KR100570810B1 - Novel ceramide derivatives, method for preparing the same and use thereof - Google Patents

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KR100570810B1
KR100570810B1 KR1020030065991A KR20030065991A KR100570810B1 KR 100570810 B1 KR100570810 B1 KR 100570810B1 KR 1020030065991 A KR1020030065991 A KR 1020030065991A KR 20030065991 A KR20030065991 A KR 20030065991A KR 100570810 B1 KR100570810 B1 KR 100570810B1
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Abstract

본 발명은 신규 세라마이드 유도체, 이의 제조방법 및 이의 용도에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 하기 화학식 2로 표시되는 세라마이드 유도체, 이의 제조방법, 이를 포함하는 화장료 조성물 및 약학적 조성물에 관한 것이다. The present invention relates to a novel ceramide derivative, a method for producing the same, and a use thereof, and more particularly, to a ceramide derivative represented by the following Chemical Formula 2, a method for preparing the same, a cosmetic composition, and a pharmaceutical composition comprising the same.

<화학식 2><Formula 2>

Figure 112005054495028-pat00001
Figure 112005054495028-pat00001

상기 식에서,Where

R1은 수소 또는 C1-C14의 알킬기이고;R 1 is hydrogen or an alkyl group of C 1 -C 14;

R2는 수소, 하이드록시기 또는 C1-C11의 알킬기이고;R 2 is hydrogen, a hydroxy group or a C1-C11 alkyl group;

R3는 6-메틸 펜타데카-1,5,7-트리엔, 1-하이드록시-노나데카-11-엔 및 노나데카-1,10-다이엔으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나이고; 및R 3 is any one selected from the group consisting of 6-methyl pentadeca-1,5,7-triene, 1-hydroxy-nonadeca-11-ene and nonadeka-1,10-diene; And

R4는 수소 또는 C1-C6의 알콕시기이다.R 4 is hydrogen or an alkoxy group of C 1 -C 6.

세라마이드 유도체, 피부보호, 아폽토시스Ceramide Derivatives, Skin Protection, Apoptosis

Description

신규 세라마이드 유도체, 이의 제조방법 및 이의 용도{Novel ceramide derivatives, method for preparing the same and use thereof} Novel ceramide derivatives, method for preparing the same and use thereof             

도 1은 본 발명에 따른 화합물의 경표피 수분 손실 측정 실험 결과를 나타낸 것이다. Figure 1 shows the results of the measurement of transdermal moisture loss of the compound according to the present invention.

non-UVB: UV 조사하지 않는 경우non-UVB: no UV radiation

UVB: UV 조사 후 무처리UVB: no treatment after UV irradiation

UVB+Cream A: UV 조사 후, 화학식 3으로 표시되는 DNC-16-A를 함유하는 크림 제제 처리UVB + Cream A: After UV irradiation, the cream formulation treatment containing DNC-16-A represented by the formula (3)

UVB+Cream B: UV 조사 후, 화학식 4로 표시되는 DNC-16-B를 함유하는 크림 제제 처리UVB + Cream B: After UV irradiation, cream formulation treatment containing DNC-16-B represented by the formula (4)

UVB+Cream C: UV 조사 후, 화학식 5로 표시되는 DNC-16-C를 함유하는 크림 제제 처리UVB + Cream C: After UV irradiation, cream formulation treatment containing DNC-16-C represented by the formula (5)

도 2는 본 발명에 따른 화합물의 세포 독성 효과를 조사하기 위하여, MTT 어세이를 수행한 결과이다. 2 is a result of performing an MTT assay to investigate the cytotoxic effect of the compound according to the present invention.

A: DNC-16-A 처리A: DNC-16-A Treatment

B: DNC-16-B 처리B: DNC-16-B Treatment

C: DNC-16-C 처리C: DNC-16-C Processing

도 3은 본 발명에 따른 화합물의 아폽토시스 유도 효과를 조사하기 위하여, TUNEL 어세이를 2회 수행한 결과를 나타낸 것이다. Figure 3 shows the results of two TUNEL assays to investigate the apoptosis inducing effect of the compounds according to the invention.

도 4는 본 발명에 따른 화합물의 아폽토시스 유도 효과를 조사하기 위하여, 활성형 카스파제-3의 발현 정도를 웨스턴 블럿으로 측정한 결과이다. Figure 4 is a result of Western blot measurement of the expression of the active caspase-3 in order to investigate the apoptosis inducing effect of the compound according to the present invention.

본 발명은 하기 화학식 2로 표시되는 신규 세라마이드 유도체, 이의 제조방법 및 이의 용도에 관한 것이다. The present invention relates to a novel ceramide derivative represented by the following formula (2), a preparation method thereof and a use thereof.

<화학식 2><Formula 2>

Figure 112003035235117-pat00002
Figure 112003035235117-pat00002

상기 식에서,Where

R1은 수소 또는 C1-C14의 알킬기이고;R 1 is hydrogen or an alkyl group of C 1 -C 14;

R2는 수소, 하이드록시기 또는 C1-C11의 알킬기이고;R 2 is hydrogen, a hydroxy group or a C1-C11 alkyl group;

R3는 6-메틸 펜타데카-1,5,7-트리엔, 1-하이드록시-노나데카-11-엔 및 노나데카-1,10-다이엔으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나이고; 및R 3 is any one selected from the group consisting of 6-methyl pentadeca-1,5,7-triene, 1-hydroxy-nonadeca-11-ene and nonadeka-1,10-diene; And

R4는 수소 또는 C1-C6의 알콕시기이다.R 4 is hydrogen or an alkoxy group of C 1 -C 6.

세라마이드는 자연적으로 존재하는 스핑고리피드(sphingolipids)계 화합물로서, 구체적으로는 하기 화학식 1로 표시되는 N-팔미틸 스핑고신(N-palmityl sphingosine)이다. 세라마이드는 지방산 라디칼에 아미노그룹이 존재하는 특징이 있다.Ceramides are naturally occurring sphingolipids-based compounds, specifically N-palmityl sphingosine represented by the following formula (1). Ceramides are characterized by the presence of amino groups in fatty acid radicals.

<화학식 1><Formula 1>

Figure 112003035235117-pat00003
Figure 112003035235117-pat00003

세라마이드는 주로 세포막 구성 인지질의 일종인 스핑고마이엘린(sphingomyelin; SM)으로부터 스핑고마이엘리나제(sphingomyelinase; SMase)라는 효소의 가수분해 작용에 의해 생성되며, 피부 각질층에 존재하는 주요 성분이다. 사람의 피부의 표면은 기저층으로부터 분화되어 성숙된 각질형성세포(keratinocytes)가 퇴화된 각질세포(corneocytes)로 보호되어 있으며, 이들 각질세포들은 각질층에 다량 존재하는 세라마이드의 이중 사슬 라멜라 구조에 의하여 피부표면에 결합되어 있어서 피부는 탄력성을 유지한다. 그러나, 나이가 들어 피부의 노화가 진행될수록 각질층 내 세라마이드의 함량이 감소되고, 이로 인해 피부 표면에 대한 각질세포의 결합력이 감소되어 피부는 보호를 받지 못한다. 즉, 각질층 내의 세라마이드의 함량이 감소함에 따라 수분의 손실, 자외선이나 화학물질 등의 외부자극에의 노출 및 각질세포 각리현상이 발생하여 피부 표면은 거칠게 된다. 이러한 경우 세라마이드를 외부에서 보충함으로써 피부의 라멜라 구조를 회복시켜 피부를 정상상태로 회복시킬 수 있음이 보고되고 있다. 또한, 세라마이드는 피부에 수분을 공급할 뿐 아니라 피부의 수분이 외부로 빠져나가지 못하게 한다(보습효과). 또한, 세라마이드는 피부 장벽에 매우 중요한 역할을 하며, 피부에 국소 도포된 세라마이드는 손상된 피부 장벽의 회복을 향상시키는 것으로 알려졌다. 현재 세라마이드는 기능성 화장품, 피부 및 모발 보습제 등의 주요 성분으로서 널리 사용되고 있다. Ceramide is produced mainly from the hydrolysis of an enzyme called spingomyelinase (SMase) from sphingomyelin (SM), a kind of cell membrane phospholipid, and is a major component present in the stratum corneum. The skin surface of human is differentiated from the basal layer and the mature keratinocytes are protected by the degenerated corneocytes, and these keratinocytes are protected by the double-chain lamellar structure of ceramide, which is present in large quantities in the stratum corneum. It is bound to the skin to maintain elasticity. However, as the skin ages, the content of ceramide in the stratum corneum decreases as the skin ages, thereby decreasing the adhesion of keratinocytes to the surface of the skin, thereby preventing the skin from being protected. That is, as the content of ceramide in the stratum corneum decreases, loss of moisture, exposure to external stimuli such as ultraviolet rays or chemicals, and keratinocyte keratinization occur, resulting in a rough skin surface. In this case, by supplementing the ceramide externally, it has been reported that the skin may be restored to its normal state by restoring the lamellar structure of the skin. In addition, ceramide not only moisturizes the skin, but also prevents the moisture of the skin from leaking out (moisturizing effect). In addition, ceramides play a very important role in the skin barrier, and ceramides applied topically to the skin are known to enhance the recovery of damaged skin barriers. Ceramide is widely used as a major component of functional cosmetics, skin and hair moisturizers.

한편, 세라마이드가 세포의 막 구조를 형성하는 주요지질로서의 단순한 구조적인 기능 이외에 최근에 세포 분화 조절자 및 신호전달체계의 중간 전달 물질로서의 역할 등 다양한 생리활성 기능을 보유하고 있음이 밝혀지고 있다. 세라마이드 및 이의 유도체가 아폽토시스(apoptosis)를 촉진하며, 암세포의 증식을 억제하는 2차 전달 물질로 작용함이 밝혀졌다(Macchia M. et al., Farmaco. 58(3):205-11, 2003; Kimura K. et al., Cell Death Differ. 10(2):240-8, 2003; Kilkus J. et al., J. Neurosci. Res. 1;72(1):65-75, 2003). 세라마이드에 의한 아폽토시스는 크게 2가지 요인에 의하여 이루어지는데, 하나는 TNF와 같은 사이토카인(cytokine) 에 의해 활성화된 중성 스핑고마이엘리나아제에 의해 세라마이드가 생성되어서 일어나는 경우와 다른 하나는 방사선, UV, 또는 H2O2 등과 같은 스트레스에 의해 활성화된 산성 스핑고마이엘리나아제에 의해 세라마이드가 생성되어서 일어나는 경우이다. 상기 두 경우 모두 MAP 키나제(kinase) 경로를 조절하여 카스파제(caspase)를 활성화시킴으로써 궁극적으로 아폽토시스를 유도한다. On the other hand, ceramide has recently been found to possess various physiologically active functions such as a cell differentiation regulator and a role as an intermediate transporter of a signaling system in addition to a simple structural function as a major lipid to form a cell membrane structure. Ceramide and its derivatives have been found to promote apoptosis and act as secondary delivery agents that inhibit the proliferation of cancer cells (Macchia M. et al ., Farmaco . 58 (3): 205-11, 2003; Kimura K. et al ., Cell Death Differ . 10 (2): 240-8, 2003; Kilkus J. et al., J. Neurosci.Res . 1; 72 (1): 65-75, 2003). Apoptosis by ceramides is largely caused by two factors, one of which is caused by the production of ceramides by neutral sphingomyelinase activated by cytokines such as TNF. Or when ceramide is produced by acidic sphingomyelinase activated by stress such as H 2 O 2 . In both cases, apoptosis is ultimately induced by regulating the MAP kinase pathway to activate caspases.

이와 같이 세라마이드의 다양한 생리학적 기능이 보고됨에 따라 천연 동식물 및 미생물계에서 신규 세라마이드 또는 이의 유도체를 분리하려는 시도가 계속되고 있다. 이에, 본 발명자들은 신규 세라마이드를 분리하기 위해 연구를 거듭하던 중, 불가사리로부터 신규 세라마이드 유도체를 분리하고, 이의 생리학적 기능을 규명함으로써 본 발명을 완성하였다. As such various physiological functions of ceramides are reported, attempts to separate new ceramides or derivatives thereof from natural animals and plants and microorganisms continue. Accordingly, the present inventors have completed the present invention by separating the new ceramide derivative from the starfish and clarifying its physiological function while repeatedly studying to separate the new ceramide.

본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 신규 세라마이드 유도체, 이의 제조방법 및 이의 용도를 제공하는 것이다.
The technical problem to be achieved by the present invention is to provide a novel ceramide derivative, its preparation method and its use.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기 화학식 2로 표시되는 세라마이드 유도체를 제공한다.In order to achieve the above object, the present invention provides a ceramide derivative represented by the following formula (2).

Figure 112003035235117-pat00004
Figure 112003035235117-pat00004

상기 식에서,Where

R1은 수소 또는 C1-C14의 알킬기이고;R 1 is hydrogen or an alkyl group of C 1 -C 14;

R2는 수소, 하이드록시기 또는 C1-C11의 알킬기이고;R 2 is hydrogen, a hydroxy group or a C1-C11 alkyl group;

R3는 6-메틸 펜타데카-1,5,7-트리엔, 1-하이드록시-노나데카-11-엔 및 노나데카-1,10-다이엔으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나이고; 및R 3 is any one selected from the group consisting of 6-methyl pentadeca-1,5,7-triene, 1-hydroxy-nonadeca-11-ene and nonadeka-1,10-diene; And

R4는 수소 또는 C1-C6의 알콕시기이다.R 4 is hydrogen or an alkoxy group of C 1 -C 6.

또한, 본 발명은 상기 세라마이드 유도체의 제조방법을 제공한다.The present invention also provides a method for preparing the ceramide derivative.

본 발명은 상기 세라마이드 유도체 또는 이의 염을 함유하는 화장료 조성물을 제공한다.The present invention provides a cosmetic composition containing the ceramide derivative or a salt thereof.

나아가, 본 발명은 상기 세라마이드 유도체 또는 이의 염을 함유하는 피부질환 또는 암 치료용 약학적 조성물을 제공한다. Furthermore, the present invention provides a pharmaceutical composition for treating skin diseases or cancer containing the ceramide derivative or salt thereof.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail.

본 발명은 불가사리로부터 분리된 신규 세라마이드 유도체를 제공한다는 점에 특징이 있다. 본 발명에 따른 세라마이드 유도체는 하기 화학식 2로 표시된다.The invention is characterized in that it provides a novel ceramide derivative isolated from the starfish. The ceramide derivative according to the present invention is represented by the following formula (2).

<화학식 2><Formula 2>

Figure 112003035235117-pat00005
Figure 112003035235117-pat00005

상기 식에서,Where

R1은 수소 또는 C1-C14의 알킬기이고;R 1 is hydrogen or an alkyl group of C 1 -C 14;

R2는 수소, 하이드록시기 또는 C1-C11의 알킬기이고;R 2 is hydrogen, a hydroxy group or a C1-C11 alkyl group;

R3는 6-메틸 펜타데카-1,5,7-트리엔, 1-하이드록시-노나데카-11-엔 및 노나데카-1,10-다이엔으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나이고; 및R 3 is any one selected from the group consisting of 6-methyl pentadeca-1,5,7-triene, 1-hydroxy-nonadeca-11-ene and nonadeka-1,10-diene; And

R4는 수소 또는 C1-C6의 알콕시기이다.R 4 is hydrogen or an alkoxy group of C 1 -C 6.

본 발명에 따른 바람직한 화합물은 R1이 C14의 알킬기, R2가 하이드록시기, R3가 6-메틸 펜타데카-1,5,7-트리엔(6-methyl pentadeca-1,5,7-triene), R4가 수소인 하기 화학식 3으로 표시될 수 있다.Preferred compounds according to the invention are those in which R 1 is a C14 alkyl group, R 2 is a hydroxy group, R 3 is a 6-methyl pentadeca-1,5,7-triene (6-methyl pentadeca-1,5,7- triene), and R 4 is hydrogen.

<화학식 3><Formula 3>

Figure 112003035235117-pat00006
Figure 112003035235117-pat00006

상기 화학식 3으로 표시되는 화합물(이하, 'DNC-16-A'라 함)의 물리적/분광학적 특성은 다음과 같다.Physical and spectroscopic properties of the compound represented by Chemical Formula 3 (hereinafter, referred to as 'DNC-16-A') are as follows.

1. 분자식: C35H65NO4 Molecular Formula: C 35 H 65 NO 4

2. 분자량: 5632. Molecular Weight: 563

3. 물질의 성상: 무색의 무정형고체 형태 물질3. Properties of matter: Colorless amorphous solid substance

4. 녹는점: 68-70℃4. Melting Point: 68-70 ℃

5. 적외선 흡수대(KBr): 3317, 2918, 2849, 1650, 1540, 1450, 1409 cm-1 5.Infrared absorption band (KBr): 3317, 2918, 2849, 1650, 1540, 1450, 1409 cm -1

6: 자외선 흡수대(MeOH): λ=235nm (ε 4.52)6: UV absorption band (MeOH): λ = 235 nm (ε 4.52)

7: 1H 및 13C-NMR: 표 1 참조7: 1 H and 13 C-NMR: see Table 1

8. 용해성: 클로로포름, 아세톤, 메탄올 등의 중정도 극성 및 극성 유기용매에 잘 녹는다.8. Solubility: Soluble in moderate polar and polar organic solvents such as chloroform, acetone and methanol.

9. 화학 구조상의 특징: 지방산의 탄소수가 16개이고, 스핑고신 영역에 메틸 부타디엔(methyl butadiene) 기가 있다.9. Chemical Structural Features: Fatty acids have 16 carbon atoms and methyl butadiene groups in the sphingosine region.

또한, 본 발명에 따른 바람직한 화합물은 R1이 C14의 알킬기, R2가 하이드록시기, R3가 1-하이드록시-노나데카-11-엔(1-hydroxy-nonadeca-11-ene), R4가 수소인 하기 화학식 4로 표시될 수 있다.In addition, preferred compounds according to the invention are those in which R 1 is a C14 alkyl group, R 2 is a hydroxy group, R 3 is a 1-hydroxy-nonadeca-11-ene (1-hydroxy-nonadeca-11-ene), R It may be represented by the formula (4) 4 is hydrogen.

<화학식 4><Formula 4>

Figure 112003035235117-pat00007
Figure 112003035235117-pat00007

상기 화학식 4로 표시되는 화합물(이하, 'DNC-16-B'라 함)의 물리적/분광학적 특성은 다음과 같다.Physical and spectroscopic properties of the compound represented by Chemical Formula 4 (hereinafter, referred to as 'DNC-16-B') are as follows.

1. 분자식: C38H75NO5 Molecular Formula: C 38 H 75 NO 5

2. 분자량: 6252. Molecular Weight: 625

3. 물질의 성상: 무색의 고형물질3. Nature of matter: Colorless solid substance

4. 녹는점: 135-137℃4. Melting Point: 135-137 ℃

5. 적외선 흡수대(KBr): 3313, 2919, 2850, 1634, 1545, 1457 cm-1 5. Infrared absorption band (KBr): 3313, 2919, 2850, 1634, 1545, 1457 cm -1

6: 자외선 흡수대(MeOH): 200 - 600nm 범위에서 미검출됨6: Ultraviolet absorption band (MeOH): not detected in the range of 200-600 nm

7: 1H 및 13C-NMR: 표 2 참조7: 1 H and 13 C-NMR: see Table 2

8. 용해성: 클로로포름, 아세톤, 메탄올 등의 중정도 극성 및 극성 유기용매 에 잘 녹는다.8. Solubility: Soluble in moderate polar and polar organic solvents such as chloroform, acetone and methanol.

9. 화학 구조상의 특징: 지방산에 있는 탄소수가 16개이고, 스핑고신 영역에서 탄소 4 위치에 하이드록시기가 있고, 탄소 14 위치에 이중 결합이 있다. 9. Chemical Structural Features: The fatty acid has 16 carbon atoms, a hydroxy group at the carbon 4 position in the sphingosine region, and a double bond at the carbon 14 position.

나아가, 본 발명에 따른 바람직한 화합물은 R1이 C14의 알킬기이고, R2가 하이드록시기, R3가 노나데카-1,10-다이엔(nonadeca-1,10-diene), R4가 수소인 하기 화학식 5로 표시될 수 있다.Furthermore, preferred compounds according to the invention are those in which R 1 is an alkyl group of C14, R 2 is a hydroxy group, R 3 is a nonadeca-1,10-diene, and R 4 is hydrogen Phosphorus may be represented by the following Formula 5.

<화학식 5><Formula 5>

Figure 112005054495028-pat00020
Figure 112005054495028-pat00020

상기 화학식 5로 표시되는 화합물(이하, 'DNC-16-C'이라 함)의 물리적/분광학적 특성은 다음과 같다.Physical and spectroscopic properties of the compound represented by Chemical Formula 5 (hereinafter, referred to as 'DNC-16-C') are as follows.

1. 분자식: C38H73NO4 Molecular Formula: C 38 H 73 NO 4

2. 분자량: 6072. Molecular Weight: 607

3. 물질의 성상: 무색의 반고형 물질3. Appearance of material: colorless semi-solid material

4. 녹는점: 64-67℃4. Melting Point: 64-67 ℃

5. 적외선 흡수대(KBr): 3364, 2921, 2845, 1647, 1450, 1414, 1112 cm-1 5.Infrared absorption band (KBr): 3364, 2921, 2845, 1647, 1450, 1414, 1112 cm -1

6: 자외선 흡수대(MeOH): 200 - 600nm 범위에서 미검출됨6: Ultraviolet absorption band (MeOH): not detected in the range of 200-600 nm

7: 1H 및 13C-NMR: 표 3 참조7: 1 H and 13 C-NMR: see Table 3

8. 용해성: 클로로포름, 아세톤, 메탄올 등의 중정도 극성 및 극성 유기용매에 잘 녹는다.8. Solubility: Soluble in moderate polar and polar organic solvents such as chloroform, acetone and methanol.

9. 화학 구조상의 특징: 지방산에 있는 탄소수가 16개이며, 스핑고신 영역에서 탄소 4 및 14 위치에 이중 결합이 있다. 9. Chemical Structural Features: The fatty acid has 16 carbon atoms and double bonds at carbon 4 and 14 positions in the sphingosine region.

본 발명에 따른 화합물은 염, 바람직하게는 약학적으로 허용 가능한 염의 형태로 사용될 수 있다. 상기 염으로는 약학적으로 허용가능한 유리산(free acid)에 의해 형성된 산 부가염이 바람직하다. 상기 유리산으로는 유기산과 무기산을 사용할 수 있다. 상기 유기산은, 이에 제한되는 것은 아니나, 구연산, 초산, 젖산, 주석산, 말레인산, 푸마르산, 포름산, 프로피온산, 옥살산, 트리플루오로아세트산, 벤조산, 글루콘산, 메탄술폰산, 글리콜산, 숙신산, 4-톨루엔술폰산, 글루탐산 및 아스파르트산을 포함한다. 또한, 상기 무기산은, 이에 제한되는 것은 아니나, 염산, 브롬산, 황산 및 인산을 포함한다. The compounds according to the invention can be used in the form of salts, preferably pharmaceutically acceptable salts. As such salts, acid addition salts formed with pharmaceutically acceptable free acids are preferred. Organic acids and inorganic acids may be used as the free acid. The organic acid is, but is not limited to, citric acid, acetic acid, lactic acid, tartaric acid, maleic acid, fumaric acid, formic acid, propionic acid, oxalic acid, trifluoroacetic acid, benzoic acid, gluconic acid, methanesulfonic acid, glycolic acid, succinic acid, 4-toluenesulfonic acid , Glutamic acid and aspartic acid. In addition, the inorganic acid includes, but is not limited to, hydrochloric acid, bromic acid, sulfuric acid and phosphoric acid.

본 발명은 상기 화합물의 제조 방법을 제공한다. 본 발명에 따른 방법은 하기의 단계를 포함한다:The present invention provides a method for preparing the compound. The method according to the invention comprises the following steps:

(a) 불가사리를 유기용매로 추출하는 단계;(a) extracting the starfish with an organic solvent;

(b) 상기 (a) 단계에서 얻은 추출물을 감압농축한 후, 메탄올과 헥산의 혼합용매로 극성에 따라 분획하여 활성분획을 얻는 단계; 및(b) concentrating the extract obtained in step (a) under reduced pressure, and then fractionating according to polarity with a mixed solvent of methanol and hexane to obtain an active fraction; And

(c) 상기 활성분획을 크로마토그래피로 분리 정제하는 단계.(c) separating and purifying the active fraction by chromatography.

상기 (a) 단계는 불가사리로부터 본 발명에 따른 화합물을 추출하는 단계로서, 본 발명에 따른 화합물은 바람직하게는 디스톨아스테리아스 니폰(Distolasterias nipon)으로부터 추출되는 것이 바람직하다. 또한, 추출에 사용되는 유기용매는, 이에 제한되는 것은 아니나, 메탄올, 에탄올, 클로로포름, 아세톤 및 디클로로메탄으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있다. 바람직한 유기용매는 메탄올이다. 구체적으로 본 발명에서는 디스톨아스테리아스 니폰을 절단한 후, 메탄올을 가하여 48시간 동안 방치함으로써 본 발명에 따른 화합물을 추출하였다. The step (a) is a step of extracting the compound according to the present invention from the starfish, the compound according to the present invention is preferably extracted from Distolasterias nipon ( Distolasterias nipon ). In addition, the organic solvent used for extraction may be, but is not limited to, one or more selected from the group consisting of methanol, ethanol, chloroform, acetone and dichloromethane. Preferred organic solvents are methanol. Specifically, in the present invention, the compound according to the present invention was extracted by cleaving the distorasteria nipon, and then adding methanol to stand for 48 hours.

상기 (b) 단계는 추출물로부터 활성분획을 얻는 단계로서, 상기 혼합용매는 메탄올 50-80%와 헥산 20-50%로 이루어진 용매가 바람직하다. 구체적으로 본 발명에서는 (a) 단계로 얻은 추출물을 메탄올 80%와 헥산 20%으로 이루어진 혼합 용매에 용해시키고 2시간 이상 방치하여 메탄올층과 헥산층으로 분획하였다. 이후, 수소 핵자기 공명 분광 스펙트럼으로 각 층에 함유되어 있는 물질을 확인하였다. The step (b) is to obtain an active fraction from the extract, the mixed solvent is preferably a solvent consisting of 50-80% methanol and 20-50% hexane. Specifically, in the present invention, the extract obtained in step (a) was dissolved in a mixed solvent consisting of 80% methanol and 20% hexane, and left to stand for 2 hours or more and fractionated into a methanol layer and a hexane layer. Subsequently, hydrogen nuclear magnetic resonance spectroscopy confirmed the material contained in each layer.

상기 (c) 단계는 본 발명에 따른 화합물을 분리 정제하는 단계로서, 상기 (b) 단계에서 얻은 세라마이드를 포함하고 있는 활성분획(헥산층)을 크로마토그래피로 분리한다. 이 때 크로마토그래피로는 실리카 크로마토그래피(silica vaccum chromatography), 역상 반-분취 고성능 액체 크로마토그래피(reversed-phased semi-preparative HPLC) 및 C18 역상 반-분취 고성능 액체 크로마토크래피(C18 reversed-phased semi-preparative HPLC)를 순차적으로 행하는 것이 바람직하다. 실리카 크로마토그래피 수행시에는 용리액으로 헥산, 에틸아세테이트, 아세톤 및 메탄올을 순차적으로 사용하는 것이 바람직하다. 또한, 역상 반-분취 고성능 액체 크로마토 그래피 수행시에는 용리액으로 메탄올을 사용하는 것이 바람직하며, C18 역상 반-분취 고성능 액체 크로마토크래피 수행시에는 용리액으로 메탄올 80%와 아세톤나이트릴 20%로 이루어진 혼합용매를 사용하는 것이 바람직하다. 구체적으로 본 발명에서는 실리카 크로마토그래피를 통해 아세톤층에 세라마이드 성분이 함유되어 있는 것을 확인하였으며, 상기 아세톤층을 역상 반-분취 고성능 액체 크로마토그래피로 분리한 결과 머무름 시간 17분, 22분 및 27분의 분획에 세라마이드 성분이 함유되어 있는 것을 확인하였다. 상기 세라마이드 성분을 더욱 분리 정제하기 위하여 상기 각 활성분획을 대상으로 C18 역상 반-분취 고성능 액체 크로마토크래피를 수행한 결과, 머무름 시간 30분, 20분 및 18분에서 무정형고체 형태의 물질(DNC-16-A), 고형물질(DNC-16-B) 및 무색의 반고형 물질(DNC-16-C)을 각각 얻었다. 이후, 핵자기 공명(nuclear magnetic resonance; NMR) 스펙트럼, 적외선 및 자외선 분광 분석, 고해상 질량 분석 등을 수행하여 각 화합물의 구조를 확인하였다. Step (c) is a step of separating and purifying the compound according to the present invention, and the active fraction (hexane layer) containing the ceramide obtained in step (b) is separated by chromatography. At this time chromatography with silica chromatography (silica vaccum chromatography), reverse-phase semi-preparative high performance liquid chromatography (reversed-phased semi-preparative HPLC ) and C 18 reverse-phase semi-preparative high performance liquid chromatography (C 18 reversed-phased It is preferable to perform semi-preparative HPLC) sequentially. When performing silica chromatography, it is preferable to use hexane, ethyl acetate, acetone and methanol sequentially as the eluent. In addition, it is preferable to use methanol as the eluent when performing reverse phase semi-preparative high performance liquid chromatography, and 80% methanol and 20% acetonitrile as eluent when performing C 18 reverse phase preparative high performance liquid chromatography. It is preferable to use a mixed solvent. Specifically, in the present invention, it was confirmed that the ceramide component was contained in the acetone layer through silica chromatography, and the acetone layer was separated by reverse phase semi-preparative high performance liquid chromatography, and the retention time was 17 minutes, 22 minutes, and 27 minutes. It was confirmed that the ceramide component was contained in the fraction. In order to further separate and purify the ceramide component, C 18 reversed-phase semi-preparative high performance liquid chromatography was performed on each of the active fractions. As a result, the amorphous solid material (DNC) was retained for 30 minutes, 20 minutes and 18 minutes. -16-A), a solid material (DNC-16-B) and a colorless semi-solid material (DNC-16-C) were obtained, respectively. Subsequently, nuclear magnetic resonance (NMR) spectra, infrared and ultraviolet spectroscopic analyzes, high resolution mass spectrometry, and the like were performed to confirm the structure of each compound.

또한, 본 발명은 본 발명에 따른 세라마이드 유도체의 용도를 제공한다. 본 발명에 따른 화합물은 외부자극에 의해 손상된 피부 장벽의 회복 및 피부 보호 효과를 나타낸다. 구체적으로 본 발명의 바람직한 실시예에서는 TEWL(total epidermal water loss) 측정을 통해 본 발명에 따른 화합물이 피부 장벽대(skin barrier) 손상에 의한 경표피 수분 소실을 유의적으로 감소시킴을 확인하였다(도 1 참조). 상기 TEWL 측정은 기능성 표피장벽 연구(functional epidermal barrier research)의 기본으로, 이를 통해 보습력 및 장벽복구기능을 알 수 있다. 따라서, 본 발명은 본 발명에 따른 화합물 또는 이의 염을 함유하는 화장료 조성물을 제공한다. 본 발명에 따른 화장료 조성물은 유연화장수, 수렴화장수, 영양화장수, 마사지크림, 영양크림, 에센스, 아이에센스, 아이크림, 팩 또는 젤 등으로 제형화될 수 있으며, 그 제형은 특별히 제한되지 않는다. 또한, 본 발명에 따른 화장료 조성물은 화장료 조성물의 제형 또는 사용목적에 따라 일반적인 화장료 조성물에 포함되는 성분들, 예컨대, 천연오일, 왁스, 검, 향, 색소 또는 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다. 본 발명에 따른 세라마이드 유도체는 화장료 조성물 총 중량에 대하여 1-50중량%, 바람직하게는 10-30중량%의 범위 내에서 제형에 따라 적절하게 배합될 수 있다. The present invention also provides the use of the ceramide derivatives according to the invention. The compound according to the present invention exhibits the effect of restoring and protecting the skin barrier damaged by external stimulation. Specifically, in the preferred embodiment of the present invention, it was confirmed that the compound according to the present invention significantly reduced water loss of the epidermis due to skin barrier damage (TEWL) by measuring total epidermal water loss ( FIG. 1 ). The TEWL measurement is the basis of functional epidermal barrier research, through which the moisturizing power and barrier recovery function can be known. Accordingly, the present invention provides a cosmetic composition containing a compound according to the present invention or a salt thereof. The cosmetic composition according to the present invention may be formulated with softening cream, astringent cream, nutrient cream, massage cream, nutrition cream, essence, eye essence, eye cream, pack or gel, and the formulation thereof is not particularly limited. In addition, the cosmetic composition according to the present invention may further include components included in the general cosmetic composition, for example, natural oils, waxes, gums, flavors, pigments or preservatives, etc. according to the formulation or purpose of use of the cosmetic composition. The ceramide derivative according to the present invention may be suitably formulated according to the formulation within the range of 1-50% by weight, preferably 10-30% by weight, based on the total weight of the cosmetic composition.

또한, 본 발명은 본 발명에 따른 화합물 또는 이의 염을 유효성분으로 함유하는 피부 질환의 치료 및 예방용 약학적 조성물을 제공한다. The present invention also provides a pharmaceutical composition for the treatment and prevention of skin diseases containing the compound according to the invention or a salt thereof as an active ingredient.

상기 약학적 조성물은 피부 장벽에 결함이 있거나 불완전한 피부 장벽이 요인이 되는 임의의 질환 상태를 치료 또는 예방하는데 사용될 수 있다. 즉, 본 발 명에 따른 약학적 조성물은 피부의 수분 손실에 의해 유발되거나 또는 피부의 수분 손실을 동반하는 임의의 질환 상태를 치료 또는 예방하는데 사용될 수 있다. 이러한 면에서 상기 조성물은 세제, 비누, 및 열수에의 규칙적인 노출; 추위, 바람, UV에의 계절적인 노출; 화학물질, 다른 건조제 또는 손상제에의 직업적 노출로 인한 일반적인 건성 피부 질환의 예방 또는 치료에 사용될 수 있다. 또한, 상기 조성물은 각질이 매우 두껍지만 피부 지질 장벽이 부족한 발바닥과 손바닥에서 발생하는 것과 같은 불완전한 피부 장벽의 치료에도 사용될 수 있다. 상기 불완전한 피부 장벽은 종종 화상, 상처, 수포, 울혈성 궤양 및 욕창과 관련되어 일어나며, 본 발명에 따른 조성물은 이러한 손상의 치료에 효과가 있을 것으로 기대할 수 있다. 아토피성 피부염 또는 접촉성 피부염 등의 피부 질환은 피부 건조를 동반하는데, 경표피의 수분손실을 억제할 때 피부질환이 개선된다는 사실이 보고된 바 있다(Berardesca E and Distante F, Contact Dermatitis 31:281-287, 1994; Agner T, Acta Derm Venereol Suppl. 173:1-26, 1992). 따라서, 본 발명에 따른 조성물은 습진, 건선, 어린선, 아토피성 피부염, 피부염증, 소양증, 세균감염증, 여드름 또는 창상 등과 같은 병리학적 피부 질환의 예방 또는 치료에도 효과적으로 사용될 수 있다. 또한, 건성 피부가 노화와 관련있다는 것은 잘 알려져 있다. 따라서, 본 발명에 따른 조성물은 노화 피부에 대한 추가의 손상을 예방하거나 또는 건성 피부와 관련되는 잔주름과 주름살의 발생 및 노화와 함께 발생하는 각질의 얇아짐을 포함하는 이미 존재하는 피부 손상, 즉 피부노화에 의해 발생하는 여러 피부질환의 치료에 사용될 수 있다. The pharmaceutical composition may be used to treat or prevent any disease state that is caused by a defective or incomplete skin barrier. In other words, the pharmaceutical composition according to the present invention can be used to treat or prevent any disease state caused by or with the loss of moisture of the skin. In this respect the composition comprises regular exposure to detergents, soaps, and hot water; Seasonal exposure to cold, wind, UV; It can be used for the prevention or treatment of common dry skin diseases caused by occupational exposure to chemicals, other desiccants or damaging agents. The compositions can also be used for the treatment of incomplete skin barriers such as those found in the soles and palms of the skin that are very thick in keratin but lack a skin lipid barrier. Such incomplete skin barriers often occur in connection with burns, wounds, blisters, congestive ulcers and pressure sores, and the compositions according to the invention can be expected to be effective in the treatment of such injuries. Skin diseases, such as atopic dermatitis or contact dermatitis, are accompanied by dry skin, which has been reported to improve skin disease when inhibiting water loss of the epidermis (Berardesca E and Distante F, Contact Dermatitis 31: 281). -287, 1994; Agner T, Acta Derm Venereol Suppl . 173: 1-26, 1992). Therefore, the composition according to the present invention can be effectively used for the prevention or treatment of pathological skin diseases such as eczema, psoriasis, young, atopic dermatitis, dermatitis, pruritis, bacterial infections, acne or wounds. It is also well known that dry skin is associated with aging. Thus, the composition according to the invention prevents further damage to the aging skin or the already existing skin damage, ie skin aging, including the development of fine lines and wrinkles associated with dry skin and thinning of the keratin that occurs with aging. It can be used for the treatment of various skin diseases caused by.

최근 아폽포시스 촉진제는 암을 치료하는 핵심 표적으로 급부상하고 있다. 아폽토시스와 관련한 암 치료법 중에서 가장 흥미로운 분야 중의 하나는 스핑고리피드 경로를 이용하는 것이다. 많은 연구를 통해 스핑고리피드가 아폽토시스와 관련이 있는 것으로 보고되고 있으며, 특히 스핑고리피드가 일종인 세라마이드가 아폽토시스를 촉진하는 것으로 밝혀지고 있다. 또한, 세포 내 세라마이드 증가에 의해 암세포의 사멸이 유도된다고 보고됨에 따라 현재 천연 세라마이드 뿐만 아니라 세포 내 세라마이드 수준을 높이는 약물들이 항암제로 사용되고 있다(Radin N. S., Biochem. J., 371:243-256, 2003; Sawada, M. et al., Cell Death Differ. 7:761-772, 2000; Myrick, D. et al., Leuk. Res. 23:569-578, 1999; Biswal, S. S. et al., Toxicology 154:45-53, 2000; Ferraro, C. et al., Cell Death Differ. 7:197-206, 2000). 본 발명에 따른 화학식 3 및 4로 표시되는 세라마이드 유도체(DNC-16-A 및 DNA-16-B)는 아폽토시스를 유도하여 세포 독성 효과를 나타낸다(도 2 내지 도 4 참조). 따라서, 본 발명은 화학식 3 또는 4로 표시되는 세라마이드 유도체 또는 이의 염을 함유하는 암 치료용 약학적 조성물을 제공한다. 상기 암에는, 이에 한정되지는 않으나, 유방암, 대장암, 폐암, 소세포폐암, 위암, 간암, 혈액암, 골암, 췌장암, 피부암, 두부 또는 경부암, 피부 또는 안구내 흑색종, 자궁암, 난소암, 직장암, 항문부근암, 결장암, 유방암, 나팔관암종, 자궁내막암종, 자궁경부암, 질암, 음문암종, 호지킨병, 식도암, 소장암, 내분비선암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 전립선암, 만성 또는 급성 백혈 병, 림프구 림프종, 신경세포종/신경교아세포종, 방광암, 신장 또는 수뇨관 암, 신장세포 암종, 신장골반 암종, CNS 종양, 1차 CNS 림프종, 척수 종양, 뇌간신경교종, 뇌하수체 선종과 같은 암 또는 이들 암의 하나 이상의 조합일 수 있다. Recently, apoptosis promoters are emerging as key targets for treating cancer. One of the most interesting areas of cancer therapy involving apoptosis is the use of the sphingolipid pathway. Many studies have reported that sphingolipids are associated with apoptosis, and especially ceramides with sphingolipids promote apoptosis. In addition, as it has been reported that cancer cell death is induced by increased intracellular ceramide, drugs that increase intracellular ceramide levels as well as natural ceramide are currently used as anticancer agents (Radin NS, Biochem. J. , 371: 243-256, 2003). Sawada, M. et al., Cell Death Differ. 7: 761-772, 2000; Myrick, D. et al., Leuk.Res . 23: 569-578, 1999; Biswal, SS et al., Toxicology 154 : 45-53, 2000; Ferraro, C. et al., Cell Death Differ . 7: 197-206, 2000). The ceramide derivatives (DNC-16-A and DNA-16-B) represented by Formulas 3 and 4 according to the present invention induce apoptosis and show cytotoxic effects (see FIGS . 2 to 4 ). Accordingly, the present invention provides a pharmaceutical composition for treating cancer containing a ceramide derivative represented by Formula 3 or 4 or a salt thereof. The cancer may include, but is not limited to, breast cancer, colon cancer, lung cancer, small cell lung cancer, stomach cancer, liver cancer, hematologic cancer, bone cancer, pancreatic cancer, skin cancer, head or neck cancer, skin or intraocular melanoma, uterine cancer, ovarian cancer, and rectal cancer. , Anal muscle cancer, colon cancer, breast cancer, fallopian tube carcinoma, endometrial carcinoma, cervical cancer, vaginal cancer, vulvar carcinoma, Hodgkin's disease, esophageal cancer, small intestine cancer, endocrine gland cancer, thyroid cancer, parathyroid cancer, adrenal cancer, soft tissue sarcoma, urethral cancer, Penile cancer, prostate cancer, chronic or acute leukemia, lymphocytic lymphoma, neuroblastoma / glioblastoma, bladder cancer, kidney or ureter cancer, renal cell carcinoma, renal pelvic carcinoma, CNS tumor, primary CNS lymphoma, spinal cord tumor, brainstem glioma , Pituitary adenoma, or a combination of one or more of these cancers.

특히, 본 발명에서는 일 실시예에서는 본 발명에 따른 화학식 3 및 4로 표시되는 세라마이드 유도체가 인간 각질 형성 세포주(human keratinocyte cell line)에서 아폽토시스를 유도함을 확인하였다. 따라서, 본 발명에 따른 화학식 3 또는 4로 표시되는 세라마이드 유도체 또는 이의 염은 습진, 건선, 어린선 등과 같은 각질 이상 피부 질환에서 각질세포의 아폽포시스를 유도하여 상기 질환의 치료 또는 예방에 효과적으로 사용될 수 있다. In particular, in the present invention, it was confirmed that the ceramide derivative represented by Formulas 3 and 4 according to the present invention induces apoptosis in human keratinocyte cell line. Therefore, the ceramide derivative represented by the formula (3) or (4) according to the present invention or salts thereof can be effectively used for the treatment or prevention of keratinocytes by inducing apoptosis of keratinocytes in keratinous skin diseases such as eczema, psoriasis, and thymus. Can be.

본 발명에 따른 약학적 조성물은 약학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함할 수 있다. 상기 약학적으로 허용되는 담체는, 경구 투여의 경우에는 결합제, 활탁제, 붕해제, 부형제, 가용화제, 분산제, 안정화제, 현탁화제, 색소 및/또는 향료를 사용할 수 있고, 주사제의 경우에는 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장제 및/또는 안정화제를 사용할 수 있으며, 또한 국소투여용 제제의 경우에는 기제, 부형제, 윤활제 및/또는 보존제를 사용할 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물의 제형은 상술한 바와 같은 약학적으로 허용되는 담체와 혼합하여 다양하게 제조될 수 있다. 예를 들어, 경구 투여시에는 정제, 트포키, 캡슐, 엘릭시르, 서스펜션, 시럽, 웨이퍼(wafer)등의 형태로 제조할 수 있으며, 주사제의 경우에는 단위 투약 앰플 또는 다수회 투약 포함제 형태로 제조할 수 있다. 본 발명에 따른 약학적 조성물 의 치료학적 또는 예방학적 유효량은 투여대상, 연령, 개인차 및 질병 상태에 따라 적절히 선택할 수 있다. The pharmaceutical composition according to the present invention may further comprise a pharmaceutically acceptable carrier. The pharmaceutically acceptable carrier may be a binder, a suspending agent, a disintegrant, an excipient, a solubilizer, a dispersant, a stabilizer, a suspending agent, a coloring agent, and / or a perfume in the case of oral administration, and a buffer in the case of injection. , Preservatives, analgesic, solubilizers, isotonic and / or stabilizers may be used, and in the case of topical administration agents, bases, excipients, lubricants and / or preservatives may be used. The formulation of the pharmaceutical composition of the present invention can be prepared in various ways by mixing with the pharmaceutically acceptable carrier as described above. For example, in the case of oral administration, it may be prepared in the form of tablets, tpoky, capsules, elixirs, suspensions, syrups, wafers, etc., and in the case of injections, they may be prepared in unit dosage ampoules or in multiple dosage forms. can do. The therapeutically or prophylactically effective amount of the pharmaceutical composition according to the present invention may be appropriately selected depending on the administration target, age, individual difference and disease state.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail by way of examples.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.However, the following examples are merely to illustrate the invention, but the content of the present invention is not limited to the following examples.

<실시예 1><Example 1>

불가사리로부터 세라마이드 유도체의 분리 및 정제Isolation and Purification of Ceramide Derivatives from Starfish

불가사리 디스톨아스테리아스 니폰(Distolasterias nipon) 1.2 kg(건조 중량)을 칼로 2-3 cm 길이로 절단하고, 메탄올 3 ℓ를 가하여 48시간 동안 방치한 후, 그 용액을 여과하였다. 상기 과정을 2회 반복한 후 메탄올 여과액을 감압농축하여 추출물 140 g을 수득하였다. 상기 추출물에 메탄올 80%와 헥산 20%로 이루어진 혼합용매를 첨가하고 층이 분리되도록 2시간 이상 방치하여 극성에 따라 용액을 분획하였다. 두 층으로 분리된 분획에서 용매를 감압 증류기로 제거한 후 얻어진 각 분획의 양을 측정한 결과, 헥산층은 약 17 g이었으며 메탄올층은 약 100 g 이었다. 이후, 각 층에 해당되는 물질에 대하여 수소 핵자기 공명 분광기로 스펙트럼을 측정, 분석한 결과 헥산층에 세라마이드가 함유되어 있는 것을 확인할 수 있었다.1.2 kg (dry weight) of Starfish Distolasterias nipon were cut into 2-3 cm lengths with a knife, and 3 L of methanol was added and left for 48 hours, after which the solution was filtered. After repeating the above twice the methanol filtrate was concentrated under reduced pressure to obtain 140 g of the extract. A mixed solvent consisting of 80% methanol and 20% hexane was added to the extract, and the layers were left for at least 2 hours to separate the layers, thereby partitioning the solution according to polarity. In the fraction separated into two layers, the solvent was removed by a vacuum distillation, and the amount of each fraction was measured. The hexane layer was about 17 g and the methanol layer was about 100 g. Subsequently, spectra were measured and analyzed with a hydrogen nuclear magnetic resonance spectroscopy for the material corresponding to each layer, and it was confirmed that the ceramide was contained in the hexane layer.

이후, 헥산층에 있는 세라마이드를 분리하기 위하여 실리카 크로마토그래피 를 수행하였다. 이 때 용리액은 100% 헥산, 100% 에틸아세테이트, 100% 아세톤, 100% 메탄올 순으로 사용하였다. 수득된 각 분획의 양은 0.95 g(헥산), 7.77 g(에틸아세테이트), 0.80 g(아세톤), 2.68 g(메탄올)이었다. 각 분획에 있는 물질을 확인하기 위하여 수소 핵자기공명 분광스펙트럼 측정을 하였다. 그 결과, 세라마이드는 아세톤층에 함유되어 있음을 확인할 수 있었다. Thereafter, silica chromatography was performed to separate the ceramide in the hexane layer. At this time, the eluent was used in order of 100% hexane, 100% ethyl acetate, 100% acetone, 100% methanol. The amount of each fraction obtained was 0.95 g (hexane), 7.77 g (ethyl acetate), 0.80 g (acetone), 2.68 g (methanol). Hydrogen nuclear magnetic resonance spectroscopic measurements were performed to identify the substances in each fraction. As a result, it was confirmed that ceramide was contained in the acetone layer.

아세톤층에 존재하는 세라마이드를 분리하기 위하여, 감압 증류기로 아세톤 용매를 제거한 후 역상 반-분취 HPLC 컬럼(reversed-phased semi-preparative HPLC column)(YMC ODS-C18 입자 직경 5 μm, 250 ×10 mm (길이 ×내경), 용출속도 2.9 ㎖/min, 굴절율 검출기) 상에서 크로마토그래피를 수행하였다. 이 때 100% 메탄올을 용리액으로 사용하였다. 각 분획의 수소 핵자기공명 분광스펙트럼 분석 결과, 머무름 시간 17분, 22분 및 27분에 용출된 반고형 성분들이 세라마이드임을 확인할 수 있었다. In order to separate the ceramides present in the acetone layer, the acetone solvent was removed by a vacuum distillation, followed by a reversed-phased semi-preparative HPLC column (YMC ODS-C18 particle diameter of 5 μm, 250 × 10 mm ( Length x inner diameter), elution rate 2.9 mL / min, refractive index detector). At this time, 100% methanol was used as the eluent. Hydrogen nuclear magnetic resonance spectroscopic analysis of each fraction showed that the semi-solid components eluted at the retention time of 17 minutes, 22 minutes and 27 minutes were ceramides.

각 세라마이드 성분을 더욱 정제하기 위하여, 먼저 머무름 시간 17분에서 얻어진 반고형 성분을 20% 아세토 나이트릴/80% 메탄올에 녹인 후 다시 100% 메탄올을 용리액으로 하여 C18 역상 반-분취 HPLC 컬럼(C18reversed-phase semi-preparativeHPLC column)(YMC ODS-A, 입자 직경 5 μm, 250 ×10 mm (길이 ×내경), 용출속도 2 ml/min, 굴절율 검출기) 상에서 크로마토그래피를 수행하였다. 그 결과, 머무름 시간 30분에서 무정형고체 형태의 물질 12.4 mg을 수득하였으며, 이를 'DNC-16-A'라 명명하였다.To further purify each ceramide component, first dissolve the semi-solid component obtained at the retention time of 17 minutes in 20% acetonitrile / 80% methanol and then again use a C 18 reversed phase preparative HPLC column (C) with 100% methanol as eluent. Chromatography was performed on an 18 reversed-phase semi-preparative HPLC column (YMC ODS-A, particle diameter 5 μm, 250 × 10 mm (length × inner diameter), elution rate 2 ml / min, refractive index detector). As a result, 12.4 mg of the material in amorphous solid form was obtained at the retention time of 30 minutes, which was named 'DNC-16-A'.

또한, 상기 머무름 시간 22분에 얻어진 반고형 성분을 상기와 동일한 조건으 로 C18 역상 반-분취 HPLC를 수행한 결과, 머무름 시간 20분에서 고형성분 32.1 mg을 수득하였으며, 이를 'DNC-16-B'라 명명하였다.In addition, C 18 reversed-phase semi-preparative HPLC was performed on the semi-solid component obtained at the retention time of 22 minutes under the same conditions as above, and 32.1 mg of the solid component was obtained at the retention time of 20 minutes. It was named B '.

마지막으로, 상기 머무름 시간 27분에 얻어진 성분을 상기와 동일한 조건으로 C18 역상 반-분취 HPLC를 수행한 결과, 머무름 시간 18분에서 무색의 반고형 물질 13.9 mg을 수득하였으며, 이를 'DNC-16-C'라 명명하였다.Finally, C 18 reversed phase semi-preparative HPLC of the components obtained at the retention time of 27 minutes under the same conditions as above gave 13.9 mg of a colorless semi-solid substance at retention time of 18 minutes. It was named -C '.

<실시예 2><Example 2>

구조 및 물리적/분광학적 특성 분석Structural and Physical / Spectroscopic Characterization

<2-1> 구조 분석<2-1> Structure Analysis

상기 실시예 1에서 얻어진 3개의 화합물(DNC-16-A, DNC-16-B 및 DNC-16-C)의 구조를 NMR 스펙트럼, 적외선/자외선 분광 분석 및 고해상 질량 분석을 수행하여 결정하였으며, 상기 NMR 스펙트럼에서 1H-nmr 시그날과 13C-nmr 시그날에 대한 위치지정(assignment)은 COSY, TOCSY, gradient HSQC, gradient HMBC 등의 다차원 핵자기 공명 실험을 통하여 수행하였다. 이 때 1H과 13C NMR 스펙트럼은 메탄올-d 4 용매로 각각 500 MHz와 125 MHz에서 측정하였다. 화학전이는 1H의 경우에는 테트라메틸실란 피크(0 ppm)를 기준으로 하였으며, 13C의 경우에는 메탄올-d4 용매에서 잔여용매 피크(49 ppm)를 기준으로 하였다. 또한, 각 화합물의 스핑고리피드에 있는 지 방산과 스핑고신의 탄소수를 결정하기 위하여 기체크로마토그래피-질량분석기를 활용하였다. The structures of the three compounds (DNC-16-A, DNC-16-B and DNC-16-C) obtained in Example 1 were determined by performing NMR spectra, infrared / ultraviolet spectroscopy, and high resolution mass spectrometry. The assignment of 1 H-nmr signal and 13 C-nmr signal in the NMR spectrum was performed through multidimensional nuclear magnetic resonance experiments such as COSY, TOCSY, gradient HSQC, and gradient HMBC. At this time, 1 H and 13 C NMR spectra were measured at 500 MHz and 125 MHz with methanol-d 4 solvent, respectively. Chemical shifts were based on tetramethylsilane peaks (0 ppm) for 1 H and residual solvent peaks (49 ppm) in methanol-d 4 solvent for 13 C. In addition, gas chromatography-mass spectrometry was used to determine the carbon number of fatty acid and sphingosine in the sphingolipid of each compound.

a. DNC-16-A의 구조 분석 결과a. Structure analysis result of DNC-16-A

DNC-16-A는 탄소 3 및 2' 위치에 각각 하이드록시기가 있고, 탄소 4 위치에 이중 결합을 가진 일반적인 세라마이드 형태를 지니고 있는 분자식 C35H65NO 4의 스핑고리피드계 화합물로 확인되었다. DNC-16-A의 구조를 하기 화학식 3으로 표시하였다.DNC-16-A was identified as a sphingolipid compound of molecular formula C 35 H 65 NO 4 having a hydroxy group at the carbon 3 and 2 ′ positions, respectively, and a general ceramide form having a double bond at the carbon 4 position. The structure of DNC-16-A is represented by the following formula (3).

<화학식 3><Formula 3>

Figure 112003035235117-pat00009
Figure 112003035235117-pat00009

그러나, DNC-16-A는, 상기 화학식 3에서 보는 바와 같이, 지방산의 탄소수가 16개이고 스핑고신 영역에 메틸 부타디엔 기가 존재하는 점에 특징이 있다. 문헌 조사 결과, DNC-16-A는 지방산의 탄소수와 스핑고신에 있는 탄소수면에서 지금까지 알려진 세라마이드류와 전혀 상이한 신규 화합물로 판명되었다. DNC-16-A의 구조에 대한 지정은 하기 표 1과 같다. However, DNC-16-A, as shown in the formula (3), is characterized in that the fatty acid has 16 carbon atoms and methyl butadiene group in the sphingosine region. As a result of literature review, DNC-16-A was found to be a novel compound that is completely different from the ceramides known to date in carbon number of fatty acids and carbon level in sphingosine. Designation of the structure of the DNC-16-A is shown in Table 1 below.

DNC-16-A의1H와13C NMR 지정 1 H and 13 C NMR Designation of DNC-16-A 위치location DNC-16-ADNC-16-A 1H 1 H 13C 13 C 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 (CH2)5 18 19 1' 2' 3' (CH2)12 16'1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 (CH 2 ) 5 18 19 1 '2' 3 '(CH 2 ) 12 16' 3.66 ( 1H, dd, J = 11.2, 3.9 ), 3.78 ( 1H, dd, J = 11.2, 5.4 ) 3.84 ( 1H, ddd, J = 7.3, 5.4, 3.9 ) 4.09 ( 1H, dd, J = 7.3, 7.3 ) 5.50 ( 1H, dd, J = 15.6, 7.3 ) 5.72 ( 1H, dt, J = 15.6, 6.4 ) 2.10 ( 2H, dt, J = 6.4, 7.3 ) 2.20 ( 2H, dt. J = 7.3, 7.3 ) 5.35 ( 1H, t, J = 7.3 ) 6.02 ( 1H, d, J = 15.6 ) 5.54 ( 1H, dt, J = 15.6, 7.3 ) 2.08 ( 2H, dt, J = 7.3, 6.8 ) 1.29-1.31 ( 10H, m ) 0.89 ( 3H, t, J = 6.9 ) 1.71 ( 3H, s ) 3.99 ( 1H, dd, J = 7.8, 3.9 ) 1.55 ( 1H, m ), 1.71 ( 1H, m ) 1.29-1.39 ( 24H, m ) 0.89 ( 3H, t, J = 6.9 )3.66 (1H, dd, J = 11.2, 3.9), 3.78 (1H, dd, J = 11.2, 5.4) 3.84 (1H, ddd, J = 7.3, 5.4, 3.9) 4.09 (1H, dd, J = 7.3, 7.3 ) 5.50 (1H, dd, J = 15.6, 7.3) 5.72 (1H, dt, J = 15.6, 6.4) 2.10 (2H, dt, J = 6.4, 7.3) 2.20 (2H, dt. J = 7.3, 7.3) 5.35 (1H, t, J = 7.3)                                                  6.02 (1H, d, J = 15.6) 5.54 (1H, dt, J = 15.6, 7.3) 2.08 (2H, dt, J = 7.3, 6.8) 1.29-1.31 (10H, m) 0.89 (3H, t, J = 6.9) 1.71 (3H, s)                                                  3.99 (1H, dd, J = 7.8, 3.9) 1.55 (1H, m), 1.71 (1H, m) 1.29-1.39 (24H, m) 0.89 (3H, t, J = 6.9) 61.9, t 56.0, d 73.2, d 131.5, d 134.1, d 33.0, t 28.7, t 130.2, d 135.1, s 136.1, d 128.5, d 33.9, t 30.9-30.3, t 14.4, q 12.7, q 177.1, s 73.0, d 35.9, t 30.9-28.7, t 14.4, q 61.9, t                                                   56.0, d 73.2, d 131.5, d 134.1, d 33.0, t 28.7, t 130.2, d 135.1, s 136.1, d 128.5, d 33.9, t 30.9-30.3, t 14.4, q 12.7, q 177.1, s 73.0, d 35.9, t 30.9-28.7, t 14.4, q

b. DNC-16-B의 구조 분석 결과b. Structure analysis result of DNC-16-B

DNC-16-B는 탄소 3, 4 및 2' 위치에 각각의 하이드록시기를 가지고 있고 스핑고신 영역에 이중 결합을 한 개 가지고 있는 분자식 C38H75NO5의 스핑고리피드계 화합물로 확인되었다. DNC-16-B의 구조를 하기 화학식 4로 표시하였다.DNC-16-B was identified as a sphingolipid compound of the molecular formula C 38 H 75 NO 5 which has hydroxy groups at the carbon 3, 4 and 2 'positions and one double bond in the sphingosine region. The structure of DNC-16-B is represented by the following formula (4).

<화학식 4><Formula 4>

Figure 112003035235117-pat00010
Figure 112003035235117-pat00010

DNC-16-B는 상기 화학식 4에서 보는 바와 같이, 지방산에 있는 탄소수가 16개이고 스핑고신 영역에서 탄소 4의 위치에 하이드록시기가 있고, 탄소 14 위치에 이중 결합이 있는 점에 특징이 있다. 문헌조사 결과, DNC-16-B는 이중 결합의 위치 및 탄소수 면에서 지금까지 알려진 세라마이드류와 전혀 상이한 신규 물질로 판명되었다. 세라마이드 DNC-16-B의 구조에 대한 지정은 하기 표 2와 같다. As shown in Formula 4, DNC-16-B is characterized by having 16 carbon atoms in a fatty acid, a hydroxyl group at a carbon 4 position in a sphingosine region, and a double bond at a carbon 14 position. As a result of literature review, DNC-16-B was found to be a novel material that is completely different from the ceramides known to date in terms of the position and carbon number of the double bond. The designation for the structure of ceramide DNC-16-B is shown in Table 2 below.

DNC-16-B의1H와13C NMR 지정 1 H and 13 C NMR Designation of DNC-16-B 위치location DNC-16-BDNC-16-B 1H 1 H 13C 13 C 1 2 3 4 5 (CH2)7 13 14, 15 16 (CH2)5 18 1' 2' 3' (CH2)12 16'1 2 3 4 5 (CH 2 ) 7 13 14, 15 16 (CH 2 ) 5 18 1 '2' 3 '(CH 2 ) 12 16' 3.74 ( 1H, d, J = 4.4 ), 3.75 ( 1H, d, J = 4.4 ) 4.09 ( 1H, ddd, J = 4.4, 4.4, 5.9 ) 3.56 ( 1H, dd, J = 5.9, 5.9 ) 3.51 ( 1H, ddd, J = 8.7, 5.9, 2.9 ) 1.64 ( 1H, m ), 1.41( 1H, m ) 1.42-1.28 ( 14H, m ) 2.02 ( 2H, m ) 5.33 ( 2H, t, J = 4.9 ) 2.02 ( 2H, m ) 1.42-1.28 ( 10H, m ) 0.89 ( 3H, t, J = 6.4 ) 4.02 ( 1H, dd, J = 7.3, 3.9 ) 1.58 ( 1H, m ), 1.73 ( 1H, m ) 1.29-1.39 ( 24H, m ) 0.89 ( 3H, t, J = 6.4 )3.74 (1H, d, J = 4.4), 3.75 (1H, d, J = 4.4) 4.09 (1H, ddd, J = 4.4, 4.4, 5.9) 3.56 (1H, dd, J = 5.9, 5.9) 3.51 (1H , ddd, J = 8.7, 5.9, 2.9) 1.64 (1H, m), 1.41 (1H, m) 1.42-1.28 (14H, m) 2.02 (2H, m) 5.33 (2H, t, J = 4.9) 2.02 ( 2H, m) 1.42-1.28 (10H, m) 0.89 (3H, t, J = 6.4)                                                  4.02 (1H, dd, J = 7.3, 3.9) 1.58 (1H, m), 1.73 (1H, m) 1.29-1.39 (24H, m) 0.89 (3H, t, J = 6.4) 62.0, t 52.9, d 76.0, d 73.2, d 33.0, t 30.9-30.5, t 28.2, t 130.8, d 28.2, t 30.9-30.5, t 14.4, q 176.9, s 72.9, d 35.0, t 30.9-23.7, t 14.4, q 62.0, t 52.9, d 76.0, d 73.2, d 33.0, t 30.9-30.5, t 28.2, t 130.8, d 28.2, t 30.9-30.5, t 14.4, q 176.9, s 72.9, d 35.0, t 30.9-23.7, t 14.4, q

c. DNC-16-C의 구조 분석 결과c. Structure analysis result of DNC-16-C

DNC-16-C는 DNC-16-A와 같이 탄소 3 및 2'의 위치에 각각의 하이드록시기를 가지고 있으며 탄소 4 위치에 이중 결합을 한 개 가지고 있는 분자식 C38H73NO 4의 스핑고리피드계 화합물로 확인되었다. DNC-16-C의 구조를 하기 화학식 5로 표시하였다.DNC-16-C is a sphingolipid of the molecular formula C 38 H 73 NO 4 , which has a hydroxyl group at the carbon 3 and 2 ′ position and one double bond at the carbon 4 position as DNC-16-A. It identified as a system compound. The structure of DNC-16-C is represented by the following formula (5).

<화학식 5><Formula 5>

Figure 112005054495028-pat00021
Figure 112005054495028-pat00021

DNC-16-C는, 상기 화학식 5에서 보는 바와 같이, DNC-16-A와 같이 지방산에 있는 탄소수가 16개이나, 스핑고신 영역에서 메틸 부타디엔 대신 탄소 14 위치에 이중 결합이 존재한다는 점에 특징이 있다. 문헌조사 결과, DNC-16-B와 마찬가지로 DNC-16-C 또한 이중 결합의 위치 및 탄소수면에서 지금까지 알려진 세라마이드류와 전혀 상이한 신규 화합물로 판명되었다. 세라마이드 DNC-16-C의 구조에 대한 지정은 하기 표 3과 같다. As shown in Formula 5, DNC-16-C has 16 carbons in fatty acids as in DNC-16-A, but in the sphingosine region, a double bond exists at carbon 14 position instead of methyl butadiene. There is this. As a result of the literature review, like DNC-16-B, DNC-16-C was also found to be a novel compound that is completely different from the ceramides known to date at the position of the double bond and the carbon level. The designation for the structure of ceramide DNC-16-C is shown in Table 3 below.

DNC-16-C의1H와13C NMR 지정 1 H and 13 C NMR Designation of DNC-16-C 위치location DNC-16-CDNC-16-C 1H 1 H 13C 13 C 1 2 3 4 5 6 (CH2)6 13 14, 15 16 (CH2)5 18 1' 2' 3' (CH2)12 16'1 2 3 4 5 6 (CH 2 ) 6 13 14, 15 16 (CH 2 ) 5 18 1 '2' 3 '(CH 2 ) 12 16' 3.78 ( 1H, dd, J = 11.2, 4.9 ), 3.66 ( 1H, dd, J = 11.2, 3.9 ) 3.84 ( 1H, ddd, J = 7.3, 4.9, 3.9 ) 4.07 ( 1H, dd, J = 7.3, 7.3 ) 5.46 ( 1H, dd, J = 15.1, 7.3 ) 5.70 ( 1H, dt, J = 15.1, 6.8 ) 2.01 ( 2H, m ) 1.42-1.28 ( 12H, m ) 2.02 ( 2H, m ) 5.34 ( 2H, t, J = 4.9 ) 2.02 ( 2H, m ) 1.42-1.28 ( 10H, m ) 0.89 ( 3H, t, J = 5.9 ) 3.98 ( 1H, dd, J = 7.8, 3.9 ) 1.54 ( 1H, m ), 1.70 ( 1H, m ) 1.28-1.41 ( 24H, m ) 0.89 ( 3H, t, J = 5.9 )3.78 (1H, dd, J = 11.2, 4.9), 3.66 (1H, dd, J = 11.2, 3.9) 3.84 (1H, ddd, J = 7.3, 4.9, 3.9) 4.07 (1H, dd, J = 7.3, 7.3 ) 5.46 (1H, dd, J = 15.1, 7.3) 5.70 (1H, dt, J = 15.1, 6.8) 2.01 (2H, m) 1.42-1.28 (12H, m) 2.02 (2H, m) 5.34 (2H, t , J = 4.9) 2.02 (2H, m) 1.42-1.28 (10H, m) 0.89 (3H, t, J = 5.9)                                                  3.98 (1H, dd, J = 7.8, 3.9) 1.54 (1H, m), 1.70 (1H, m) 1.28-1.41 (24H, m) 0.89 (3H, t, J = 5.9) 62.0, t 56.0, d 73.3, d 131.1, d 134.9, d 33.5, t 30.9-30.2, t 28.2, t 130.8, d 28.2, t 30.9-30.2, t 14.5, q 177.1, s 73.0, d 35.9, t 30.9-23.7, t 14.5, q 62.0, t                                                   56.0, d 73.3, d 131.1, d 134.9, d 33.5, t 30.9-30.2, t 28.2, t 130.8, d 28.2, t 30.9-30.2, t 14.5, q 177.1, s 73.0, d 35.9, t 30.9-23.7, t 14.5, q

<2-2> 물리적/분광학적 특성 분석 결과<2-2> Physical and spectroscopic characterization results

물질 성상, 용해도 등을 분석하여 각 화합물의 특성을 분석한 결과, 본 발 명에 따른 화합물들은 모두 무색의 고형물질로서, 실온에서 대체적으로 안정하며, 클로로포름, 아세톤, 메탄올 등 중정도 극성 및 극성 유기용매에 잘 녹는 것으로 확인되었다. 본 발명에 따른 세라마이드 유도체의 특성을 비교한 결과를 하기 표 4에 기재하였다.As a result of analyzing the properties of each compound by analyzing the material properties, solubility, etc., the compounds according to the present invention are all colorless solids, which are generally stable at room temperature, and have moderate polarity and polar organic properties such as chloroform, acetone, and methanol. It was found to be well soluble in the solvent. The results of comparing the properties of the ceramide derivatives according to the present invention are shown in Table 4 below.

본 발명에 따른 세라마이드 유도체의 물리적/분광학적 특성Physical and Spectroscopic Properties of Ceramide Derivatives According to the Present Invention DNC-16-ADNC-16-A DNC-16-BDNC-16-B DNC-16-CDNC-16-C 분자식Molecular formula C35H65NO4 C 35 H 65 NO 4 C38H75NO5 C 38 H 75 NO 5 C38H73NO4 C 38 H 73 NO 4 분자량Molecular Weight 563563 625625 607 607 색color 무색Colorless 무색Colorless 무색Colorless 녹는점Melting point 68-70℃68-70 ℃ 135-137℃135-137 ℃ 64-67℃ 64-67 ℃ 적외선 흡수대Infrared absorption band 3317, 2918, 2849, 1650, 1540, 1450, 1409 cm-1 3317, 2918, 2849, 1650, 1540, 1450, 1409 cm -1 3313, 2919, 2850, 1634, 1545, 1457 cm-1 3313, 2919, 2850, 1634, 1545, 1457 cm -1 3364, 2921, 2845, 1647, 1450, 1414, 1112 cm-1 3364, 2921, 2845, 1647, 1450, 1414, 1112 cm -1 자외선 흡수대UV absorber λ=235nm (ε 4.52)λ = 235 nm (ε 4.52) 200 -600nm에서 미검출됨Undetected at 200 -600 nm 200 -600nm에서 미검출됨Undetected at 200 -600 nm 용해성Solubility 클로로포름, 아세톤, 메탄올 등의 중정도 극성 및 극성 유기용매에 잘 녹는다.Soluble in moderate polar and polar organic solvents such as chloroform, acetone and methanol.

<실시예 3><Example 3>

생리활성 측정Physiological activity measurement

<3-1> 경표피 수분 손실 측정 실험(TEWL)<3-1> Hard Cuticle Water Loss Measurement Experiment (TEWL)

먼저, 본 발명에 따른 세라마이드 유도체 DNC-16-A, DNC-16-B 및 DNC-16-C를 소량의 70% 에탄올에 용해시킨 후, 이를 백색 페트로라텀(petrolatum)(Sigma Chemicals (St. Louis, MO) 혼합하여 각각 2%의 크림제제(Cream A, Cream B 및 Cream C)를 제조하였다. 실험 생쥐(hairless mice)들을 최소 1시간 전에 측정장소로 옮겨져 환경에 적응하도록 하였다. 각 생쥐의 배부(back)에 고용량(3 minimal erythemal dose, 3MED)의 자외선 B를 조사한 후, 7일 동안 상기 크림제제를 마우스의 배부에 도포하였다. 이후, 경표피 수분 손실 변화를 TWEL(transepidermal water loss) 어세이를 통하여 측정하였다. TWEL 어세이는 온도 20-22℃, 습도 30-32%로 유지되는 항온 항습실에서 수행하였으며, 컴퓨터 프로그램(S. Bagley, personal communication)을 이용하여 수분손실량(g/표피면적/단위시간)을 측정하였다(Nolte et al., Arch. Dermatol. Res. 285:466-474. 1993.; Hanley et al., J. Invest. Dermatol. 106:404-411. 1996; Harman et al., Development 125:1541-1552. 1998). 대조군에는 자외선 조사 후 아무 것도 처리하지 않았다. First, the ceramide derivatives DNC-16-A, DNC-16-B and DNC-16-C according to the present invention are dissolved in a small amount of 70% ethanol and then white petrolatum (Sigma Chemicals (St. Louis) , MO) were mixed to prepare 2% of cream formulations (Cream A, Cream B and Cream C), respectively.The mice were transferred to the measurement site at least 1 hour before adaptation to the environment. After irradiating a high dose (3 minimal erythemal dose, 3MED) of ultraviolet B to the back, the cream formulation was applied to the back of the mouse for 7 days, after which the transepidermal water loss (TWEL) assay was used. The TWEL assay was performed in a constant temperature and humidity room maintained at a temperature of 20-22 ° C. and a humidity of 30-32%, and the amount of water loss (g / epidermal area / Unit time) was measured (Nolte et al., Arch. Dermatol. Res . 285: 46 1993 .; Hanley et al., J. Invest.Dermatol. 106: 404-411. 1996; Harman et al., Development 125: 1541-1552. 1998). Did.

그 결과, 도 1에서 보는 바와 같이, 3MED의 자외선 조사 후 본 발명에 따른 화합물들을 포함하는 크림제제를 도포한 실험군 모두에서 대조군에 비해 경표피 수분 손실이 유의하게(p<0.01) 감소되었다. 특히, DNC-16-C를 함유하는 크림제제(Cream C)를 도포한 군에서 가장 유의한 감소를 보였다. 그러나, 실험군 간 유의적 차이는 없었다. 이로부터 본 발명에 따른 세라마이드 유도체들이 모두 자외선 B 조사에 의한 피부장벽대(skin barrier) 손상 후 경표피 수분 손실을 유의하게 감소시킴을 확인할 수 있었다.As a result, as shown in Figure 1 , after 3MED UV irradiation in the experimental group coated with the cream formulation containing the compounds according to the present invention, the epidermal moisture loss was significantly reduced (p <0.01) compared to the control group. In particular, the most significant decrease was found in the group to which cream cream containing DNC-16-C was applied. However, there was no significant difference between the experimental groups. From this, it could be seen that the ceramide derivatives according to the present invention significantly reduced the transdermal moisture loss after skin barrier damage by ultraviolet B irradiation.

<3-2> 세포 독성 효과 조사(MTT 어세이)<3-2> Cytotoxic Effect Investigation (MTT Assay)

본 발명에 따른 화합물들의 세포 독성 효과를 조사하기 위하여 MTT 어세이를 수행하였다. 인간 각질형성 세포주(human keratinocyte cell line, 독일 암 연구 소의 N. Fuseng 교수로부터 제공받음)인 HaCaT 세포을 100 mm 디쉬에 1×106 cells/ml의 농도로 분주하여 5% CO2, 37℃의 조건에서 48시간 동안 배양하였다. 이 때 배지로는 10% FBS(fetal bovine serum, GIBCO), 100 units/㎖ 페니실린(penicillin) 및 100 μg/㎖ 스트렙토마이신(streptomycin)을 함유하는 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium, GIBCO)을 사용하였다. MTT assays were performed to investigate the cytotoxic effects of the compounds according to the invention. HaCaT cells, a human keratinocyte cell line (provided by Professor N. Fuseng of the German Cancer Research Institute), were dispensed in 100 mm dishes at a concentration of 1 × 10 6 cells / ml and treated at 5% CO 2 at 37 ° C. Incubated for 48 hours at. At this time, DMEM (Dulbecco's modified Eagle's medium, GIBCO) containing 10% FBS (fetal bovine serum, GIBCO), 100 units / ml penicillin and 100 μg / ml streptomycin was used.

이후, 배양된 세포에 트립신(trypsin)을 처리한 후, 세포들을 다시 96-웰 플레이트에 웰(well)당 1-2 ×104 cells/㎖의 농도로 분주하여 무혈청 배지(serum-free medium)에서 배양하였다. 약 3시간 후, DMSO에 용해된 본 발명에 따른 화합물들을 최종농도 0-30 μM로 24시간 동안 각각 처리하였다. 이후, MTT(3-[4, 5-dimethylthiazol-2-yl]-2, 5-diphenyltetrazolium bromide)(Sigma Chemicals(St. Louis, MO)를 2 ㎎/㎖의 농도로 첨가하여 4시간 동안 더 배양하였다. 배지를 완전히 제거하고 세포를 DMSO에 현탁시켜 540nm에서 흡광도를 측정하였다.Then, after treatment with trypsin to the cultured cells, the cells are again dispensed in a 96-well plate at a concentration of 1-2 × 10 4 cells / ㎖ per well (serum-free medium) Incubated). After about 3 hours, the compounds according to the invention dissolved in DMSO were each treated for 24 hours at a final concentration of 0-30 μM. Thereafter, MTT (3- [4, 5-dimethylthiazol-2-yl] -2, 5-diphenyltetrazolium bromide) (Sigma Chemicals (St. Louis, MO)) was added at a concentration of 2 mg / ml and further incubated for 4 hours. The media was completely removed and the cells suspended in DMSO to measure absorbance at 540 nm.

그 결과, 도 2에서 보는 바와 같이, DNC-16-A는 1-30 μM의 농도에서 각각 24-44%의 세포독성효과를 나타내었으며, DNC-16-B는 33-55%의 세포독성효과를 나타내었다. 반면, DNC-16-C는 거의 세포 독성 효과를 나타내지 않았다. 이로부터 DNC-16-A 및 DNC-16-B가 농도 의존적으로 세포 성장(cell growth)을 억제하는 것을 확인할 수 있었다. As a result, as shown in Figure 2 , DNC-16-A showed a cytotoxic effect of 24-44% at a concentration of 1-30 μM, respectively, DNC-16-B 33-55% of a cytotoxic effect Indicated. In contrast, DNC-16-C showed little cytotoxic effect. From this, it was confirmed that DNC-16-A and DNC-16-B inhibit cell growth in a concentration-dependent manner.

<3-3> 아폽토시스 유도 효과 조사<3-3> Investigation of apoptosis induction effect

a. TUNEL 어세이(TdT-mediated dUTP nick end labeling- assay)a. TUNEL Assay (TdT-mediated dUTP nick end labeling-assay)

인 시투 세포 사멸 검출 키트(in situ cell death detection kit, POD)(Enzo, 1684817, Boeringer Mannhein)를 이용하여 본 발명에 따른 화합물들이 세포의 아폽토시스를 유도하는지 조사하였다. TC 챔버(Lab-TEK chamber Slide w/cover Permanox Slide sterile 1 well, 177410)에 HaCaT 세포를 1 ×106 cells/㎖의 농도로 씨딩(seeding)하여 0.25% FBS를 함유하는 DMEM에서 18시간 이상 배양하였다. 이후, 본 발명에 따른 화합물들을 각각 10 μM의 농도로 처리하였다. 24시간 후 세포를 고정시킨 후, 블로킹 용액(blocking solution)(3% H2O2 in MeOH)으로 내인성 퍼옥시다제(peroxidase)를 차단하고 투과성 용액(permeabilization solution)(0.1% Triton X-100 in 0.1% sodium citrate)으로 세포의 투과성을 증대시켰다. 이후, TUNEL 반응 용액을 이용하여 아폽토틱 세포들(apoptotic cells)을 표지(labeling)한 후, DAB 기질(DAKO, K3465)를 이용하여 발색시켰다. 이후, 현미경을 이용하여 발색된 세포를 관찰하였다. 모든 실험은 수 차례 반복 수행되었다.In situ cell death detection kit it was investigated whether (in situ cell death detection kit, POD) The compounds according to the present invention have inducing apoptosis in cells using (Enzo, 1684817, Boeringer Mannhein) . HaCaT cells are seeded in a TC chamber (Lab-TEK chamber Slide w / cover Permanox Slide sterile 1 well, 177410) at a concentration of 1 × 10 6 cells / ml and incubated for 18 hours in DMEM containing 0.25% FBS. It was. The compounds according to the invention were then treated at concentrations of 10 μM each. After 24 hours, the cells were fixed, and then the endogenous peroxidase was blocked with a blocking solution (3% H 2 O 2 in MeOH) and permeabilization solution (0.1% Triton X-100 in) 0.1% sodium citrate) to increase cell permeability. Subsequently, apoptotic cells were labeled using a TUNEL reaction solution and then developed using DAB substrate (DAKO, K3465). Then, the colored cells were observed using a microscope. All experiments were repeated several times.

그 결과, 도 3에서 보는 바와 같이, DNC-16-A 및 DNC-16-B 처리군에서는 아폽토시스가 관찰된 반면, DNC-16-C 처리군에서는 아폽토시스가 관찰되지 않았다. 이 결과를 통하여 상기 실시예 <3-2>에서 확인된 DNC-16-A 및 DNC-16-B의 세포 독성 효과가 아폽토시스에 기인한 것임을 알 수 있었다. As a result, as shown in FIG. 3 , apoptosis was observed in the DNC-16-A and DNC-16-B treatment groups, while apoptosis was not observed in the DNC-16-C treatment groups. These results show that the cytotoxic effects of DNC-16-A and DNC-16-B confirmed in Example <3-2> are due to apoptosis.

b. 활성형 카스파제-3(cpp20) 발현 유도b. Induction of Active Caspase-3 (cpp20) Expression

카스파제, 특히 카스파제 3이 아폽토시스의 유도에 중요한 조절인자로 알려져 있다. 따라서, 본 발명자들은 본 발명에 따른 화합물에 의해 카스파제-3가 활성화되는지 조사하였다. 상기 실시예 <3-2>과 동일한 방법으로 HaCaT 세포에 본 발명에 따른 화합물들을 10 μM의 농도로 처리하여 100-mm 디쉬에서 배양한 후, 시간대 별로 수거하였다. 수거된 각 세포에 500 ㎕ RIPA 용해 완충용액(1% Nonidet P-40, 1% sodium deoxycholate, 0.1% SDS, 0.15 M SDS, 0.01 M sodium phosphate, pH 7.2, 2 mM EDTA, 50 mM sodium fluoride, 0.2 mM sodium vanadate)을 처리하여 단백질을 추출하였다. 브래드포드(Bradford) 방법으로 단백질 농도를 측정하였다. 이후, 12% 폴리아크릴아미드 겔을 이용하여 전기영동을 수행한 후, 니크로셀룰로스 막으로 전이하였다. 5% 논-팻 밀크(non-fat milk)로 블로킹(blocking)한 막을 1차 항체(caspase-3 p20 (cpp20))(Delta Biolabs, Campbell, CA)와 반응시켰다. 막을 세척한 후, HRP-결합 2차 항체(Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ)와 반응시켰다. ECL 키트(Amersham, Piscataway, NJ)를 이용하여 단백질 강도(protein intensity)를 분석하였다.Caspase, particularly caspase 3, is known to be an important regulator of induction of apoptosis. Therefore, we investigated whether caspase-3 is activated by the compounds according to the invention. In the same manner as in Example <3-2>, HaCaT cells were treated with the compounds according to the present invention at a concentration of 10 μM, cultured in a 100-mm dish, and collected according to time zones. 500 μl RIPA lysis buffer (1% Nonidet P-40, 1% sodium deoxycholate, 0.1% SDS, 0.15 M SDS, 0.01 M sodium phosphate, pH 7.2, 2 mM EDTA, 50 mM sodium fluoride, 0.2 in each harvested cell) protein was extracted by treatment with mM sodium vanadate). Protein concentration was measured by the Bradford method. Thereafter, electrophoresis was performed using a 12% polyacrylamide gel and then transferred to a microcellulose membrane. The membrane blocked with 5% non-fat milk was reacted with primary antibody (caspase-3 p20 (cpp20)) (Delta Biolabs, Campbell, CA). The membrane was washed and then reacted with HRP-binding secondary antibody (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ). Protein intensity was analyzed using an ECL kit (Amersham, Piscataway, NJ).

그 결과, 도 4에서 보는 바와 같이, DNC-16-A를 처리한 경우, 활성형 카스파제-3(cpp20)의 발현은 시간 경과에 따라 서서히 증가하다가 6시간에 가장 높은 수준을 나타내었으며, 그 이후에는 감소하였다. 또한, DNC-16-B를 처리한 경우, 활성형 카스파제-3(cpp20)의 발현은 1시간부터 증가되어 24시간까지 계속적으로 증가하였다. 반면, DNC-16-C의 경우에는 TUMEL 어세이 결과와 유사하게 활성형 카스파제-3(cpp20)이 활성화되지 않았다. 상기 결과를 통해 본 발명에 따른 DNC-16-A 및 DNC-16-B가 카스파제 활성화를 통하여 아폽토시스를 효과적으로 유도하는 것으로 사료된다.As a result, as shown in Figure 4 , when treated with DNC-16-A, the expression of active caspase-3 (cpp20) gradually increased over time and showed the highest level at 6 hours. Thereafter it decreased. In addition, when treated with DNC-16-B, the expression of active caspase-3 (cpp20) increased from 1 hour to continuously increased up to 24 hours. On the other hand, in the case of DNC-16-C, active caspase-3 (cpp20) was not activated, similar to the TUMEL assay results. The above results suggest that DNC-16-A and DNC-16-B according to the present invention effectively induce apoptosis through caspase activation.

이상 살펴본 바와 같이, 본 발명에서는 불가사리로부터 신규 세라마이드 유도체를 분리하고, 이의 생리학적 기능을 규명하였다. 본 발명에 따른 세라마이드 유도체는 손상된 피부 장벽의 회복/피부 보호 효과 및/또는 아폽토시스 유도에 의한 세포 독성 효과를 나타낸다. 따라서, 본 발명에 따른 세라마이드 유도체는 화장료 조성물, 피부질환 치료 및 예방용 조성물 및/또는 암 치료용 조성물의 유효성분으로서 유용하게 사용될 수 있다.As described above, in the present invention, the new ceramide derivative is isolated from the starfish and its physiological function has been identified. Ceramide derivatives according to the invention exhibit a repair / skin protective effect of damaged skin barriers and / or a cytotoxic effect by inducing apoptosis. Therefore, the ceramide derivative according to the present invention can be usefully used as an active ingredient of a cosmetic composition, a composition for treating and preventing skin diseases, and / or a composition for treating cancer.

Claims (11)

하기 화학식 2로 표시되는 세라마이드 유도체.Ceramide derivative represented by the following formula (2). <화학식 2><Formula 2>
Figure 112005054495028-pat00012
Figure 112005054495028-pat00012
 상기 식에서,Where R1은 C14의 알킬기이고;R 1 is an alkyl group of C14; R2는 하이드록시기이고;R 2 is a hydroxy group; R3는 6-메틸 펜타데카-1,5,7-트리엔, 1-하이드록시-노나데카-11-엔 및 노나데카-1,10-다이엔으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나이고; 및R 3 is any one selected from the group consisting of 6-methyl pentadeca-1,5,7-triene, 1-hydroxy-nonadeca-11-ene and nonadeka-1,10-diene; And R4는 수소이다.R 4 is hydrogen. 제 1항에 있어서, 하기 화학식 3으로 표시되는 세라마이드 유도체.The ceramide derivative according to claim 1, represented by the following general formula (3). <화학식 3><Formula 3>
Figure 112003035235117-pat00013
Figure 112003035235117-pat00013
 제 1항에 있어서, 하기 화학식 4로 표시되는 세라마이드 유도체.The ceramide derivative according to claim 1, represented by the following general formula (4). <화학식 4><Formula 4>
Figure 112003035235117-pat00014
Figure 112003035235117-pat00014
 제 1항에 있어서, 하기 화학식 5로 표시되는 세라마이드 유도체.According to claim 1, ceramide derivative represented by the following formula (5). <화학식 5><Formula 5>
Figure 112005054495028-pat00022
Figure 112005054495028-pat00022
 (a) 불가사리를 유기용매로 추출하는 단계;(a) extracting the starfish with an organic solvent; (b) 상기 (a) 단계에서 얻은 추출물을 감압농축한 후, 메탄올과 헥산의 혼합용매로 극성에 따라 분획하여 활성분획을 얻는 단계; 및(b) concentrating the extract obtained in step (a) under reduced pressure, and then fractionating according to polarity with a mixed solvent of methanol and hexane to obtain an active fraction; And (c) 상기 활성분획을 크로마토그래피로 분리 정제하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 제1항의 세라마이드 유도체의 제조 방법.(C) a method for producing a ceramide derivative of claim 1 comprising the step of separating and purifying the active fraction by chromatography. 제5항에 있어서, 상기 불가사리는 디스톨아스테리아스 니폰(Distolasterias nipon)인 것을 특징으로 하는 제조 방법.The method according to claim 5, wherein the starfish is Distolasterias nipon . 제5항에 있어서, 상기 (a)의 유기용매는 메탄올, 에탄올, 클로로포름, 아세톤 및 디클로로메탄으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하 는 제조 방법.The method of claim 5, wherein the organic solvent of (a) is at least one selected from the group consisting of methanol, ethanol, chloroform, acetone and dichloromethane. 제5항에 있어서, 상기 (c) 단계는 실리카 크로마토그래피, 역상 반-분취 고성능 액체 크로마토그래피 및 C18 역상 반-분취 고성능 액체 크로마토크래피를 순차적으로 행하는 것을 특징으로 하는 제조 방법.6. A process according to claim 5, wherein step (c) comprises silica chromatography, reverse phase semi-preparative high performance liquid chromatography and C 18 reverse phase semi-preparative high performance liquid chromatography. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 화합물 또는 이의 염을 함유하는 화장용 조성물.Cosmetic composition containing the compound of any one of Claims 1-4, or its salt. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 화합물 또는 이의 염을 유효성분으로 함유하는 피부질환 치료용 약학적 조성물.A pharmaceutical composition for treating skin diseases containing the compound of any one of claims 1 to 4 or a salt thereof as an active ingredient. 제3항 또는 제4항의 세라마이드 유도체, 또는 이의 염을 유효성분으로 함유하는 암 치료용 약학적 조성물.A pharmaceutical composition for treating cancer, comprising the ceramide derivative of claim 3 or 4, or a salt thereof as an active ingredient.
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