KR100581318B1

KR100581318B1 - 페니실리움 옥살리쿰 유래의 신규 파이테즈 유전자 및파이테즈를 생산하는 형질전환 피치아 파스토리스 균주

Info

Publication number: KR100581318B1
Application number: KR20030091438A
Authority: KR
Inventors: 복진덕; 박승환; 이창환; 구동환; 박근수; 한영숙; 김민경; 최윤재
Original assignee: 주식회사 중앙바이오텍
Priority date: 2003-12-15
Filing date: 2003-12-15
Publication date: 2006-05-17
Also published as: WO2005056835A1; KR20050059723A

Abstract

본 발명은 디제너레이트 프라이머와 PCR(polymerase chain reaction) 방법을 이용하여 다양한 곰팡이로부터 효소 유전자를 탐색하는 방법 및 상기 방법을 이용하여 얻어진 페니실리움 옥살리쿰(Penicillium oxalicum KCTC 6440)의 파이테즈 유전자 및 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 피치아 파스토리스 균주 및 상기 균주가 생산하는 재조합 파이테즈 효소에 관한 것이다.

본 발명의 형질전환 균주와 그로부터 생산되는 파이테즈 효소는 매우 뛰어난 역가를 나타내므로 사료첨가제로서의 효용가치를 제공한다.

파이테즈, phytase, 페니실리움 옥살리쿰, 피치아 파스토리스 GS115

Description

페니실리움 옥살리쿰 유래의 신규 파이테즈 유전자 및 파이테즈를 생산하는 형질전환 피치아 파스토리스 균주 {A novel phytase gene derived from Penicillium oxalicum and a Pichia pastoris transformant producing the phytase}

도 1은 디제너레이트 프라이머(Py-1/Py-4)로 터치다운 PCR을 수행한 전기영동 사진이다.

도 2는 POX 유전자의 인버스 PCR 후 아가로스 겔 전기영동 사진이다.

도 3은 페니실리움 옥살리쿰 파이테즈 유전자(POX)의 게놈 DNA 염기서열이다.

도 4는 파이테즈 발현벡터 pPICZαA-POX의 구축도이다.

도 5는 피치아 파스토리스 GS115/pPICZαA-POX에서 발현되는 재조합 파이테즈의 아미노산 서열이다.

도 6a는 형질전환 피치아 파스토리스 GS115/pPICZαA-POX에서 유가식 발효를 통한 재조합 파이테즈의 생산을 나타낸 것이다.

도 6b는 피치아 파스토리스 KM71/pPICZαA-POX에서 유가식 발효를 통한 재조합 파이테즈의 생산을 나타낸 것이다.

도 7은 형질전환 피치아 파스토리스 GS115/pPICZαA-POX에서 생산된 재조합 파이테즈의 유가식 발효의 시간대 별 단백질 발현양상을 나타낸 것이다.

도 8a는 형질전환 피치아 파스토리스 GS115/pPICZαA-POX에서 생산된 재조합 파이테즈의 최적 pH를 나타낸 것이다.

도 8b는 형질전환 피치아 파스토리스 GS115/pPICZαA-POX에서 생산된 재조합 파이테즈의 최적 온도를 나타낸 것이다.

본 발명이 해결하려고 하는 기술분야는 효소 특히 산업용 효소 그 중에서도 축산에서 사용할 수 있는 소화효소류, 특히 신규성이 있는 파이테즈 효소를 다양한 곰팡이로부터 스크리닝하는 기술을 개발하는 것이며 이 방법을 통해 우수한 효소유전자를 확보하고 이를 축산에 이용할 수 있는 형태로 생산하기 위한 생산 시스템을 개발하는 것이다.

가축사료의 주요 영양원으로 공급되는 곡물류의 주 인(Pi) 저장형태는 파이틱산으로 각종 미네랄(구리, 아연, 마그네슘, 철 및 칼슘)과 결합하거나 단백질-파 이틱산-미네랄 복합체의 형태를 가지는 피틴태로 존재한다.

단위 동물의 경우 이를 분해하는 파이테즈 효소가 없어 곡물 사료에 존재하는 피틴태 인을 이용하지 못하기 때문에 인의 추가적인 급여는 불가피하며, 인산화 칼슘(Dicalcium phosphate) 등과 같은 무기태 인의 형태로 첨가하고 있다. 이는 사료비용을 높이고 각종 단백질이나 아미노산, 필수 광물질과 결합하고 있어 항 영양인자로 작용하여 사료의 소화율을 감소시키고 인의 분뇨배출로 인한 환경오염의 문제를 제공한다. 이런 문제를 부분적으로 해결하기 위해 미생물 유래의 파이테즈 효소를 사료에 첨가하여 주고 있다. 몇 개의 효소생산 회사에서 곰팡이 유래의 파이테즈를 생산공급하고 있어 시장을 선점하고 있고 많은 연구소 및 회사들이 신규하고 좀더 우수한 효소를 찾기 위해 노력하고 있다. 현재 15종 이상의 곰팡이 파이테즈가 균주은행(Gene Bank)에 등록되어 있고 계속 늘어날 것이다[참조: GeneBank accession numbers : AF218813, LO2421, AB042805, AF537344, U59804, U59805, AX0851913, U59802, U59803, U59806, AJ310696, AJ310697, AJ310698, AJ310699, AJ310700].

종래의 파이테즈를 포함한 효소 스크리닝 방법은 미생물을 분리해 효소활성을 확인할 수 있는 선발 배지에서 배양 후 효소 활성을 측정하고 단백질의 일부 아미노산 서열을 분석하여 기존의 것과 차이를 구하거나 효소발현이 높은 균주로부터 해당 유전자를 클론하는 것으로, 시간이 많이 소요되고 유전자를 분리해 염기서열 또는 아미노산 서열을 분석하여 유전자 은행의 자료와 비교분석하였을 때 흔히 기존의 것과 상동성이 높아 신규성을 인정받기 어려울 때가 많이 있다.

본 발명자들은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위해 기존에 알려진 여러 가지 기술을 조합하여 신규성이 인정되는 효소 특히 파이테즈 효소의 스크리닝을 쉽게 할 수 있는 방법을 개발하고자 하였고 이 방법을 이용하여 실제 신규성이 있고 효소활성이 높은 파이테즈를 균주은행에서 구입한 다양한 곰팡이 종으로부터 스크리닝함으로써 우수한 파이테즈 효소를 제공하고자 하였다.

따라서 본 발명의 목적은 고활성의 파이테즈 효소 유전자를 불특정 다수의 곰팡이 균주로부터 획득하는 방법과 선발된 유전자를 피치아 효모에서 대량 생산하는 방법을 제공하는 데 있다.

상기한 바와 같은 본 발명의 기술적 과제는, 디제너레이트 프라이머와 PCR(polymerase chain reaction) 방법을 이용하여 다양한 곰팡이로부터 효소 유전자를 탐색하고, 상기 방법을 이용하여 페니실리움 옥살리쿰(Penicillium oxalicum KCTC 6440)의 파이테즈 유전자(POX)를 선별하고, 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 피치아 파스토리스 GS115/pPICZαA-POX (Pichia pastoris GS115/pPICZαA-POX) KCTC 10386BP 균주를 획득하고, 상기 균주로부터 재조합 파이테즈 효소를 생산함으로써 달성하였다.

본 발명은 디제너레이트 프라이머와 PCR(polymerase chain reaction) 방법을 이용하여 다양한 곰팡이로부터 효소 유전자를 탐색하는 방법 및 상기 방법을 이용하여 얻어진 페니실리움 옥살리쿰(Penicillium oxalicum KCTC 6440)의 파이테즈 유 전자 및 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 피치아 파스토리스 균주 및 상기 균주가 생산하는 재조합 파이테즈 효소에 관한 것이다.

본 발명은 다양한 곰팡이 균으로부터 게놈 DNA를 획득하여 이를 주형(template)으로 기존의 곰팡이 유래 파이테즈(phytase)의 염기서열에서 상동성이 높은 부위를 선정함으로써 디제너레이트 프라이머(degenerate primer)를 제작하는 단계; 상기 프라이머를 이용한 피씨알(PCR)을 통해 유전자 단편을 얻고 그 염기서열을 유전자 은행(Gene Bank)에 등록된 염기서열과 비교함으로써 기존 파이테즈와 상이한 유전자를 선발하는 단계; 인버스 피씨알(Inverse-PCR) 방법을 이용하여 상기에서 얻어진 신규한 파이테즈 유전자 단편으로부터 전체 파이테즈 유전자의 염기서열을 획득하는 단계; 상기 효소 유전자를 피치아 발현벡터에 접합시키고 피치아균에 형질전환시켜 파이테즈를 발현시키는 단계; 상기 발현된 파이테즈의 특성을 밝혀 역가가 높은 유전자를 선발하는 방법을 통해 여러 파이테즈 유전자 중 페니실리움 옥살리쿰 KCTC 6440 균주 유래 POX 유전자를 선발하는 단계; 상기 페니실리움 옥살리쿰 유래의 신규 파이테즈 유전자(POX)를 포함하는 재조합 벡터 pPICZα A-POX를 제조하는 단계; 상기 벡터로 피치아 파스토리스 GS115 또는 KM71 균주를 형질전환시키고 그 중 파이테즈 발현능이 우수한 균주로서 피치아 파스토리스 GS115/pPICZαA-POX 균주를 최종 선발하는 단계; 및 상기 균주에서 파이테즈를 발현시키는 단계로 이루어진다.

이하 본 발명의 구체적인 방법을 실시예를 들어 상세히 설명하고자 하지만 본 발명의 권리범위는 이들 실시예에만 한정되는 것은 아니다.

실시예 1 : PCR기법을 이용한 신규한 곰팡이 파이테즈 유전자의 확보방법

제 1 단계 : 디제너레이트 PCR(degenerate PCR)을 통한 파이테즈 유전자의 탐색

기존에 알려진 다양한 곰팡이 유래의 파이테즈 유전자 서열을 다중정렬(Multiple Alignment)하여 상동성이 높은 부분의 염기서열을 이용하여 하기 표 1과 같은 올리고뉴클레오타이드 프라이머 쌍을 제작하고, 이를 다수의 곰팡이 유전체(genome)를 대상으로 PCR 하였다. 다중정렬에 사용한 파이테즈 유전자는 기존에 알려진 유전자를 서로 비교하여 중복성이 있는 것은 제외하고 90% 미만의 상동성을 갖는 것만 선택하여 사용하였다[참조: GeneBank Accession Numbers: L02421(Aspergillus niger awamori), M94550 (A. niger), AB042805 (A. oryzae), U59804 (A. fumigatus), U59805 (A. terreus), U59802 (Talaromyces thermophilus), U59803 (Emericella nidulans)].

곰팡이 유래의 파이테즈 유전자 탐색에 사용한 디제너레이트 프라이머

	염기서열
전방향 프라이머(Forward primer), Py-1, 서열번호 1	5'-TGGGGHCAVTAYKCGCCNTWCTTYTC-3' (26 mer)
역방향 프라이머(Reverse primer), Py-4, 서열번호 2	5'-GTTDCCBSCRCCRTRGCCGTAGTAYTT-3' (27 mer)
주) Mixed base code : B(G,T,C); D(G,A,T); H(A,T,C); K(G,T); N(A,C,G,T); R(A,G); S(G,C); Y(C,T); V(A,C,G); W(A,T)

PD(Potato dextrose) 배지에 3일 배양한 곰팡이 균체를 미라클로즈 (MiraCloth)를 이용하여 회수, 세척하고 동결건조한 후, Zircornium bead로 파쇄한 후, CTAB 버퍼로 처리하였다. 정제된 곰팡이 유전체의 양을 결정한 후, 적량(50ng)을 PCR 반응에 이용하였다. PCR은 선발 가능성을 최대한 높일 수 있도록 터치다운(touch-down)방식으로 다음과 같은 조건에서 수행되었다.

I. 95℃에서 2분간 디내츄레이션(denaturation); II. 8회의 사이클 (1회 사이클당 어닐링 온도 2℃ 씩 하강)- (1) 95℃에서 30초간 디내츄레이션 (denaturation), (2) 65℃~50℃에서 45 초간 어닐링(annealing), (3) 72℃에서 1분간 신장(extension); III. 30회의 사이클(cycle)-(1) 95℃에서 30초간 디내츄레이션(denaturation), (2) 50℃에서 45초간 어닐링(annealing), (3) 72℃에서 1분간 신장(extension); IV. 72℃에서 7분간 신장(extension), 4℃에서 보관.

상기의 조건에서 PCR을 수행하고 아가로오스 전기영동을 통해 확인한 결과,페니실리움 옥살리쿰(Penicillium oxalicum KCTC 6440)을 포함한 다양한 곰팡이 유전체에서 대략 785 bp의 PCR 산물이 확인되었다(도 1 참조). 이 PCR 산물을 pGEM-T 벡터에 라이게이션(ligation)한 후 (라이게이션 조건: 1.5uL PCR 산물/0.5uL T-vector/2.5uL 2X ligase buffer/0.5uL T4 DNA ligase [Promega]를 포함하는 ligation mixture를 4도에서 16시간동안 방치), E. coli TOP10F' 균주에 형질전환하였다. 785bp 유전자 단편의 염기서열을 결정하고 이 염기서열을 유전자 은행의 것들과 엔씨비아이의 블라스트 프로그램(NCBI Blast search)을 통해 비교하여 알려진 파이테즈 유전자와 유전자의 상동성이 90% 이하인 것을 신규하다고 규정하고, 10종의 신규한 파이테즈 유전자 단편을 확보하였다.

제 2 단계 : Inverse PCR 기법을 통한 전체 파이테즈 유전자의 염기서열 확보

인버스(inverse) PCR은 유전자 단편의 염기서열을 기반으로 간단한 과정과 빠른 시간 안에 전체 유전자의 염기서열을 결정할 수 있는 매우 강력한 PCR 기법이다. 상기 제 1 단계에서 신규한 유전자로 확보한 10종의 파이테즈 유전자 단편 중에 페니실리움 옥살리쿰(Penicillium oxalicum KCTC 6440)의 게놈 DNA를 BamHI, BglII, EcoRI, HindIII, PstI, SalI, XbaI, XhoI 의 제한효소(restriction enzyme)로 각각 자르고 (효소처리조건: 1ug DNA/1X buffer/50uL/최적 온도에서 16시간반응), 정제한 후(PCR purification kit, Qiagen) DNA의 농도를 2 ng/㎕되게 조정하여 라이게이션(self ligation) 하였다. 위의 과정을 거친 DNA 단편들은 선형 DNA 에서 원형 DNA로 변화된다. 라이게이션 혼합물을 PCR purification kit(Qiagen)을 이용하여 정제하여 주형(template)으로 사용하였고, 프라이머는 하기 표 2의 것을 사용하였다.

	염기서열
전방향 프라이머(Forward primer), INV-1 서열번호 3	5'-CAAGACTTGGACAAAGGTGAGCTCGC-3' (26mer)
역방향 프라이머(Reverse primer), INV-2 서열번호 4	5'-TTCACCGACACCGAGTGGTCCCAG-3' (24mer)

인버스 PCR의 조건은 다음과 같다 [PCR 반응물 조성: 5uL ligated DNA/0.4uM INV-1 & -2 primer/ 0.4mM dNTP/1X buffer/1.25U Taq polymerase/25uL volume].

I. 94℃에서 1분간 디내츄레이션(denaturation); II. 10회의 사이클(1회 사이클당 어닐링 온도 1℃ 씩 상승)-94℃에서 15초간 디내츄레이션(denaturation), 60℃에서 30 초간 어닐링(annealing), 68℃에서 4분간 신장(extension); III. 20회의 사이클(1회 사이클당 신장 시간 10초씩 증가)- 95℃에서 15초간 디내츄레이션(denaturation), 60℃에서 30 초간 어닐링(annealing), 68℃에서 4분 간 신장(extension); IV. 68℃에서 20분간 신장(extension).

상기 PCR 과정을 통해 얻은 산물은 아가로오스 전기영동을 통해 확인하였다. 총 8종의 제한 효소 처리군 중에서 BamHI, BglII, PstI, SalI 등의 4종의 제한효소 처리군에서만 인버스 PCR 산물이 나타났다(도 2 참조). 이 4종의 PCR 산물을 pGEM-T(Promega™) 벡터에 클로닝하여 염기서열을 결정하였다. 그 결과로서, 페니실리움 옥살리쿰 유래의 파이테즈 유전자(이하, "POX"라 명명함)의 전체 염기서열을 결정하였다(도 3 참조).

상기에서 얻어진 페니실리움 옥살리쿰 유래 파이테즈 유전자의 전체 아미노산 서열을 다른 곰팡이 파이테즈 유전자와 비교한 결과, 가장 상동성이 높은 것이 아스퍼길루스 나이거 PhyA(Aspergillus niger PhyA, Accesion No.M94550)로 동일성(identity)이 58.8%이고 상동성 (homology)이 68.8%이다. 같은 페니실리움 속에 속하는 호다이 파이테즈(P. hordei, Accesion No. AX0851913)가 최근 특허로 공개되었는데 이는 POX 파이테즈와 비교시 52.1% 동일성과 61.5% 상동성을 보여 신규성을 확인하였다. 페니실리움 에스피(Penicillium sp., Accesion No. AE48448)의 파이테즈는 상동성이 35.5%로 더 낮다.

위 방법은 이미 알려진 디제너레이트 프라이머 제작, 터치다운 PCR 수행, PCR 산물의 클론, 염기서열 규명, 염기서열 비교, 인버스 PCR용 프라이머 제작, 인버스 PCR 수행 등 방법들을 조합 응용하여 다양한 곰팡이 균주로부터 신규한 파이테즈 유전자를 검색하고 전체 유전자를 얻는 방법을 새로이 고안한 것으로, 이 방법을 통해 다양한 곰팡이 균주로부터 기존에 알려지지 않았던 신규한 유전자를 찾 을 수 있었으며, 그 실시예의 하나로써 POX 파이테즈 유전자의 염기서열을 제시한다.

실시예 2 : 파이테즈 발현을 위한 재조합 벡터 및 형질전환 균주의 제조

제 1단계: 파이테즈 유전자의 PCR 증폭 및 클로닝

상기 실시예 1에서 얻어진 페니실리움 옥살리쿰의 파이테즈 유전자, POX의 염기서열을 토대로 피치아 균주에서 발현을 수행할 성숙 유전자(mature gene) 부분만을 얻어낼 수 있는 프라이머를 하기와 같이 제작하였다.

POX4 프라이머는 피치아 파스토리스 벡터인 pPICZαA의 클로닝 부위에 존재하는 제한효소, EcoRI 의 인지서열(recognition sequence)을 5' 말단에 만들어 주었고, 또한 POX ORF(open reading frame)에 맞추어 제작하였다. POX5 프라이머 역시 ORF에 맞추어 제작하였으며, 5' 말단에 종료 코돈(stop codon)을 삽입하여 주었다.

페니실리움 옥살리쿰 파이테즈 유전자(POX)의 클로닝에 사용한 프라이머

	염기서열
전방향 프라이머(Forward primer), POX4 서열번호 5	5'-TTGAATTCCGTACCTGTGATACCGGTGACGGTGGC-3' EcoR I
역방향 프라이머(Reverse primer), POX5 서열번호 6	5'-TTCACTTTGAAGAAACGCCACATT-3' Stop Codon

상기의 POX4와 POX5를 프라이머로 하고, 페니실리움 옥살리쿰 유전체(genomic DNA)를 주형으로 하여, 어닐링 온도는 55℃, 총 30 사이클 동안 PCR을 수행하여 얻은 산물을 pGEM-T 클로닝 벡터에 삽입하여 재차 염기서열을 확인 하였다.

제 2단계: 파이테즈 유전자를 벡터 pPICZαA에 삽입(ligation)

pGEM-T 벡터에 클로닝된 성숙 POX 유전자를 제한 효소 EcoRI 과 NotI 으로 절단한 후, 피치아 파스토리스 발현용 벡터인 pPICZαA의 다중클로닝 부위(Multiple Cloning Site)에 존재하는 동일 제한효소 부위에 삽입하였다(도 4 참조). 삽입 산물(ligation product)을 40 ㎕의 E. coli TOP10F' 컴피턴트 세포(competent cell)에 혼합한 후, 0.2cm 큐벳에 넣어 얼음위에서 5분간 반응하였다. Bio-Rad 사의 전기천공기(electroporator)를 이용하여 2.5 KV, 5 ms 의 조건으로 전기천공(electroporation)을 수행하였다.

전기천공 후, 형질전환 세포는 저염 LB 한천배지(Low salt Luria-Bertani Agar Medium ; 배지 1리터 당 10g 트립톤, 5g 염화나트륨, 5g 효모추출물, 15g 한천, 수산화나트륨(NaOH)을 이용하여 pH 7.5로 조정 + 25 ㎍/mL 제오신(Zeocin™))에서 배양하였다. 선별한 형질전환체로부터 플라스미드(plasmid) DNA를 추출한 후, DNA 염기서열을 확인하여 파이테즈를 발현시킬 수 있는 재조합 플라스미드 pPICZα A-POX 벡터를 최종 선발하였다 (도 4 및 도 5 참조).

제 3 단계: 피치아 파스토리스 GS115 또는 KM71의 형질 전환

16 시간 배양한 E.coli Top10F' / pPICZαA-POX 세포에서 Promeaga 사의 Wizard plasmid purification Kit로 벡터 DNA를 정제하였다. 50 ㎍ 정제 DNA를 형 질전환 효율을 높이기 위해 BglII 제한효소로 처리하여 선형으로(linearized) 만들어 준 후, 제한효소 반응액과 동일한 부피의 페놀:클로로포름:아이소아밀알코올 (25:24:1) 용액 처리과정으로 단백질을 제거하고, 1/10 부피의 3M 초산나트륨(sodium acetate), pH 5.2 용액과 2 배 부피의 에탄올을 처리하여 침전농축하였다.

숙주균주인 피치아 파스토리스 GS115(인비트로젠(INVITROGEN)사 제품, 카달로그 번호 C181-00) 또는 KM71(인비트로젠사 제품, 카달로그 번호 C183-00) 효모는 YPD 배지(배지 1 리터 당 10 g 효모추출물(Yeast extract), 20g 펩톤(Peptone), 20g 포도당(Dextrose), pH 5.8) 50mL에 접종하여 대략 20 시간동안 30 ℃에서 200 rpm으로 진탕 배양한 다음 0.5mL을 500mL의 YPD 배지 (2L 플라스크)에 접종하고 600nm에서 흡광도(OD600)가 1.3 에 도달할 때까지 30 ℃에서 200 rpm으로 진탕 배양하였다. 배양액을 4 ℃에서 1,500 x g 로 5분간 원심분리한 후, 500mL의 냉각된 멸균 증류수로 펠렛(pellet)을 현탁하여 동일 조건으로 원심분리하고 재차 250mL의 냉각된 멸균 증류수로 동일 과정을 반복한다. 최종 부피가 1.5mL이 되게 냉각된 멸균 증류수로 최종 세포를 현탁하여 컴피턴트 세포(competent cell)를 만들었다. 이 컴피턴트 세포 80 ㎕과 선형 DNA 10 ㎍을 섞어 0.2 cm 전기천공용 큐벳(electroporation cuvette)에 넣고 얼음에서 5분간 정치 후 1500 volt, 200 Ω 에서 전기천공을(electroporation)하여 형질전환시켰다. 전기천공 후, 즉시 1 mL의 1 M 솔비톨(sorbitol)을 붓고 멸균된 15 mL 코니컬 튜브(conical tube)에 옮긴 후 30℃ 배양기에서 대략 150 rpm으로 1시간동안 진탕배양한다. 배양을 마치면 YPDS-zeocin 한천배지(YPD + 1M Sorbitol + 100 ㎍/mL Zeocine, pH 6.5)에 100 ~ 300 ㎕ 씩 형질전환 세포를 도말하여 30 ℃에서 대략 2 ~ 4일, 콜로니(colony)가 형성될 때까지 배양하였다.

제 4 단계 : 피치아 파스토리스 형질전환체의 선발(screening)

제오신 저항성 균주 중에서 재조합 파이테즈 발현 균주의 선발은 MMH-Phytate 한천배지를 이용하여 수행하였다. 본 발명에서 사용한 MMH-Phytate 한천배지의 조성과 제법(배지 1 리터 당)은 하기와 같다.

20 g 의 한천(Bacto Agar)을 750 mL 의 증류수에 녹이고 증기멸균 (Autoclave)한다. 멸균이 끝나면 항온수조에서 60℃로 냉각한다. 5 mL의 2 % 미오이노시톨(myo-Inositol) 증기멸균 용액, 15 mL의 20 % 염화 칼슘(CaCl₂) 증기멸균 용액, 30 mL의 20 % 나트륨 파이틱산(Na-Phytate), pH 6.0 여과멸균 용액을 교반하면서 순차적으로 첨가하여 반응시킨다. 나트륨 파이틱산이 첨가됨에 따라 흰색 침전물이 발생한다. 침전물의 크기가 미세하고 균일하도록 용액을 천천히 일정하게 첨가하도록 한다. 100 mL의 10X YNB (13.4% Yeast Nitrogen Base with amino acids), 2 mL의 500X Biotin (0.02% Biotin), 100 mL의 10X Methanol (5% Methanol) 용액을 교반하면서 첨가한다. YPD-zeocin 한천배지에서 형성된 콜로니를 0.2mL 파이펫 팁(pipette tip)으로 MMH-Phytate 한천배지에 옮겨 배양하였다. 그 결과 파이테즈의 작용으로 인해 투명환이 발생하며, 이 투명환의 크기로서 파이테즈 발현능이 우수한 균주를 선발하였다.

제 5 단계 : 피치아 파스토리스 pPICZαA-POX의 파이테즈 발현 여부 조사

상기 제 4 단계에서 선발된 균주들을 플라스크 액체 배양을 통해 파이테즈 정량 분석 실험(phytase assay)을 실시하였다. 50 mL의 GMMY 배지(Invitrogen)가 들어있는 500 mL 배플 플라스크(baffle flask)에 선발 균주를 접종하고, 24시간 동안 배양하였다. 1 mL의 배양액을 시료로 취하고, 50X 메탄올을 최종 0.5%농도가 되게 첨가하여 파이테즈의 발현을 유도하였다. 첫 메탄올 발현 유도 이후, 72시간 까지 매 24시간 마다 메탄올 첨가를 반복하였다. 시료는 12,000 x g에서 5분간 원심분리하여 취한 상층액(supernatant)으로 파이테즈 효소 역가 분석, 단백질 정량을 수행하고, 펠렛(pellet)으로 세포중량(wet cell weight)을 측정하였다.

파이테즈 효소 역가 분석은 배양 시료의 상층액을 0.1 M 구연산 나트륨(Sodium citrate), pH 5.5 완충액에 0.25% 나트륨 파이틱산(Sigma)가 용해된 기질용액에 넣어 1 mL이 되게 하고, 이 용액을 37℃에서 30분간 반응시킨 후, 1mL의 5% 삼염화초산(trichloroacetic acid) 용액을 첨가하여 반응을 종료하였다. 종료된 시료에서 100㎕를 취하여 900㎕의 증류수에 희석한 후, 1 mL의 발색시약 (0.5% 암모늄 몰리브데이트 : 0.6M 황산 : 2% 아스코르빈산)을 첨가하여 50 ℃에서 10분간 발색반응을 수행하고, 820 nm에서의 흡광도로 유리된 무기인(inorganic phosphate)을 정량하였다. 파이테즈 효소 역가 1 Unit 는 상기 조건하에서 1분 동안 1 mole 의 무기인산을 유리하는 효소의 양으로 정의하였다.

단백질은 Bio-Rad 사의 Protein Assay Kit를 이용하여 595nm에서 흡광도로 정량하였다. 1mL 의 배양액(broth)을 12,000 x g에서 10분간 원심분리하고, 펠렛을 회수하여 80℃에서 2시간 동안 건조한 후, 건조세포중량을 측정하였다.

실시예 3 : 재조합 파이테즈의 생산 및 특성 조사

제 1 단계 : 7 리터 발효조에서 재조합 파이테즈의 생산

플라스크 실험을 거쳐 파이테즈 발현능이 우수한 균주로서, 피치아 파스토리스 GS115/pPICZαA-POX 균주를 최종 선발하였다. 상기 형질전환 균주 피치아 파스토리스 GS115/pPICZαA-POX (Pichia pastoris GS115/pPICZαA-POX)는 한국생명공학연구원 유전자원센터(KCTC)에 2002년 11월 27일자로 기탁하여 기탁번호 KCTC-10386BP를 부여받았다.

상기 균주를 실험실 수준의 발효조에서 배양하여 그 특성을 살펴보았다. 본 발명에서 사용한 발효실험은 Invitrogen™ 사의 피치아 발효지침에 따라 수행하였다. 선발 균주를 MGY 배지 100ml에 접종하여 30℃에서 20시간 진탕배양 후, 2 L 발효 배지에 접종한다. 24시간 글리세롤 회분발효 후, 4시간 정도 글리세롤로 유가배양하고, 70시간 정도의 메탄올 유가배양을 수행하였다. 유가배양시 배지의 첨가는 용존산소량(DO)을 기준으로 결정하였다. 대략 12시간 간격으로 시료를 취하고, 파이테즈 효소역가, 단백질 농도, 세포중량등을 분석하였다.

발효가 종료된 후, 파이테즈 효소역가는 470 U/mL, 단백질 농도는 1.1 g/L, 건조전세포중량 (WCW, wet cell weight)은 350g/L, 건조세포 중량(DCW, dry cell weight)은 90 g/L 수준으로 분석되었다(도 6 참조). 또한 음이온 세제인 SDS를 포함하는 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동(SDS-PAGE)을 통해 발효 배양액을 분석한 결과, 64.6 KDa의 분자량을 갖고 있음을 확인하였다(도 7 참조).

PSS 용액(0.2% α-naphtyl phosphate, 0.1% Fast Garnet GBC, 50 mM 초산나트륨 용액, pH 5.2)으로 전기영동을 수행한 겔을 반응시켜서 효소활성을 확인하는 자이모그램(Zymogram) 실험을 수행한 결과, SDS-PAGE에서 예상한 동일한 위치에서 포스파타아제 활성이 확인되었다(도 7 참조). 파이테즈 역시 포스파타아제의 일종이므로 상기의 자이모그램 실험은 파이테즈의 활성에 의한 것이라고 보는 것이 타당하다.

제 2 단계 : 재조합 파이테즈의 N-말단 아미노산 서열분석

SDS-PAGE 분석에서 파이테즈이외의 단백질 밴드가 거의 보이지 않아 SDS-PAGE 후에 단백질을 PVDF 막에 전기영동방법으로 옮긴 후 파이테즈 밴드 부분만 절단하여 N-말단 아미노산의 서열을 분석하였다.

재조합 POX 파이테즈 효소의 분자량과 N- 말단 아미노산 서열

	분자량	N- 말단 아미노산 서열
DNA 분석 이론 예상치	49 kDa	Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Phe-Arg-Thr-Cys-Asp
실험결과	64.6 kDa	Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Phe-Arg-Thr-X*-Asp
주)* 시스테인(Cysteine) 이거나 변형된 아미노산(Modified amino acid)일 가능성이 큼

상기 결과에 따르면, 피치아 파스토리스 GS115/pPICZαA-POX 균주에서 생산된 유전자 재조합 파이테즈는 정상적으로 발현되었고, 예상했던 Kex 2 시그널 절단부위(Glu-Lys-Arg * Glu-Ala-Glu-Ala ; *는 절단부위를 표시)에서 정확히 절단되어 세포외로 분비되었다(도 5 및 도 7 참조). 이론분자량 (49kDa)과 실제측정한 분자 량 (64.6 kDa)의 차이는 약 25%의 당쇄가 부가(glycosylation) 되었음을 의미한다. 피치아 파스토리스 GS115/pPICZαA-POX 균주에서 발현되는 재조합 파이테즈의 아미노산 서열은 도 5와 같다. 밑줄 친 부분은 pPICZαA 벡터에 내재된 알파 메이팅팩터의 분비시그널이며 Kex2에 의해 이 부분이 잘라져 성숙한 POX 단백질이 분비된다.

제 3 단계 : 재조합 파이테즈의 효소특성 분석

재조합 파이테즈의 pH가 효소역가에 미치는 영향을 글리신산염(pH 2.0 ~ 3.5), 구연산나트륨(pH 4.0 ~ 6.5), 트리스산염(pH 7.0 ~ 8.5) 완충액등을 0.2 M 농도로 조제하여 조사하였다. 실험결과 피치아 파스토리스에서 생산한 재조합 파이테즈는 pH 5.5에서 최적 pH(optimum pH)를 가지며, pH 4.5에서 pH 6.6 까지 이르는 범위에서는 총활성의 60% 정도의 활성을 보여준다.

재조합 파이테즈의 최적 온도는 4℃에서부터 80℃까지의 범위에서 조사하였다. 실험결과 피치아 파스토리스에서 생산한 재조합 파이테즈는 50℃에서 최적 온도를 나타내며, 대략 30℃ 에서 60℃ 까지 50%의 활성을 보여준다. 상기 실험은 실시예 2의 제 5단계에서 기술한 방법으로 파이테즈 효소 역가를 측정하였다.

P. pastoris pPICZαA-POX에서 발현된 재조합 파이테즈의 효소활성

구분	단백질 농도(mg/ml)	효소 역가(U/ml)	특이적 활성도(U/mg)
상층액	1.1	470	427
주) pH 5.5, 37℃에서 30분간 반응 시켰으며 1unit은 무기인을 1분에 1 μmol 분리해 낼 수 있는 효소의 양으로 정의한다.

조효소액의 효소역가가 427unit/mg 으로 기존에 알려진 곰팡이 파이테즈와 비교하여 매우 높았다. 현재까지 알려진 효소역가가 가장 높은 것은 담자균류에 속하는 곰팡이 4종 (Peniophora lycii, Agrocybe pediades, Ceriporia sp., Trametes pubescens)으로부터 분리한 파이테즈로 400-1200 Unit/mg 이었다[참조: Appl Environ Microbiol 67:4701-7 (2001)]. 파이테즈 시장을 선점하여 시장점유율이 가장 높은 Natuphos(네덜란드 BASF사) 는 아스퍼길루스 나이거로부터 유래한 파이테즈인데 효소활성이 100 unit/mg 으로 낮다. 다른 곰팡이 파이테즈의 역가는 8-190 unit/mg 정도로 다양하다. 따라서 본 발명에 의한 POX 파이테즈는 상기한 담자균류의 효소활성과 비슷할 정도로 높은 활성을 지닌 신규한 파이테즈로 분류할 수 있다.

이상의 실시예를 통하여 기술한 바와 같이 본 발명은 매우 효율적으로 신규 파이테즈 효소 유전자를 다수의 곰팡이 균주로부터 검색하는 방법을 고안하여 실증하였고 이렇게 얻어진 파이테즈 유전자 중 하나인 페니실리움 옥살리쿰 POX 파이테즈 유전자를 다량으로 발현하는 벡터시스템, pPICZαA-POX을 구축하여 피치아 파스토리스(Pichia pastoris) 효모균주에 도입하여 형질전환시킴으로써 다량의 역가가 뛰어난 재조합 파이테즈 효소를 생산하는 균주를 선발하였다. 본 발명에서 상기한 신규 유전자를 찾는 방법은 파이테즈 뿐만 아니라 기타 효소류의 선발에도 유용하게 적용될 수 있는 방법이며 또한 이 재조합 파이테즈는 사료 첨가물로 사용시 단위 동물의 분뇨 내 인의 배설량을 감소시키고 곡물류의 소화율을 개선하는 효과가 있을 것으로 기대되어 본 발명은 축산업 및 환경보전 산업상 매우 유용한 발명인 것이다.

<110> Choongan Co.,Ltd <120> A novel phytase gene derived from Penicillium oxalicum and a Pichia pastoris transformant producing the phytase <160> 7 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for degenerate PCR <400> 1 tgggghcavt aykcgccntw cttytc 26 <210> 2 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for degenerate PCR <400> 2 gttdccbscr ccrtrgccgt agtaytt 27 <210> 3 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for Inverse PCR <400> 3 caagacttgg acaaaggtga gctcgc 26 <210> 4 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for Inverse PCR <400> 4 ttcaccgaca ccgagtggtc ccag 24 <210> 5 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for POX cloning <400> 5 ttgaattccg tacctgtgat accggtgacg gtggc 35 <210> 6 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for POX cloning <400> 6 ttcactttga agaaacgcca catt 24 <210> 7 <211> 1942 <212> DNA <213> phytase derived from Penicillium oxalicum <400> 7 gagaattgat tcatcttccg ggatcctctc gtttccttct ccccttttct tgatttcctt 60 tcgccatgca cgatccgcgg tgacaaacca cactatccga cgcacgcgcg ggaatatcat 120 atcctcaact accgcatctt ggctaccgcg gctggctgga aaatgacaga tctttaccga 180 ggagacatgt cccatctggt cgaaaagcag gaccttttga gtatctctcc atattctgga 240 agttatgacc accactcctc tcacaggaaa cctcgttcct tggcgaccag atgtttgaca 300 ttgctcttcg ctctggtcct actcgtggcg gggtacgtga tcgctggcca cggactctca 360 ctctcgcgag aggtggctac gaatgatgaa gcccgagccc gtccaggttc agacgcgtcg 420 aacataccgg caaggcccgc agtcaaacag gtctcacatc gtgttcggac ctgtgacacc 480 gtcgacggtg gctatcaatg tttcccgcag ctgtcccatc gatggggcca gtattcgcca 540 tacttttctc ttgccaacac tggccttccc agtgaagtgc ccgagaagtg cgagctcacc 600 tttgtccaag tcttgtctcg tcatggcgca cggtatccca cggcgtccaa gagcaaaaag 660 tacaaatctc tcatccaggc catccaagcc aacgcgacag cctacaatgg tcaaagtgca 720 ttcctgcgtg cctacaatta tacgttggga agcgaggatt tgacctcctt tggcgagcac 780 caaatgatca actccgggat caagttctac cagcgctatg cggccctgac tcgcgaccac 840 gtccccttta tccgctcttc agactcatcg cgcgtggtcg cctcgggtca actgttcatt 900 caaggctatg aacaatccaa ggcacaagat tgtgatgcgg atcacagtca agatcacgca 960 gccatcaatg tgctaatctc cgaagccccc ggtgccgaca acaccctcaa tcgcaatacc 1020 tgcgcggcct ttgaagccga taagctcggc gaccaggtct cggcgaaata cacggctctc 1080 attgcacccc ctatggtcca acgcctacac catgatctcc caggcgtcac cctcaccaac 1140 gaccaagtca tatacctcat ggacatgtgc gcctacgaca ccgtctcaag caccccaggc 1200 gcaacctccc tctcgccctt ctgcgccctc ttcaccgaca ccgagtggtc ccagtacaac 1260 taccttcagt ccctcggcaa atactacggt tacggcgccg gcaaccccct cggtccaacc 1320 caaggcgtgg gattcatcaa cgagctcatc gcccgcatga ctcattcccc cgtccacgac 1380 cacaccacca gcaatcgcac cctcgacgca ccaggcgcag actcgttccc caccaaccgc 1440 accctctacg cggatttcac ccacgataac ggcatgatcc ccatcttctt cgccctgggc 1500 ttgtacaatg gatcagaccc gctgccgctc gatcgcatcg tgcctgccac acaggcggat 1560 ggatactctg ccgcgtgggc ggtgccattt gcggcgcgcg cctatatcga aatgatgcag 1620 tgtggtcggg acaccgaacc cctggtgcgg gtgttgatca atggtcgagt ggcgccgctc 1680 aagggatgca acgtggatca actgggtcga tgcaagagga gtgattttgt gaatgccttg 1740 agttttgctc aagatggggg caactgggcg aaatgtggcg tttcttcaaa gtgaagaatt 1800 gaaaatgttc ggaatccctt tctctctctc tcttcaagtc gggtcaattt atttattttg 1860 agtcgtggct cgtggcttgt ggctcgtgcg gacgcgaatt gggggattat accatatcat 1920 tactcgatga ttataaaacg tc 1942

Claims

삭제
서열목록 서열번호 1과 2의 프라이머 세트를 이용하여 PCR 기법을 통해 얻은 서열목록 서열번호 7로 표시되는 페니실리움 옥살리쿰(Penicillium oxalicum) KCTC6440 유래의 파이테즈 유전자(POX).
제2항의 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 피치아 파스토리스 GS115/pPICZαA-POX (Pichia pastoris GS115/pPICZαA-POX) KCTC 10386BP.
제3항의 균주로부터 발현되는 것을 특징으로 하는 재조합 파이테즈 효소.