KR100602683B1 - 아실-코에이：콜레스테롤 전이효소 저해활성을 갖는프탈레이트계 화합물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 아실-코에이:콜레스테롤 전이효소에 대해 저해활성을 갖는 프탈레이트계 화합물 및 그의 제조방법에 관한 것으로, 구체적으로 반묘로부터 얻어진 프탈레이트계 화합물을 유효성분으로 하는 아실-코에이:콜레스테롤 전이효소 저해활성용 약학적 조성물 및 반묘로부터 프탈레이트계 화합물을 제조하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 프탈레이트계 화합물을 함유하며 반묘로부터 얻어진 반묘 추출물 및 이를 유효성분으로 하는 아실-코에이:콜레스테롤 전이효소 저해활성용 약학적 조성물에 관한 것이다.

상기 아실-코레이:콜레스테롤 전이효소 저해활성용 약학적 조성물은 고지혈증 및 동맥경화를 포함하는 순환계 질환의 예방제 및 치료제로 사용할 수 있다.

프탈레이트계 화합물, 아실-코에이:콜레스롤 전이효소.

Description

아실-코에이：콜레스테롤 전이효소 저해활성을 갖는 프탈레이트계 화합물{NOVEL PHTHALATE­TYPE COMPOUND HAVING INHIBITANDY ACTIVITY AGAINST ACYL­COA：CHOLESTEROL ACRYTRANSFERASE}

도 1은 본 발명의 반묘 추출물의 제조방법을 나타낸 개략도이다.

본 발명은 아실-코에이:콜레스테롤 전이효소에 대해 저해활성을 갖는 프탈레이트계 화합물 및 그의 제조방법에 관한 것이다.

동맥경화증은 동맥이 비후되고 경화되어 탄력을 잃고 약해진 것으로서, 노화와 더불어 발생하는 주요 질환 중의 하나이다. 동맥경화증은 뇌동맥경화증 및 관상동맥경화증이 가장 대표적인 것으로, 이는 동맥경화가 뇌동맥 및 관상동맥에서 일어나기 쉽기 때문이다. 뇌동맥경화증은 두통, 현기증, 정신장애를 나타내고 뇌연화증의 원인이 되며, 관상동맥경화증은 심장부에 동통과 부정맥을 일으켜 협심 증, 심근경색 등의 원인이 되는 것으로 알려져 있다. 또한 동맥경화증은 고혈압, 심장병, 뇌일혈 등이 유발되어, 이로 인한 질병이 현대 사회에 있어, 특히 50∼60대의 남성들에게 가장 큰 사망요인으로 부각되고 있다. 따라서 동맥경화의 발병 기작을 밝히고 그 예방제 및 치료제를 개발하기 위한 많은 연구가 진행되고 있다.

아실-코에이:콜레스테롤 전이효소(Acyl-CoA: cholesterol acyltransferase; ACAT, EC 2.3.1.26)는 콜레스테롤의 에스터화를 통한(Mahley, R. I. et al., J. Lipid Res. 25, 1277-1294, 1984) 동맥에서의 콜레스테릴 에스터 축적(Bell, F. P. 1986. pp.409-422. In J. R. Prous[ed.], Pharmacological control of hyperlipidemia)과 장으로부터 콜레스테롤 흡수 및 간에서의 지단백질 형성(Heider, J. G. 1986. pp423-438. In J. R. Prous[ed.], Pharmacological control of hyperlipidemia)에 중요한 역할을 하는 효소이다.

ACAT 활성에 의해 거품세포가 콜레스테롤로부터 유도된 다량의 콜레스테릴 에스터를 포함하기 때문에, 실험적, 임상적인 측면에서 대식세포(macrophages)와 평활근세포로부터 유도된 거품세포의 형성은 매우 중요하다.

혈관벽내의 거품세포의 증식은 ACAT 활성증가와 직접적으로 연관되어 있기 때문에 강력한 항동맥경화제로써 ACAT 저해제의 개발은 바람직하다.

지금까지 보고된 ACAT 활성 저해제는 쥐간 마이크로좀 ACAT 또는 쥐간 대식세포(J774) ACAT 에 대한 활성 저해제에 한정된다. 한편, 사람의 ACAT는 사람 ACAT-1과 사람 ACAT-2가 있는데, 사람 ACAT-1(50 kDa)은 성인의 간, 부신, 대식세포, 신장에서 주로 작용하며, 사람 ACAT-2(46 kDa)는 소장에서 작용한다(Rudel, L. L. et al., Curr. Opin. Lipidol 12, 121-127, 2001). 사람 ACAT 활성을 저해하는 물질은 음식으로부터 유입되는 콜레스테롤의 흡수를 억제하고, 혈관내벽에 콜레스테릴 에스터의 축적을 억제하는 기작을 통해 고콜레스테롤증, 콜레스테롤 결석 또는 동맥경화 예방 및 치료제의 표적이 되고 있다(Buhman, K. K. et al., Nature Medicine 6, 1341-1347, 2000).

한편, 반묘(斑猫, Mylabris phalerate Pallas)는 가래과(Meloidae) 길나잡이의 건사체로서 중국에서는 예로부터 진통, 이뇨, 소염약으로 사용되어 왔다. 우리 나라에서는 민간에서 암치료 보조약, 신경계 질환, 당뇨병 등의 만성 성인병 치료에 사용되어 왔다.

본 발명의 목적은 아실-코에이:콜레스테롤 전이효소 저해활성을 갖는 새로운 화합물을 제공하는 것으로, 구체적으로 곤충으로부터 얻어진 아실-코에이:콜레스테롤 전이효소 저해활성을 갖는 새로운 화합물 및 그의 제조방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 프탈레이트계 화합물을 함유한 반 묘 추출물을 제공한다.

또한, 본 발명은 반묘로부터 프탈레이트계 화합물을 제조하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 프탈레이트계 화합물 또는 반묘 추출물을 함유한 아실-코에이:콜레스테롤 전이효소 활성저해용 약학적 조성물을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 프탈레이트계 화합물을 함유한 반묘 추출물을 제공한다.

구체적으로, 반묘(Mylabris phalerate Pallas)를 헥산, 클로로포름, 에틸아세테이트, 메탄올 및 물로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 또는 하나 이상의 용매로 추출하여 제조되며, 상기 화학식 1로 표시되는 프탈레이트계 화합물을 함유하는 반묘 추출물을 제공한다.

또한, 본 발명은 반묘로부터 화학식 1로 표시되는 프탈레이트계 화합물의 제조방법을 제공한다.

구체적으로, 반묘를 헥산, 클로로포름, 에탈아세테이트, 메탄올 및 물로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 또는 하나 이상의 용매로 추출하여 추출액을 얻는 단계(단계 1); 및

상기 추출액을 크로마토그래피를 수행하여 화학식 1로 표시되는 프탈레이트계 화합물을 분리하는 단계(단계 2)를 포함하는 것으로 이루어진 프탈레이트계 화합물의 제조방법을 제공한다.

단계 1은 반묘를 용매를 이용하여 추출하는 것으로, 이때 사용하는 용매는 헥산, 클로로포름, 에탈아세테이트, 메탄올 및 물로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 또는 하나 이상을 사용하며, 상기 용매를 단독으로 사용하거나 이를 순차적으로 사용하여 추출액을 얻을 수 있다. 일예로 도 1에 나타낸 바와 같이 메탄올, 헥산, 클로로포름, 에틸아세테이트를 순차적으로 이용하여 추출액을 얻을 수 있다. 이때, 추출액은 농축하여 흑갈색의 유성 물질로 얻어진다.

단계 2는 상기 추출액을 크로마토그래피를 수행하는 것으로,

구체적으로, 상기 단계 1의 추출액을 클로로포름, 메탄올 또는 클로로포름과 메탄올의 혼합용매를 이동상으로 사용하여 칼럼 크로마토그래피로 분리하여 분획을 제조하는 단계(단계 2-1);

상기 단계의 분획을 n-헥산 또는 n-헥산과 에틸 아세테이트의 혼합용매를 이동상으로 사용하여 칼럼 크로마토그래피로 분리하여 분획을 제조하는 단계(단계 2- 2);

상기 단계의 분획을 메탄올 수용액을 이동상으로 사용하여 역상 고속칼럼 크로마토그래피로 분리하여 분획을 제조하는 단계(단계 2-3);및

상기 단계의 분획을 메탄올과 물의 혼합용매를 이동상으로 사용하여 역상고속칼럼 크로마토그래피로 정제하여 프탈레이트계 화합물을 제조하는 단계(단계 2-4)로 이루어진다.

상기 단계 2-1에서 이동상으로 클로로포름과 메탄올을 각각 사용하거나 또는 이를 혼합한 혼합용매를 이용하는데, 이때 클로로포름:메탄올의 혼합비는 -부피비로 100:0-0:100이다.

상기 단계 2-2에서 이동상으로 n-헥산을 사용하거나 n-헥산과 에틸 아세테이트의 혼합용매를 이용하는데, 이때 n-헥산:에탈 아세테이트의 혼합비는 부피비로 100-50:0-50이다.

상기 단계 2-3에서 이동상으로 메탄올 수용액을 이용하는데, 이때 물:메탄올의 혼합비는 부피비로 20:80가 바람직하다.

상기 단계 2-4에서 이동상으로 메탄올 수용액을 이용하는데, 이때 물:메탄올의 혼합비는 부피비로 10:90가 바람직하다.

상기와 같은 방법에 의해 건조된 반묘 1 kg 당 14 mg이상의 프탈레이트계 화합물을 얻을 수 있다.

또한, 본 발명은 화학식 1로 표시되는 프탈레이트계 화합물 또는 반묘 추출 물을 유효성분으로 함유하는 아실-코에이:콜레스테롤 전이효소 활성저해용 약학적 조성물을 제공한다.

화학식 1로 표시되는 프탈레이트계 화합물은 아실-코에이:콜레스테롤 전이효소(ACAT)에 대한 저해 활성을 측정하기 위해 쥐간 마이크로좀 ACAT, 사람 ACAT-1 및 사람 ACAT-2를 효소원으로 하여 콜레스테롤 용액과 (1-¹⁴C)올레일-CoA 용액이 반응하여 생성된 콜레스테릴 올레이트의 량을 측정한 결과, 화학식 1로 표시되는 프탈레이트계 화합물의 쥐간 ACAT, 사람 ACAT-1 및 사람 ACAT-2에 대한 IC₅₀치가 각각 287 μM, 177 μM, 131 μM로서, 아실-코에이:콜레스테롤 전이효소(ACAT)에 대한 우수한 저해 활성을 나타낸다. 따라서 본 발명에 의한 프탈레이트계 화합물은 아실-코에이:콜레스테롤 전이효소에 의해 유발되는 것으로 알려진 고지혈증, 동맥경화 등 순환계 질환을 예방 또는 치료하기 위해 사용될 수 있다.

본 발명에 의한 화합물 및 반묘 추출물은 임상투여시에 경구 또는 비경구로 투여가 가능하며 일반적인 의약품제제의 형태로 사용될 수 있다.

본 발명의 화합물 및 반묘 추출물은 실제 임상투여 시에 경구 및 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 하나 이상의 화학식 1의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구 투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔 (witepsol), 마크로골, 트윈 (tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세롤, 젤라틴 등이 사용 될 수 있다.

투약 단위는, 예를 들면 개별 투약량의 1, 2, 3 또는 4배로, 또는 1/2, 1/3 또는 1/4배를 함유할 수 있다. 개별 투약량은 바람직하기로는 유효 화합물이 1회에 투여되는 양을 함유하며, 이는 통상 1일 투여량의 전부, 1/2, 1/3 또는 1/4배에 해당한다.

화학식 1의 화합물의 유효용량은 0.1∼100 mg/kg이고, 바람직하기로는 0.5∼10 mg/kg 이며, 하루 1∼3 회 투여될 수 있다. 또한 반묘추출물의 경우 유효용량은 2∼20,000 mg/kg이고 바람직하기로는 10∼1,000 mg/kg이며, 하루 1∼3회 투여될 수 있다.

또한 본 발명의 화합물 및 반묘 추출물을 마우스에 경구 투여하여 독성 실험을 수행한 결과, 경구 독성시험에 의한 50 % 치사량 (LD₅₀)은 적어도 1000 mg/kg 이 상인 것으로 나타났다.

이하 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다.

단, 하기 실시예들은 본 발명을 예시하는 것으로 본 발명의 내용이 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 반묘추출물의 제조

건조된 반묘(한약사에서 구입) 500 g을 분쇄기를 사용하여 분쇄하여 분말로 만들었다. 반묘 분말을 메탄올 1.5 ℓ에 넣어 상온에서 24시간 동안 방치하였으며, 이후 메탄올 용액을 교반시키고 여과지로 여과하여 액상을 분리하였다. 상기와 같은 메탄올 추출 과정을 모두 2번 반복하여 액상만을 모으고 감압하에서 농축하였다.

상기에서 얻은 메탄올 추출물을 물 500 ㎖ 에 현탁시키고 여기에 다시 n-헥산 500 ㎖를 가한 다음 분별깔대기를 이용하여 헥산층을 분리하였다. 물층은 클로로포름을 가하여 다시 추출하고 분별깔대기를 이용하여 물층과 클로로포름층을 분리하였다. 물층은 에틸 아세테이트을 가하여 다시 추출하고 분별깔대기를 이용하여 물층과 에틸 아세테이트층을 분리하였다(도 1 참조)

상기 과정에서 얻은 헥산층 (9.4 g), 클로로포름층 (17.2 g), 에틸 아세테이트층(22.0 g) 및 물층(건조무게 측정 안함)에 대하여 각각 아실-코에이:콜레스테 롤 전이효소에 대한 저해 활성을 측정하였다. 각 분획에 대한 아실-코에이:콜레스테롤 전이효소에 대한 저해 활성은 하기 실험예의 방법에 의해 측정하였다.

실험 결과 에틸 아세테이트층에서 가장 강한 아실-코에이:콜레스테롤 전이효소에 대한 저해 활성이 나타났으므로, 에틸 아세테이트층을 감압하에서 농축, 건조시켜 흑갈색의 유성 (oily) 물질을 얻었다. 에틸 아세테이트 추출물은 다시 하기와 같은 방법에 의해 분리, 정제하였다.

<실시예 2> 반묘로부터 프탈레이트계 화합물의 분리 및 정제

(단계 1) 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 에틸아세테이트층을 얻었다.

(단계 2) 프탈레이트계 화합물의 분리 및 정제

(단계 2-1) 클로로포름과 메탄올의 비율을 변화시켜 가며 실리카겔 칼럼 크로마토그래피(실리카겔 : Merck, Art 9385, 칼럼 크기 : Ø 7.5 x 21.5 cm)를 실시하여 상기에서 얻은 에틸 아세테이트 추출물을 분리하였다. 그 결과 클로로포름 100%인 용매를 사용한 경우 활성물질이 가장 효과적으로 분리되었으며, 이 때 활성분획 8.8 g을 얻었다.

(단계 2-2) 이 활성분획을 다시 n-헥산과 에틸 아세테이트 용액의 비율을 변화시켜가며 실리카겔 칼럼 크로마토그래피 (실리카겔 : Merck, Art 9385, 칼럼 크기 : Ø 3.5 x 19.0 cm)를 실시하였다. n-헥산:에틸 아세테이트=2:1(v/v) 인 용매를 사용한 경우 활성물질이 가장 효과적으로 분리되어 1.2 g의 활성분획을 얻었다.

(단계 2-3) 이 활성분획에 대하여 다시 물 과 메탄올 용액을 이동상으로 사용한 역상 C-18 칼럼 크로마토그래피 (C-18 : Merck, 칼럼 크기 : Ø 2.0 x 15.0 cm)를 실시하였다. 물:메탄올=1:4(v/v)인 용매를 사용한 경우 활성물질이 가장 효과적으로 분리되었다.

(단계 2-4) 이 활성분획에 대하여 다시 물과 메탄올 용액을 이동상으로 사용한 고속 역상 크로마토그래피 (HPLC) (hydrosphere C18 : s-5㎛, 칼럼 크기 : Ø 250 x 20 mmI.D.)를 실시하였다. 물:메탄올=1:9(v/v)인 용매를 사용한 경우 활성물질이 가장 효과적으로 분리되었으며, 이 때 순수 활성물질 7 mg을 얻을 수 있었다

<실시예 3> 본 발명의 프탈레이트계 화합물의 구조 분석

상기 실시예 2를 통하여 얻은 물질은 VG 고분해능 GC/MS 분광기 (VG high resolution GC/MS spectrometer, Election Ionization MS, Autospec-Ultima)를 사용하여 분자량 및 분자식을 결정하였으며, 선광도는 편광기 (Jasco DIP-181 digital polarimeter)를 사용하여 측정하였다. 또한 핵자기 공명 (NMR) 분석 (Bruker AMX 300)을 통하여 ¹H NMR, ¹³C NMR, 호모-코지 (HOMO-COSY), HMQC (¹ H-Detected heteronuclear Multiple-Quantum Coherence), HMBC (Heteronuclear Multiple-Bond Coherence), DEPT (Distandtionless Enhancement by Polarization) 스펙트럼을 얻고, 분자구조를 결정하였다. 측정 결과는 하기와 같으며, 발표된 문 헌의 것과 비교 분석한 결과, 화학식 1의 화합물은 Mylate A 로 동정하였다.

Mylate A

1) 물성 : 무색 유액

2) 선광도 : [α]_D ²⁵ 0 (c = 0.6, CHCl₃)

3) 분자량: 418.56

4) 분자식: C₂₆H₄₂O₄

5) ¹H-NMR (CDCl₃, 500 MHz) δ 7.69 (2H, dd, J =4.1, 7.2 Hz, benzene), 7.51 (2H, dd, J =4.1, 7.2 Hz, benzene), 4.20 (4H, d, J =9.2 Hz, H-1 and H-1') 1.66 (2H, m, H-2 and H-2'), 1.42 (4H, m, H-3 and H-3'), 1.39 (4H, m, H-4 and H-4'),1.33 (4H, m, H-5 and H-5'), 1.29 (4H, m, H-6 and H-6'), 1.23 (4H , m, H-8 and H-8'), 0.90 (6H, t, J= 9.3Hz, H-7 and H-7'), 0.86 (6H, t, J= 7.8 Hz, H-9 and H-9')

6) ¹³C-NMR (CDCl₃, 75 MHz) δ 167.7 (C-10 and C-10') 132.4 (C-11 and C-11'), 130.8 (C-13 and C-13'), 128.8 (C-12 and C-12'), 68.1 (C-1 and C-1'), 38.7 (C-2 and C-2'), 30.3 (C-3 and C-3'), 29.7 (C-4 and C-4'), 28.9 (C-5 and C-5'), 22.9 (C-6 and C-6'), 23.7 (C-8 and C-8'), 14.1 (C-7 and C-7'), 10.9 (C-9 and C-9').

6)FAB-MS: m/z [M+H]⁺ 419 (5), 279 (80), 167 (85), 149 (100), 113 (65), 83(50), 71(70), 57(75).

<제제예 1> 정제의 제조방법

본 발명의 프탈레이트계 화합물 또는 약학적으로 허용가능한 그의 염을 유효성분으로 함유하는 정제는 하기와 같은 방법으로 제조하였다.

실시예 2의 화합물을 체질하고, 락토오스, 전분 및 전젤라틴화 옥수수 전분과 혼합한 후, 적합한 용적의 정제수를 첨가하고 분말로 과립화시켰다. 과립을 건조시킨 후 스테아르산마그네슘과 혼합하고 압착하여 정제를 얻었다.

상기 정제의 구성성분은 하기와 같다.

실시예 2의 화합물 5.0 mg

락토오스 BP 150.0 mg

전분 BP 30.0 mg

전젤라틴화 옥수수 전분 BP 15.0 mg

스테아르산 마그네슘 1.0 mg

<제제예 2> 캡슐제의 제조방법

본 발명의 프탈레이트계 화합물 또는 약학적으로 허용가능한 그의 염을 유효성분으로 함유하는 캡슐제는 하기와 같은 방법으로 제조하였다.

실시예 2의 화합물을 일정량의 부형제 및 스테아르산마그네슘과 혼합하였다. 얻어진 혼합물을 젤라틴 캡슐 중에 충전하여 캡슐을 수득하였다.

상기 캡슐제의 구성성분은 하기와 같다.

실시예 2의 화합물 5.0 mg

전분 1500 100.0 mg

스테아르산마그네슘 BP 1.0 mg

<제제예 3> 주사액제의 제조방법

본 발명의 프탈레이트계 화합물 또는 약학적으로 허용가능한 그의 염을 유효성분으로 함유하는 주사액제는 하기와 같은 방법으로 제조하였다.

적당한 용적의 주사용 염화나트륨 BP 중에 실시예 2의 화합물을 용해시키고, 생성된 용액의 pH를 묽은 염산 BP를 사용하여 pH 3.5로 조절하고, 이어서 주사용 염화나트륨 BP를 사용하여 용적을 조절하고 충분히 혼합하였다. 용액을 투명유리로된 5 ml 타입 I 앰플 중에 충전시키고, 유리를 용해시킴으로써 공기의 상부 격자하에 봉입시키고, 이어서 120℃로 15 분 이상 오토클래이브시켜 살균하여 주사액제를 얻었다.

상기 주사액제의 구성성분은 하기와 같다.

실시예 2의 화합물 100 ㎍/ml

묽은 염삼 BP pH 3.5로 될 때까지

주사용 염화나트륨 BP 최대 1 ml

<실험예 1> 아실-코에이:콜레스테롤 전이효소에 대한 저해 활성

하기와 같은 실험을 통하여, 반묘에서 분리한 상기 Mylate A의 아실-코에이:콜레스테롤 전이효소에 대한 저해 활성을 조사하였다.

(단계 1) ACAT 효소원의 제조

ACAT 효소원으로는 흰 쥐(male Sprague-Dawley 150∼200 g)의 간을 적출하였다. 1 g의 간을 5 ml의 균질화 용액(0.1 M KH₂PO₄, pH 7.4, 0.1 mM EDTA 및 10 mM β-머캅토에탄올) 에 균질화하였다. 이 균질액을 4℃에서 3,000xg 로 10분 동안 원심분리하고, 얻어진 상층액을 4℃에서 15,000xg로 15분 동안 원심분리하여 상층액을 얻었다. 상층액을 초원심분리 튜브(Beckman)에 넣고, 4℃에서 100,000xg 로 1 시간 동안 원심분리하여 마이크로좀 펠렛을 얻은 후, 이를 3 ml의 균질화 용액에 현탁시키고 4℃에서 100,000xg로 1 시간 동안 원심분리하였다. 얻어진 펠렛을 1 ml의 균질화 용액에 현탁시켰다. 얻어진 현탁액중의 단백질 농도를 로우리(Lowry) 등의 방법으로 측정하고, 단백질 농도를 4 내지 8 ㎎/㎖로 조절하였다. 얻어진 현탁액을 딥 프리저(Biofreezer, Fandma Scientific Inc.)에 보관하였다.

사람 ACAT-1과 ACAT-2의 활성에 미치는 영향을 알아보기 위하여 베큘로바이러스 발현체제를 이용하여 사람 ACAT-1과 ACAT-2 단백질을 얻었다. 먼저, 사람 간 cDNA library screening을 통하여 얻어진 hACAT-1과 hACAT-2의 cDNA를 베큘로바이러스 전달 벡터에 삽입하고, 곤충세포인 sf9 세포에 도입하여 바이러스를 제조하였 다. 그 후, 플라크 정제(plaque purification) 방법으로 사람 ACAT-1과 ACAT-2의 재조합 바이러스를 분리한 후 3 차례의 증폭과정을 거쳐 viral stock의 titer를 높였다. 단백질 발현효율이 좋은 Hi5 곤충세포에 재조합 바이러스를 감염다중도(Mutiplicity of Infection)가 1이 되도록 감염시킨 후 27℃에서 하루 동안 진탕배양하였다. 이렇게 hACAT-1과 hACAT-2가 각각 과량 발현된 Hi5 세포들로부터 마이크로좀 분획을 분리하기 위하여 500×g에서 15 분간 원심분리하여 세포들을 모으고 hypotonic buffer에서 급냉동 급해동 방법으로 세포를 깬 후 100,000×g에서 한 시간 동안 초원심분리하였다. 얻어진 마이크로좀 분획들은 단백질 농도가 8 ㎎/㎖이 되도록 hypotonic buffer로 현탁하여 사용 전까지 저온냉동고에 보관하였다.

(단계 2) ACAT 활성 측정

아세톤에 1 ㎎/㎖의 농도로 용해된 콜레스테롤 용액 6.67 ㎕를 아세톤중의 10 % 트리톤 WR-1339(Sigma Co.) 6 ㎕와 혼합하고, 질소가스를 이용하여 아세톤을 증발시켜 제거하였다. 얻어진 혼합물에 증류수를 가하여 콜레스테롤의 농도가 30 ㎎/㎖가 되도록 조절하였다.

10 ㎕의 생성된 콜레스테롤 수용액에 10 ㎕의 1 M KH₂PO₄(pH 7.4), 5 ㎕의 0.6 mM 우 혈청 알부민(BSA), 10 ㎕의 (단계 1)에서 얻은 마이크로좀 용액 및 55 ㎕의 증류수를 가하였다(총 90 ㎕). 혼합물을 37℃ 수욕에서 30 분 동안 예비 반 응시켰다.

10 ㎕의 (1-¹⁴C)올레일-CoA 용액(0.05 μCi, 최종 농도: 10 μM)을 예비 반응된 혼합물에 가하고, 생성된 혼합물을 37℃ 수욕에서 30 분동안 반응시켰다. 혼합물에 500 ㎕의 이소프로판올:헵탄 혼합물(4:1(v/v)), 300 ㎕의 헵탄 및 200 ㎕의 0.1 M KH₂PO₄(pH 7.4)을 가하고, 혼합물을 볼텍스(vandtex)로 격렬하게 혼합한 후, 상온에서 2분 동안 방치하였다.

200 ㎕의 생성된 상층액을 신틸레이션 병에 넣고, 신틸레이션 액(Lumac) 4 ml을 가하였다. 이 혼합물의 방사선량을 1450 마이크로베타 액체 신틸레이션 계수기(1450 Microbeta liquid scintillation counter, Wallacoy, Finland)로 측정하였다. ACAT 활성은 1 분 동안 단백질 1 ㎎ 당 합성된 콜레스테릴 올레이트 피코몰(피코몰/분/㎎ 단백질)로 계산하였으며, Mylate A의 아실-코에이:콜레스테롤 전이효소에 대한 저해 활성을 하기 표 1에 나타내었다.

마이라 레이트 A 의 아실-코에이:콜레스테롤 전이효소에 대한 저해 활성

효소원	IC50 (μM)
쥐간 ACAT	281
사람 ACAT-1	177
사람 ACAT-2	131

상기 표 1에서 볼 수 있듯이, 본 발명에 의한 프탈레이트계 화합물은 쥐간 ACAT, 사람 ACAT-1, 사람 ACAT-2에 대한 IC₅₀치가 각각 281 μM, 177 μM, 131 μM 로 나타났으며, 특히 사람 ACAT-1에서 아실-코에이:콜레스테롤 전이효소에 대한 저 해 활성이 매우 우수함을 알 수 있었다. 따라서 본 발명에 의한 Mylate A는 콜레스테릴 에스터의 합성 및 축적으로 유발되는 고지혈증 및 동맥경화 등 순환계 질환의 예방제 또는 치료제로서 유용히 사용될 수 있다.

<실험예 2> 랫트에 대한 경구투여 급성 독성실험

한편 화학식 1의 화합물 및 이를 함유한 반묘 추출물의 급성 독성을 알아보기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다.

6주령의 특정병원부재(SPF) SD계 랫트를 사용하여 급성독성실험을 실시하였다. 군당 2마리씩의 동물에 실시예에서 얻어진 화합물 및 추출물 각각을 각각 0.5 % 메틸셀룰로오스 용액에 현탁하여 1 g/kg/15 ml의 용량으로 단회 경구투여하였다. 시험물질 투여후 동물의 폐사 여부, 임상증상 및 체중변화 등을 관찰하고 혈액학적 검사와 혈액생화학적 검사를 실시하였으며, 부검하여 육안으로 복강장기와 흉강장기의 이상여부를 관찰하였다.

시험 결과, 시험물질을 투여한 모든 동물에서 특기할 만한 임상증상은 없었고 폐사된 동물도 없었으며, 또한 체중변화, 혈액검사, 혈액생화학 검사, 부검소견 등에서도 독성변화는 관찰되지 않았다.

이상의 결과 실험된 화합물 및 추출물은 모두 랫트에서 1000 mg/kg까지 독성변화를 나타내지 않았으며, 경구 투여 최소치사량(LD₅₀)은 1000 mg/kg 이상인 안전한 물질로 판단되었다.

상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 프탈레이트계 화합물 및 이를 함유한 반묘 추출물은 아실-코에이:콜레스테롤 전이효소의 활성을 억제하는 효과가 우수하므로 콜레스테릴 에스터의 합성 및 축적으로 유발되는 것으로 알려진 고지혈증 및 동맥경화 등 순환계 질환의 예방 또는 치료를 목적으로 유용히 사용될 수 있다.

Claims (6)

1. 하기 화학식 1로 표시되는 프탈레이트계 화합물 또는 약학적으로 허용가능한 그의 염.

   [화학식 1]

   
2. 반묘를 헥산, 클로로포름, 에틸아세테이트, 메탄올 및 물로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 또는 하나 이상의 용매로 추출하여 추출액을 얻는 단계(단계 1); 및

   상기 추출액을 크로마토그래피를 수행하여 청구항 1항의 프탈레이트계 화합물을 분리하는 단계(단계 2)

   를 포함하는 것으로 이루어진 제1항의 프탈레이트계 화합물 또는 약학적으로 허용가능한 그의 염의 제조방법.
3. 제 2항에 있어서, 상기 단계 2가

   상기 단계 1의 추출액을 클로로포름, 메탄올 또는 클로로포름과 메탄올의 혼합용매를 이동상으로 사용하여 칼럼 크로마토그래피로 분리하여 분획을 제조하는 단계(단계 2-1);

   상기 단계의 분획을 n-헥산 또는 n-헥산과 에틸 아세테이트의 혼합용매를 이동상으로 사용하여 칼럼 크로마토그래피로 분리하여 분획을 제조하는 단계(단계 2-2);

   상기 단계의 분획을 메탄올 수용액을 이동상으로 사용하여 역상 고속칼럼 크로마토그래피로 분리하여 분획을 제조하는 단계(단계 2-3);및

   상기 단계의 분획을 메탄올과 물의 혼합용매를 이동상으로 사용하여 고속칼럼 크로마토그래피로 분리하여 프탈레이트계 화합물을 제조하는 단계(단계 2-4)

   로 이루어지는 것을 특징으로 하는 제1항의 프탈레이트계 화합물 또는 약학적으로 허용가능한 그의 염의 제조방법.
4. 청구항 1항의 프탈레이트계 화합물 또는 약학적으로 허용가능한 그의 염을 유효성분으로 함유하는 고지혈증 또는 동맥경화증의 예방 및 치료용 약학적 조성물.
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