの全ての起源及び細胞増殖の条件 は、文献に以前記載したのと同様である。

バンニング皿の調製 最初にヤギ抗−マウスＩｇＭで被覆し、次にモノクローナル抗−３ＳＥＡ−１抗 体（Ｄ。

５ｏｌｔｅｒにより提供された腹水、ｌ　：　１０００希釈）を被覆して、パン ニング皿を調製した。

ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングＡ４３１ライブラリーを前記した方法で スクリーニングした。プラスミドＤＮＡをプランニングさらに付着しているトラ ンスフェクトしたＣＯ５−１細胞から開放し、トランスホーメイションにより細 菌性宿ｆｊＪｃ１０６１／Ｐ３中に導入した。形質転換体を抗生物質選択条件下 に液体培地中で飽和になるまで成長させ、凍結段階のために了りコートを除去し 、培養物の残りを用いてプラスミドＤＮＡをｍ製した。このプラスミドＤＮＡの 一部を、抗−３ＳＥＡ−］パンニング皿上でトランスフェクト及び免疫選択によ る次の濃縮に使用した。

ＦＡＣＳ分析 トランスフェクトしたＣＯ５−１細胞をマウス［ｇＭ抗−５ＳＥＡ−１モノクロ ーナル抗体（腹水でｌ：１ｏｏｏに希釈）又はマウスモノクローナルＩｇＭ抗− Ｈモノクローナル抗体（Ｃｈｅｍｂｉｏｍｅｄ、　Ｌｔｄ、、Ｅｄｍｏｎｔｏｎ ；　１０ｕｌｇ／ｍｌ）。細胞を次にフルオレッセイン結合ヤギ抗−マウスＩｇ Ｍ（Ｓｉｇｍａ；　４０■／ｍ１）で染色し、前述したように蛍光活性化細胞ソ ーティングによる分析に供した。

ノーザン及びサザンブロツティング Ａ４３１細胞ＲＮＡを前述したようにノーザンブロッティング分析に供した。プ ローブは、プラスミドｐｃＤＭ７−α（１，３／１．４）ＦＴ中のｃＤＮＡイン サートの５゛末端から単離された１、　７Ｋｂ　Ｘｈｏｌ−Ｘｂａｌ断片を含ん でいた。この断片は、ヒトＡｌｕ配列と同様な配列を示すこのｃＤＮＡの部分を 含んでいない。このプローブは、α［”Ｐ］ｄＣＴＰを伴ったニックトランスレ ーションにより、比活性が６刈０１ｃｐｆｆＬ／μｇに放射性ラベル化した。

ゲノムＤＮＡを、前述したように調製し、サザンブロッティングに供した。プロ ットを０．Ｉ　Ｘ５ＳＣ及び０．５％ＳＤＳで６５０Ｃで３０分の最終洗浄に供 した。使用したプローブは、ランダムブリミンク法でラベルされていることを除 き、ノーザンブロッティング分析に供したのと同じである。

配列分析 ｐＣＤＭ７−　ａ　（１，３／１．４）Ｆｒ中のｃＤＮＡインサートを、２重ス トランドプラスミドＤＮＡテンプレート及び市販の試薬（Ｐｈａｒｍａｃ　ｉａ ）を用いた鎖終結法を用いて、配列分析した。ｃＤＮＡ　インサートの配列に従 って合成した１７−＋ｎｅｒ又は１９−ｍｅｒオリゴヌクレオチドプローブを用 いて、両方のストランドを配列分析した。そのＤＮＡ配列を組み立て、Ｂｅｃｋ ｍａｎ　Ｍｉｅｒｏｇｅｎｉｃ　パッケージ、及びウィスコンシンジェネティッ クコンピューターグループの配列分析ソフトウェア−パッケージを用いて分析し た。

ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｈランスクリブションートランスレーションブラスミドｐＣ Ｄｌｉｒ７−　ａ　（１，３／１．４）Ｆｒ　ＤＮＡを、クローン化ｃＤＮＡイ ンサートから下流に、Ｎｏｔｌによる消化により線状化した。次に、キャップし たＲＮＡ　ｌ−ランスクリプトを、　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　）ランスクリブション キット（Ｐｈａｒｍａｃ　ｉａ）に基づく■ポリメラーゼプロモーターを用いて 、この線状化したテンプレートから生成した。トランスクリプトは、ｐＣＤＭ７ 中のｃＤＮＡクローニングサイトに近い方の胃プロモーターから開始した。ｉｎ 　ｖｉｔｒｏで製造したＮトランスクリプトを用い、５ｓｓ−メチオニン（Ａｍ ｅｒｓｈａωの存在下、製造指針に従って、ラビット網状赤血球溶解液をｉｎ　 ｖｉｔｒ。

トランスレーションシステムにプログラムした。カニンパンクレアチンミクロソ ーム膜（Ｐｒｏｍｅｇａ）　（コトランスレーション）の存在下、又はミクロソ ーム（ポストトランスレーションミクロソーム添加）の添加前に生成した膜会合 放射性ラベル化ｉｎ　ｖｊｔｒｏ生成物を、スクロースクッションを介した遠心 分離（０，５スクロース、１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ　７．４．１５０ｍＭ　ＮａＣ１ ：　１７０，０００　Ｘｇ　テロ０分）により可溶性反応成分の本体から単離し た。エンドグリコシダーゼＨ消化のために、ミクロソーム会合放射性ラベル化生 成物を含むベレットを最初ｐＨ５，５のクエン酸ナトリウム５−に再懸濁し、Ｓ ＤＳ中０．為にし、１００°Ｃで４分間加熱した。この材料のアリコートを同量 の水で希釈シ、０．１％ＢＳＡ、０．５％Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００ＳＯ，５ｒ ｒＭ　ＰＭＳＦ、　４０μｇ／ｍｌベスタチン、ＩＯｕｇ／ｍｌ　ａｔ　７クロ グ。プリン及び３０μｇ／ｍｌのＥ−６４ノ存在下、３７°Ｃで２０時間、ｌ　 ＯｍＵ又は５ｍＵのエンドグリコシダーゼＨによる消化に供した。これとは別に 、該ベレットを５酬のＣａＣ１ｔを含む氷冷ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　トランスレーシ ョンバッファーに再懸濁し、１％Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００の存在下又は不存在 下、氷上で１時間、１５０μｇ／ｍｌのブロティナーゼにでインキュベートした 。種々の放射性ラベル化１ｎｖｉｔｒｏｈランスレーノヨン生成物を、６２．５ 　ｍ　Ｔｒｉｓ　ｐＨ６，８，１００ｍＭ　ジチオスレイトール、２％ＳＯ３， １０％　グリセロール及び０．０２％　ブロモフェノールブルー中で、１００° Ｃで４分間加熱して、変性し、還元した。次にサンプルをＳＤＳポリアクリルア ミドゲルを通して分別し、ゲルをオートラジオグラフ法に供した。

フコシルトランスフェラーゼ検定 培養細胞をＰＢＳ中で洗浄し、ラバーポリスマン（ｒｕｂｂｅｒ　ｐｏｌｉｃｅ ｍａｎ）でスクレープ（ｓｃｒａｐｉｎｇ）　Ｌ／て収穫し、再度ＰＢＳ中で洗 浄し、遠心分離によりベレットにした。

細胞ベレットを１％Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００に、抽出物中の最終蛋白質濃度が 約５■／ｍ１（ＢＣＡ法、Ｐｉｅｒｃｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、）となるよ うに再懸濁して、細胞抽出物を調製した。

５０　＋ｒＭＭＯＰＳ　ｐＨ６，５，２５ｍＭ　ＭｎＣ１ｔ　、１０　ｍＭ　Ｌ −フコース、５　ｄ　ＡＴＰ、　３　ｄａ　ＧＤＰ−［’　”Ｃｌ　）＝−ス（ 比活性６００．０００　ｃｐｍ／ｎｍｏｌ　；　３５．０００　ｃｐｍ／検定） 、２．５ｍＭアクセプター（例えば、２−フコツルラクトース、Ｎ−アセチルラ クトースアミン、ラクトース又はラクトＮ−ビオースＩ）及び１０ｕｌまでの細 胞抽出物、最終容積２０μｌ中で、フコシルトランスフェラーゼ検定を行った。

ｓｉｂ選択工程の間にα（１，３）同圧活性の決定を行った場合、蛋白質Ａ−フ コシルトランスフェラーゼ融合蛋白質実験の分析において添加した細胞抽出物の 量とインキュベーション時間を調節して、正確な比活性を反映している（線状） 反応速度を得た。反応物を３７°Ｃで６時間インキュベートし、次いでエタ、ノ ール２ｏμｍを添加し、次いで水５ｏｏＬＩｌで希釈して反応を停止した。反応 を停止し、かつ希釈した反応物を次いで＋５．０００　ｘｇで５分間遠心分離し た。それぞれの反模上澄み液８μｌをカウントし、総放射活性を測定し、それぞ れの２００μｍをＤｏｗｅｘ−１クロマトグラフイーで分別した。

次に生成物形成の指針どして、カラムから溶離する中性放射性ラベル化材料を直 接カウント１．た。酵素比活性は、時間当たりの細胞抽出蛋白質■当たりのアク セプターに対する、ＧＤＰ−フコースから転換するフコースのｐＩＩｌｏｌとし て定義付けられる。中性生成物については、さらに、以下に述べる降下ペーパー クロマトグラフィー及びＨＰＬＣにより分析してその特性を確認した。アクセプ ターを添加せずに同様の実験を行い、内因性アクセプター分子、基質と生成物の 加水分解についての修正を行った。これらのコントロール実験により、アクセプ ターの添加かない場合、中性生成物としてはＧＤＰ−［１４Ｃ］フコース中の放 射活性の２．６％以下であり、又この材料の全てか事実上ｆ”Ｃｌフコースを表 すことがわかった。

放射性ラベル化ＨタイプＩ及びＨタイプＩＩ分子をアクセプターとして使用した 場合、ＧＤＰ−［目Ｃ１フコースの代わりに放射性ラベル化されていないＧＤＰ −フコースを含まれており、反応を１６時間進めた。残りの未反応中性放射性ラ ベル化アクセプター基質及び中性放射性ラベル（ヒＬ酸物をＤｏｗｅｘ−１クロ マトグラフィーで単離し、ついでＨＰＬＣで分析した。

放射性ラベル化ＨタイプＩ及びＨタイプＩＩアクセプターのｔＩｌ製ヒトα（ｉ 、２）ＦＴ活性を含む細胞抽圧物を使用して、放射性ラベル化ＨタイプＩ及びＨ タイプＩＩアクセプター分子を合成した。この細胞抽出物は、ｍ１ｌ−１２Ｊｔ Ｂ胞、つまりヒトα（１，２）ＦｒをコードするヒトＤＮＡセグメントを含むマ ウスＬ細胞トランスフェクトから調製した。これらの抽出物は、検出可能なα（ １，３）Ｆｒ活性やα（１，４）Ｆｒ活性を含まない。ラクト州−ビオースｌ　 （２０ｍＭ）又（卦−アセチルラクトースアミン（２０ｍ）を、３μＭのＧＤＰ −［”Ｃｌフコースを含む４０μｌの２５面のカコジル酸（ｃａｃｏｄｙｌａｔ ｅ）ナトリウムｐＨ６，２中、３７°Ｃで１６時間１００４ｇのｍＨｌ−１２抽 出蛋白質でインキュベーションた。エラ２ノール４０μｌを添加し、次いで水２ ００μｌで希釈して反応を停止した。沈殿した蛋白質を１２．０００Ｘｇで５分 間遠心分離して除き、上澄み液中の中性放射性ラベル化反応生成物をＤｏｗｅｘ −１クロマトグラフィーにより単離した。次にそれぞれの中性放射性ラベル化物 質の大部分を含むタイプＩＨトリサンカライド分子（ラクト−Ｎ−ビオース１反 応）又はタイプＩＩＨ）リサノカライド分子（Ｎ−アセチルラクトースアミン反 応）を以下に示すように１（ＰＬＣで精製した。

ＨＰＬＣ及び降下ペーパークロマトグラフィーによるｒＲ製物分析アフィニティ ー精製蛋白質Ａ−フコツルトランスフェラーゼ融合蛋白質により、又はＰＣＤＭ ７−α（１，３／１．４）ＦｒプログラムＣＯ３−１抽出物により生成した中性 放射性うベル化反応生成物、タイプＩ又はタイプＩＩジサッカライドアクセプタ ー及びＧＤＰ−［”ＣＩフコース（上記フコシルトランスフェラーゼ検定参照） を降下ペーパークロマトグラフィー又は）［ＰＬＣクロマトグラフィーにより分 別して、それらの構造を決定した。ＨＰＬＣにより分析した試料を７０％アセト ニトリル中に溶解し、アセトニトリル　水（７０：３０）中で平衡にしたダイナ マックス６０Ａ（第１アミンカラム、Ｒａ１ｎｉｎ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、 　４．１４ｎｕ　ｘ２５ａ＋）に施した。化合物を了セトニトリル・水（７０： ３０〜４０・６０）の直線勾配で１時間、流速１ｍｌ／分で溶離した。溶離液を ＢｅｃｋｍａｎＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔオンラインラジオアイソトープ検出器でモ ニターした。

降下ペーパークロマトグラフィーにより分析した試料を水に溶解し、Ｔｈａｔｍ ａｎＮｏ、　４を通しフェノール／イソプロパツール／ギＩＩ／水（８５：５： ｔｏ：ｔｏｏ下層）中に分別した。クロマトグラフィー終了後（図６、パネルＡ は４０時間又はパネルＢは４８時間）、空気乾燥クロマトグラムを１ｃｍの断片 に切断し、放射性ラベル化化合物を水２ｍｌ中に溶離した。１０ｍ１のシンチレ ーションカクテルを混合した後、個々の溶離液の放射活性をシンチレーションカ ウントにより測定した。ＨＰＬＣ精製１４ＣラベルしたタイプＩ又はタイプＩ　 Ｉ　Ｈｉ性トリサツカライド標準を、′６ＣラベルしたタイプＩ及びタイプＩＩ Ｈ活性アクセプタートリサツカライドについて上述したようにして調製した。

α−Ｌ−フコシダーゼ消化 中性ＨＰＬＣｍ製放射性ラベル化うコンルＹ・ジルスフェラーゼ生成物をα−Ｌ −フコシダーゼ消化に供し、付着したフコースのアルファアノマー配置を確認し た。

（１，３）　［”　ＣＩフコシル−Ｎ−アセチルラクトースアミン（１，３）［ １４Ｃｌフコシル−２゛−フッシルラクトース（１，３）　［”　Ｃｌフコシル ラクトース及び（１，４）　［”　Ｃｌフコシルラクト−Ｎ−ビオース【をＨＰ ＬＣＴ精製し、それぞれのアリ：７−ト（１０，０００から２０．０００ｃｐｍ ｓ）を、７０μｌの１００酬クエン酸ナトリウムｐｏｓ、ｓ中、１００ｍＵの＋ ２−Ｌ−フコシダーゼ（Ｅ、　Ｃ，３，２，１゜５＋、　Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ −Ｍａｎｎｈｅｉｍ）で３７８Ｃでｎ時間消化した。反応物をＤｏｗｅｘカラム クロマトグラフィーで脱塩し、上記条件のＨＰＬＣ分析に供した。消化生成物を 、し−（ｌ″Ｃ１Ｃ１フコース１４Ｃｌフコースラベル化了クセブタ−の同様の 分離物と比較して同定した。それぞれの場合、α−１７−フコシダーゼ消化によ りし−［１４Ｃｌフフースの定量的な放出を達成した。

ｐＰＲＯＴＡ−α（１，３／１．４）ＦｒＣ構築及び分析推定のフコシルトラン スフェラーゼ触媒ドメインを含むｃＤＮＡインサートの１３４４−ｂｐ　Ｓｍａ ｌ−ＢａｍＨｌセグメントをｐＣＤＭ７−α（１，，３／１．４）ＦＴから単離 した。この断片は、ＤＮＡポリメラーゼＩの１（ｌｅｎｏｄｌ’ｒ片でプラント エンドされており、その末端は、Ｋｉｎａｓｅｄダブルストランドリンカ−に結 合した（５’　ＣＧＧＡＡＴＴＣＣＧ３”）。この結合した断片を、ゲル精製し 、ＥｃｏＲＩで消化し、再度ゲル精製した。この断片をｐＰＲＯＴＡのユニーク ＥｃｏＲＩサイトに挿入した。適当な配向で単一インサートを含む１つのプラス ミド（ｐＰＲＯＴＡ−（１，３／１．４）Ｆｒｅ）をＤＮＡ配列分析により分析 し、ベクター、リンカ−及びインサートの間の接続を横切る予想した配列を確認 した。

ブラスミ）’ｐＰＲＯＴＡ−（１，３／１．４）ＦＴｃ、　ｐＣＤＩＪ７−　ａ 　（１，３／１．４）Ｆｒ　又ハｐＰＲＯＴＡソれツレれ５０μｇを、ＤＥＡＥ −デキストラン仲介トランスフェクションにより別々にＣＯ３−１細胞（５００ ，０００／１００ａｎｉ）に導入した。７２時間の発現期間後、該媒体（１０１ １１１）をそれぞれのプレートから収穫し、低速（３００ＸＧで８分間）及び高 速（１００，０ＯＯＸＧで１時間）遠心分離した。上澄み液を０．０５％のＴ＊ ｅｅｏ２０に調整し、直接検定するか、又はＩｇＧ−セファロース結合研究に使 用した。［ｇＧ−セファロース又はセファロース６Ｂを製造業者（Ｐｈａｒｍａ ｃｉａ）により、前記したように予め平衡にしておき、次いでダルベツコ改良イ ーグル培地の１０％牛脂児血清（ＰＣＳ／Ｄ証めで平衡にした。トランスフェク トしたＣＯ５−１細胞から調製した既知の酵素活性を含む処理した上澄みのアリ コートを、１００μｍの平衡にしたＩｇＧ−セファロース又はセファロース６Ｂ のバッチで、４°Ｃ−夜インキユベートした。上澄みを検定用（“ｆｌｏｗ　ｔ ｈｒｕ”活性、表ＩＩＩ）に貯蔵した。次にマトリックスを５０ｍ＆Ｊ　Ｔｒｉ ｓ　ｐＨ７，５，１ｍｇ／ｍｌ牛血清アルブミンＬｍｌで９回遠心分離し、２０ ｍＭ　Ｔｒｉｓ　ｐＨ７，５，５ａＡ口：ａＣｌ、、　ｏ、ｏｓ％Ｔｗｅｅｎ− ２０の１ｍｌで１回、ＦＣＳ／ＤＭＥＭで１回遠心分離して洗浄した。次にマト リックスを等容量のＦＣＳ／ＤＩＪＥＭに再懸濁した。この懸濁物をα（１，３ ）ＦＴ活性の検定に直接使用した。

ＧＤＰ−ＦｕｃをコードするＤＮＡ配列のクローニング及び発現［β−Ｄ−Ｇａ ｌ（１，４）］−Ｄ−ＧｌｃＮＡｃ　α（１，３）−フコシルトランスフェラー ゼ；細胞培養、　ＣＯ３−１細胞、Ｃ）１０　）ランスフエクタント及びＡ４３ １細胞の起源及び増３４４７：　Ｒａｊａｎ　ｅｔ　ａｌ、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、 　Ｃｈｅｍ、　（１９８９）　２６４：１１１５８−１１１６７）　。ヒトＨＬ |６０セ ルラインは、Ｄｒ、　５ｔｅｖｅ　Ｋｕｎｋｅｌ　（ミシガン大学Ａｎｎ　Ａｒ ｂｏｒ）から入手した。ＨＬ−６０細胞をＩＯ％牛脂児血清及びダルベツコ改良 イーグル培地中で増殖させた。

抗体　抗−Ｌｅｘ抗体　抗−５ＳＥＡ−１（Ｓｏｌｔｅｒ　ｅｔ　ａｌ、　Ｐｒ ｏｃ、　Ｎａｔ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、（ＵＳＡ）（＋９７８）７５：５５６ ５−５５６９Ｘ腹水としてマウスモノクローナルＩｇＡＪ）を使用した。抗−Ｈ 及び抗−Ｌｅｗｉｓ　ａ　抗体（マウスモノクローナル［ｇＭ、抗原アフィニテ ィー精製）をＣｈｅｍｂｉｏｍｅｄ　Ｌｔｄ　（エドモントン、アルバータ）か ら購入した。抗−シアリルＬｅｗｉｓ　ｘ抗体Ｃ３ＬＥＸ＋（７クシマら、Ｃａ ｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、　（１９８４）４４：５２７９−５２８５（マウス　モノク ローナルＩｇＭＳＨＰＬＣ精製）及び抗−シアリルＬｅｗｉｓ　ａ抗体Ｃ３ＬＥ Ａ＋ＣＣｔｎａら、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、　（１９８５Ｍ５：４３５−４３７ （マウスモノクローナルＩｇＧ３　、硫酸アンモニウム沈殿）を使用した。抗− ＶＩＭ−２をＤｒ、　Ｂｒｕｃｅ　Ｍａｃｈｅｒ　（サンフランシスコ州立大学 ）から入手した。プールしたマウスＩｇＧ抗体製剤（Ｍｓ　Ｉｇ）をＣｏｕｌｔ ｅｒから購入した。

フルオＩノッセイン結合ヤギ抗マウスＩｇＭ又はＩｇＧ抗体をシグマから購入し た。

ヒトゲノムライブラリーの構築、高分子量ヒトゲノムＤＮＡを前記したようにヒ ト抹消血白血球からＥＩｉ製した（Ｅｒｎｓｔ　ｅｔ　ａｌ　（１９８９））。

ゲノムＤＮＡを、制限エンドヌクレアーゼ５ａｕ３Ａで部分的に消化した。部分 的に消化したゲノムＤＮＡを塩化ナトリウム勾配によるウルトラ遠心分離により サイズ分別した。８Ｋｂから２０Ｋｂの間のＤＮＡ断片に富んだフラクションを 、ｄＴｒＰ及びｄＣＴＰで部分的にフィルインされている！虹Ｉ消化１側ｂムＦ ＩＸ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）ファージアームにつないで、錘亜Ａ断片に適合す る末端をつくった。この結合混合物を＜ｎ　ｖｉｔｒｏで、Ｅ、Ｃｏ１１宿主Ｔ ＡＰ９０（Ｐａｔｔｅｒｏｎ　ｅｔ　ａｌ、　Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ 、　（１９８７）＋５：６２９８）上にタイターされた市販のバッケイジング抽 出物（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）でバッケイジングした。約＋、ｏ　ｘｉｏ’組換 え体１ａｍｂｄａファージをブラークハイプリダイゼーソヨンによりスクリーン した。プラークリフトをニトロセルロースフィルター（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ及 び５ｃｈｕｅｌ　ｌ）を用いて調製し、４２°Ｃで１６時間、５０％ホルムアミ ド、５ＸＳＳＣ，１０Ｘデンノ１−ト溶液及び０．１％ＳＤＳ中でプレハイブリ ダイズした。１０％硫酸デキストラン及び１００■−■の変性サケ***ＤＮＡを 含むプレハイブリダイゼーション溶液中で、３５°Ｃで７２時間、フィルターを ハイブリダイズした。プローブは、［α−”Ｐ］ｄＣＴＰでラベルしたＬｅｗｉ ｓ血液型α（１，３／１．４）フコシルトランスフェラーゼをコードするｃＤＮ Ａインサートの５末端から単離した１、　７ｔＣｂ　Ｘｈｏ［−Ｘｂａｌ断片か らなっていた。フィルターをそれぞれ室温でＺＸ　ＳＳＣ中で２０分間三回すす ぎ、次いで５０°ＣでＩＸ　ＳＳＣ，０，５％ＳＤＳで１回４分間すすいだ。次 に、フィルターをオートラジオグラフィーにかけた。

プラークハイプリダイゼーノヨンをさらに２回行った後、１８の独立のハイブリ ダイゼーション−陽性プラークを同定した。ファージＤＮＡを液状溶解物から調 製し次に制限エンドヌクレアーゼ消化とサザーンプロット分析により特徴付した 。

ＤＮＡ配列分析 ファージＤＮＡをＰｓｔｌで消化し、ヒトα（１，３／Ｉ、４）フコシルトラン スフェラーゼｃＤＮＡに一致する３、８Ｋｂ断片をゲル精製し、ｐＴＺ１８Ｒの Ｐｓｔ１部位に連結した。一つの挿入物を含む代表的なサブクローンをｐＦＴ− ３と命名した。９７０ｋｂハイブリダイゼーシヨン−ポジティブΔｖａｌｌ−Ｐ ｓｔＩ断片をｐＦＴ−３の挿入物から単離し、ｐＴＺ１８Ｒにサブクローニング した。

このプラスミドの挿入物のＤＮＡ配列を、Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼ（ファルマシ アＬＫＢバイオテクノロジー社）を用いたジデオキシ鎖決定法により決定し、オ リゴヌクレオチドを、フランキングプラスミ自配列、次いでこの挿入物の配列に 従い合成した。この配列データを用いてさらに他の合成デオキシヌクレオチドを 合成し、次いでこれを用いてｐＦＴ−３の挿入物の部分の配列を分析した。配列 分析は、ライスコンシン大学・ジェネティクス・コンピュータ・グループの配列 分析ソフトウェアパッケージを用いて行った。

サザンプロット分析 高分子量ヒトゲノムＤＮＡを全末梢血から調製した。ゲノムＤＮＡ　（１０μｇ ）を制限エンドヌクレアーゼで消化し、０．８％アガロースゲルで分画し、サザ ンプロット分析にかけた。得られたハイブリダイゼーションパターンの異なった プローブによる比較を容易にするため、複数のプロットを、単一のゲル上で電気 泳動した同一の制限酵素消化物から調製した。温度を３５゛Ｃに保持してサザン プロットをハイブリダイズした。サザンプロットを、ルイスα（１，３／１．　 ４）フッノルトランスフェラーゼ酵素をコードするヒトｃＤＮＡの５′末端を表 すプラス４００ｂｐのΔΣａ　Ｉ　Ｉ−Ｐｖｕ　Ｔ　Ｉ断片でプローブした。ハ イブリダイゼーションの後、プロットを２ｘＳＳＣＯ，５％ＳＤＳで室温で１０ 分間２回濯ぎ、洗浄し、次いでオートラジオグラフィにかけた。

ノーザンプロット分析 培養細胞から全ＲＮＡを調製した。次に、市販のカラム（クロンチック）とその 製造者か示す操作手順を用いたオリゴｄＴセルロースカラムクロマトグラフィに より、全ＲＮＡからポリＡ＋ＲＮＡを単離した。ＲＮＡ試料を、ホルムアルデヒ ド含有１．０％アガロースゲルにより電気泳動し、次いでナイロン膜（Ｈｙｂｏ ｎｄ−Ｎ。

アマーンヤム）に転写した。ノーザンプロットを、１ｘＰＥ　（１６）、５ｘＳ ＳＣ，１％ドデシル硫酸すｌ・リウム、及び１００μｇ／ｍｌ剪断サケ***ＤＮ Ａ中６１°Ｃで１時間プレハイブリダイゼーションを行った。次に、プロットを 同じハイブリダイゼーション溶液中６１’Ｃで１６時間以上ハイブリダイゼーシ ョンを行った。プローブは、ｐＦＴ−３の挿入物から単離した、放射標識した４ ｏｏｂｐのΔｖａ　Ｉ　Ｉ−Ｐヱｕｌｌ断片であった。ハイブリダイゼーション の後、１０分間室温で２ｘｓｓｃ中で３回［、次いで２ｘｓｓｃ、０．２％ＳＤ Ｓ中６２°ｃで３０分洗浄した。

た。プラスミドのＣＭＶプロモーターエンハンサ−配列に関して意味のある配向 をした単一の挿入物を有する１個のプラスミドをｐＣＤＮＡｌ−α（１，３）Ｆ Ｔと命名し、以下の分析に使用した。

この集落から、単一の、クローニングされた、５ＳＥＡ−１−ポジティブ細胞系 統（ＣＨＯ−ＬｅＲｅＦＴ）か誘導された。ＣＨＯ−ＬｅＲｅＦＴから調製した 細胞抽出物は、アクセプターＮ−アセチルラクトサミンで検定すると、非常に高 いα（１，３）フコノルトランスフェラーゼ活性を持っていた。

ＦＡＣ３分析 プラスミドＤＮＡで感染したＣＯ３−１細胞を感染後、４８−７２時間培養し染 色用媒体で希釈したモノクローナル抗体で染色した。抗−ルイスａ及び抗−Ｈ抗 体（マウス１ｇＭモノクローナル、抗原アフィニティ精製；　Ｃｈｅｍｂｉｏｍ ｅｄ。

Ｅ凸ｏｎｔｏｎ）を１０μｇ／ｍｌで使用した。抗−５ＳＥＡ−１（マウスモノ クローナルＩｇＭ：腹水）を１：１０００ｇ釈で使用した。抗−シアリルルイス Ｘ（マウスモノクローナルＩｇ！ｉｆ：腹水からＨＰＬＣ精製）を１　ＯＬｌｇ 　／ｍｌで使用した。抗−シアリルルイスａ（マウスモノクローナル［ｇＧ３： 腹水の硫酸アンモニウム沈澱物）を１゜１０００希釈で使用した。対照マウスＩ ｇＧ３抗体（Ｍｓｌｇ、　Ｃｏｕｌｔｅｒ）をｌｏμｇ／ｍｌの濃度で使用した 。抗−ＶＩＭ−２抗体（マウスモノクローナル［ｇＭ：腹水）を１゜２００希釈 で使用した。次いで細胞を適宜、フルオレセインイソチオシアネート−結合ヤギ 抗−マウスＩｇＭ又はＩｇＧで染色し、次いでＦＡＣ３ｃａｎ（Ｂｅｃｔｏｎ− Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）１％トリトンＸ−１００を含む細胞抽出物を感染ＣＯ３− １細胞から調製した。

５加侃カコジル酸ナトリウム、ｐＨ６，２，５ｎｌｊ　ＡＴＩ’　、１０ｍＭフ コース、２０ｍＭ　ＭｎＣ１ｔ、３μＭ　ＣＤＩ”−’″ＣＣフコースび細胞抽 出物５μ１（３０μｇ蛋白質）を含む全量２０μｇ中でフコシルトランスフェラ ーゼ検定を行った。アクセプター基質を最終［２０晶１となるように加えた。３ ７°Ｃで１時間反応を行い、２０μｌのエタノールを加えて反応を終了させ、蒸 留水６００μｌを加えた。各反応のアリコート（５０μｌ）をシンチレーション カウントし、反応物中の全放射活性を決定した。別のアリコート（２００μｌ） を、Ｄｏｗｅｘ　ｌＸ２−４００４００　μｌを含むカラムにかけた。流出画分 、及びさらに２μｌの水溶出液を集め、シンチレーションカウントし、中性生成 物中の放射性フコースの含量を定量した。降下ペーパークロマトグラフィにより アクセプターＮ−アセチルラクトサミンとともに生成した生成物の構造を確認し た。Ｄｏｗｅｘカラム溶出物中の中性生成物を凍結乾燥して濃縮し２、少量の水 に再懸濁し、Ｔｈａｔｍａｎ　Ｎｏ、　４０を用いフェノール／イソプロパツー ル／ギ酸／水（８５・５．ＩＯ・１００、下層）で分画した。クロマトグラフィ （４０時間）後、空気乾燥したクロマトグラムを１ｃｍのストリップにカットし 、このストリップを水２ｍｌに溶出した。各溶出液中の放射活性を、シンチレー ションカクテルｌ０ｍ１と混合した後、シンチレーションカウントすることによ り測定した。

アフィニティ精製した、蛋白質Ａ−ルイスフコシルトランスフェラーゼ融合蛋白 質を用いて、コノ分析用の、放射標識Ｇａｌβ８　（１−＋４）［”ＣＦｕｃ　 α（１−＋３）］ＧｌｃＮＡｃの標準品を調製した。この融合蛋白質を、標準フ コシルトランスフェラーゼ反応混合物中、２０ｍＭ　Ｎ−アセチルラクトサミン 、１５０　ａｍ　ＧＤＰ−［”Ｃ］フコース（ｓｐ。

ａｃｔ　・３．８００　ｅｐｍｓ／ｎｍｏｌ）とともにインキュベートした。中 性の、放射標識生成物を、Ｗａｔｅｒｓ炭水化物分析カラムを用いたアミン吸着 ＨＰＬＣにより、７０％アセトニトリル水からなるアイソクラティック（ｉｓｏ ｃｒａｔｉｃ）グラジェントを用い、流速１ｍｌ／分で精製した。生成物（＋７ 　ｎｍｏｌ）を１４ＣＮＭＲ（Ｃｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　Ｃｏｍｐｌｅｘ　Ｃａｒ ｂｏｈｙｄｒａｔｅ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、　Ａｔｈｅｎｓ、　ＧＡ）分析にかけ た。試料をり、Ｏ中で繰り返して交換し、５００　Ｍｌ（ｚの狸分析にかけた。

プロトン陥択スペクトルを２８°ＣでＢｒｕｋｅｒ　ＡＭ５００で記録した。化 学ソフトはアセテート（δ、１．９０８ｐｐｍ）に対するものである。期待され たトリサツカライドＧａｌβ（１−”４）［Ｆｕｃα（１−３）］Ｇ１ｃＮＡｃ 　、の構造が５００ＭＨｚ分光分析により証明された。Ｄ、０中２８°Ｃで記録 されたこのスペクトルは、δ＝５、１０２にＧｌｃＮＡｅ　（α−アノマー）の 、δ＝４，４６７及びδ＝　４．４５４　ｐｐｍにＧａ１（それぞれトリサツカ ライドのα−及びβ−アノマー）の、及びδ＝　５．１０２　ｐｐｍ　ｉ：Ｆｕ ｅ留するＨＯＤピーク（δ・４．７２　ｐｐｍ）により妨害された。ＧｌｅＮＡ ｃｃＩ）Ｎ−アセチル基のメチルシグナル及びＦｕｅ　Ｏ’）Ｃ６プロトンはそ わぞねδ＝２．０３２及び１．１７８　ｐｐｍに観察された。これらの化学シフ トは、標準トリサラカラ２イドＧａｌ　β（ｌ→４）　［Ｆｕｃα（ｌ→３）　 ］Ｇ１ｃＮＡｃの公表されているものと合致した。

α−Ｌ−フコンダーゼ消化 中性の、クロマトグラフィにより精製した放射標識したフコシルトランスフェラ ーゼ生成物をα−Ｌ−フコシダーゼ消化し、結合したフコースのアルファアノメ リック配Ｉを確認した。上述のとおり、降下ベーパークロマトグラフィにより３ −［”Ｃｌフコシル州−了セチルラクトサミンを精製し、アリコート（７０００ ｃｐｍｓ）を４０ｍＵのａ−Ｌ−フコシダーゼ（Ｅ、　Ｃ，３，２，１，５＋、 　Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を用いて１００ｍＭ＜えん酸ナト リウム、ｐＨ５，５，２０μｌ中、３７゛Ｃで二時間、消化した。反応混合物を Ｄｏｗｅｘカラムクロマトグラフィで脱塩し、上述の放射標識標準品調製のため の条件を用いてＨＰＬＣ分析を行った。消化生成物を、Ｌ−［１４Ｃｌフコース と３−（”Ｃ］フコシル−Ｎ−アセチルラクトサミン出発材料を並行して分離比 較することにより同定した。α−Ｌ−フコノダーゼ消化によりＬ−［”Ｃ］フコ ースの定量的な離脱か達成された。

上述の教示に照らし、本発明の多数の改良、改変が可能である、ことはいうまで もない。従って、添付した請求の範囲の記載の範囲内で、ここに具体的に記載し た以外の方法で本発明を実施することか可能である。

配列範囲　Ｉ　ＴＯ３６４７ ３４［１３５０３６０３７０：］８０ ：］９０　４００　４１０　４２０　４３０　４４０４５０　４６０　４７０　 ４８Ｑ　４９０■夏夏１１１１Ｎ夏！■ ５００　５１０　５２０　５３０　５４０　５５［ＩＦｌσ−４Ａ Ｆ’ＩＣ−４１３ ＋６００　１６１０　１６２０　１６３０　１６４０　１６５０夏■夏１１１１ １１ｍ肩 ＦＩＣ−４Ｃ １７１０１７２０１７：１０　１７４０　１７５０　１７６０１　夏　Ｉ　蔓　 １　１１１１１１ Ｗ１夏蚕冨蚕ＩＩＩ葺Ｉ ＧＣＡＣＴ　ＴＧＧＧＡ　ＧＧ＾ＧＣＡＧＧＧＣＡＧＧＧＣＣＣＧＣＧ　ＧＣＣ ｎ　丁ＧＣＡＴ　丁ＣＴＧＧ　Ｃ１ＡＣＣＧ　ＣＣＣｌ１．m： ＣＧ丁ＧＡ　ＡＣＣ口Ｔ　ＧＣＴＣＧ　ＴＣＣＣＧ　ＴＣＣＣＧ　ＧＧＣＧＣＣ ［ｌ［ＩＡＡ　ＡＣＧ丁＾　ＡＧＡＣＣＣＴＧＧＣＧＧＧＧf １Ｂ２０　１８３０　１８４０　１８５０　１８６０　１８７０１夏Ｉ夏夏ＩＩ Ｎ夏ＩＩ ＴＴＣＣＡ　ＴＴＣＣＣＧＧＧＣＣＡＧＣＧＧ　ＣＧＡＧＣＧＧＣＡＧ　ＣＧＡ ＣＧ　ＧＣＴＧＧ　ＡＧＣＣＧ　ＣＡＵｉ、丁　ＡＣＡＧＣＡＡＧＧＴ　ＭＧＧ Ｇ　ＣＣＣＧＧ　ＴＣＧＣＣＧＣＴＣＧ　ＣＣ［ＪＴＣＧＣＴＧＣＣＧＡＣＣＴ ＣＧＩ：Ｉｃ　ＧＴＣＧＡ　Ｔ［１ｌＴb（１ ！■夏Ｉ夏１１１１１五 １９３０　１９４Ｇ　＋９５０　１９６０　１９７０葺１１Ｍ１１１１１１ １　１　ＩＩ　Ｎ　ＩＩ　Ｉ　ｌＩ ２０３０　２０４０　２０５０　２０６０　２［１７０蚕葺ｘｗｉｉｉ員！！ ＩＶθ、４〃 １１１１ｆｉＩＮＩＩＮ １”’ＩＣ：、４に’ ２３９０　２４００　２４＋０　２４２０　２４’］０２４４０　２４５０　２ ４６ｆｌ　２４７０　２４８０２４９０　２５００　２５１０　２５２０　２５ ３Ｄ２’５４０　２５５０　２５６０　２５７０　２５８０ＦＩＣ：、４Ｆ ＦＩＣ，４Ｃ： ３１００　３＋１０　３１２０　３１コ０　：］１４０　３１５０３１６０　３ １７０　’１１８０　３１９０　：１２００八八Ｍ＾ＣＴＡＧＧＡＧＡ丁ＧＡＣ ＡＣ［ＩＴＡＧＡＧＣｉＭＣＴＧＡＣらＧＣＧＴＡＧＴＡＣＣＣＴＣＡＴＴＣ＾ ＡＧＡ３２７０　ｋ８０　３２９Ｑ　３３００　３３１０３３２０３３３０３３ ４０コ３５０３コロ０：１３７０ＦＩＣ−４Ｈ ３３８０：ｌ］’３９０　３４００　３４１０　３４２０ＡＧＧＧＡ　ＡＡＣＧ Ａ　ＣＧＡＣＴ　ＡＣＣＣ［Ｊ　ＴＡＧＴＡ　ＡＣＡＡＡ　丁Ｃ［：ＣＣＡＣｎ ＣＣＴＣ（、口　ＣＣＡＡＧ　ＡＡＧfＡ ３４：３０　３４４０　３４５０　３４６０　３４７０　３４８０夏ＩＩＩ夏葺 １ｉｉｉｉ ＣＡＣＣＴ　丁ＧＴＡＡ　Ｃ１：ＡＧＴ　ＧＣＡＧＡ　ＡＡ丁ＣＲＡＭ丁ｔ、Ｇ 　ＣＴＴＡＧ　ＣＧＧＣＡ　ＡＧＡＡＧ　ＣＣＧＴＴ　ＧＡfＧＣ ＧＴＧＧＡ　ＡＣＡＴＴ　ＧＧＴＣＡ　ＣＧＴＣＴ　ＴＴＡＣＴ　ＴＴＡＴＣＧ ＭＴＣＧＣＣＧＴ　ｒｃＴＴｃ　ＧＧＣＡＡ　ＣＴＣＣＧ３４９０　３５００　 ：１１５１０　３５２０　”１５３０ＩＩ　夏　ＭＩＮＩ　蔓　Ｉ　夏　Ｉ ＧＧＴ丁Ｔ　ＣＣＴＧＡ　ＡＴＴＴＣＣＣ口Ａ丁　Ｃ丁ＧＣＣＡＣＡＧＧ　ＣＣ ＡＴＡ　ＴＴＴＧＴ　ＧＧＣＣＣＧＴＧＣＡ　ＧＣＴ丁ＣＣＣＡＡＡ　ＧＧＡＣ Ｔ　Ｔｌ！ｔＡＡＧ　ＧＧＧＴＡ　ＧＡＣＧＧ　ＴＧＴＣＣＧＧＴＡＴ　ＡＭＣ Ａ　ＣＣＧＧＧ　ＣＡＣ［ＪＴ　ＣＧ`ＡＧ ３５４０　３５５０　３５’６０　３５７０　３５８０　３５９０１１１１　遍 　夏　１１１１Ｉ ＣＡＡＡ丁　ＣＴＣＡＴ　ＡＣＡＣＡ　ＡＣＴＧＴ　ＴＣＣＣＧ　Ａ丁ＴＣＡ　 ＣＧＴＴＴ　ＴＴＣＴＧ　ＧＡＣＣＡ　ＡＧＧＴＧ　ＭＧＣ` ＧＴ丁ＴＡ　ＧＡＧＴＡ　丁ＧＴＧＴ　ＴＧＡＣＡ　ＡＧＧＣｉＣＴＡＡＧＴ　 ＧＣＭＡ　ＭＧＡＣＣＴＧＧＴ　ＴＣＣＡＣｎＣＧＴ：３６００　３６１０　３ ６２０　３６］Ｑ　：３６４０ＡＡＴ丁Ｔ　０７６６丁　ＴＧＴＡ［ｌ＋　ＡＡ ＧＧＡ　ＧＣＣｎ　［ＪＴＴ［ｌｌＧ　ＴＧＧＡＧ　ＡＧＴＧＧ　ＡＡＧＧＡ　 ＣＴＧＴＧ@ＧＣＴＧ口 丁ＴＡＡＡ　ＣＡＣＣＡ　ＡＣＡＴＣＴ丁ＣＣＴ　ＣＧＧＡＡ　ＣＡＡＣＣＡＣ ＣＴＣＴＣＡＣＣＨＣＣＴ　ＧＡＣＡＣＣ［１ｌＡＣδＧ Ｃ ＦＩＣ−４１ Ｃ１〜　−り　ζり　ａ）　σ〜　ｎ　〜！ｓ　３　ａｓ　ｓ　Ｘ３　ツ　ａｓ 　３　ｇｓ　３４　旧　爾　× 要約書 本発明は、遺伝子及び以下の工程を含む方法により得られる該遺伝子の発現によ り得られる遺伝子産物に関する。

（ｉ）　目的の翻訳後特性を有する第１細胞を単離する工程、該翻訳後特性は、 該第Ｉ細胞表面上の目的の膜結合オリゴ糖又は多糖の存在、該第１細胞抽出物中 の目的の可溶性オリゴ糖又は多糖の存在、又は該第１細胞抽畠物中の特にグリコ ジルトランスフェラーゼ活性の存在であり、（ｉｉ）　該単離した第１細胞の遺 伝子材料からＣＤＮＡ又はゲノムＤＮＡの遺伝子ライブラリーを作成する工程、 （Ｎｉ）宿主細胞を該遺伝子ライブラリーで形質転換する工程、及び（ｉｖ）　 該形質転換宿主細胞をスクリーニングして該翻訳後特性を有する宿主細胞を得、 それによって該遺伝子を含む細胞を得る工乱国際調査報告 ＰＣＴ／ＵＳ９１１００８９９ Ｔｈｘｑ　ｉｎ＋＊ｒｎａｆｉ自１＋Ａ’ｌ　ａｎｎｌｉｃｓｔｘｎｎ　Ｉ”＋ ｎｎτａｉｒ＋＋＋　ｒ、ｈｅ　ｆｃ＋−ｔｔｌｗｉｎ（＋ｍ＋＋ＨｉｒＩｉａ 　１ｕｓｐｎｒ＋ｃ＋ｒ＋ｐ：Ｔ、＋１ａｔｍｑ　ｌ−ｈ、Ｌｌ、＋２．２６． ２７．１１．３２　ｋ　３’ｓ　Ｃｏｍｐｒｔｑｔｎｇ　ａｔｒｒｑｒ　ｐｒｒ ＩＬＩｕＣｔ、ａ　ｇｅｎｅ、ａｎｒｌ　ｓ　ｆｉｒ＋＋τ　ｐｒｎｃｅ＋＋＋ ｑ　ｏｒ　ｍｓｋｌｎｇ　５ａｉｄｐｒｒ＋小ＩＣｔ・ Ｔ１．　＋−，１ａｚｍｑ　７−ｂ）、＋４−２５．３０．３３．、ＩＪ　＆　 ３６−．１８　ｒｙｒ＋ＭＤｒｉ＊ｉｎ＋、＋　ａｓｅｃｃ＋ｎ（ｌ　ｐｒｒ＋ ｄ＋＋ｒｔ　、ａ　ｐｒＯｔｅｊｎ、５ｎｃｌ　ａ　ｆｊｒ酎ｐ耐Ｏｃｔｌｌｐ ｔ　ｎｆ　ｕｓｉｎ９　Ｍａｉi１ ｎｒｒ＋ｄｕｒｒ　＊ｑ　ａｎ　ｐｎｚｖｍｐ：ｔＴｌ、　（１ｓ１ｍ　１．１ 　ｒ：ｒ＋ｍｐｒｉｑｉｎｇ　ａ　ｊｈｉｒｄ　ｐｒｒｘ！ｕｒ：ｔ、、　ｎ　 ｒｅＣｒ＋ｍｈｉｒ＋ａｎｒ■〜　＋−，１ａｉ＋ｕ＋　２Ｒ＆　２９　Ｃｎ＋ ｍｐｒｉｓｔｎｇ　Ａ　ｆｏｕｒｔ、ｈ　ｐｒｒｙｌｕｃＬ　５ｎａｎＮｔ＋ｒ ＋ｒｌｙ。

Ｐｔ−Ｔ　ＲＩＩＩＪ　Ｌ３．２　ｐｒＯＶｌｄＰｎ　θｎｌｌ／　ｆｎｒ　Ａ 　ｓｉｎｇｌｅ　ＬｎＶ句ｎｊｉＶ＊　＋？ｎｎＣ１！ｐｒｃＯｍｐｒ］ｑｊｎ ｑ　Ａ　ｐｒｏ山ｌｅｔ、Ａ　ｐｒＯｃｔ’Ｑ９　（げ　−ａｋｊｎｇ　ａｎｄ ／ｃ＋ｒ　ａ　ｐｒｃｏ−ｐｐ＋ｓ　ｏ■

Claims (38)

【特許請求の範囲】
1. １．下記の工程を含む方法により得られる遺伝子の発現により得られる酵素遺伝 子産物： （ｉ）目的の翻訳後特性を有する細胞を単離する工程、該翻訳後特性は、該細胞 表面上の目的の膜結合オリゴ糖又は多糖の存在、該細胞抽出物中の目的の可溶性 オリゴ糖又は多糖の存在、又は該細胞抽出物中の特にグリコシルトランスフェラ ーゼ活性の存在であり、 （ｉｉ）該単離した細胞の遺伝子材料からｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡの遺伝子ラ イブラリーを作成する工程、 （ｉｉｉ）宿主細胞を該遺伝子ライブラリーで形質転換する工程、及び（ｉｖ） 該形質転換宿主細胞をスクリーニングして該翻訳後特性を有する宿主細胞を得、 それによって該遺伝子を含む細胞を得る工種を含み、該遺伝子は、β（１，４） ガラクトシルトランスフェラーゼ、α（２，６）シアリルトランスフェラーゼ、 又はＵＤＰガラクトース：β−Ｄ−ガラクトシルー１，４−Ｎ−アセチル−Ｄ− グルコサミニドα−１，３−ガラクトシル−トランスフェラーゼをコードする遺 伝子以外のものである。
2. ２．工程（ｉ）における該細胞の単離工程が、該細胞抽出物中の該グリコシルト ランスフェラーゼ活性の検出を含む請求の範囲１記載の遺伝子産物。
3. ３．工程（ｉ）における該細胞の単離工程が、該膜結合オリゴ糖又は多糖の検出 を含む請求の範囲１記載の遺伝子産物。
4. ４．工程（ｉ）における該細胞の単離工程が、該細胞抽出物中の可溶性オリゴ糖 又は多糖の存在の検出を含む請求の範囲１記載の遺伝子産物。
5. ５．前記グリコシルトランスフェラーゼが、フコシルトランスフェラーゼ、シア リルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、ガ ラクトシルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラ ーゼ、マンノシルトランスフェラーゼ、グルコシルトランスフェラーゼ、キシロ シルトランスフェラーゼ、アセチラーゼ、スルホトランスフェラーゼ、グルクロ ニルトランスフェラーゼ及びグルクロニルエピメラーゼからなる群から選ばれた ものである請求の範囲２記載の遺伝子産物。
6. ６．下記の工程を含む方法により得られるＤＮＡ配列：（ｉ）目的の翻訳後特性 を有する細胞を単離する工程、該翻訳後特性は、該細胞表面上の目的の膜結合オ リゴ糖又は多糖の存在、該細胞抽出物中の目的の可溶性オリゴ糖又は多糖の存在 、又は該細胞抽出物中の特にグリコシルトランスフェラーゼ活性の存在であり、 （ｉｉ）該単離した細胞の遺伝子材料からｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡの遺伝子ラ イブラリーを作成する工程、 （ｉｉｉ）宿主細胞を該遺伝子ライブラリーで形質転換する工程、及び（ｉｖ） 該形質転換宿主細胞をスクリーニングして該翻訳後特性を有する宿主細胞を得、 それによって該遺伝子を含む細胞を得る工程を含み、該遺伝子は、β（１，４） ガラクトシルトランスフェラーゼ、α（２，６）シアリルトランスフェラーゼ、 ＧＤＰ−Ｌ−フコス−β−Ｄ−ガラクトシド２−α−Ｌ−フコシルトランスフェ ラーゼ、又はＵＤＰガラクトース：β−Ｄ−ガラクトシル−１，４−Ｎ−アセチ ル−Ｄ−グルコサミニドα−１，３−ガラクトシル−トランスフェラーゼをコー ドする遺伝子以外のものである。
7. ７．ＵＤＰガラクトース：β−Ｄ−ガラクトシル−１，４−Ｎ−アセチル−Ｄ− グルコサミニドα−１，３−ガラクトシル−トランスフェラーゼの触媒的に機能 するドメイン以外の、非グリコシル化グリコシルトランスフェラーゼの触媒的に 機能するドメインに少なくとも対応し、かつ完全非グリコシル化β（１，４）ガ ラクトシルトランスフェラーゼ又はα（２，６）シアリルトランスフェラーゼ以 外の完全非グリコシル化グリコシルトランスフェラーゼまでに対応する、非グリ コシル化蛋白質。
8. ８．非グリコシル化グリコシルトランスフェラーゼが、非グリコシル化フコシル トランスフェラーゼ、シアリルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミニ ルトランスフェラーゼ、ガラクトシルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルガラク トサミニルトランスフェラーゼ、マンノシルトランスフェラーゼ、グルコシルト ランスフェラーゼ、キシロシルトランスフェラーゼ、アセチラーゼ、スルホトラ ンスフェラーゼ、グルクロニルトランスフェラーゼ及びグルクロニルエピメラー ゼからなる群から選ばれたものである請求の範囲７記載の非グリコシル化蛋白質 。
9. ９．２つの部分を含む融合蛋白質であって：第１の部分が、少なくともＵＤＰガ ラクトース：β−Ｄ−ガラクトシル−１，４−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミニ ドα−１，３−ガラクトシル−トランスフェラーゼの触媒的に機能するドメイン 以外の、グリコシルトランスフェラーゼの触媒的に機能するドメイン、及び完全 グリコシルトランスフェラーゼまでであり；第２の部分が固体支持体に結合可能 な蛋白質スペーサー又はアフィニティリガンドを含む蛋白質成分である融合蛋白 質。
10. １０．前記グリコシルトランスフェラーゼが、フコシルトランスフェラーゼ、シ アリルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、 ガラクトシルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェ ラーゼ、マンノシルトランスフェラーゼ、グルコシルトランスフェラーゼ、キシ ロシルトランスフェラーゼ、アセチラーゼ、スルホトランスフェラーゼ、グルク ロニルトランスフェラーゼ及びグルクロニルエピメラーゼからなる群から選ばれ たものである請求の範囲９記載の融合蛋白質。
11. １１．（ｉ）少なくとも図１の配列（Ｉ）のアミノ酸位置４３からアミノ酸位置 ３６１まで及び全配列（Ｉ）まで、又は（ｉｉ）少なくとも図４の配列（ＩＶ） のヌクレオチド位置２０８９からヌクレオチド位置３１５６まで及び全配列（Ｉ Ｖ）まで、に相当するＤＮＡ配列。
12. １２．請求の範囲６又は１１記載のＤＮＡ配列の一つを含むベクター。
13. １３．請求の範囲１２記載のベクターで形質転換された微生物。
14. １４．前記非グリコシル化グリコシルトランスフェラーゼが、非グリコシル化フ コシルトランスフェラーゼである請求の範囲７記載の非グリコシル化蛋白質。
15. １５．前記非グリコシル化グリコシルトランスフェラーゼが、非グリコシル化シ アリルトランスフェラーゼである請求の範囲７記載の非グリコシル化蛋白質。
16. １６．前記非グリコシル化グリコシルトランスフェラーゼが、非グリコシル化Ｎ −アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼである請求の範囲７記載の非グリ コシル化蛋白質。
17. １７．前記非グリコシル化グリコシルトランスフェラーゼが、非グリコシル化ガ ラクトシルトランスフェラーゼである請求の範囲７記載の非グリコシル化蛋白質 。
18. １８．前記非グリコシル化グリコシルトランスフェラーゼが、非グリコシル化Ｎ −アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼである請求の範囲７記載の非グ リコシル化蛋白質。
19. １９．前記非グリコシル化グリコシルトランスフェラーゼが、非グリコシル化マ ンノシルトランスフェラーゼである請求の範囲７記載の非グリコシル化蛋白質。
20. ２０．前記グリコシルトランスフェラーゼがフコシルトランスフェラーゼである 請求の範囲１０記載の融合蛋白質。
21. ２１．前記グリコシルトランスフェラーゼがシアリルトランスフェラーゼである 請求の範囲１０記載の融合蛋白質。
22. ２２．前記グリコシルトランスフェラーゼがＮ−アセチルグルコサミニルトラン スフェラーゼである請求の範囲１０記載の融合蛋白質。
23. ２３．前記グリコシルトランスフェラーゼがガラクトシルトランスフェラーゼで ある請求の範囲１０記載の融合蛋白質。
24. ２４．前記グリコシルトランスフェラーゼがＮ−アセチルガラクトサミニルトラ ンスフェラーゼである請求の範囲１０記載の融合蛋白質。
25. ２５．前記グリコシルトランスフェラーゼがマンノシルトランスフェラーゼであ る請求の範囲１０記載の融合蛋白質。
26. ２６．少なくとも配列（Ｉ）のアミノ酸位置４３からアミノ酸位置３６１まで及 び全配列（Ｉ）までに対応する請求の範囲１１記載のＤＮＡ配列。
27. ２７．少なくとも配列（ＩＶ）のヌクレオチド位置２０８９からヌクレオチド位 置３１５６まで及び全配列（ＩＶ）までに対応する請求の範囲１１記載のＤＮＡ 配列。
28. ２８．請求の範囲７記載の非グリコシル化蛋白質に対する抗体。
29. ２９．請求の範囲１記載の遺伝子産物に対する抗体。
30. ３０．請求の範囲７記載の非グリコシル化蛋白質を酵素として使用する、オリゴ 糖の製造方法。
31. ３１．請求の範囲６記載のＤＮＡ配列のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
32. ３２．下記の工程を含む、遺伝子の単離方法であって、（ｉ）目的の翻訳後特性 を有する第１細胞を単離する工程、該翻訳後特性は、該細胞表面上の目的の膜結 合オリゴ糖又は多糖の存在、該細胞抽出物中の目的の可溶性オリゴ糖又は多糖の 存在、又は該細胞抽出物中の特にグリコシルトランスフェラーゼ活性の存在であ り、 （ｉｉ）該単離した第１細胞の遺伝子材料からｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡの遺伝 子ライブラリーを作成する工程、 （ｉｉｉ）宿主細胞を該遺伝子ライブラリーで形質転換する工程、及び（ｉｖ） 該形質転換宿主細胞をスクリーニングして該翻訳後特性を有する宿主細胞を得、 それによって該遺伝子を含む細胞を得る工程を含み；工程（ｉ）における該第１ 細胞の単離工程が、該宿主細胞抽出物中の該グリコシルトランスフェラーゼ活性 の検出を含み；又は、工程（ｉ）における該細胞の単離工程が、該宿主細胞抽出 物中の可溶性オリゴ糖又は多糖の存在の検出を含むことを特徴とする方法。
33. ３３．下記の工程を含む、可溶性オリゴ糖又は多糖、若しくは細胞膜関連オリゴ 糖又は多糖を得る方法。 （ｉ）オリゴ糖又は多糖分子前駆体を、（ｉａ）少なくともグリコシルトランス フェラーゼの触媒的に機能するドメイン、及び完全グリコシルトランスフェラー ゼまでに相当する非グリコシル化蛋白質、又は（ｉｂ）２つの部分を含む融合蛋 白質であって；第１の部分が、少なくともグリコシルトランスフェラーゼの触媒 的に機能するドメイン、及び完全グリコシルトランスフェラーゼまでであり；第 ２の部分が固体支持体に結合した蛋白質スペーサー又はアフィニティリガンドを 含む蛋白質成分である融合蛋白質、と接触させる工程；及び（ｉｉ）オリゴ糖又 は多糖生産物を得る工程。
34. ３４．細胞膜関連オリゴ糖又は多糖が得られる請求の範囲３２記載の方法。
35. ３５．前記第１細胞が哺乳動物細胞であるか、前記宿主細胞が真核細胞又は野性 型細胞である、請求の範囲３２記載の方法。
36. ３６．前記第１細胞が哺乳動物細胞である請求の範囲３３記載の方法。
37. ３７．前記宿主細胞が真核細胞である請求の範囲３３記載の方法。
38. ３８．前記宿主細胞が野性型細胞である請求の範囲３３記載の方法。