KR100518686B1

KR100518686B1 - 성장호르몬 분비촉진용 생약추출물

Info

Publication number: KR100518686B1
Application number: KR10-2002-0035770A
Authority: KR
Inventors: 김정숙; 하혜경; 정대영; 이제현; 김진숙
Original assignee: 한국 한의학 연구원
Priority date: 2001-06-26
Filing date: 2002-06-25
Publication date: 2005-11-08
Also published as: KR20030004042A

Abstract

본 발명은 도인(Persicae Semen) 추출물의 제조방법, 상기 방법에 의해 얻어지는 도인 추출물 및 이를 포함하는 약학적 조성물 및 건강식품에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 도인을 알콜 또는 알콜과 물의 혼합 용매를 첨가하거나 산 또는 염기 용액으로 가수분해하고 중화한 후 알콜 또는 알콜과 물의 혼합 용매를 첨가하여 추출되는 도인 추출물의 제조방법, 상기 방법에 의해 얻어지는 도인 추출물 및 이를 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물 및 건강식품에 관한 것이다. 본 발명의 도인 추출물은 강력한 성장호르몬 분비촉진 활성을 나타내며 천연약재로서 안전성이 확보되어 있으므로 성장호르몬 분비촉진제용 의약품 및 식품으로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

성장호르몬 분비촉진용 생약추출물{Extract of herb for promoting release of growth hormone}

본 발명은 도인(Persicae Semen) 추출물의 제조방법, 상기 방법에 의해 얻어지는 도인 추출물 및 이를 포함하는 약학적 조성물 및 건강식품에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 도인을 알콜 또는 알콜과 물의 혼합 용매를 첨가하거나 산 또는 염기 용액으로 가수분해하고 중화한 후 알콜 또는 알콜과 물의 혼합 용매를 첨가하여 추출되는 도인 추출물의 제조방법, 상기 방법에 의해 얻어지는 도인 추출물 및 이를 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물 및 건강식품에 관한 것이다.

성장호르몬(growth hormone, GH)은 동물의 뇌하수체에서 분비되는 단백질로서 191개의 아미노산으로 구성된 펩타이드 호르몬이다. 이러한 성장호르몬은 오래 전부터 동물체로부터 분리되어 주로 왜소증(dwarfism, 난장이병) 환자들의 치료에 사용되어 왔는데, 단백질의 손실을 억제하고 나이가 많은 장년 또는 노인에서 생리학적인 노화 현상을 지연시키는 작용이 있으므로 다양한 질병의 치료에 사용될 수 있다(Horber, F. F. and Haymond, M.W., J. Clin. Invest., 1990, 86, 265-272).

성장호르몬을 지속적으로 투여하면 체중, 근육 및 지방의 무게 등이 증가하여 노화로 인한 질병을 예방할 수 있고, 일시적으로 투여하는 경우에도 혈장내의 인슐린 및 IGF-1(Insulin-like growth factor-1)의 농도를 증가시키며 소변 내의 단백질 농도를 감소시키는 것으로 알려져 있으며(Kohrt, W. M. et al., Med. Sci. Sports Exerc., 1992, 24, 832-837; Zachweija, J. J. et al., Am. J. Physiol., 1994, 266 (Endocrinol. Metab. 29), E840-844), 이외에도 간의 무게와 크기를 증가시키고 근육, 뼈 및 연결 조직 등의 말단 조직에서 단백질의 합성을 향상시키는 것으로 보고되었다(Kaiser, F. E. et al., J. Am. Geriatr. Soc., 1991, 39, 235-240; Marcus, R. et al., J. Clin. Endocrino. Metab., 1990, 70, 519-527).

지금까지의 연구로는 선천적인 뇌하수체 기능부전(hypopituitarism)인 어린이와 성인에게 성장호르몬 분비촉진 호르몬(growth hormone releasing hormone, 이하 "GHRH"라 칭한다)과 아르기닌(arginine)을 동시에 투여했을 때 그 효과는 성인보다도 어린이에게서 성장호르몬의 감응정도가 높았으며 많은 종류의 뇌하수체호르몬 결핍 환자보다도 성장호르몬 결핍 환자에게서 감응정도가 더 높았고 완전한 뇌하수체계를 갖는 환자보다도 뇌하수체의 잔여 맥관 성분(residual vascular component)을 가진 환자에게서 더 높은 결과를 얻었다. GHRH와 아르기닌에 대한 성장호르몬의 반응성은 나이에 따라 감소하는 경향(J. Clin. Endocrinol. Metab., 2001, 86(4), 1574-79)이 있고, 성장호르몬 분비촉진제(secretagogue)에 대한 내생 리간드인 그레린(ghrelin)을 성장호르몬 결핍 쥐에 투여하였을 때 효과가 있었으며(Diabetes, 2001, 50(2), 227-32), 활성 성장호르몬 분비촉진제인 MK-677과 강력한 골 흡수 저해제인 아렌드로네이트(alendronate)를 함께 투여하면 아렌드로네이트를 단독 투여했을 때보다 상대적으로 더 높은 형성 속도를 유지하므로 폐경후 골다공증인 여성에게서 골 무기질 밀도(bone mineral density)를 증가시킨다. MK-677과 아렌드로네이트의 병행 투여의 IGF-1 레벨에 대한 영향은 MK-677 단독 투여나 아렌드로네이트와 병행 투여 모두 IGF-1 레벨이 증가하고 골 형성 감소를 완화시켰으며 대퇴 목(femoral neck)의 골 무기질 밀도는 증가한 반면 요추, 둔부의 골 무기질 밀도는 증가 현상이 나타나지 않았다. MK-677을 통한 성장호르몬의 대사효과는 골 형성에 있어서 아렌드로네이트의 직접적인 억제효과를 줄였다(J. Clin. Endocrinol. Metab., 2001, 86(3), 1116-25).

과거에 성장호르몬은 주로 사체의 뇌하수체로부터 추출되어 사용되었으나, 이 과정에서 성장호르몬을 투여 받은 환자들에게 크로이츠펠트-야콥병 (Creutzfeldt-Jakob disease)이란 질병을 유발시킴이 밝혀졌다. 이렇게 분리 과정에서 다른 질병의 원인 물질까지 환자에게 유입될 수 있는 위험성이 있어 사체로부터 분리한 성장호르몬은 그 사용이 매우 제한되었다. 유전공학의 발달과 더불어 미생물을 이용하여 생산한 재조합 성장호르몬은 대량 생산 및 공급이 가능하고 다른 질환의 감염 위험성이 적으므로 왜소증 치료제 시장의 대부분을 재조합 성장호르몬을 포함하는 단백질 제제가 차지하게 되었다. 유전자 재조합 방식의 성장호르몬을 체내에 투여하는 방법은 성장호르몬 자체가 거대 단백질이어서 경구투여가 불가능하여 주사기를 이용한 근육주사로 이루어진다. 이와 같이 재조합 성장호르몬은 대량 생산될 수 있음에도 불구하고 일정한 치료 기간동안 요구되는 비용이 상당하고, 경구투여가 불가능하여 주사를 이용해야 하는 불편함으로 인하여 최근에는 경구 투여용 제제를 개발하려는 시도들이 활발히 진행되고 있다.

경구 투여용 성장호르몬 제제의 기본 요건은 체내에서 흡수율이 높아야 하는 동시에, 선택적으로 성장호르몬 분비를 자극할 수 있는 생물학적 활성도를 지니고 있어야 하는 것이다. 경구 투여로 체내에서 높은 흡수율을 갖기 위해서는 분자량이 작을수록 유리하며, 체내에서 생리 활성 작용을 원활하게 수행하려면 구조적으로도 특별한 물리화학적 성질을 가져야 한다.

이와 같은 기본 요건을 갖춘 물질로서 연구되어 임상시험 단계까지 개발된 대표적인 것들로는 유기합성된 L-692, 429(Horm. Res., 1993, 40, 109-115) 및 L-163, 191(PNAS, 1995, 92, 7001-7005), 그리고 펩타이드성 화합물 GHRP-2(Endocrinology, 1994, 140, R9-R13), GHRP-1(J. Neuroendocrinology, 1994, 6, 185) 및 헥사렐린(Hexarelin: His-D-2-methyl-Trp-Ala-Trp-D-Phe-Lys-NH2) 등이 있다. 상기 물질들은 공통적으로 1980년대 초에 알려진 펩타이드성 화합물인 GHRP-6 (His-D-Trp-Ala-Trp-D-Phe-Lys-NH2)의 기본 구조를 이용하여 새로이 연구 개발된 것이다.

최근에는 새로운 물질을 개발하는 접근 방식으로 화학물질 라이브러리(chemical library)를 이용하여 후보 물질들을 대량 검색하는 방법이 각광을 받고 있으며, 이외에도 길이가 짧은 펩타이드들로 구성된 펩타이드 라이브러리(peptide library) 및 자연계에 존재하는 여러 물질들로 구성된 천연물질 라이브러리(natural library)도 이러한 새로운 물질을 개발하기 위하여 활용되고 있다. 이와 같이 다양하고 광범위한 라이브러리를 이용하여 신약을 개발하는 것은 개발에 소요되는 기간 및 비용 면에서 기존의 접근 방식보다 상당히 효율적이므로 선진 제약기업에서는 이미 오래 전부터 자사의 라이브러리를 이용한 신약 개발에 적극적으로 참여하여 왔다. 구체적으로 상기 L-163, 191 및 헥사렐린도 이러한 접근 방식으로 개발된 물질이라 할 수 있다.

원래 체내에는 동물마다 다르지만 사람의 경우 44개의 아미노산으로 구성된 GHRH가 존재한다. 사람의 체내에서 성장호르몬의 분비를 조절하는 것은 성장호르몬의 분비를 촉진하는 GHRH와 성장호르몬의 분비를 억제하는 소마토스타틴 (Somatostatin)이라는 호르몬이며 이들은 상호작용을 통해 성장호르몬을 간헐적 (pulsatile)으로 특이하게 분비하도록 작용하는 것으로 알려져 왔다

GHRP-6는 생물학적 활성도에 있어서 상기 GHRH 보다 효과는 저조하지만 분자량 크기 면에서는 상당히 압축되어 있는 유용한 합성 펩타이드이다(대한 내분비학회지, 1995, 10(1), 1-9). GHRP-6의 개발 이후 많은 연구자들에 의해 GHRP-6가 GHRH와 동일한 수용체(receptor)에 작용하여 효과를 나타내는 것이 아니라는 보고가 있었고, 이러한 합성화합물인 성장호르몬 분비촉진제들이 경유하는 새로운 수용체의 존재 가능성이 제기되었다(Endocrinology, 1989, 124, 2791). 이러한 가능성은 머크(Merck)사의 연구진에 의해 돼지와 사람의 뇌하수체 만곡형상 복층정중(Arcuate ventro-medial) 부위 그리고 시상하부에 존재하는 성장호르몬 분비촉진제 수용체의 cDNA의 염기서열이 밝혀지면서 사실로 입증되었다(Science, 1996, 273, 974-977). 이러한 사실을 통해 기존에 밝혀진 성장호르몬 분비촉진호르몬과 합성화합물인 성장호르몬 분비촉진제 사이의 상승작용(synergism)이 입증되었으며, 체내에 존재하여 GHRH와 같은 역할을 수행하리라 추측되는 물질의 규명에 더욱 관심이 증가되고 있는 실정이다.

미국 머크사가 개발한 L-692, 429(Science, 1993, 260, 1640-1643)는 선택적으로 성장호르몬을 분비시키는 것으로 알려졌으며, 동물 실험 단계에서도 효과적인 체내 흡수율을 보여주었다. 그러나 인체 실험 결과는 동물의 그것과 다르게 경구 투여시 흡수가 그리 높지 않은 문제점이 있었다. 이에 이러한 문제를 개선한 L-163, 191 이 개발되었고, 이는 기존에 개발되었던 성장호르몬 분비촉진제들의 가장 큰 문제점이었던 경구 흡수율을 높인 화합물로서 개에서 경구 투여시 60% 이상의 흡수율을 나타내는 것으로 보고되었고 이를 바탕으로 임상시험이 진행중이다(PNAS, 1995, 92, 7001-7005; Endocrinology, 1996, 137, 5284-5289). 이들 물질에 관한 연구 결과는 뇌하수체를 자극하여 성장호르몬을 분비시키는 물질 등이 성장호르몬 대체제로서 임상적으로 유용하게 사용될 수 있음을 시사하고 있는 반면, 새로운 성장호르몬 분비촉진제를 개발하는 것이 용이하지 않다는 것을 보여준다.

이러한 연구의 일환으로 인체 내에 무해한 천연물 추출물을 이용하여 성장호르몬 분비촉진 역할을 하는 물질을 찾는 연구가 진행되고 있다. 그 예로 황기 뿌리의 알콜 추출물 그리고 7-하이드록시-4'-메톡시-이소플라본(7-hydroxy-4'-methoxy-isoflavone, formononetin) 및 스티그마스트-4-엔-6β-올-3-온(stigmast-4-en-6β-ol-3-one) 등이 성장호르몬 분비를 자극하는 활성이 있음이 본 발명자들에 의해 확인된 바 있고(대한민국 특허등록 제 257840호 및 제 251519호; Kim, J. S. and Kim, C. S., Kor. J. Pharmacogn., 1997, 28(2), 75-79; Kim, J. S. et al., Kor. J. Pharmacogn., 1996, 27(4), 336-341), 원지 추출물, 사상자 추출물, 백합 추출물 및 길경 추출물로 이루어진 그룹 중에서 선택된 1종 이상의 추출물을 함유하는 성장호르몬 분비촉진 조성물에 관한 것(대한민국 특허출원 제 1998-0053921호), 천연 생약재로부터 성장호르몬 분비 자극인자를 추출하는 방법 및 수용성 속단 추출물(대한민국 특허출원 제 1998-014589호)과 글리코알카로이드(glycoalkaloids) 계열의 아스퍼로사포닌 H1(asperosaponin H1)의 성장호르몬 분비촉진인자(대한민국 특허출원 제 1998-014590호)에 대한 연구가 보고되어 있다.

도인(桃仁, 생약명: Peach Kernel: Persicae Semen)은 복사나무(Prunus persica Batsch) 또는 산복사(Prunus davidiana Maximowicz, 장미과 Rosaceae)의 씨이다. 생약으로는 종자를 사용하며 도인(桃仁, Persicae Semen)이라 한다.

도인을 건조한 것은 정량할 때 아미그달린(amygdalin, C₂₀H₂₇NO₁₁; 457.44)을 0.5% 이상 함유한다. 도인의 성분으로는 아미그달린, 에멀신(emulsin), 지방유 등이 함유되어 있다. 또한 도인의 화학성분은 프루닌(Prunin), (+)-카테친((+)-Catechin), 콜린(Choline), 구아니딘(Guanidine), 메틸구아니딘(Methylguanidine), (3R)-12'-Apo-β-카로텐-3,12'-디올((3R)-12'-Apo-β-carotene-3,12'-diol), (3S,5R,6S,15Z)-5,6-에폭시-5,6-디하이드로-12'-apo-β-카로덴-3((3S,5R,6S,15Z)-5,6-Epoxy-5,6-dihydro-12'-apo-β-carotene-3),12'-디올l,(3S,5R,6S,9Z,13Z')-5,6-에폭시-5,6-디하이드로-12'-아포-β-카로텐-3,12'-디올(12'-diol,(3S,5R,6S, 9Z,13Z')-5,6-Epoxy-5,6-dihydro-12'-apo-β-carotene-3,12'-diol), (3S,5R,8R,all -E)-5,8-에폭시-5,8-디하이드로2'-아포-β-카로텐-3,12'-디올((3S,5R,8R,all-E)-5, 8-Epoxy-5,8-dihydro12'-apo-β-carotene-3,12'-diol), (3S,5R,8S,all-E)-5,8-에폭시-5,8-디하이드로12'-아포-β-카로텐-3,12'-디올((3S,5R,8S,all-E)-5,8-Epoxy-5,8 -dihydro12'-apo-β-carotene-3,12'-diol), 9-시스-β-카로텐(9-cis-β-Carotene), 크립토잔틴(Cryptoxanthin), 페르시카잔틴(Persicaxanthin), 제아잔틴(Zeaxanthin (all E-form)), α-카로텐(α-Carotene), β-카로텐(β-Carotene(all-trans)), 기버렐린 A32(Gibberellin A32), 기버렐린 A5(Gibberellin A5), 잔탄올(Xanthanol), (-)-에피카테친-3-O-갈레이트((-)-Epicatechin-3-O-gallate), 아프제린(Afzelin), 아스트라갈린(Astragalin), 헤스퍼레틴5-O-β-D-글루코피래노시드(Hesperetin-5-O-β-D-glucopyranoside), 하이퍼로시드(Hyperoside), 아이소쿼시트린 (Isoquercitrin), 캠프페롤-3-O-β-D-루티노시드(Kaempferol-3-O-β-D-rutinoside), 멀티프로린 A(Multiflorin A), 멀티프로린 B(Multiflorin B), 멀티노시드 A(Multinoside A), 쿼세틴-3-O-β-D-디글루코피래노시드(Quercetin-3-O-β-D-diglucopyranoside),쿼세틴-3-O-갈락토피래노실-7-O-디글루코피래노시드(Quercetin-3-O-galactopyronosyl-7-O-diglucopyranoside), 쿼세틴-3-O-글루코피래노실-7-O-디글루코피래노시드 (Quercetin-3-O-glucopyranosyl -7-O-diglucopyranoside), 쿼시트린(Quercitrin), 루틴(Rutin), 트리폴린(Trifolin), 메바론산 (Mevalonic acid), 벤즈알데히드(Benzaldehyde), 카페인산(Caffeic acid), 크로로제닌산(Chlorogenic acid), dl-만델린산(dl-Mandelic acid), 아르기닌(arginine), 크레아틴(Creatine), 구아니디노아세트산(Guanidinoacetic acid), γ-구아니디노부틸아미드(γ-Guanidinobutyramide), γ-구아니디노부틸산(γ-Guanidinobutyric acid), γ-구아니디노그로피온산(γ-guanidinopropionic acid), 아이소잔탄올(Isoxanthanol), 토멘토신(Tomentosin), 잔타틴(Xanthatin), 잔틴인 (Xanthinin), 잔텀인(Xanthumin), 캄페스테롤(Campesterol), 다우코스테롤(Daucosterol), 스티그마스테롤(Stigmasterol), δ-5-아베나스테롤(δ-5-avenasterol) 등이 있다.

도인의 약효는 한방처방에서 월경통, 월경불순, 타박통 등에 소염성 구어혈제로 배합된다. 또한 민간에서는 변비에 말린 복숭아 꽃봉오리를 끓여서 이용하기도 하며 땀띠에 잎을 목욕물에 넣기도 하며 달여서 외용한다. 도인은 냄새가 거의 없으며 맛은 쓰고 기름과 같다.

도인이 사용되는 처방은 계지오인탕(桂枝桃仁湯), 구미안신환(九味安腎丸), 도인승기탕(桃仁承氣湯), 도인탕(桃仁湯), 독활탕(獨活湯), 통경환(通經丸) 등이 있다. 적용되는 병증은 대변비결(大便秘結), 사수, 산후요통, 산후음종, 상한(傷寒), 상한축혈증, 소복급통(小腹急通), 소아음퇴, 십종시주, 예막, 오시(五尸), 적취(積聚), 졸심통(卒心痛), 징가, 혈가, 혈고(血蠱) 등의 증상에 사용된다. 도인의 수치법은 거피각(去皮殼), 도인니(桃仁泥), 도인탕법(桃仁湯法), 수탕, 초도인(炒挑仁), 탕포(湯泡) 등이 있다.

최근 과학적인 연구결과에 의한 도인의 효과를 살펴보면 UV로 인한 정상 인간 케라틴세포(keratinocyte)와 섬유아세포(fibroblast)의 세포독성에 대한 보호효과가 있으며(Archives of Phamacial Research, 2000, 23(4), 396-400) 돌연변이 유발 물질(mutagen)에 대한 억제물질을 함유하고 있는 것이 보고되었고(Yakugaku Zasshi-J, Pharmaceutical Society of Japan, 1992, 112(12), 934-9), 하이포콜레스테롤(hypocholesterolemic) 생쥐의 콜레스테롤 수치를 낮추는 효과(Kor. J. Pharmacogn., 1990, 21(2), 153-157)와 산소 래디칼(oxygen radical) 소거작용이 있음이 보고되었다(Yakugaku Zasshi-J. Pharmaceutical Society of Japan, 1985, 105(9), 895-901).

이와 같이 여러 가지 효능이 있는 것으로 알려진 도인은 현재까지 다른 생약재와의 혼합물 형태로 제조되어 왔다. 도인을 이용하여 전이 억제 조성물(등록번호 291630), 부인과 질환 및 여성비만 치료를 위한 조성물(등록번호 232671)이 있고, 아이소플라본(isoflavone)을 분리 정제한 제조방법(US 5679806), 체리(cherry)의 바이오플라보노이드(bioflavonoids)를 COX 억제제와 항염증제에 응용법(US 194469) 및 알러지 억제제(US 6180106), 항진통 항염증제(US 5908628) 등이 알려져 있다. 또한 혈압순환상승도 시키며(US 5942233), 이외에는 복합제로 다이어트 식품에 첨가하고(WO 103714A1) 항산화제(WO 039249A1)로도 사용되고 있다. 이외에도 발모제나 포스파타제 저해제(phosphatase inhibitor, JP 103293A2), 건강차(JP 8073369A2) 등에 응용한 경우도 있다. 복합제로 류마티즘, 화상이나 상처치유에 응용하고 있다.

이에, 본 발명자들은 도인 추출물의 생리학적 활성을 연구한 결과, 도인 추출물이 성장호르몬 분비촉진제로 작용하여 성장호르몬의 생산을 증가시킴을 밝힘으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 성장호르몬 분비촉진 활성을 갖는 도인 추출물의 제조방법, 상기 방법에 의해 얻어지는 도인 추출물 및 이를 유효성분으로 함유하는 약학적 조성물 및 건강성 식품을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 도인 추출물의 제조방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조되는 성장호르몬 분비촉진 활성을 갖는 도인 추출물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 도인 추출물을 유효성분으로 함유하는 성장호르몬 분비촉진용 약학적 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 도인 추출물을 유효성분으로 함유하는 성장호르몬 분비촉진용 건강식품을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 도인 추출물의 제조방법을 제공한다.

구체적으로 본 발명에서는 도인을 알콜 또는 알콜과 물의 혼합용매를 첨가하고 5 내지 40℃에서 침지하여 상기 도인 추출물을 제조하는 방법을 제공한다. 상기에서 알콜 수용액은 10 내지 100%의 에틸알콜(ethyl alcohol), 10 내지 100%의 메틸알콜(methyl alcohol) 및 주정으로 구성된 군으로부터 선택되어 사용될 수 있다.

또한 본 발명에서는 도인을 산 또는 염기로 가수분해하고 중화한 후 알콜 또는 알콜과 물의 혼합용매를 첨가하여 도인 추출물을 제조하는 방법을 제공한다. 이 때 상기 산 또는 염기는 0.1 내지 2 N의 농도인 것이 바람직하며, 산은 염산, 황산, 질산 및 인산으로 구성된 군으로부터 선택되어 사용될 수 있고 염기는 수산화나트륨 및 수산화칼륨으로 구성된 군으로부터 선택되어 사용될 수 있다. 이 방법에 의하면 당 또는 다른 알킬기 등 여러 가지 치환기와 결합되어 있던 식물의 결합형 화합물이 가수분해되어 도인 추출물에는 식물의 유리된 형태의 화합물로 포함된다. 상기에서 알콜 수용액은 10 내지 100%의 에틸알콜(ethyl alcohol), 10 내지 100%의 메틸알콜(methyl alcohol) 및 주정으로 구성된 군으로부터 선택되어 사용될 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 성장호르몬 분비촉진 활성을 갖는 도인 추출물을 제공한다.

본 발명자들은 본 발명의 도인 추출물이 성장호르몬 분비 촉진 활성을 갖는지 확인해 보았다. 먼저, 생후 4-5 주령의 스프래그-다우리(Sprague-Dawley rat) 랫트로부터 무균 조작하에 뇌하수체를 꺼낸 뒤 약하게 세척하고 잘게 분쇄하여 뇌하수체 세포(pituitary cell)를 분리하였다. 상기에서 분리한 뇌하수체 세포에 본 발명의 도인 추출물을 가하였으며, 비교군으로는 성장호르몬 분비의 기준 물질인 랫트 성장호르몬 분비인자(rat GRF, Bachem Co., Torrance, CA, U.S.A.)를 가한 후에 37℃에서 배양하였다. 배양한 후 원심분리하여 그 상등액을 분리하였으며, 쥐 성장호르몬 RIA 키트를 사용하여 성장호르몬의 양을 측정하였다.

그 결과, 본 발명의 도인 추출물은 뇌하수체 세포에 작용하여 성장호르몬의 분비를 촉진시키며, 아울러 비교군으로 사용한 랫트 성장호르몬 분비인자보다 성장호르몬은 분비촉진 효과가 월등히 뛰어남을 확인하였다(표 1 참조).

또한, 동물모델을 이용한 성장호르몬 분비촉진 실험 결과, 도인 추출물은 시험관(in vitro) 뿐만 아니라 생체내(in vivo)에서 성장호르몬을 강력하게 증가시키는 것으로 나타났다(표 2 참조).

본 발명의 성장호르몬 분비촉진용 약학적 조성물은 상기 도인 추출물을 유효 성분으로 함유한다. 상기 도인 추출물은 임상 투여 시에 경구 또는 비경구로 투여가 가능하며 일반적인 의약품 제제의 형태로 사용될 수 있다. 즉, 본 발명의 도인 추출물은 실제 임상 투여 시에 경구 및 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제 및 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구 투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제 및 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 도인 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로스, 락토오스 및 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구 투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제 및 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제 및 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제 및 좌제가 포함된다. 비수성용제와 현탁용제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세롤 및 젤라틴 등이 사용될 수 있다.

투약 단위는, 예를 들면 개별 투약량의 1, 2, 3 또는 4배를 함유하거나 또는 1/2, 1/3 또는 1/4배를 함유할 수 있다. 개별 투약량은 바람직하기로는 유효 약물이 1회에 투여되는 양을 함유하며, 이는 통상 1일 투여량의 전부, 1/2, 1/3 또는 1/4배에 해당한다.

도인 추출물의 유효용량은 0.1 내지 40 ㎎/㎏이고, 바람직하기로는 0.4 내지 4 mg/kg이며, 하루 1-6 회 투여될 수 있다.

본 발명의 도인 추출물을 마우스에 경구 투여, 복강 내 투여시 및 피하 주사시의 독성 실험을 수행한 결과, 복강 내 투여 및 피하 주사 독성 실험에 의한 50% 치사량(LD₅₀)은 적어도 물 추출물 222.5 ±7.5 g/kg 이상인 안전한 물질로 판명되었다.

또한, 본 발명은 도인 추출물을 유효성분으로 함유하는 성장호르몬 분비촉진용 건강식품을 제공한다.

본 명세서에서 건강식품이란 일반 식품에 도인 추출물을 첨가함으로써 일반 식품의 기능을 향상시킨 식품이며, 도인 추출물을 일반식품에 첨가하거나, 캡슐화, 분말화, 현탁액 등으로 제조할 수 있다. 이를 섭취할 경우 건강상 특정한 효과를 가져오고, 일반 약품과는 달리 식품을 원료로 하였기 때문에 약품의 장기복용시 발생할 수 있는 부작용 등이 없는 장점이 있다.

본 발명의 도인 추출물을 식품 첨가물로 사용할 경우, 상기 도인 추출물을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용되고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합양은 그의 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 도인 추출물을 식품 또는 음료의 제조시에 원료에 대하여 0.0001 내지 10 중량%, 바람직하게는 0.1 내지 5 중량%의 양으로 첨가될 수 있다. 그러나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있다. 또한, 본 발명의 건강식품은 상기 약학적 조성물로의 용도시 측정된 독성 범위내의 도인 추출물을 함유한다.

상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있다. 구체적으로, 도인 추출물을 함유하는 건강 식품으로는 도인을 주성분으로 만든 즙, 차, 젤리, 쥬스 등의 건강식품 및 기호품을 들 수 있으며, 월경통, 타박통 등을 목적으로 하는 민간요법제 등을 들 수 있다. 또한, 계지도인탕, 도인승기탕, 도인탕, 통경환 등과 같은 여러 한의학 처방들에도 사용할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 도인 추출물의 제조 1

도인 건조물 분말 50 g을 70% 메탄올 수용액 500 ㎖에 첨가하여 실온에서 2일 동안 교반시켰다. 교반 과정을 거쳐 얻어진 용액을 거름종이로 여과한 후 감압 농축하여 메탄올을 제거한 뒤 동결 건조하여 수분을 제거하여 본 발명의 도인 추출물을 제조하였다.

<실시예 2> 도인 추출물의 제조 2

도인 건조물 분말 0.1 g을 1 N HCl 수용액 1 ㎖에 넣고 100℃에서 2시간 동안 반응시켰다. 2시간 동안 가수분해시킨 뒤 중화한 후 상기 반응액을 동결건조로 수분을 제거한 후 상기 실시예 1과 동일하게 본 발명의 도인 추출물을 제조하였다.

<제제예 1> 주사액제의 제조방법

유효성분 10 ㎎을 함유하는 주사액제는 다음과 같은 방법으로 제조하였다.

도인 추출물 1 g, 염화나트륨 0.6 g 및 아스코르브산 0.1 g을 증류수에 용해시켜서 100 ㎖를 만들었다. 이 용액을 병에 넣고 20℃에서 30분간 가열하여 멸균시켰다.

상기 주사액제의 구성성분은 다음과 같다.

도인 추출물 1 g

염화나트륨 0.6 g

아스코르브산 0.1 g

증류수 정량

<제제예 2> 시럽제의 제조방법

본 발명의 도인 추출물을 유효성분 2% (중량/부피)로 함유하는 시럽은 다음과 같은 방법으로 제조한다.

도인 추출물, 사카린, 당을 온수 80 g에 용해시켰다. 이 용액을 냉각시킨 후, 여기에 글리세린, 향미료, 에탄올, 소르브산 및 증류수로 이루어진 용액을 제조하여 혼합하였다. 이 혼합물에 물을 첨가하여 100 ㎖가 되게 하였다.

상기 시럽제의 구성성분은 다음과 같다.

도인 추출물 2 g

사카린 0.8 g

당 25.4 g

글리세린 8.0 g

향미료 0.04 g

에탄올 4.0 g

소르브산 0.4 g

증류수 정량

<제제예 3> 정제의 제조방법

유효성분 15 ㎎이 함유된 정제는 다음과 같은 방법으로 제조한다.

도인 추출물 250 g, 락토오스 175.9 g, 감자전분 180 g 및 콜로이드성 규산 32 g과 혼합하였다. 이 혼합물에 10% 젤라틴 용액을 첨가시킨 후, 분쇄해서 14 메쉬체를 통과시켰다. 이것을 건조시키고 여기에 감자전분 160 g, 활석 50 g 및 스테아린산 마그네슘 5 g을 첨가해서 얻은 혼합물을 정제로 만들었다.

상기 정제의 구성성분은 다음과 같다.

도인 추출물 250 g

락토오스 175.9 g

감자전분 180 g

콜로이드성 규산 32 g

10% 젤라틴 용액

감자전분 160 g

활석 50 g

스테아르산 마그네슘 5 g

<제제예 4> 식품 및 음료의 제조방법

본 발명자들은 도인 추출물을 유효성분으로 함유하는 식품 또는 음료 조성물을 하기와 같이 제조하였다.

<4-1> 비스켓의 제조

박력1급 88 ㎏

중력1급 76.4 ㎏

정백당 16.5 ㎏

식염 2.5 ㎏

포도당 2.7 ㎏

팜쇼트닝 40.5 ㎏

암모 5.3 ㎏

중조 0.6 ㎏

중아황산나트륨 0.55 ㎏

쌀가루 5.0 ㎏

비타민 B1 0.003 ㎏

비타민 B2 0.003 ㎏

밀크향 0.16 ㎏

물 71.1 ㎏

전지분유 4 ㎏

대용분유 1 ㎏

제일인산칼슘 0.1 ㎏

살포염 1 ㎏

분무유 25 ㎏

도인 추출물 0.1 ∼ 0.5 ㎏

상기 조성 및 함량으로 하여 통상적인 방법을 사용하여 비스켓을 제조하였다.

<4-2> 음료의 제조

꿀 522 ㎎

치옥토산아미드 5 ㎎

니코틴산아미드 10 ㎎

염산리보플라빈나트륨 3 ㎎

염산피리독신 2 ㎎

이노시톨 30 ㎎

오르트산 50 ㎎

도인 추출물 0.48 ∼ 1.28 ㎎

물 200 ㎖

상기 조성 및 함량으로 하여 통상적인 방법을 사용하여 음료를 제조하였다.

<실험예 1> 도인 추출물을 이용한 성장호르몬 분비촉진 활성실험

<1-1> 뇌하수체 세포 배양

생후 4-5 주령의 스프래그-다우리(Sprague-Dawley rat) 랫트로부터 무균 조작하에 뇌하수체를 꺼낸 뒤 콜라게네이즈(collagenase, Gibco co., Grand Island, NY)와 히알루로니데이즈(hyaluronidase, Sigma co., St. Louis, MO)로 처리하여 뇌하수체 세포(rat pituitary cell)를 분리하였다. 분리된 뇌하수체 세포를 10% 말 혈청(horse serum), 2.5% 태아 소 혈청(fetal bovine serum, FBS), 및 항생제를 함유하는 DMEM 배지(Dulbecco's Modified Eagle's medium)에 부유시킨 후 항습 조건(humidified condition, 37℃, 5% CO₂)에서 배양하였다.

<1-2> 성장호르몬 분비 촉진 활성 실험

상기 실험예 <1-1>에서 분리한 뇌하수체 세포를 배양한 후에 시험액에 부유시켰다. 약재를 1 mg/ml 농도로 뇌하수체 세포에 가하였으며, 비교군으로는 성장호르몬 분비의 기준 물질인 랫트 성장호르몬 분비인자(rat GRF, Bachem Co., Torrance, CA, U.S.A.)를 300 nM, 500 nM, 1,000 nM이 되도록 가한 후에 총 부피가 1 ㎖가 되도록 시험액을 가하여 37℃에서 15분간 배양하였다. 배양한 후 원심분리하여 그 상등액을 분리하였으며, 성장호르몬을 측정하기 위하여 -70℃에 보관하였다.

성장호르몬 측정은 쥐 성장호르몬 RIA 키트(rat GH RIA kit, Amersham, Buckinghamshire, England)를 사용하여 수행하였다. 일정한 양의 ¹²⁵I-표지 성장호르몬과 상기에서 보관한 시험물질에 함유된 성장호르몬은 항 성장호르몬 항체(anti-GH antibody)에 대한 경쟁적인 반응에 의해서 각기 다른 양의 성장호르몬-항체 복합체(GH-Ab complex)를 형성하게 되고 여기에 2차 항체(second antibody)를 가하여 침전시킨 후 침전으로부터 ¹²⁵I의 방사활성도를 측정하였고 그 결과를 하기 표 1에 나타내었다.

	첨가한 농도	성장호르몬 농도 (ng/ml)
대조군	0	23.7
비교군^*	300 nM	38.2
	500 nM	57.7
	1,000 nM	146.6
도인	1 ㎎ 약재/ml	272.8

* 비교군으로는 랫트 성장호르몬 분비인자를 사용함.

그 결과, 상기 표 1에서 알 수 있는 바와 같이 본 발명의 도인 추출물은 뇌하수체 세포에 작용하여 성장호르몬의 분비를 촉진시키며, 아울러 비교군으로 사용한 랫트 성장호르몬 분비인자보다 성장호르몬 분비촉진 효과가 월등히 뛰어남을 확인하였다.

<실험예 2> 랫트의 성장호르몬 유발 실험

8주령의 SD 랫트를 펜토바비탈(pentobarbital) 50 mg/kg 농도로 마취시킨 후 도인 추출물을 건조약재 1 mg/kg 농도로 생리식염수에 용해시켜 랫트의 경정맥에 투여하였으며 대조군으로는 생리식염수를 투여하였다. 꼬리 경정맥으로부터 일정 시간간격으로 채혈한 후 RIA 키트를 사용하여 분비된 성장호르몬을 측정하였다. 혈중 성장호르몬의 농도 측정은 상기 실험예 1과 동일한 방법으로 쥐 성장호르몬 RIA 키트(rat GH RIA kit, Amersham, Buckinghamshire, England)를 사용하여 수행하였다. 일정한 양의 ¹²⁵I-표지 성장호르몬과 상기에서 보관한 시험물질에 함유된 성장호르몬은 항 성장호르몬 항체(anti-GH antibody)에 대한 경쟁적인 반응에 의해서 각기 다른 양의 성장호르몬-항체 복합체(GH-Ab complex)를 형성하게 되고 여기에 2차 항체(second antibody)를 가하여 침전시킨 후 침전으로부터 ¹²⁵I의 방사활성도를 측정하여 표준곡선을 이용하여 해당 농도를 계산하였다.

시간(분)	대조군(ng/ml)	도인(ng/ml)
0	3.667	6.694
10	3.299	4.314
20	2.815	8.549
30	3.365	9.110
45	2.566	4.103
60	2.593	3.209
90	3.270	16.302
120	2.267	1.561

상기 표 2에서 보는 바와 같이 동물을 이용하여 본 발명의 도인 추출물을 건조약재 1 mg/kg의 농도로 랫트의 경정맥에 투여한 후 꼬리 정맥으로부터 일정 시간 간격으로 채혈하여 분리된 플라스마의 성장호르몬을 측정한 결과 대조군에 비해 약물 투여 30분 후 약 2.5배 정도의 증가를 보였고 90분 후 약 5배 정도의 증가를 보였으며 2시간 이내에 도인 추출물의 성장호르몬 분비 촉진 능력이 측정되었다(도 1).

<실험예 3> 랫트에 대한 경구투여 급성 독성실험

6주령의 특정병원체부재(specific pathogen-free, SPF) SD계 랫트를 사용하여 급성독성실험을 실시하였다. 군당 2 마리씩의 동물에 본 발명의 도인 추출물을 각각 0.5% 메틸셀룰로즈 용액에 현탁하여 1 g/㎏/㎖의 용량으로 1회 단회 경구투여 하였다. 시험물질 투여 후 동물의 폐사여부, 임상증상, 체중변화를 관찰하고 혈액학적 검사와 혈액생화학적검사를 실시하였으며, 부검하여 육안으로 복강장기와 흉강장기의 이상여부를 관찰하였다.

그 결과, 시험물질을 투여한 모든 동물에서 특기할 만한 임상증상이나 폐사된 동물은 없었으며, 체중변화, 혈액검사, 혈액생화학 검사, 부검소견 등에서도 독성변화는 관찰되지 않았다. 이상의 결과, 본 발명의 도인 추출물은 모두 마우스에서 3 g 추출물/㎏까지 독성변화를 나타내지 않으며 경구 투여 최소치사량(LD₅₀)은 추출물 222.5 ±7.5 g/kg 이상인 안전한 물질로 판단되었다.

상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 도인 추출물은 매우 높은 성장호르몬 분비촉진 활성을 나타내고 이 추출물의 원료인 도인이 오래 동안 사용되어온 인체에 무해하고 흡수율이 좋은 천연약재이므로 성장호르몬과 관련된 각종 질환의 치료 및 예방에 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 본 발명의 도인 추출물을 랫트의 경정맥에 투여한 후 꼬리 정맥으로부터 일정 시간 간격으로 성장호르몬을 측정한 것을 그래프로 나타낸 것이다.

Claims

도인 추출물을 유효 성분으로 함유하고, 성장 호르몬의 분비를 촉진하여 관절염, 노화, 알츠하이머 질병, 왜소증, 비만, 골다공증 및 궤양으로 이루어진 군으로부터 선택되는 성장호르몬 결핍에 의하여 야기되는 질병을 치료 또는 예방하기 위한 건강 식품.
제1항에 있어서, 상기 도인 추출물이 도인(Persicae Semen)에 알콜 또는 알콜과 물의 혼합 용매를 첨가하거나, 산 또는 염기 용액으로 가수분해하고 중화한 후 알콜 또는 알콜과 물의 혼합 용매를 첨가하여 추출되는 것을 특징으로 하는 건강 식품.
제2항에 있어서, 상기 알콜 또는 알콜과 물의 혼합 용매는 10 내지 100%의 에틸알콜(ethyl alcohol), 10 내지 100%의 메틸알콜(methyl alcohol) 및 주정으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 건강 식품.
제2항에 있어서, 상기 산 또는 염기 용액은 0.1 내지 2 N의 농도인 것을 특징으로 하는 건강 식품.
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