KR100581433B1 - Composition for preventing secretion of immunoglobulin E-dependent histamine releasing factor - Google Patents
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Abstract
본 발명은 IgE-의존적 히스타민 방출 인자의 분비 억제용 조성물 및 그 약학적 용도에 관한 것이다.The present invention relates to a composition for inhibiting the secretion of IgE-dependent histamine releasing factor and a pharmaceutical use thereof.
본 발명의 조성물은 양성자 펌프 저해 활성을 지니는 벤즈이미다졸계 화합물을 유효성분으로 함유한다.The composition of the present invention contains a benzimidazole compound having a proton pump inhibitory activity as an active ingredient.
또한 본 발명의 조성물은 양성자 펌프 저해 활성을 지니는 페녹티민, 올레인산, 카테친, 스코파둘시올, 펜타갈로일 글루코스, 부파린, 그리고 마크로라이드계 항생제인 바필로마이신 및 콘카나마이신 중 선택된 하나 이상의 물질을 추가로 또는 단독으로 함유할 수 있다.In addition, the composition of the present invention is one or more substances selected from phenoxymin, oleic acid, catechin, scopadulsiol, pentagaloyl glucose, buparin, and macrolide antibiotics of the bacillomycin and concanamycin having a proton pump inhibitory activity May be contained additionally or alone.
본 발명의 조성물은 IgE-의존적 히스타민 방출 인자에 의해 유발되는 각종 알러지 질환 및 말라리아의 예방 및 치료용 약제학적 조성물로서 유용하게 사용될 수 있다. The composition of the present invention can be usefully used as a pharmaceutical composition for the prevention and treatment of various allergic diseases and malaria caused by IgE-dependent histamine releasing factor.
Description
도 1은 HRF가 다양한 알러지성 환자들의 혈액 중에 분비됨을 나타낸 도이다.1 is a diagram showing that HRF is secreted in the blood of various allergic patients.
도 2는 HRF가 알러지 유발물질에 의해 세포 외부로 분비됨을 나타낸 도이다.2 is a diagram showing that HRF is secreted out of the cell by the allergen.
도 3은 본 발명의 조성물이 시험관 내에서(in vitro) 알러지 유발물질에 의해 증가되는 HRF 분비를 억제함을 나타낸 도이다.3 is a diagram showing that the composition of the present invention inhibits HRF secretion increased by an allergen in vitro.
도 4는 본 발명의 조성물이 생체 내에서(in vivo) 알러지 유발물질에 의해 증가되는 혈중 HRF 농도를 감소시킴을 나타낸 도이다.4 is a diagram showing that the composition of the present invention reduces blood HRF concentrations increased by allergens in vivo.
도 5는 본 발명의 조성물이 알러지성 비염 증상의 발현을 억제함을 나타낸 도이다.5 is a diagram showing that the composition of the present invention inhibits the expression of allergic rhinitis symptoms.
도 6은 본 발명의 조성물이 알러지성 비염 마우스에서 호산구 수치의 증가를 감소시킴을 나타낸 도이다.Figure 6 shows that the composition of the present invention reduces the increase in eosinophil levels in allergic rhinitis mice.
본 발명은 IgE-의존적 히스타민 방출 인자(immunoglobulin E-dependent histamine releasing factor: 이하 'HRF'라 한다)의 분비 억제용 조성물 및 그 약학적 용도에 관한 것이다.The present invention relates to a composition for inhibiting the secretion of IgE-dependent histamine releasing factor (hereinafter referred to as 'HRF') and its pharmaceutical use.
HRF는 알러지 반응 중 IgE-의존적 후기 반응(late phase reaction, 이하 'LPR' 이라 한다)에서 중요한 역할을 수행하며, 호염기구(basophil)를 자극하여 히스타민 분비를 유도함으로써, 다양한 알러지 질환을 매개하는 것으로 알려져 있다(McDonald et al., 1995).HRF plays an important role in the IgE-dependent late reaction (LPR) during allergic reactions and mediates various allergic diseases by stimulating basophils to induce histamine secretion. Known (McDonald et al., 1995).
또한 HRF는 말라리아 모기에서 항말라리아제인 아르테미시닌(Artemisinin)과 결합하는 일종의 종양 단백질인 것으로도 알려져 있다(Bhisutthibhan, 1998).HRF is also known to be a type of tumor protein that binds to the antimalarial artemisinin in malaria mosquitoes (Bhisutthibhan, 1998).
HRF가 유발하는 히스타민성 알러지 질환으로는 아나필락시스(anaphylaxis), 천식, 담마진, 알러지성 비염, 알러지성 기관지확장증, 건초열(hay fever), 아토피성 피부염 등이 있으며, 특히 환경 오염으로 인해 다양한 알러젠에 노출될 확률이 급증하면서 알러지 질환은 더욱 증가하는 추세이다. HRF-induced histamine allergic diseases include anaphylaxis, asthma, gallbladder, allergic rhinitis, allergic bronchiectasis, hay fever, and atopic dermatitis, especially exposure to various allergens due to environmental pollution Allergic diseases are on the rise as the probability of becoming a sudden increase.
HRF는 친수성이며, 세포 밖으로 방출되는 단백질이 일반적으로 지니는 신호 펩타이드(signal peptide)를 갖고 있지 않은 세포질 단백질이다. 그러나 세포 외부에서도 HRF가 검출된다는 연구 결과가 보고된 바 있으며(McDonald et al., 1995), HRF는 세포 외부에서 IgE-감작된(sensitized) 호염기구를 자극하여 히스타민을 분비하게 한다는 사실이 밝혀졌다.HRF is a cytoplasmic protein that is hydrophilic and does not have a signal peptide, which is usually a protein released outside the cell. However, studies have reported that HRF is detected outside of cells (McDonald et al., 1995), and HRF stimulates IgE-sensitized basophils to secrete histamine. .
따라서, 세포질 단백질인 HRF가 세포 외부로 분비되는 기작을 밝히고, 그 과정을 차단할 수 있는 물질을 개발함으로써, HRF가 유발하는 다양한 질환을 예방하고 억제하려는 노력이 진행되어 왔다.Therefore, efforts to prevent and suppress various diseases caused by HRF have been progressed by elucidating the mechanism by which HRF, a cellular protein, is secreted to the outside of the cell, and developing a material capable of blocking the process.
현재까지 HRF처럼 신호 펩타이드를 가지고 있지 않으면서 세포 외부에서도 검출되는 분자로, 염기성 섬유모세포 성장 인자(basic fibroblast growth factor(FGF-2)), plasminogen activator inhibitor 2(PAI 2), 탄수화물 결합 단백질(carbohydrate-binding protein 30(CBP 30)) 등이 알려져 있다. It is a molecule that is detected outside the cell without a signal peptide like HRF until now, such as basic fibroblast growth factor (FGF-2), plasminogen activator inhibitor 2 (PAI 2), carbohydrate-binding protein (carbohydrate) -binding protein 30 (CBP 30)).
이들의 분비 경로에 대해서는 아직도 정확히 밝혀지지 않았으나, 최근 나트륨/칼륨 펌프(Na,K-ATPase pump)가 유력한 FGF-2 방출 경로일 수 있다는 연구결과가 발표된 바 있다(Florkiewicz RZ, 1998).Their secretion pathways are still unclear, but studies have recently published that sodium / potassium pumps (Na, K-ATPase pumps) may be a potent FGF-2 release pathway (Florkiewicz RZ, 1998).
이러한 사실에 착안한 본 발명자들은 HRF 또한 펌프를 경유하여 분비될 수도 있을 것이라 가정하여, HRF의 분비 경로를 밝히고, HRF 분비를 억제할 수 있는 조성물을 발명하였다.In view of this fact, the inventors have invented a composition capable of revealing the secretion pathway of HRF and suppressing HRF secretion, assuming that HRF may also be secreted via a pump.
본 발명에서는 HRF 분비 억제용 조성물 및 그 약학적 용도를 제공하고자 한다.In the present invention, to provide a composition for inhibiting HRF secretion and its pharmaceutical use.
본 발명은 IgE-의존적 히스타민 방출 인자의 분비 억제용 조성물 및 그 약학적 용도를 제공한다.The present invention provides a composition for inhibiting the secretion of IgE-dependent histamine releasing factor and its pharmaceutical use.
본 발명의 조성물은 양성자 펌프(proton pump) 저해 활성을 지니는 벤즈이미다졸계 화합물(benzimidazolic compound)을 유효성분으로 함유한다.The composition of the present invention contains a benzimidazole compound having a proton pump inhibitory activity as an active ingredient.
본 발명에서 '양성자 펌프'는 농도 구배에 역행하여 수소이온(H+)을 세포막 밖으로 능동수송하는 막단백질인 H+-K+ ATPase를 의미한다.In the present invention, 'proton pump' means a membrane protein H + -K + ATPase that actively transports hydrogen ions (H + ) out of the cell membrane in response to a concentration gradient.
본 발명에서 벤즈이미다졸계 화합물은 치환된 벤즈이미다졸 링, 피리딘(pyridine) 고리 및 그 사이에 위치하는 메칠설피닐기(methylsulfinyl group)로 이루어진 지질 용해성 약염기로, 하기 화학식 1의 구조를 지닌다.In the present invention, the benzimidazole-based compound is a lipid soluble weak base composed of a substituted benzimidazole ring, a pyridine ring, and a methylsulfinyl group positioned therebetween, and has a structure of
식 1에서 Het1은 
본 발명에서 벤즈이미다졸계 화합물은 구체적으로 오메프라졸(omeprazole), 란소프라졸(lansoprazole), 판토프라졸(pantoprazole), 라베프라졸(rabeprazole) 중에서 선택된 하나 이상이 될 수 있다.In the present invention, the benzimidazole-based compound may be at least one selected from omeprazole, lansoprazole, pantoprazole, and rabeprazole.
본 발명에서 벤즈이미다졸계 화합물은 상기 물질 외에 이들의 유도체 및 이성질체가 될 수 있으며, 구체적으로 히드록시-오메프라졸, 히드록시-란소프라졸, 오메프라졸의 카르복실산 유도체, 데스메틸-판토프라졸, 에소메프라졸 (esomeprazole) 등이 될 수 있다. Benzimidazole-based compounds in the present invention may be derivatives and isomers thereof in addition to the above materials, specifically, hydroxy-omeprazole, hydroxy-lansoprazole, carboxylic acid derivatives of omeprazole, desmethyl-pantoprazole, esome Esomeprazole, and the like.
본 발명의 벤즈이미다졸계 화합물은 양성자 펌프를 저해함으로써, 세포 외부로 HRF가 분비되는 것을 억제한다. 이는 양성자 펌프가 HRF의 분비 과정에 관여하기 때문이다.The benzimidazole-based compound of the present invention inhibits the proliferation of HRF by inhibiting the proton pump. This is because the proton pump is involved in the secretion process of HRF.
따라서 본 발명의 조성물을 사용하면 히스타민 농도를 증가시키는 알러지 유발물질에 의한 HRF 분비를 억제할 수 있다.Therefore, the use of the composition of the present invention can suppress the HRF secretion by allergens that increase the histamine concentration.
특히 본 발명의 조성물은 C48/80에 의한 HRF 분비를 억제하여 혈중 HRF 및 히스타민의 농도를 감소시킴으로써, C48/80에 의한 전신성 아나필락시 반응에 의한 사망 확률을 현저히 감소시킨다.In particular, the compositions of the present invention inhibit HRF secretion by C48 / 80, thereby reducing the concentrations of HRF and histamine in the blood, thereby significantly reducing the probability of death from systemic anaphylactic reactions by C48 / 80.
본 발명의 조성물은 혈중에 존재하는 HRF와 히스타민의 양을 감소시킴으로써, 알러지 유발물질에 의해 일어나는 전신성 아나필락시 반응에 의한 사망 확률을 현저히 감소시키고, 알러지성 비염의 증상을 효과적으로 완화시킨다.The compositions of the present invention reduce the amount of HRF and histamine present in the blood, thereby significantly reducing the probability of death from systemic anaphylactic reactions caused by allergens and effectively alleviating the symptoms of allergic rhinitis.
또한 본 발명의 조성물은 알러지성 비염 마우스 모델에서 알러지성 비염의 증상 발현과 조직학적 변화를 감소시키는 효과가 있다.In addition, the composition of the present invention has the effect of reducing the onset of symptoms and histological changes in allergic rhinitis mouse model.
따라서 본 발명의 조성물은 HRF에 의해 유발되는 각종 알러지 질환, 즉 아스피린과 같은 약물 또는 음식에 의한 천식이나 알러지성 기관지 천식 등을 포함하는 천식, 담마진, 아나필락시, 알러지성 비염, 알러지성 기관지 확장증, 건초열, 아토피성 피부염과, 말라리아의 예방 및 치료를 위한 약제학적 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.Therefore, the composition of the present invention is a variety of allergic diseases caused by HRF, namely, asthma, including aspirin or allergic bronchial asthma by drugs or foods, such as amarine, anaphylaxis, allergic rhinitis, allergic bronchiectasis, hay fever It can be usefully used as a pharmaceutical composition for the prevention and treatment of atopic dermatitis and malaria.
본 발명의 조성물은 상기 물질들과 동일 또는 유사한 기능을 지닌 물질을 추 가의 유효성분으로, 또는 단독의 유효성분으로 함유할 수 있으며, 구체적으로는 양성자 펌프 저해 활성을 지니는 것으로 알려진 페녹티민(fenoctimine), 올레인산(oleic acid), 카테친(catechin), 스코파둘시올(scopadulciol), 펜타갈로일 글루코스(pentagalloyl glucose), 부파린(bufalin), 그리고 마크로라이드(macrolide)계 항생제인 바필로마이신(bafilomycin) 및 콘카나마이신(concanamycin) 중 선택된 하나 이상의 물질을 추가로 또는 단독으로 함유할 수 있다.The composition of the present invention may contain a substance having the same or similar function as the above substances as an additional active ingredient, or as an active ingredient alone, specifically, fenoctimine known to have a proton pump inhibitory activity. Oleic acid, catechin, scopadulciol, pentagalloyl glucose, bufalin, and macrolide antibiotic bafilomycin ) And concanamycin may additionally or alone be included.
본 발명의 조성물은 필요에 따라 상기 물질들과 상이한 기능을 지닌 물질을 유효성분으로서 추가로 함유할 수 있다.The composition of the present invention may further contain a substance having a different function from the above substances as an active ingredient, if necessary.
본 발명의 조성물은 상기 유효성분 이외에, 약제학적으로 적합하며 생리학적으로 허용되는 보조제를 사용하여 제조될 수 있으며, 상기 보조제로는 용매, 붕해제, 감미제, 결합제, 피복제, 팽창제, 윤활제, 활택제 또는 향미제 등의 가용화제를 사용할 수 있다.The composition of the present invention, in addition to the active ingredient, may be prepared using a pharmaceutically suitable and physiologically acceptable adjuvant, and the adjuvant may include a solvent, a disintegrant, a sweetener, a binder, a coating agent, an expanding agent, a lubricant, a lubricant. Solubilizers, such as an agent or a flavoring agent, can be used.
본 발명의 조성물은 투여를 위해 상기 기재한 유효성분 이외에, 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 추가로 포함하여 제제화할 수 있다.The composition of the present invention may be formulated to include one or more additional pharmaceutically acceptable carriers, in addition to the active ingredients described above for administration.
약제학적으로 허용 가능한 담체는 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 하나 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 더 나아가 당분야의 적정한 방법으로, 또는 Remington's Pharmaceutical Science(최근판), Mack Publishing Company, Easton PA에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라, 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.Pharmaceutically acceptable carriers may be used in combination with saline, sterile water, Ringer's solution, buffered saline, dextrose solution, maltodextrin solution, glycerol, ethanol and one or more of these components, as necessary, including antioxidants, buffers, Other conventional additives such as bacteriostatic agents can be added. Diluents, dispersants, surfactants, binders and lubricants may also be added in addition to formulate into injectable formulations, pills, capsules, granules or tablets such as aqueous solutions, suspensions, emulsions and the like. Furthermore, it may be preferably formulated according to each disease or component by a suitable method in the art or using a method disclosed in Remington's Pharmaceutical Science (Recent Edition), Mack Publishing Company, Easton PA.
본 발명의 조성물의 제제 형태는 과립제, 산제, 피복정, 정제, 캡슐제, 좌제, 시럽, 즙, 현탁제, 유제, 점적제 또는 주사 가능한 액제 및 활성 화합물의 서방출형 제제 등이 될 수 있다.Formulation forms of the compositions of the invention may be granules, powders, coated tablets, tablets, capsules, suppositories, syrups, juices, suspensions, emulsions, drops or injectable solutions and sustained release formulations of the active compounds, and the like. .
본 발명의 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구, 정맥내, 동맥내, 복강내, 근육내, 동맥내, 복강내, 흉골내, 경피, 비측내, 국소, 직장, 또는 피내 경로를 통해 통상적인 방식으로 투여할 수 있다.The compositions of the present invention may be administered in a conventional manner via oral, intravenous, intraarterial, intraperitoneal, intramuscular, intraarterial, intraperitoneal, intrasternal, transdermal, nasal, topical, rectal, or intradermal routes. Can be administered.
본 발명의 조성물의 투여량은 판토프라졸을 유효성분으로 함유하는 경우, 래트나 마우스일 때에는 체중 1㎏ 당 10㎎을, 사람일 때에는 체중 1㎏ 당 100 μg∼1㎎을 사용하는 것이 바람직하다. 본 발명의 약제학적 조성물의 투여량은 질환의 종류, 질환의 중증도, 조성물에 함유된 유효성분 및 다른 성분의 종류 및 함량, 제형의 종류 및 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절될 수 있다.When the dosage of the composition of the present invention contains pantoprazole as an active ingredient, it is preferable to use 10 mg per 1 kg of body weight for rats or mice, and 100 μg to 1 mg per 1 kg of body weight for humans. . The dosage of the pharmaceutical composition of the present invention may include the type of disease, the severity of the disease, the type and amount of the active ingredient and other ingredients contained in the composition, the type of formulation and the age, weight, general health condition, sex and diet of the patient, It may be adjusted according to various factors including the time of administration, the route of administration and the rate of secretion of the composition, the duration of treatment, and the drugs used simultaneously.
본 발명의 조성물은 이전부터 이미 위궤양, 십이지장 궤양, 졸링거-엘리슨 증후군이나 역류성 식도염 치료에 사용되고 있는 약물로 그 안전성이 입증된 바 있으며, 생체에 별다른 부작용을 미치지 않는다.The composition of the present invention has already been proved as a drug that is already used for the treatment of gastric ulcer, duodenal ulcer, Solinger-Elison syndrome or reflux esophagitis, and has no adverse side effects on the living body.
본 발명의 조성물은 단독으로, 또는 식이요법, 화학 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병행하여 사용할 수 있다.The compositions of the present invention can be used alone or in combination with methods using diet, chemotherapy and biological response modifiers.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 보다 상세히 설명하지만, 이것은 본 발명의 이해를 돕기 위한 것일 뿐, 하기 실시예에 본 발명의 범위가 국한되는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples, but this is only for better understanding of the present invention, and the scope of the present invention is not limited to the following Examples.
[실시예 1] 본 발명의 조성물에 의한 HRF 분비 억제 효과Example 1 HRF Secretion Inhibitory Effect by the Composition of the Present Invention
본 발명의 조성물에 의한 HRF 분비 억제 효과를 확인하기 위해, 우선 HRF 분비와 알러지 증상, 그리고 알러지 유발물질과의 상호 관계를 밝힌 후, 본 발명의 조성물이 HRF의 분비에 미치는 효과를 확인하였다.In order to confirm the inhibitory effect of HRF secretion by the composition of the present invention, first revealed the correlation between HRF secretion, allergic symptoms, and allergens, and then confirmed the effect of the composition of the present invention on the secretion of HRF.
1) HRF 분비와 알러지 증상, 그리고 알러지 유발물질과의 상호 관계 확인1) Identify the relationship between HRF secretion and allergic symptoms and allergens
HRF 분비와 알러지 증상, 그리고 알러지 유발물질과의 상호 관계를 다음과 같이 확인하였다.The relationship between HRF secretion, allergic symptoms, and allergens was as follows.
1-1) 다양한 알러지 증상에서 HRF의 분비 증가 확인1-1) Confirmation of increased HRF secretion in various allergic symptoms
다양한 알러지 증상에서 HRF의 분비가 증가함을 확인하기 위해, 아스피린 투여에 의해 천식 반응을 나타내는 환자, 아스피린 이외의 다른 알러젠에 의해 천식 반응을 나타내는 환자, 알러지성 기관지 천식 환자, 음식 섭취 후 운동에 의한 아나필락시스 반응(food-dependent exercise-induced anaphylaxis)을 나타내는 환자, 담마진 환자 등 다양한 형태의 알러지 환자를 선택하여, HRF의 분비 증가를 확인하 였다.To confirm the increased secretion of HRF in various allergic symptoms, patients with asthma reactions by aspirin administration, patients with asthma reactions by allergens other than aspirin, allergic bronchial asthma patients, and after exercise Various types of allergic patients were selected, including patients with food-dependent exercise-induced anaphylaxis and gall bladder, to confirm increased HRF secretion.
아스피린 투여에 의해 천식 반응을 나타내는 환자의 경우, 아스피린 투여 직후와 어느 정도 시간이 지난 후에 모두 천식 반응을 나타내는 양성 반응(dual response) 환자와, 아스피린 투여 직후에만 천식 반응을 나타내는 조기 반응(early response) 환자의 두 군으로 분류하였다.Patients with asthma response by aspirin administration, positive response patients with asthma reactions both immediately after aspirin administration and after some time, and early response with asthma reaction only immediately after aspirin administration The patients were divided into two groups.
혈중 HRF의 존재를 확인하기 위해 각 환자로부터 소량의 혈청을 얻었으며, 아스피린이 아닌 다른 알러젠에 대해 알러지 반응을 나타내는 환자의 경우, 알러젠에 노출되지 않은 상태일 때 혈청을 채취하였다. 대조군으로 알러지 반응을 나타내지 않는 정상인의 혈청도 함께 채취하였다.A small amount of serum was obtained from each patient to confirm the presence of HRF in the blood. Serum was collected when the patient was allergic to allergens other than aspirin. As a control group, serum of normal persons without allergic reactions was also collected.
각 군의 혈청을 동량의 4 ×시료 완충액과 혼합하였으며, 이때 사용한 시료 완충액은 글리세롤의 비율을 반으로 하여 전기영동시 밴드가 끌리는 현상을 방지하도록 하였다. 상기 시료 혼합액을 3분간 끓는 물에 넣어 변성시키고 잠시 얼음에서 식힌 후, 5분간 12000rpm에서 원심분리하여 상등액만을 취하였다.Serum of each group was mixed with the same amount of 4 × sample buffer, and the sample buffer used was half the ratio of glycerol to prevent the band dragging during electrophoresis. The sample mixture was denatured in boiling water for 3 minutes, cooled in ice for a while, and centrifuged at 12000 rpm for 5 minutes to obtain only the supernatant.
상기와 같이 준비된 시료에 대해, 실시예 1의 2-1)과 마찬가지의 방법에 의해 웨스턴 분석을 수행하고, 그 결과를 도 1에 나타내었다.On the sample prepared as above, Western analysis was performed by the same method as 2-1) of Example 1, and the result is shown in FIG.
도 1에 나타난 바와 같이, 아스피린 투여에 대한 양성 반응 환자(a)와, 조기 반응 환자(b), 아스피린 이외의 다른 알러젠에 의한 천식 환자(c), 알러지성 기관지 천식 환자(d), 음식 섭취 후 운동에 의한 아나필락시스 반응을 나타내는 환자(e), 담마진 환자(f)의 혈청에서는 모두 높은 농도의 HRF가 검출되었다. 반면 정상인의 혈청에서는 HRF가 거의 검출되지 않았다(g).As shown in FIG. 1, patients positively responding to aspirin administration (a), patients with early response (b), asthma patients with allergens other than aspirin (c), allergic bronchial asthma patients (d), and food intake High concentrations of HRF were detected in the sera of patients (e) and dwarf patients (f) who exhibited anaphylactic responses due to post-exercise. On the other hand, little HRF was detected in the serum of normal subjects (g).
이처럼 HRF는 다양한 알러지 환자에게서 검출되므로, HRF 분비는 알러지 반응에서 중요한 역할을 수행함을 알 수 있다.As HRF is detected in various allergic patients, HRF secretion plays an important role in allergic reactions.
1-2) C48/80에 의한 HRF의 분비 증가1-2) Increased secretion of HRF by C48 / 80
알러지 유발물질이 HRF의 분비에 미치는 영향을 확인하기 위해, 대표적인 알러지 유발물질인 C48/80(compound 48/80, Sigma)을 선택하여 다음과 같이 실험을 수행하였다.In order to determine the effect of allergens on the secretion of HRF, the experiment was performed by selecting a representative allergen C48 / 80 (compound 48/80, Sigma).
HRF 분비 세포 모델로 U-937 세포를 선택하여, 1% L-글루타민, 100U/㎖ 페니실린 및 100U/㎖ 스트렙토마이신, 10% 우태아혈청을 첨가한 RPMI 1640 배지에서 37℃, 5% CO2의 조건으로 배양하였다.U-937 cells were selected as an HRF secreting cell model, and 37 ° C., 5% CO 2 in RPMI 1640 medium with 1% L-glutamine, 100 U / ml penicillin and 100 U / ml streptomycin, 10% fetal bovine serum. Cultured under conditions.
U-937 세포의 배양액을 1000rpm에서 3분간 원심분리하여 세포를 수집하고, 인산완충액(phosphate buffered saline(PBS): 200㎎/ℓ염화칼륨, 200㎎/ℓ인산수소칼륨, 8g/ℓ염화나트륨, 1.15g/ℓ인산수소나트륨)로 1번 세척한 후, 다시 1000rpm에서 3분간 원심분리하여 세포를 수집하였다.Cells were collected by centrifuging the culture solution of U-937 cells at 1000 rpm for 3 minutes, phosphate buffered saline (PBS): 200 mg / L potassium chloride, 200 mg / L potassium hydrogen phosphate, 8 g / L sodium chloride, 1.15 g / l sodium hydrogen phosphate) once and then centrifuged again at 1000 rpm for 3 minutes to collect the cells.
수집된 세포에 1% L-글루타민만을 첨가한 RPMI 배지를 가하고 흔들어 주면서 가라앉은 세포가 배지와 잘 섞이도록 한 후, 일부액을 취하여 트리판 블루(tryphan blue, Gibco BRL)로 염색하여 살아있는 세포의 수를 측정하였다. 6 웰 플레이트(well plate)에 웰당 106개의 세포를 깔아주고, 5시간 동안 37℃, 5% CO2의 조건에서 세포를 기아 상태 하에 방치하였다(cell starvation). 세포 기아가 끝난 후, 각 웰에 대해 C48/80(Sigma)을 0μg/㎖, 2μg/㎖, 4μg/㎖, 6μg/㎖, 8μg/㎖, 10μg/㎖ 농도로 30분간 처리하고 세포와 상등액(supernatant)을 따로 분리하여 취하였다.RPMI medium containing only 1% L-glutamine was added to the collected cells and shaken to allow the sunk cells to mix well with the medium, and then a portion of the solution was collected and stained with tryphan blue (Gibco BRL). The number was measured. 10 6 cells per well were placed in a 6 well plate and the cells were left under starvation at 37 ° C. and 5% CO 2 for 5 hours (cell starvation). After cell starvation, C48 / 80 (Sigma) was treated for 30 minutes at concentrations of 0 μg / ml, 2 μg / ml, 4 μg / ml, 6 μg / ml, 8 μg / ml, and 10 μg / ml for each well. supernatant) was taken separately.
상등액에 100mM PMSF, 1㎎/㎖ 아프로티닌(aprotinin), 1M 벤즈아미딘(benzamidine), 10㎎/㎖ 류펩틴(leupeptin)으로 구성된 단백질분해효소 저해제 혼합액(protease inhibitors cocktail)을 첨가하여, 원심력을 이용한 농축기(centricon, Sartorius)로 4℃, 12000rpm에서 수시간 원심분리하여 처음 부피의 1/100로 농축하였다.Centrifugal force was added to the supernatant by adding a protease inhibitors cocktail consisting of 100 mM PMSF, 1 mg / ml aprotinin, 1M benzamidine, and 10 mg / ml leupeptin. Centrifuge for several hours at 12000 rpm at 4 ° C. with a centrifuge (centricon, Sartorius), and concentrated to 1/100 of the initial volume.
농축액에 4 ×시료 완충액(sample buffer: 1M 트리스(pH 6.8), 10% SDS, 100% 글리세롤(glycerol), 여러 방울의 브롬페놀 블루(bromphenol blue), 소량의 베타 머캡토에탄올(β-mercaptoethanol), 3차증류수)을 첨가하고, 끓는 물에 10분간 담가 변성시킨 후, 즉시 얼음으로 옮겨 변성된 단백질이 원래의 상태로 복귀하는 것을 방지하였다.4 × sample buffer (1M Tris, pH 6.8), 10% SDS, 100% glycerol, several drops of bromphenol blue, small amount of beta mercaptoethanol (β-mercaptoethanol) , Tertiary distilled water) was added, soaked in boiling water for 10 minutes, and then denatured immediately to ice to prevent the denatured protein from returning to its original state.
이러한 과정을 통하여 얻어진 시료를 15% SDS-PAGE 젤을 이용하여 전기영동한 후, 니트로셀룰로스 막(nitrocellulose membrane)에 전이시켜 웨스턴 블롯팅(Western blotting) 방법으로 분석하였다.The sample obtained through this process was electrophoresed using 15% SDS-PAGE gel, and then transferred to a nitrocellulose membrane and analyzed by Western blotting method.
웨스턴 분석시 일차항체는 항토끼 폴리클로날 HRF 항체(anti-rabbit polyclonal HRF antibody)를 1:4000으로 트리스 완충액에 희석하여 사용하고, 이차항체는 항토끼-HRP 항체(anti-rabbit horseradish peroxidase antibody)를 1:10000으로 트리스 완충액에 희석하여 사용하였다. 이후, 세척된 막에 대해 이미지 분석 기계를 이용하여 단백질 밴드를 확인하고, 그 결과를 도 2에 나타내었다.In Western analysis, the primary antibody is used by diluting the anti-rabbit polyclonal HRF antibody at 1: 4000 in Tris buffer, and the secondary antibody is the anti-rabbit horseradish peroxidase antibody. Was used diluted to Tris buffer at 1: 10000. The protein bands were then identified using an image analysis machine for the washed membrane, and the results are shown in FIG. 2.
도 2에 나타난 바와 같이, 알러지 유발물질 C48/80은 농도의존적으로 HRF의 분비를 증가시켰다. 이러한 특성으로 인해, C48/80은 이후의 실시예에서 HRF 분비 증가제로 사용되었다.As shown in FIG. 2, allergen C48 / 80 increased HRF secretion in a concentration-dependent manner. Because of this property, C48 / 80 was used as an HRF secretion enhancer in later examples.
2) 본 발명의 조성물 제조2) Preparation of the composition of the present invention
본 발명의 조성물은 오메프라졸(Sigma)을 에탄올에 13mM의 농도로 녹여 제조하였다.The composition of the present invention was prepared by dissolving omeprazole (Sigma) in ethanol at a concentration of 13 mM.
본 발명의 조성물을 세포에 처리할 때는 오메프라졸의 최종농도가 10μM, 100μM 이 되도록 하였다.When the composition of the present invention is treated to cells, the final concentration of omeprazole is set to 10 μM and 100 μM.
3) 본 발명의 조성물에 의한 HRF 분비 억제 효과3) HRF secretion inhibitory effect by the composition of the present invention
본 발명의 조성물에 의한 HRF 분비 억제 효과를 다음과 같이 확인하였다.The inhibitory effect of HRF secretion by the composition of this invention was confirmed as follows.
상기 실시예 1의 1-2)과 마찬가지의 방법으로 6 웰 플레이트에 세포를 깔고 5시간 동안 기아상태에서 방치한 후, 아무 것도 처리하지 않은 군, C48/80을 10μg/㎖ 처리한 군, 오메프라졸을 각각 10μM, 100μM 처리한 군, 오메프라졸 10μM과 C48/80 10μg/㎖를 같이 처리한 군, 오메프라졸 100μM과 C48/80 10μg/㎖을 같이 처리한 군을 각각 준비하여, 세포와 상등액을 따로 분리하여 취하였다.After laying cells in a 6-well plate in the same manner as in Example 1-2) and left in starvation for 5 hours, the group treated with nothing, C48 / 80 treated with 10 μg / ml, omeprazole 10μM, 100μM treated group, omeprazole 10μM and C48 / 80 10μg / ㎖ treated group, omeprazole 100μM and C48 / 80 10μg / ㎖ respectively prepared groups, the cells and the supernatant were separated separately Was taken.
수집된 세포는 인산완충액으로 1번 세척하고 12000rpm에서 10분간 원심분리하여 다시 가라앉힌 후, 세포 용균 완충액(cell lysis buffer: 20mM 트리스(pH 7.4), 150mM 염화나트륨, 5mM EDTA, 0.5% 디옥시콜레이트(deoxycholate), 2mM EGTA, 1% NP40, 단백질 분해효소 혼합액)에 재현탁시켜 볼텍싱(vortexing)하였다.The collected cells were washed once with phosphate buffer and centrifuged at 12000 rpm for 10 minutes to settle again, followed by cell lysis buffer (20 mM Tris, pH 7.4), 150 mM sodium chloride, 5 mM EDTA, 0.5% deoxycholate ( deoxycholate), 2 mM EGTA, 1% NP40, protease mixture solution) and vortexed.
상기 세포혼합액을 30분간 얼음에 방치하면서 2∼3회 정도 볼텍싱한 후, 12000rpm에서 10분간 원심분리하여 상등액을 취하였다. 상등액의 일부를 취하여 브래드포드 방법(Bradford assay)으로 단백질을 정량한 후, 같은 양의 단백질을 포함하는 상등액에 4 ×시료 완충액을 가하고 10분간 끓여서 식혀 전기영동할 시료를 준비하였다. 상기 실시예 1의 1-2)와 마찬가지의 방법에 의해 웨스턴 분석을 수행한 후, 그 결과를 도 3에 나타내었다.The cell mixture was vortexed 2 to 3 times while standing on ice for 30 minutes, followed by centrifugation at 12000 rpm for 10 minutes to obtain a supernatant. After taking a portion of the supernatant, the protein was quantified by the Bradford assay, 4 × sample buffer was added to the supernatant containing the same amount of protein, and boiled for 10 minutes to prepare a sample for electrophoresis. After Western analysis was performed in the same manner as in Example 1-2, the results are shown in FIG. 3.
도 3에 나타난 바와 같이, 본 발명의 조성물은 C48/80에 의해 증가되는 HRF 분비를 효과적으로 억제하였다. 이처럼 HRF의 분비가 양성자 펌프 저해제에 의해 억제되는 것으로 보아, HRF의 분비에 양성자 펌프가 관여한다는 것을 알 수 있다.As shown in FIG. 3, the composition of the present invention effectively inhibited HRF secretion increased by C48 / 80. Since the secretion of HRF is inhibited by the proton pump inhibitor, it can be seen that the proton pump is involved in the secretion of HRF.
따라서 양성자 펌프 저해제를 유효성분으로 함유하는 본 발명의 조성물은 HRF로 인한 다양한 알러지 증상의 예방 및 치료에 유용하게 사용할 수 있다.Therefore, the composition of the present invention containing a proton pump inhibitor as an active ingredient can be usefully used for the prevention and treatment of various allergic symptoms caused by HRF.
[실시예 2] 본 발명의 조성물에 의한 아나필락시스 억제 효과Example 2 Anaphylactic Inhibitory Effect by the Composition of the Present Invention
1) 본 발명의 조성물 제조1) Preparation of the composition of the present invention
본 발명의 조성물은 판토프라졸(판토록 주사, 태평양 제약)을 인산완충액에 4.8 mM의 농도로 녹여 제조하였다.The composition of the present invention was prepared by dissolving pantoprazole (Pantro Injection, Pacific Pharmaceuticals) at a concentration of 4.8 mM in phosphate buffer.
본 발명의 조성물을 동물에 투여할 때는 판토프라졸의 사용량이 10㎎/㎏이 되도록 하였다.When the composition of the present invention is administered to an animal, the amount of pantoprazole is 10 mg / kg.
2) 본 발명의 조성물에 의한 아나필락시 억제 효과2) Anaphylactic Inhibitory Effect by the Composition of the Present Invention
본 발명의 조성물에 의한 아나필락시 억제 효과를 다음과 같이 확인하였다.The anaphylactic inhibitory effect by the composition of this invention was confirmed as follows.
체중이 200∼220 g 되는 SD 쥐를 각 군 당 8마리씩 사용하여, 음성대조군과 양성대조군에는 인산완충액을 꼬리 정맥에 주사투여하고, 시험군에는 본 발명의 조성물을 판토프라졸의 사용량이 10 mg/㎏가 되도록 꼬리정맥을 통해 주사투여하였다. Eight SD rats weighing 200-220 g were used in each group. Phosphate buffer was injected into the tail vein in the negative control group and the positive control group, and the test group used 10 mg of pantoprazole. Injection through the tail vein to / kg.
상기 전처치 후 30분이 지나서 음성대조군에는 인산완충액을 꼬리 정맥을 통해 주사하고, 양성대조군과 시험군에는 C48/80을 10 ㎎/㎏로 꼬리 정맥에 주사를 하였다. 주사 후에는 C48/80에 의한 아나필락시 반응으로 사망하는 개체의 수를 관찰하였다. 사망과 생존의 기준은 C48/80 투여 후 1시간 동안 생존하는지의 여부로 결정하였으며, 각 군의 폐사율 결과를 표 1에 나타내었다. 30 minutes after the pretreatment, the phosphate buffer solution was injected into the negative control group through the tail vein, and the positive control group and the test group were injected into the tail vein at 10 mg / kg in C48 / 80. After injection, the number of individuals who died from the anaphylactic response by C48 / 80 was observed. Mortality and survival were determined by survival for 1 hour after C48 / 80 administration, and the mortality results of each group are shown in Table 1.
표 1에 나타난 바와 같이, 본 발명의 조성물은 동물에서 아나필락시스 반응을 현저히 감소시킴을 알 수 있다. 이러한 결과는 본 발명의 조성물이 세포로부터 HRF의 분비를 억제한다는 실시예 1과 일치하는 것이다.As shown in Table 1, the composition of the present invention can be seen to significantly reduce the anaphylactic response in animals. This result is consistent with Example 1, wherein the composition of the present invention inhibits the secretion of HRF from cells.
따라서, 본 발명의 조성물은 아나필락시스와 같이 HRF에 의해 유발될 수 있 는 과민성 면역반응으로 인한 질환의 예방 및 치료에 유용하게 사용될 수 있다.Therefore, the composition of the present invention can be usefully used for the prevention and treatment of diseases caused by hypersensitivity immune response that can be induced by HRF, such as anaphylaxis.
3) 본 발명의 조성물에 의한 혈중 히스타민 농도의 감소3) Reduction of Histamine Levels in Blood by the Composition of the Present Invention
상기 실시예 2의 2)에서 나타난 본 발명의 조성물의 아나필락시스 억제 효과가, 혈중 히스타민 농도를 감소시키기 때문인지를 다음과 같이 확인하였다.It was confirmed as follows whether the anaphylactic inhibitory effect of the composition of the present invention shown in Example 2 of 2 is due to a decrease in blood histamine concentration.
상기 실시예 2의 2)에서 실험에 사용된 쥐 중에서, 사망한 쥐의 경우 사망하기 직전 또는 직후에 쥐의 심장에서 혈액을 소량 취하고, 생존한 쥐의 경우 에테르로 마취를 하여 혈액을 소량 취하였다.Among the rats used in the experiment in Example 2, 2), a small amount of blood was taken from the heart of the mouse immediately before or after death in the case of a dead mouse, and a small amount of blood was taken by anesthesia with ether in a surviving mouse. .
각각 얻은 혈액을 4℃에 밤새 방치하여 혈구를 응고시킨 후, 3000rpm에서 10분간 원심분리를 하여 혈청을 분리하였다. 혈청 중 일부를 취하여 3차 증류수에 10배∼300배까지 희석한 후, 히스타민 분석용 기계로 혈중 히스타민 농도를 분석하여 그 결과를 표 2에 나타내었다.The obtained blood was left at 4 ° C. overnight to coagulate blood cells, and then serum was separated by centrifugation at 3000 rpm for 10 minutes. After taking some of the serum and diluting it in distilled
(측정불가: 농도가 측정가능한 범위 미만임)(Not measurable: concentration is below the measurable range)
표 2에 나타난 바와 같이, 본 발명의 조성물을 전처치한 실험군의 혈액에서는 양성대조군에 비해 히스타민의 방출량이 80% 이상 감소하였다.As shown in Table 2, in the blood of the experimental group pretreated with the composition of the present invention, the release amount of histamine was reduced by more than 80% compared to the positive control group.
따라서, 본 발명의 조성물은 혈중 히스타민 양을 감소시키는 효과가 있으며, 그 결과 아나필락시스 반응의 예방 및 치료에 유용하게 사용될 수 있다.Therefore, the composition of the present invention has the effect of reducing the amount of histamine in the blood, as a result can be usefully used for the prevention and treatment of anaphylactic reactions.
4) 본 발명의 조성물에 의한 혈중 HRF 농도의 감소4) Reduction of HRF Concentration in Blood by Compositions of the Invention
상기 실시예 2의 3)에서 나타난 본 발명의 조성물의 혈중 히스타민 농도 감소 효과가, HRF의 분비 감소에 의한 것인지를 다음과 같이 확인하였다.It was confirmed whether the effect of reducing the histamine concentration in blood of the composition of the present invention shown in 3) of Example 2 was due to the decrease in secretion of HRF.
상기 실시예 2의 3)에서 얻은 각 군의 혈청을 동량의 4 ×시료 완충액과 혼합하였으며, 이때 사용한 시료 완충액은 글리세롤의 비율을 반으로 하여 전기영동 시 밴드가 끌리는 현상을 방지하도록 하였다. 상기 시료 혼합액을 3분간 끓는 물에 넣어 변성시키고 잠시 얼음에서 식힌 후, 5분간 12000rpm에서 원심분리하여 상등액만을 취하였다.The serum of each group obtained in 3) of Example 2 was mixed with the same amount of 4 × sample buffer, and the sample buffer used was half the ratio of glycerol to prevent the band dragging during electrophoresis. The sample mixture was denatured in boiling water for 3 minutes, cooled in ice for a while, and centrifuged at 12000 rpm for 5 minutes to obtain only the supernatant.
상기와 같이 준비된 시료에 대해, 실시예 1의 1-2)와 마찬가지로 웨스턴 분석을 수행하고, 그 결과를 도 4에 나타내었다.The sample prepared as above was subjected to Western analysis in the same manner as in Example 1-2), and the results are shown in FIG. 4.
도 4에 나타난 바와 같이, 본 발명의 조성물을 전처치하지 않고 아나필락시스 반응을 일으켜 사망한 군의 혈액에서는 대부분 HRF의 밴드가 뚜렷하게 검출되었다.As shown in FIG. 4, most of the bands of HRF were clearly detected in the blood of the group who died of the anaphylactic reaction without pretreatment of the composition of the present invention.
반면 본 발명의 조성물을 전처치하여 생존한 군의 혈액에서는 HRF 밴드가 거의 검출되지 않았다.On the other hand, almost no HRF band was detected in the blood of the group surviving the composition of the present invention.
따라서 C48/80에 의한 아나필락시스 반응에 HRF가 중요하게 작용함을 알 수 있으며, 본 발명의 조성물은 HRF의 혈중 농도를 감소시키고, 순차적으로 히스타민의 양을 감소시킴으로써 아나필락시스 반응을 억제할 수 있음을 알 수 있다.Therefore, it can be seen that HRF plays an important role in the anaphylaxis reaction by C48 / 80, and that the composition of the present invention can suppress the anaphylaxis reaction by decreasing the blood concentration of HRF and sequentially decreasing the amount of histamine. Can be.
[실시예 3] 본 발명의 조성물에 의한 알러지성 비염의 억제 효과Example 3 Inhibitory Effect of Allergic Rhinitis by Composition of the Present Invention
1) 본 발명의 조성물 제조1) Preparation of the composition of the present invention
본 발명의 조성물을 동물에 처리할 때에는 인산완충액에 용해시켜 각 실험군 당 판토프라졸의 적용량이 각각 10㎎/㎏, 100 ㎎/㎏이 되도록 하였다.When the composition of the present invention was treated in an animal, it was dissolved in a phosphate buffer solution so that the applied amounts of pantoprazole per experimental group were 10 mg / kg and 100 mg / kg, respectively.
2) 실험방법2) Experiment Method
체중이 15∼25g 되는 생후 3주령의 BALB-c 마우스 수컷들을 각 군 당 여섯 혹은 일곱 마리씩 분류하여 4개 군으로 나눈 후, 특정 항원이 없는(specific pathogen free, SPF) 환경에서 35일간 사육을 하였다. Three-week-old males of BALB-c mice weighing 15-25 g were divided into four groups of six or seven per group, and reared for 35 days in a specific pathogen free (SPF) environment. .
알러지성 비염을 유발하기 위해, 난알부민(ovalbumin, chicken egg albumin, grade Ⅴ, Sigam Chemical Co. Phillipsberg, NY) 10 ㎍과 알루미늄 히드록시드(aluminum hydroxide, Al(OH)3) 젤 1 ㎎을 인산완충액 0.3 ㎖에 30분 이상 혼합하여 난알부민 혼합액을 제조하였다. To cause allergic rhinitis, phosphoric acid was added 10 μg of ovalbumin (chicken egg albumin, grade V, Sigam Chemical Co. Phillipsberg, NY) and 1 mg of aluminum hydroxide (Al (OH) 3 ) gel. An egg albumin mixture was prepared by mixing the buffer solution with 0.3 ml for at least 30 minutes.
상기 혼합물 0.1 ㎖을 마우스의 복강 내에 주사하고, 5일째와 14일째, 21일째에 각기 한번씩 더 주사하였다. 마지막 복강 내 주사 1주일 후(28일째) 마이크로피펫을 이용해서 비공에 인산완충액 30 ㎕ 또는 난알부민 100 ㎍을 인산완충액 30 ㎕에 혼합한 혼합액을 주입하였다. 비공 투여 30분 전에는 인산완충액 또는 판토프라졸 10 ㎎/㎏, 100 ㎎/㎏를 각각의 해당 실험군에 복강 내 주사하여 사용 약제의 알러지성 비염 억제 효과를 확인하였다. 0.1 ml of the mixture was injected intraperitoneally of the mice and injected once more on the 5th, 14th and 21st days, respectively. One week after the last intraperitoneal injection (day 28), a mixture of 30 μl of phosphate buffer or 100 μg of egg albumin was injected into the nostril using a micropipette. Thirty minutes before the nasal administration, phosphate buffer or
비강 내 난알부민 투여와 투여 전 약물의 전처치는 1일 1회씩 7일간 시행하였으며, 7일간의 투여를 마친 다음 날 모든 군의 마우스에 탄산가스를 흡입시켜 안락사시켰다. 상기 실험과정을 표 3에 정리하여 나타내였다.Nasal albumin administration and pretreatment of the drug were administered once a day for 7 days. After 7 days of administration, all groups of mice were euthanized by inhaling carbon dioxide. The experimental procedure is summarized in Table 3.
(OVA: 난알부민, Alum: Al(OH)3)(OVA: Albumin, Alum: Al (OH) 3 )
3) 본 발명의 조성물에 의한 알러지성 비염 증상의 억제 효과3) Inhibitory effect of allergic rhinitis symptoms by the composition of the present invention
본 발명의 조성물에 의한 알러지성 비염 증상의 억제 효과를 다음과 같이 확인하였다.The inhibitory effect of the symptoms of allergic rhinitis by the composition of the present invention was confirmed as follows.
상기 2)와 같이 각 군에서 비강 내 유발을 시행한 후, 일정한 시간에 15분간 각각의 마우스에서 알러지성 비염의 특징적인 증상, 즉 재채기 횟수와 코를 긁는 동작과 같은 증상의 발현 횟수를 측정하여 이들의 합을 증상점수(symptom score)로 기록하였다. 2명의 관찰자가 측정한 점수의 평균을 증상점수로 기록하였으며, 관찰자 간의 차이가 30% 이상인 경우는 제외하였다. 각 군의 증상점수를 표 4와 도 5에 나타내었다.After the intranasal induction in each group as shown in 2), by measuring the characteristic symptoms of allergic rhinitis, ie sneeze number and scratching the nose in each mouse for 15 minutes at a certain time The sum of these was recorded as a symptom score. The mean scores of the two observers were recorded as symptom scores, except when the difference between the observers was more than 30%. Symptom scores for each group are shown in Table 4 and FIG.
표 4 및 도 5에 나타난 바와 같이, 본 발명의 조성물을 투여한 군은 양성대조군에 비해 알러지성 비염에 의해 나타나는 증상이 현저하게 감소한 것으로 나타났다.As shown in Table 4 and Figure 5, the group to which the composition of the present invention was administered was found to significantly reduce the symptoms caused by allergic rhinitis compared to the positive control group.
따라서 본 발명의 조성물은 알러지성 비염을 비롯하여 건초열 등의 알러지성 질환을 효과적으로 억제할 수 있음을 알 수 있다.Therefore, it can be seen that the composition of the present invention can effectively suppress allergic diseases such as hay fever, including allergic rhinitis.
4) 조직학적 검사4) Histological examination
본 발명의 조성물이 알러지성 질환의 조직학적 특징인 호산구 수치의 증가에 미치는 영향을 다음과 같이 확인하였다.The effect of the composition of the present invention on the increase of eosinophil levels, which is a histological characteristic of allergic diseases, was identified as follows.
상기 2)에서 안락사시킨 마우스의 머리를 분리시킨 후, 10% 포르말린 액에서 24시간 동안 고정시켰다. 고정 후 마우스의 머리로부터 피부를 제거하고 탈석회액(decalcifier B, Accra Lab, Swedesboro, NJ)에 24시간 동안 담가 두었다. 비강조직을 파라핀에 포매한 후, 5 ㎛ 두께의 관상면(coronal section) 절편을 얻었다.The heads of euthanized mice in 2) were separated and fixed for 24 hours in 10% formalin solution. After fixation, the skin was removed from the head of the mouse and soaked in demineralizer (decalcifier B, Accra Lab, Swedesboro, NJ) for 24 hours. After embedding the nasal tissue in paraffin, coronal section sections of 5 μm thickness were obtained.
상기 절편에 대해 헤마톡실린(haematoxylin)과 에오신(eosin)으로 염색을 실시한 후 광학현미경 하에서 마우스 비강의 관상면에서 두 개의 이빨이 보이는 조직을 선정하여, 하비갑개(inferior turbinate)의 전반부에서 400배 배율로 점막 하의 호산구 갯수를 측정하였다. 각각의 측정치는 만-휘트니 유-테스트(Mann-Whitney U-test)를 이용하여 통계분석을 실시하였고, SPSS 윈도우 버전 10.0(SPSS for windows version 10.0, SPSS Inc., Chicago) 프로그램을 사용하여, 얻어진 결과 중 p<0.05 를 통계적으로 의미있는 것으로 해석하였다. 그 결과를 표 5 및 도 6에 나타내었다.The sections were stained with haematoxylin and eosin, and selected under the light microscope to see two teeth in the coronal plane of the mouse nasal cavity, 400 times in the first half of the inferior turbinate. The number of eosinophils under the mucosa was measured by the magnification. Each measurement was statistically analyzed using the Mann-Whitney U-test and obtained using the SPSS for windows version 10.0 (SPSS Inc., Chicago) program. Among the results, p <0.05 was interpreted as statistically significant. The results are shown in Table 5 and FIG.
표 5 및 도 6에 나타난 바와 같이, 본 발명의 조성물을 투여한 군은 양성 대조군에 비해 호산구 수치가 매우 낮은 것으로 나타났다.As shown in Table 5 and Figure 6, the group administered the composition of the present invention was found to be very low eosinophil levels compared to the positive control.
따라서 본 발명의 조성물은 알러지성 비염을 비롯하여 건초열 등의 알러지성 질환을 효과적으로 억제할 수 있음을 알 수 있다.Therefore, it can be seen that the composition of the present invention can effectively suppress allergic diseases such as hay fever, including allergic rhinitis.
본 발명의 조성물은 알러지 유발물질에 의한 HRF 분비를 억제하는 효과가 있다.The composition of the present invention has the effect of inhibiting HRF secretion by allergens.
본 발명의 조성물은 혈중에 존재하는 HRF와 히스타민의 양을 감소시킴으로써, 알러지 유발물질에 의해 일어나는 전신성 아나필락시 반응에 의한 사망 확률을 현저히 감소시키고, 알러지성 비염의 증상을 완화시키는 효과가 있다.The composition of the present invention reduces the amount of HRF and histamine present in the blood, significantly reducing the probability of death due to systemic anaphylactic reactions caused by allergens, and alleviating the symptoms of allergic rhinitis.
따라서 본 발명의 조성물은 HRF에 의해 유발되는 각종 알러지 질환, 즉 아스피린과 같은 약물 또는 음식에 의한 천식이나 알러지성 기관지 천식 등을 포함하는 천식, 담마진, 아나필락시, 알러지성 비염, 알러지성 기관지 확장증, 건초열, 아토피성 피부염과, 말라리아의 예방 및 치료를 위한 약제학적 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.Therefore, the composition of the present invention is a variety of allergic diseases caused by HRF, namely, asthma, including aspirin or allergic bronchial asthma by drugs or foods, such as amarine, anaphylaxis, allergic rhinitis, allergic bronchiectasis, hay fever It can be usefully used as a pharmaceutical composition for the prevention and treatment of atopic dermatitis and malaria.
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