KR100568390B1 - 비타민 비6의 효소적 생산방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 포스페이트(NADP+), 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드(NAD+) 및 아데노신 트리포스페이트(ATP)의 존재하에 리조비움(Rhizobium) 속, 시노리조비움(Sinorhizobium) 속, 플라보박테리움(Flavobacterium) 속, 크리세오박테리움(Chryseobacterium) 속, 락토바실러스(Lactobacillus) 속, 아르트로박터(Arthrobacter) 속, 바실러스(Bacillus) 속, 클렙시엘라(Klebsiella) 속, 에스케리치아(Escherichia) 속, 슈도모나스(Pseudomonas) 속, 스테노트로포모나스(Stenotrophomonas) 속, 엔테로박터(Enterobacter) 속, 세라티아(Serratia) 속, 코린박테리움(Corynebacterium) 속, 브레비박테리움(Brevibacterium) 속, 엑시구오박테리움(Exiguobacterium) 속, 사카로마이세스(Saccharomyces) 속, 야마다쯔마(Yamadazma) 속, 피키아(Pichia) 속 또는 캔디다(Candida) 속에 속하는 미생물의 세포로부터 제조된 효소 반응 시스템과 1-데옥시-D-트레오-펜툴로스 및 4-하이드록시-L-트레오닌을 항온반응시키는 것을 포함하는 비타민 B6의 효소적 생산방법에 관한 것이다. 망간 이온 및 마그네슘 이온은 상기 반응을 촉진시킨다. 본 발명에 의해, 동물, 식물 및 미생물의 영양에서 필수 비타민이고 의약용 첨가물이나 식품 첨가물로서 유용한 비타민 B6를 고수율로 생산할 수 있다.

Description

비타민 비6의 효소적 생산방법{Enzymatic production of vitamin B6}
본 발명은 1-데옥시-D-트레오-펜툴로스(이후, DTP로 지칭함) 및 4-하이드록시-L-트레오닌(HT)으로부터 비타민 B6를 효소적으로 생산하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 사용된 바와 같은 "비타민 B6"란 표현은 피리독솔, 피리독살 및 피리독스아민을 포함한다.
비타민 B6는 동물, 식물 및 미생물의 영양에서 필수 비타민 중의 하나이고, 또한 인간을 위한 의약용 첨가물이나 식품 첨가물로도 매우 중요하다. 본 발명의 목적은 DTP 및 HT로부터 비타민 B6를 매우 효율적으로 생산하는 효소적 생산방법을 제공하는 것이다.
비타민 B6의 발효적 생산에 대한 많은 연구가 보고되어 있다. 사카로마이세스(Saccharomyces) 속(쉐르(G. H. Scherr) 및 라펠손(M. E. Rafelson)의 문헌[J. Appl. Bacteriol., 1962, 25, 187-194] 참조), 피키아(Pichia) 속(니시노(N. Nishino), 후지(K. Fujii) 및 가미쿠보(T. Kamikubo)의 문헌[Agric. Biol. Chem., 1973, 37, 553-559] 참조), 클렙시엘라(Klebsiella) 속(스즈에(R. Suzue) 및 하루나(Y. Haruna)의 문헌[J. Vitaminol., 1970, 16, 154-159] 참조), 아크로모박터(Achromobacter) 속(이시다(M. Ishida) 및 시무라(K. Shimura)의 문헌[Agric. Biol. Chem., 1970, 34, 327-334] 참조), 바실러스(Bacillus) 속(플러그(W. Pflug) 및 린젠스(F. Lingens)의 문헌[HoppeSeyler's Z. Physiol. Chem., 1978, 359, 559-570] 참조) 및 플라보박테리움(Flavobacterium) 속(다니(Y. Tani), 나카마쓰(T. Nakamatsu), 이즈미(T. Izumi) 및 오가타(K. Ogata)의 문헌[Agric. Biol. Chem., 1972, 36, 189-197] 참조)에 속하는 다양한 미생물이 비타민 B6를 생산하는 것으로 알려져 있다. 그러나, 상업적으로 가치가 있는 비타민 B6의 발효적 생산방법은 아직까지 알려져 있지 않다. 최근에, 유럽 특허 공개공보 제 0 765 938 A2 호에서 호기적 조건하에 배양 배지에서 비타민 B6를 생산할 수 있는 리조비움(Rhizobium) 속에 속하는 미생물을 배양하여 비타민 B6를 생산하는 발효적 방법을 기술한 바 있다. 이 방법에서 배양 배지는 동화성 탄소원, 소화성 질소원, 무기염 및 다른 영양소 이외에, 비타민 B6 역가를 향상시키는 추가의 물질(예를 들어, DTP 및 HT)을 포함할 수도 있다. 최근에 공지된 이러한 방법이 비타민 B6를 고수율로 생산하긴 하지만, 그 효율성을 향상시킬 필요가 있다.
본 발명의 목적은 DTP 및 HT로부터 비타민 B6를 매우 효율적으로 생산하는 효소적 생산방법을 제공하는 것이다.
본 발명에 의해, 종래 방법보다 DTP 및 HT로부터 비타민 B6를 더 높은 효율로 생산할 수 있다. 본 발명에 의해, 리조비움 속, 시노리조비움(Sinorhizobium) 속, 플라보박테리움 속, 크리세오박테리움(Chryseobacterium) 속, 락토바실러스(Lactobacillus) 속, 아르트로박터(Arthrobacter) 속, 바실러스 속, 클렙시엘라 속, 에스케리치아(Escherichia) 속, 슈도모나스(Pseudomonas) 속, 스테노트로포모나스(Stenotrophomonas) 속, 엔테로박터(Enterobacter) 속, 세라티아(Serratia) 속, 코린박테리움(Corynebacterium) 속, 브레비박테리움(Brevibacterium) 속, 엑시구오박테리움(Exiguobacterium) 속, 사카로마이세스 속, 야마다쯔마(Yamadazma) 속, 피키아 속 또는 캔디다(Candida) 속과 같은 미생물의 세포로부터 제조된 무세포 추출물이 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 포스페이트(NADP+), 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드(NAD+) 및 아데노신 트리포스페이트(ATP)의 존재하에 DTP 및 HT로부터 비타민 B6를 생산할 수 있다는 사실이 밝혀졌다.
따라서, 본 발명은 NADP+, NAD+ 및 ATP의 존재하에 DTP 및 HT로부터 비타민 B6를 생산할 수 있는 미생물의 세포로부터 제조된 효소 반응 시스템과 DTP 및 HT를 접촉시키는 것을 포함하는, DTP 및 HT로부터 비타민 B6를 효소적으로 생산하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 NADP+, NAD+ 및 ATP의 존재하에 리조비움 속, 시노리조비움 속, 플라보박테리움 속, 크리세오박테리움 속, 락토바실러스 속, 아르트로박터 속, 바실러스 속, 클렙시엘라 속, 에스케리치아 속, 슈도모나스 속, 스테노트로포모나스 속, 엔테로박터 속, 세라티아 속, 코린박테리움 속, 브레비박테리움 속, 엑시구오박테리움 속, 사카로마이세스 속, 야마다쯔마 속, 피키아 속 또는 캔디다 속에 속하는 미생물과 같은, 비타민 B6를 생산할 수 있는 미생물로부터 제조된 무세포 추출물을 함유하는 효소 반응 시스템과 DTP 및 HT를 접촉시키는 것을 포함하는 B6의 효소적 생산방법에 관한 것이다.
반응 혼합물에서 비타민 B6의 함량은 오스본(D. R. Osborne) 및 부그트(P. Voogt)의 방법에 따라 사카로마이세스 칼스버젠시스(Saccharomyces carlsbergensis) ATCC 9080을 사용하는 생물학적 분석법으로 결정할 수 있다(문헌[The Analysis of Nutrients in Foods, 1978, Academic Press, London, 224-227] 참조).
본 발명의 방법을 행할 때, 예를 들어 리조비움 속, 시노리조비움 속, 플라보박테리움 속, 크리세오박테리움 속, 락토바실러스 속, 아르트로박터 속, 바실러스 속, 클렙시엘라 속, 에스케리치아 속, 슈도모나스 속, 스테노트로포모나스 속, 엔테로박터 속, 세라티아 속, 코린박테리움 속, 브레비박테리움 속, 엑시구오박테리움 속, 사카로마이세스 속, 야마다쯔마 속, 피키아 속 또는 캔디다 속에 속하는 미생물의 세포는 동화성 탄소원, 소화성 질소원, 무기염 및 미생물의 생육에 필요한 다른 영양소가 함유된 배지에 이들 미생물을 배양하여 생산할 수 있다. 탄소원으로는, 예를 들어 글루코스, 프럭토스, 락토스, 갈락토스, 수크로스, 말토스, 전분, 덱스트린 및 글리세롤이 사용될 수 있다. 질소원으로는, 예를 들어 펩톤, 효모 추출물, 대두분, 옥수수 침지수(corn steep liquor), 육 추출물(meat extract), 황산암모늄, 질산암모늄, 우레아 및 이들의 혼합물이 사용될 수 있다. 또한, 무기염으로는, 칼슘, 마그네슘, 아연, 망간, 코발트 및 철의 황산염, 염산염 또는 인산염이 사용될 수 있다. 경우에 따라, 통상의 영양소나 소포제(예를 들어, 동물성 오일, 식물성 오일 또는 광물성 오일)를 또한 배양 배지에 포함시킬 수 있다. 배양 배지의 pH는 약 5 내지 약 9이고, 바람직하게는 약 6 내지 약 8일 수 있다. 배양시의 온도 범위는 적당하게는 약 10℃ 내지 약 45℃이고, 바람직하게는 약 25℃ 내지 약 40℃이다. 배양 시간은 보통 약 1 내지 약 5일이고, 바람직하게는 약 1 내지 약 3일이다. 배양하는 동안 통기 교반하는 것은 일반적으로 바람직한 결과를 가져온다.
본 발명의 방법에 사용할 수 있는 미생물로는 리조비움 속, 시노리조비움 속, 플라보박테리움 속, 크리세오박테리움 속, 락토바실러스 속, 아르트로박터 속, 바실러스 속, 클렙시엘라 속, 에스케리치아 속, 슈도모나스 속, 스테노트로포모나스 속, 엔테로박터 속, 세라티아 속, 코린박테리움 속, 브레비박테리움 속, 엑시구오박테리움 속, 사카로마이세스 속, 야마다쯔마 속, 피키아 속 및 캔디다 속에 속하는 모든 균주를 들 수 있다. 이러한 미생물은 일본 오사카 소재의 발효연구소(Institute of Fermentation, Osaka, Japan, IFO)와 같은 공공 기탁기관(균주보관소)으로부터 누구나 신청하여 입수할 수 있다. 기탁된 이러한 균주의 예로는 리조비움 멜릴로티(Rhizobium meliloti)(또한 시노리조비움 멜릴로티(Sinorhizobium meliloti)로도 알려져 있음) IFO 14782(DSM 10226번), 플라보박테리움 인돌로제네스(Flavobacterium indologenes)(또한 크리세오박테리움 인돌로제네스(Chryseobacterium indologenes)로도 알려져 있음) IFO 14944, 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) IFO 13110, 아르트로박터 니코티아내(Arthrobacter nicotianae) IFO 14234, 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) IFO 3007, 클렙시엘라 플란티콜라(Klebsiella planticola) IFO 3317, 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli) IFO 13168, 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida) IFO 3738, 스테노트로포모나스 말토필리아(Stenotrophomonas maltophilia)(또한 슈도모나스 말토필리아(Pseudomonas maltophilia) 또는 크산토모나스 말토필리아(Xantomonas maltophilia)로도 알려져 있음) IFO 12692, 엔테로박터 클로아캐(Enterobacter cloacae) IFO 3320, 세라티아 마르체센스(Serratia marcescens) IFO 12648, 코린박테리움 암모니아제네스(Corynebacterium ammoniagenes)(또한 브레비박테리움 암모니아제네스(Brevibacterium ammoniagenes)로도 알려져 있음) IFO 12612, 코린박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)(또한 브레비박테리움 글루타미쿰(Brevibacterium glutamicum)으로도 알려져 있음) IFO 12168, 엑시구오박테리움 아세틸리쿰(Exiguobacterium acetylicum)(또한 브레비박테리움 아세틸리쿰(Brevibacterium acetylicum)으로도 알려져 있음) IFO 12146, 피키아 구일리에르몬디(Pichia guilliermondii)(또한 야마다쯔마 구일리에르몬디(Yamadazma guilliermondii)로도 알려져 있음) IFO 10106, 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) IFO 0304, 사카로마이세스 세레비지애 IFO 0306, 캔디다 트로피칼리스(Candida tropicalis) IFO 0199 및 캔디다 트로피칼리스 IFO 0587을 들 수 있다. 이들 미생물 중에서, 바람직하게는 리조비움 멜릴로티 IFO 14782(DSM 10226번), 플라보박테리움 인돌로제네스 IFO 14944, 바실러스 서브틸리스 IFO 3007, 에스케리치아 콜라이 IFO 13168, 세라티아 마르체센스 IFO 12648, 코린박테리움 암모니아제네스 IFO 12612, 코린박테리움 글루타미쿰 IFO 12168, 피키아 구일리에르몬디 IFO 10106 및 사카로마이세스 세레비지애 IFO 0306 중 선택된 미생물이 무세포 추출물을 제조하기 위해 본 발명에 사용된다.
배양하여 수득한 세포로부터 무세포 추출물을 제조하기 위해, 초음파, 및 유리 비드(bead)의 존재하에 또는 프렌치(French) 압착 균질기에 의한 세포 파쇄와 같은 일반적인 방법을 적용할 수 있다. 경우에 따라 전술한 방법으로 파쇄하기 전에, 또한 라이소자임(lysozyme)이나 자이몰레이스(zymolase)와 같은 세포용해 효소로 15℃ 내지 45℃, 바람직하게는 20℃ 내지 40℃에서 1 내지 3시간 동안 처리할 수도 있다. 예를 들면, 배양액을 원심분리한 후에, 수득한 세포를 식염수로 세척 하고 효소의 일반적인 안정제인 수크로스, 디티오트레이톨(DTT) 및 페닐메틸설포닐 플루오라이드(PMSF)가 함유된 Tris-HCl 완충액(pH 7.5)과 같은 완충액에 현탁시킨다. 세포를 파쇄한 후에, 생성된 용액을 원심분리하여 세포 파편을 분리하고, 그 상청액을 무세포 추출물로 사용할 수 있다.
효소 반응 시스템에는 전술한 바와 같이 제조된 무세포 추출물이나, 황산암모늄 침전법 또는 겔 여과 크로마토그래피와 같이 효소를 정제하는데 사용하는 일반적인 방법에 의해 부분적으로 정제된 추출물이 포함된다. 선택적으로는, 미생물의 휴면 세포나 생육 세포도 또한 사용될 수 있다. 무세포 추출물 이외에, 기질로서 DTP 및 HT와 보조인자로서 NADP+, NAD+ 및 ATP가 또한 반응 시스템에 첨가된다. 시스템에 첨가되는 DTP, HT, NADP+, NAD+ 및 ATP의 양은 사용하는 반응 시스템에 따라 다양할 수 있다. 그러나, 일반적으로 효소 반응 시스템에서의 DTP 및 HT의 농도는 0.1mM 이상, 바람직하게는 1mM 내지 10mM이고, NADP+ 및 NAD+의 농도는 바람직하게는 0.05mM 내지 5mM, 더 바람직하게는 0.2mM 내지 0.4mM이고, ATP의 농도는 바람직하게는 1mM 내지 20mM, 더 바람직하게는 3mM 내지 7mM이다. 또한, 망간 이온, 마그네슘 이온 또는 두 이온을 모두 효소 반응 시스템에 포함시킬 수 있는데, 효소 반응 시스템에 망간 이온 또는 마그네슘 이온을 첨가하면 반응이 촉진되고 두 이온을 함께 첨가하면 더 바람직한 결과가 나타난다. 이러한 이온을 제공하는 염으로는, 예를 들어 망간 및 마그네슘의 염산염, 황산염, 질산염 또는 인산염을 사용할 수 있다. 첨가하는 망간 이온 및 마그네슘 이온의 양도 사용하는 반응 시스템에 따라 다양할 수 있다. 그러나, 일반적으로 망간 이온 및 마그네슘 이온의 농도는 망간 이온의 경우 0.1mM 내지 100mM, 바람직하게는 5mM 내지 10mM이고, 마그네슘 이온의 경우 3mM 내지 300mM, 바람직하게는 20mM 내지 50mM이다.
효소 반응을 개시할 때는, DTP 및 HT로부터 비타민 B6를 생산하는데 영향을 미치지 않는 완충액을 사용할 수 있다. 이러한 이유로 Tris-HCl 완충액이 바람직하게 사용된다. 효소 반응액의 pH는 적당하게는 6.0 내지 8.5, 더 바람직하게는 7.0 내지 8.0의 범위로 된다. 반응 온도는 적당하게는 15℃ 내지 45℃이고, 바람직하게는 20℃ 내지 40℃이다. 항온반응 기간은 반응 조건에 따라 다양할 수 있지만, 일반적으로 30분 내지 5시간, 더 바람직하게는 2시간 내지 4시간이다.
전술한 바와 같은 조건하에 DTP 및 HT로부터 생산된 비타민 B6는 다음과 같이 용이하게 회수될 수 있다. 예를 들어, 반응시킨 후에, 반응 혼합물중의 단백질을 열, 산, 알칼리 또는 유기용매로 변성시켜 침전시키고 원심분리하여 제거한다. 비타민 B6를 회수하기 위해, 상기 상청액으로부터 특정의 생성물을 추출하는데 일반적으로 사용되는 방법 중 비타민 B6의 다양한 특성에 적용할 수 있는 방법을 사용할 수 있다. 따라서, 예를 들어 상청액에 존재하는 비타민 B6를 이온 교환 수지로 정제한다. 목적한 생성물을 추가로 알콜과 물의 혼합물에서 재결정화시킨다.
본 발명을 이하의 실시예를 참조하여 더 자세히 설명하겠지만, 본 발명이 이들 특정의 실시예에 한정되는 것은 아님은 물론이다.
실시예
실시예 1
무세포 추출물의 제조
리조비움 멜릴로티 IFO 14782(DSM 10226번)를 1% 글루코스, 0.5% 폴리펩톤(일본 닛폰 세이야쿠 캄파니(Nippon Seiyaku Co.) 제품), 0.2% 효모 추출물(디프코(Difco) 제품), 0.05% MgSO4·7H2O, 0.001% MnSO4·5H2O 및 0.001% FeSO4·7H2O가 함유된 종배지에서 17시간 동안 28℃에서 배양하였다. 종배양액을 4% 글루코스, 2% 폴리펩톤, 0.2% 효모 추출물, 0.05% MgSO4·7H2O, 0.05% MnSO4·5H2O, 0.001% FeSO4·7H2O 및 한 방울의 소포제 CA-115(일본 닛폰 유시 캄파니(Nippon Yushi Co.) 제품)가 함유된 200㎖의 발효 배지가 들어있는 500㎖들이 플라스크로 옮긴 후, 이 플라스크를 28℃ 플라스크 진탕기(shaker)에서 진탕시켰다. 72시간 동안 배양한 후에, 400㎖의 세포 배양액을 10,400×g에서 10분간 원심분리하여 세포를 회수하고, 0.85% NaCl 용액으로 2회, 및 15% 수크로스, 0.1mM PMSF 및 1mM DTT가 함유된 10mM Tris-HCl 완충액(pH 7.5)으로 1회 세척하고, 무세포 추출물의 제조에 사용할 때까지 -30℃에 저장하였다.
이하의 작업은 모두 얼음물이나 4℃에서 행하였다. -30℃에 저장된 세포를 해동하고, 15% 수크로스, 0.1mM PMSF 및 1mM DTT가 함유된 5㎖의 10mM Tris-HCl 완충액(pH 7.5)에 현탁시켰다. 세포 현탁액을 200kg/㎠에서 프렌치 압착 균질기(오타케 웍스 캄파니 리미티드(Ohtake Works Co., Ltd.) 제품)에 통과시켰다. 생성된 균질액을 34,800×g에서 30분간 원심분리하여 세포 파편을 제거하였다. 10㎖의 상청액을 15% 수크로스, 0.1mM PMSF 및 1mM DTT가 함유된 1ℓ의 80% 황산암모늄 용액으로 하룻밤 동안 투석시키고, 34,800×g에서 30분간 원심분리하여 침전물을 수거하였다. 침전물을 15% 수크로스 및 0.1mM PMSF가 함유된 10㎖의 10mM Tris-HCl 완충액(pH 7.5)에 용해시키고, 동일한 완충액으로 하룻밤 동안 투석시킨 후, 투석된 용액을 효소 반응에 사용할 때까지 -30℃에 저장하였다. 무세포 추출물의 단백질 함량을 로우리(Lowry) 방법(로우리 등의 문헌[J. Biol. Chem., 1951, 193, 265] 참조)으로 측정한 결과 11.4㎎/㎖였다.
실시예 2
DTP 및 HT로부터 비타민 B 6 의 효소적 생산
효소 반응은 500㎕의 하기 표 1에 기재된 반응 혼합물이 함유된 시험관을 28℃에서 항온반응시켜 행하였다. 완전 반응 시스템은 2.5mM DTP, 2.5mM HT, 0.38mM NADP+, 0.38mM NAD+, 5mM ATP, 193.25㎕의 무세포 추출물 및 80mM Tris-HCl 완충액(pH 7.50)을 함유하였다. 2시간 동안 항온반응시킨 후에, 끓는 수욕에서 3분간 가열하여 반응을 종결시키고, 10,000×g에서 10분간 원심분리한 다음, 상청액을 포스파테이스(phosphatase)로 처리하였다. 포스파테이스 처리는 15㎕의 상청액, 10㎕의 1㎎/㎖ 산 포스파테이스(독일 뵈링거 만하임 게엠베하(Boehringer Mannheim GmbH) 제품) 및 10㎕의 100mM 아세테이트 완충액(pH 5.0)이 함유된 시험관을 37℃에서 30분간 항온반응시켜 행하였다. 항온반응 후, 1,800㎕의 물을 시험 관에 첨가하고 후술한 바와 같이 사카로마이세스 칼스버젠시스 ATCC 9080을 사용하는 미생물학적 방법으로 비타민 B6를 측정하였다. 우선 피리독솔의 표준 용액(0 내지 2㎍/㎖)을 증류수로 1.21×10-2으로 희석하였다. 100㎕의 희석된 표준 용액과 사카로마이세스 칼스버젠시스 ATCC 9080을 함유한 3㎖의 비타민 B6의 분석 배지(일본 닛스이 캄파니(Nissui Co.) 제품), 또는 100㎕의 샘플과 3㎖의 이 분석 배지를 순서대로 시험관에 첨가하고, 28℃에서 30o로 기울여서 배양하였다. 17시간 동안 배양한 후에, 5㎖의 0.1N 염산을 첨가하여 세포 생육을 정지시킨 다음, 샘플의 흡광도를 660nm에서 측정하였다. 샘플내의 비타민 B6의 양은 샘플의 탁도를 사카로마이세스 칼스버젠시스 ATCC 9080의 표준 생육곡선과 비교하여 결정하였다. 결과적으로, 완전 반응 시스템에서 97ng 비타민 B6/㎖/㎎ 단백질/시간이 생산되었다. 다른 한편으로, 완전 반응 시스템에서 한 요소라도 제외된 반응 시스템에서는 비타민 B6가 생산되지 않았다. 또한, 완전 반응 시스템에 8.4mM MnCl2, 32mM MgCl2 또는 둘다가 보충된 시스템에서는 각각 119, 123 또는 587ng 비타민 B6/㎖/㎎ 단백질/시간이 생산되었다(표 1). 이 결과는 DTP 및 HT로부터 비타민 B6를 생산할 때 무세포 추출물, NADP+, NAD+ 및 ATP가 필수요소이며, MnCl2 및 MgCl2가 비타민 B6의 생산을 촉진시킨다는 사실을 나타낸다.
Figure 111999003326790-pat00001
실시예 3
실시예 1 및 실시예 2에서 기술한 바와 유사한 방법으로, 다양한 종류의 미생물의 무세포 추출물에 따른 비타민 B6의 생산을 조사하였다. 한천 평판에 생육시킨, 한 백금이량의 하기 표 2에 기재된 각 균주 세포를 각 종배지에서 17시간 동안 28℃에서 배양하였다. 2㎖의 종배양액을 100㎖의 본 배지 및 한 방울의 소포제가 들어있는 500㎖들이 플라스크로 옮긴 후, 이 플라스크를 28℃ 플라스크 진탕기에서 진탕시켰다. 하기 표 2에 기재된 각 균주를 배양하는데 사용한 종배지 및 본 배지의 조성을 하기 하기 표 3에 요약하였다:
Figure 111999003326790-pat00002
Figure 111999003326790-pat00003
24시간 동안 배양한 후에, 400㎖의 배양액을 원심분리하여 각 균주 세포를 회수하고, 0.85% NaCl 용액으로 2회, 및 15% 수크로스, 0.1mM PMSF 및 1mM DTT가 함유된 10mM Tris-HCl 완충액(pH 7.5)으로 1회 세척하였다. 수득한 세포를 5㎖의 동일한 완충액에 현탁시켰다. 하기 표 4에 나타낸 바와 같이, 플라보박테리움 인돌로제네스 IFO 14944, 락토바실러스 브레비스 IFO 13110, 아르트로박터 니코티아내 IFO 14234, 바실러스 서브틸리스 IFO 3007, 클렙시엘라 플란티콜라 IFO 3317, 에스케리치아 콜라이 IFO 13168, 슈도모나스 푸티다 IFO 3738, 스테노트로포모나스 말토필리아 IFO 12692, 엔테로박터 클로아캐 IFO 3320 또는 세라티아 마르체센스 IFO 12648의 세포를 프렌치 압착 균질기를 통과시키거나 초음파 파쇄기(코스모 바이오 캄파니 리미티드(Cosmo Bio Co., Ltd.) 제품)를 사용하여 파쇄시키고, 그밖의 균주는 파쇄하기 전에 1㎖의 세포 현탁액당 2㎎의 라이소자임(시그마(Sigma) 제품) 또는 200유니트(unit)의 자이몰레이스(시그마 제품)로 30℃에서 1시간 동안 처리하였다. 생성된 균질물을 원심분리하여 세포 파편을 제거하고, 그 상청액을 15% 수크로스 및 0.1mM PMSF가 함유된 10mM Tris-HCl 완충액(pH 7.5)에서 투석시킨 후, 무세포 추출물로 사용하였다.
효소 반응은 2.5mM DTP, 2.5mM HT, 0.38mM NADP+, 0.38mM NAD+, 5mM ATP, 193.25㎕의 무세포 추출물 및 80mM Tris-HCl 완충액(pH 7.50)이 함유된 500㎕의 반응 혼합물 A, 또는 여기에 8.4mM MnCl2 및 32mM MgCl2가 보충된 500㎕의 반응 혼합물 B가 들어있는 시험관을 28℃에서 항온반응시켜 행하였다. 2시간 동안 항온반응시킨 후에, 끓는 수욕에서 3분간 가열하여 반응을 종결시키고, 혼합물을 10,000×g에서 10분간 원심분리한 다음, 그 상청액을 37℃에서 산 포스파테이스로 처리하였다. 30분간 항온반응시킨 후에, 반응 혼합물내에 생산된 비타민 B6를 사카로마이세스 칼스버젠시스 ATCC 9080을 사용하는 생물학적 분석방법으로 측정하였다. 결과적으로, 하기 표 4에 요약된 바와 같이 반응 혼합물 A 및 반응 혼합물 B에서 각각 7 내지 23ng 비타민 B6/㎖/㎎ 단백질/시간 및 33 내지 139ng 비타민 B6/㎖/㎎ 단백질/시간이 생산되었다:
Figure 112004015110714-pat00008
본 발명에 의해, 종래 방법보다 DTP 및 HT로부터 비타민 B6를 더 높은 효율로 생산할 수 있다.

Claims (1)

1-데옥시-D-트레오-펜툴로스(DTP) 및 4-하이드록시-L-트레오닌(HT)으로부터 비타민 B6를 생산하는 방법으로서, DTP 및 HT로부터 비타민 B6를 생산할 수 있는 미생물의 세포로부터 제조된 효소 반응 시스템과 DTP 및 HT를 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 포스페이트(NADP+), 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드(NAD+) 및 아데노신 트리포스페이트(ATP)의 존재하에 접촉시킴을 포함하는 방법.
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