KR100502999B1 - 재조합 인간 ｇ-ｃｓｆ/ｇｍ-ｃｓｆ 융합 단백질 및 이를암호화하는 유전자 - Google Patents

Abstract

본 발명은 재조합 인간 G-CSF/GM-CSF 융합 단백질 및 이를 암호화 하는 유전자에 관한 발명으로 G-CSF 단백질의 기능 및 GM-CSF 단백질의 기능을 둘 다 발휘할 수 있는 재조합 인간 G-CSF/GM-CSF 융합 단백질을 제공함으로써, 골수 간세포의 생체 내 또는 생체 외 확장(expansion)을 포함하여 G-CSF 단백질 및 GM-CSF 단백질의 기능이 필요한 경우에 보다 간편하게 사용될 수 있는 단일의 융합단백질을 제공하는 뛰어난 효과가 있다.

Description

재조합 인간 Ｇ-ＣＳＦ/ＧＭ-ＣＳＦ 융합 단백질 및 이를 암호화하는 유전자 {Recombinant human G-CSF/GM-CSF fusion protein and it's coding gene}

본 발명은 재조합 단백질 및 이를 암호화하는 유전자에 관한 발명으로 더욱 상세하게는 재조합 인간 G-CSF/GM-CSF 융합 단백질 및 이를 암호화 하는 유전자에 관한 발명이다.

콜로니-자극 요소(Colony-stimulating factor; CSF)는 골수 간세포의 확장(expansion) 및 분화(differentiation)를 자극하는 시토카인이다. 다양한 CSF가 다양한 발전 단계의 골수세포에 작용을 하고, 다양한 계통의 특이적 콜로니 형성을 촉진시킨다. GM-CSF 및 G-CSF는 골수세포의 분화를 촉진하는 조혈생장인자(hematopoeictic growth factor)이고, 또한 성숙 골수세포의 활성인자이다.

최근에, 재조합 GM-CSF 단백질과 G-CSF 단백질은 암 및 조혈질환을 포함하는 다양한 질병을 치료하기 위하여 연구되어 왔고(Buchsel PC, Forgey A, Grape FB, Hamann SS. Granulocyte macrophage colony-stimulating factor: current practice and novel approaches. Clin J Oncol Nurs 2002 Jul-Aug;6(4):198-205 Related Articles, Links), 재조합 G-CSF과 GM-CSF는 미국에서 상표이름 'Filgrastima' 및 'Sargramostim'으로 각각 알려져 있다.

GM-CSF는 과립백혈구 및 대식세포를 포함하는 염증 백혈구 군락을 증가시키기 위해 골수세포에 작용을 한다(Staynov, D.Z., D.J. Cousins, and T.H. Lee. 1995. A regulatory element in the Promoter of the human Granulocyte-Macrophage Colony Stimulating Factor gene that has related sequences in other T-cell expressed cytokine genes. Proc. Natl. Acad. Sci. 92: 3606-3610.). 또한 그것은 다양한 항균 활성을 자극하고, 염증 반응을 가능하게 하면서, 시험관 내 대식세포 활성화 요소로의 활성을 나타낸다(Jarmin, D.I., R.J. Nibbs, T. Jamieson, J.S. de Bono and G.J. Graham. 1999. Granulocyte macrophage colony-stimulating factor and interleukin-3 regulate chemokine and chemokine receptor expression in bone marrow macrophages. Exp. Hematol. 27:1735-1745.; Bischof, R.J., D. Zafiropoulos, J.A. Hamilton and I.K. Campbell. 2000. Exacerbation of acute inflammatory arthritis by the colony-stimulating factors CSF-1 and granulocyte macrophage (GM)-CSF: evidence of macrophage infiltration and local proliferation. Clin. Exp. Immunol. 119:361-367.). GM-CSF는 암 화학요법 후에 골수 회복을 촉진시키는데 사용되어 왔고, 이식을 위한 골수 줄기 세포의 회수에 사용되어 왔다(Keller, J.R., S.E.W. Jacobsen, K.T. Sill, L.R. Ellingsworth, and F.W. Ruscetti. 1991. Stimulation of granulopoiesis by transforming growth factor β: Synergy with Granulocyte/Macrophage Colony Stimulating Factor. Proc. Natl. Acad. Sci. 88: 7190-7194.; Aglietta, M., F. Montemurro, F. Fagioli, C. Volta, B. Botto, M. Cantonetti, V. Racanelli, L. Teofili, R. Ferrara, S. Amadori, G.L. Castoldi, F. Dammacco and A. Levis. 2000. Short term treatment with Escheria coli recombinant human granulocyte-macrophage-colony stimulating factor prior to chemotherapy for Hodgkin disease. Cancer 88:454-460.). 그것은 감염성 질병, 조혈질환 및 암을 포함하는 다양한 질병의 치료를 위한 임상연구에 있어 증가 추세에 있고, 어떤 생물학적 치료제로서 임상학적으로 가장 성공적인 적용 중 하나가 되었다(Janik, J.E., L.L. Miller, W.C. Kopp, D.D. Taub, H. Dawson, D. Stevens, P. Kostboth, B.D. Curti, K.C. Conlon, B.K. Dunn, S.E. Donegan, R. Ullrich, W.G. Alvord, B.L. Gause and D.L. Longo. 1999. Treatment with tumor necrosis factor-alpha and granulocyte-macrophage colony-stimulating factor increases epidermal Langerhans' cell numbers in cancer patients. Clin. Immunol. 93:209-221.; Groenewegen, G. and G.C. de Gast. 1999. GM-CSF can cause T cell activation; results of sequential chemo-immunotherapy. Eur. J. Cancer 35 Suppl. 3:S23-24.; Jones, T.C. 1999. Use of granulocyte-macrophage colony stimulating factor (GM-CSF) in prevention and treatment of fungal infections. Eur. J. Cancer 35 Suppl. 3:S8-10.). 또한 그것은 전망적인 백신 보강제로서의 잠재성을 나타내었다(Kapoor, D., S.R. Aggarwal, N.P. Singh, V. Thakur, S.K. Sarin. 1999. Granulocyte-macrophage colony stimulating factor enhances the efficacy of hepatitis B virus vaccine in previously unvaccinated haemodialysis patients. J. Viral. Hepat. 6:405-409.; Anandh, U., B. Bastani and S. Ballal. 2000. Granulocyte-Macrophage Colony Stimulating Factor as an adjuvant to Hepatitis B vaccination in maintenance hemodialysis patients. Am. J. Nephrol. 20:53-56.; McClay EF. Adjuvant therapy for patients with high-risk malignant melanoma. Semin Oncol. 2002 Aug;29(4):389-99.).

G-CSF는 과립백혈구의 분화를 촉진하기 위하여 골수 간세포에 작용을 한다. 그것은 조혈 간세포 움직임을 유도하고 골수 간세포 군락을 증진시킨 이래로 임상학적 이식을 위해 광범위하게 사용되어 왔다(Petit I, Szyper-Kravitz M, Nagler A, Lahav M, Peled A, Habler L, Ponomaryov T, Taichman RS, Arenzana-Seisdedos F, Fujii N, Sandbank J, Zipori D, Lapidot T. G-CSF induces stem cell mobilization by decreasing bone marrow SDF-1 and up-regulating CXCR4. Nat Immunol 2002 Jul;3(7):687-94 ; de la Rubia J, Regadera A, Martin G, Cervera J, Sanz G, Martinez J, Jarque I, Garcia I, Andreu R, Moscardo F, Jimenez C, Molla S, Benlloch L, Sanz M. Second mobilization and collection of peripheral blood progenitor cells in healthy donors is associated with lower CD34(+) cell yields. J Hematother Stem Cell Res. 2002 Aug;11(4):705-9.). G-CSF는 말초에서의 면역세포와 상호작용을 나타내고, 또한 암 뿐만 아니라 조혈 및 자동면역 질환을 포함하는 다양한 질병의 치료 및 예방에 대한 임상연구에 사용되고 있다(CasTaqna L, Bertuzzi A, Nozza A, Siracusano L, Balzarotti M, Magagnoli M, Sarina B, Timofeeva I, Sinnone M, Grimoldi MG, Fare M, Santoro A. Reduced intensity conditioning regimen followed by glycosylated G-CSF mobilized PBSCT in patients with solid tumors and malignant lymphomas. Bone Marrow Transplant. 2002 Aug;30(4):207-14.; Ott MG, Merget-Millitzer H, Ottmann OG, Martin H, Bruggenolte N, Bialek H, Seger R, Hossle JP, Hoelzer D, Grez M. Mobilization and Transduction of CD34+ Peripheral Blood Stem Cells in Patients with X-Linked Chronic Granulomatous Disease. J Hematother Stem Cell Res 2002 Aug;11(4):683-94; Adams JR, Lyman GH, Djubegovic B, Feinglass J, Bennett CL. G-CSF as prophylaxis of febrile neutropenia in SCLC. Expert Opin Pharmacother 2002 Sep;3(9):1273-81; Hanna NH, Gordon MS, Fife K, Sandler AB. Phase I trial of topotecan plus vinorelbine with/without filgrastim (G-CSF) in patients with refractory malignancies. Am J Clin Oncol 2002 Aug;25(4):337-9; Smith MA, Smith JG. Clinical experience with the use of rhG-CSF in secondary autoimmune neutropenia. Clin Lab Haematol 2002 Apr;24(2):93-7).

G-CSF 단백질과 GM-CSF 단백질의 결합(combination)은 다양한 질병의 치료 및 말초 혈액으로부터 조혈 간세포(PBPC: progeitor cells from peripheral blood)를 제조하는데 보다 나은 결과를 발생할 수 있다. GM-CSF 단백질과 G-CSF 단백질은 정상 인간 말초 혈액으로부터 시험관 내에서 정제된 CD34(+) 거핵 조세포의 클론 확장을 증진시켰다. PBPC는 G-CSF 단백질 및 GM-CSF 단백질의 동시 도움에 의하여 효과적으로 재이동되었고(remoblized), 이는 G-CSF 단백질 및 GM-CSF 단백질의 결합이 PBPC를 활성화시키는 효과적인 방법이 될 수 있다는 것을 증명한다. 또한, 적혈구생성소(EPO)에 의한 PBPC 이동도 연속적인 GM-CSF 단백질 및 G-CSF 단백질의 처리에 의하여 매우 향상되었고, PBPC 집합의 효율성을 향상시켰다.

다른 시토카인과 GM-CSF 단백질 및 G-CSF 단백질의 결합은 인간 탯줄 혈액(UCB) 샘플 유래의 골수 간세포를 매우 증가시켰고, 이는 생체 외 조혈 간세포를 모으는 효과적인 방법을 제공하였다.

GM-CSF 단백질 및 G-CSF 단백질은 둘다 암세포로부터 생산되었고, 염증세포의 생존을 연장시켰으며, 이는 상호 결합이 암 치료에 있어 적용될 수 있다는 것을 암시한다. 이 발견은 G-CSF 단백질과 GM-CSF 단백질이 그들의 활성을 증가시키기 위하여 세포와 동시에 그리고 연속적으로 결합할 수 있음을 나타내고, 이는 재조합 G-CSF/GM-CSF 융합 단백질의 잠재적 중요성을 향상시켰다.

그러나, 아직까지 인간 G-CSF 유전자와 인간 GM-CSF 유전자가 결합(link)된 유전자 및 이로부터 발현된 융합 단백질에 대해서는 알려진 바가 없다.

이에 본 발명은 인간 G-CSF 유전자와 인간 GM-CSF 유전자가 링크되어 제조되는 유전자를 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한 본 발명은 상기 유전자로부터 제조되는 G-CSF/GM-CSF 융합단백질을 제조하는데 그 목적이 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 서열번호 1의 DNA 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드를 제공한다.

또한 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열로 구성된 폴리펩타이드를 제공한다.

단일 구조체로 인간 G-CSF 및 GM-CSF의 cDNA을 결합(ligation)하기 전에 삽입 cDNA 및 링커는 하기의 프라이머를 사용하여 PCR법에 의해 증폭할 수 있다.

G-CSF는 프라이머 31 및 32를 사용하여 증폭하고, GM-CSF는 프라이머 33 및 39를 사용한다. GS 링커 절편(Olafsena, T., Rasmussena, I. B., Norderhaugb, L., Bruland, S. and Sandliea, I. (1998) IgM secretory tailpiece drives multimerisation of bivalent scFv fragments in eukaryotic cells. Immunotechnology 4 : 141-153.)의 증폭은 프라이머 34 및 35를 사용한다.

한편, G-CSF, GM-CSF 및 링커 시퀀스의 결합은 스플라이싱 오버랩트 익스텐션(Splicing Overlapped Extension; SOEing) 기술을 사용하여 수행한다(Horton RM, Cai ZL, Ho SN, Pease LR. Gene splicing by overlap extension: tailor-made genes using the polymerase chain reaction. Biotechniques. 1990 8(5):528-35.). 첫번째 SOEing 반응을 통하여, G-CSF 및 링커 그리고, 링커 및 GM-CSF의 DNA 절편들이 각각 하기의 과정에 의하여 결합될 수 있다.

먼저, G-CSF와 링커 절편을 어니얼링(annealing)하고, 변성(denaturing), 확장(extending)의 사이클 하에서 어떤 프라이머도 사용하지 않고 Taq 폴리머라제를 사용하여 함께 결합시킨다.

반응 후에 프라이머 31 및 35를 추가하고, 변성, 어니얼링 및 확장의 사이클로 증폭시키면 G-CSF/링커 절편을 획득할 수 있다.

한편, 유사한 과정 및 프라이머 34 및 39를 사용하면, 링커/GM-CSF 절편도 획득할 수 있다.

증폭된 G-CSF/링커와 링커/GM-CSF 절편은 1% 아가로스 겔로부터 정제하고 G-CSF/링커/GM-CSF DNA 절편의 제조를 위해, 두 번째 SOEing 반응에 사용한다. G-CSF/링커와 링커/GM-CSF DNA 절편은 어떤 프라이머의 사용없이 변성 및 확장의 사이클 하에서 Taq 폴리머라제를 사용하여 어니얼링하고, 함께 결합시킨다. 반응 후에 프라이머 31 및 39를 추가하고, 변성, 어니얼링 및 확장의 사이클로 증폭시킨다.

상기의 과정을 통해 인간 G-CSF 및 GM-CSF의 PCR 증폭 산물로 단일의 증폭된 DNA 절편을 제조할 수 있는데, G-CSF 절편 및 링커 그리고, GM-CSF 및 링커를 각각 가지고 한 첫 번째 SOEing 반응을 통해 G-CSF 및 GM-CSF 절편 보다 약간 더 긴 DNA 절편을 증폭시킨 결과물을 얻을 수 있으며, 이를 통해 첫 번째 SOEing 반응이 성공적이었다는 사실을 확인할 수 있다. 또한, G-CSF/링커 및 링커/GM-CSF 절편을 가지고 한 두 번째 SOEing을 통해 G-CSF/링커/GM-CSF 절편을 얻을 수 있으며, 제조된 G-CSF/링커/GM-CSF DNA 절편은 pGEMT에 클론하고, G-CSF/GM-CSF 융합 단백질을 발현하는 pEThGGMCSF 구조체를 제조하기 위하여 pET-22b(+)벡터의 NcoⅠ 및 NotⅠ 위치로 서브클론한다. 추가적인 pEThGGMCSF 구조체 분석을 통해, 오픈 리딩 프레임에 GS 링커 시퀀스를 가지고 있으며 임의적으로 결합된 인간 G-CSF 및 GM-CSF 코딩지역 전체가 있음을 확인할 수 있다.

선형으로 확장된 구조는 인간 G-CSF 단백질의 3' 끝과 인간 GM-CSF 단백질의 5' 말단에서 각각 발견되며, 융합단백질에 있어 G-CSF 및 GM-CSF의 독립적인 구조를 허락한다.

G-CSF/링커/GM-CSF 융합 단백질의 발현은 구축체의 E. coli BL21(DE)로의 형질전환 후, IPTG 유도에 의해 수행한다. 즉, 세포는 글루코스 및 앰피실린이 보충된 배지에서 배양하고 클론된 G-CSF/GM-CSF 융합 단백질의 발현을 유도하기 위해 IPTG 및 앰피실린이 보충된 무(無)글루코스배지로 옮긴다.

유도 후, 세포를 회수하고, 김 등(Kim J. K., Tsen, M. F., Ghetie, V. and Ward, E. S. (1994a) Identifying amino acid residues that influence plasma clearance of murine IgG1 fragments by site-directed muTaqenesis. Eur. J. Immunol. 24, 542-547.; McClay EF. Adjuvant therapy for patients with high-risk malignant melanoma. Semin Oncol. 2002 Aug;29(4):389-99.)에 의하여 설명된 방법에 의해 주변세포질 공간, 세포질, 세포 봉입체로부터 단백질을 추출한다.

그 결과 40 kDa의 재조합 인간 G-CSF/GM-CSF 융합 단백질(rhG-CSF/GM-CSF)을 세포봉입체로부터 추출할 수 있는데, 비록 구조체가 주변세포질내 발현된 단백질을 얻고자 pelB 리더 시퀀스(leader sequence)를 보유하고 있었으나, 융합 단백질은 세포 봉입체에서 발현이 되며, 이는 대장균 세포 내에서 과도한 발현에 의한 불용성 단백질 응집체를 형성하였음을 의미할 것이다.

발현된 융합 단백질은 결합된 인간 G-CSF 및 인간 GM-CSF의 크기에 상응하고, 엘리자법 및 웨스턴 블랏을 이용하여 확인될 수 있다.

한편, 요소액에 있는 rhG-CSF/GM-CSF 융합 단백질은 요소의 높은 농도로 인하여 변성되기 때문에, 생물학적 활성의 측정 전에 복원되어야 할 필요가 있으며, 단백질의 간단한 투석은 단백질의 침전을 유도하지 않으나, 단백질을 잘 녹일 수 있으며, 이는 단백질이 천연의 형태로 다시 접혀지는(folding) 것을 의미할 것이다.

투석된 rhG-CSF/GM-CSF 융합 단백질의 콜로니 자극 활성은 백혈병 환자로부터 유래한 골수세포를 가지고 콜리니 형성을 검정하는 것에 의하여 조사할 수 있는데, 정제된 40kDa 단백질은 유의적으로 콜로니 형성을 증가시킴을 확인할 수 있다. 이는 요소 시료로부터 유래한 40kDa 단백질이 콜로니 자극 요소로 작용할 뿐만 아니라 간단한 투석에 의하여 생물학적 활성 형태로 다시 접혀질 수 있다는 사실을 뒷받침한다.

융합 단백질로 처리된 배지의 콜로니 형성 유니트(colony forming units)는 동일한 수의 재조합 G-CSF 또는 GM-CSF를 각각 처리한 배지보다 높은데, 비록 융합 단백질의 활성이 단지 G-CSF 및 GM-CSF의 부수적 효과인지 또는 단지 첨가하는 것 이상의 효과인지가 아직까지 불명하다 할지라도, 그 결과는 융합 단백질로 G-CSF 및 GM-CSF이 융합단백질 내에서 독립적으로 작용함을 나타내고, G-CSF 및 GM-CSF의 결합은 각각을 서로 방해하지 않는다는 것을 나타낸다.

또한, 다양한 세포 군락이 골수세포를 구성하고 그리하여 많은 분화 세포가 G-CSF 또는 GM-CSF에 반응하기 때문에, 융합 단백질에 있는 G-CSF 및 GM-CSF가 같은 세포에 함께 작용을 하는지 다른 세포에 각각 작용을 하는지 여부는 불명확하지만, 융합 단백질에서 양쪽 CSF가 비록 Gly-Gly-Gly-Gly-Ser의 짧은 GS 링커에 의해 결합되었다 할지라도 G-CSF와 GM-CSF의 콜리니 자극 활성을 보인다는 사실은 확인할 수 있다.

이하, 본 발명의 구성을 하기 실시예를 들어 더욱 상세히 설명하지만 본 발명의 권리범위가 하기 실시예에만 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 재조합 인간 G-CSF 유전자와 GM-CSF 유전자가 링크된 G-CSF/GM-CSF 유전자의 제조

재료로서 올리고뉴클레오타이드는 'Bionix(서울, 한국)'로부터 구입하였고, 제한효소는 'Kosco(서울, 한국)'로부터 구입하였다. 대장균발현을 위한 배양 배지는 'Difco Ltd(Sparks, MD, USA)'로부터 구입하였고, 다른 화학물질들은 'Sigma Aldrich Co. Ltd(St. Louis, MI, 미국)'로부터 구입하였다. Ni-NTA 정제 시스템은 'Qiagen Co.(Hilden, 독일)'로부터 구입하였다.

플라스미드 pGEMT(Promega, Madsion, WI, 미국) 및 pET-22b(+)(Novagen, Darmstadt, 독일)는 발현 구조체의 재료로 사용되었다. 대장균 균주 DH-5α 및 BL21(DE)는 플라스미드 안정성 및 재조합 단백질의 발현을 위해 사용되었다. DNA 조작 및 단백질 조작은 표준 과정(Garland, 1987; Bradley, 1980)에 의하여 수행되었고, PCR은 Taq DNA 폴리머라제(Promega)를 사용하여 제조자의 지시에 의하여 수행되었다. 인간 GM-CSF cDNA는 텍사스 대학교, 사우스웨스턴 메디컬 스쿨의 'Dr. David Carbone'으로부터 입수하였고, 인간 G-CSF cDNA는 R&D 시스템(Minneapolis. MN, 미국)으로부터 구입하였다.

단일 구조체로 인간 G-CSF 및 GM-CSF cDNA을 결합(ligation)하기 전에 삽입 cDNA 및 링커는 하기의 프라이머를 사용하여 증폭되었다.

인간 G-CSF는 프라이머 31 및 32를 사용하여 증폭되었고, 인간 GM-CSF는 프라이머 33 및 39를 사용하였다. GS 링커 절편(Olafsena, T., Rasmussena, I. B., Norderhaugb, L., Bruland, S. and Sandliea, I. (1998) IgM secretory tailpiece drives multimerisation of bivalent scFv fragments in eukaryotic cells. Immunotechnology 4 : 141-153.)의 증폭은 프라이머 34 및 35를 사용하여 수행되었다.

PCR 반응은 Taq 폴리머라제를 사용하여 하기의 증폭조건에 의하여 수행되었다. 95℃에서 4분 동안 변성(denaturing), 50℃에서 2분 동안 어니얼링(annealing), 72℃에서 3분 동안 신장(extention)으로 구성된 사이클(cycle)이 1회 수행된 후, 95℃에서 1 분 동안 변성, 50℃에서 2 분 동안 어니얼링, 72℃에서 3 분 동안 신장으로 구성된 사이클이 45회 수행되었다.

72℃에서 10 분 동안 추가적인 확장을 한 후, 증폭된 DNA 절편들은 1% 아가로스 겔로부터 정제되었다.

한편, G-CSF, GM-CSF 및 링커 시퀀스의 상호 결합은 그림 1a에 도시된 바와 같이 스플라이싱 오버랩트 익스텐션(Splicing Overlapped Extension; SOEing) 기술을 사용하여 수행되었다.

먼저, 첫번째 SOEing 반응을 통하여, G-CSF/링커와 링커/GM-CSF를 함유하는 DNA 절편이 하기의 계획에 의하여 제조되었다.

먼저 G-CSF와 링커 절편은 어니얼링되었고, 95℃에서 1 분 동안 변성, 72℃에서 4분 동안 확장으로 구성된 사이클이 10회 수행된 후, 어떤 프라이머도 없이 Taq 폴리머라제를 사용하여 함께 결합되었다.

반응 후, 프라이머 31 및 35가 추가되었고, 95℃에서 30 초 동안 변성, 60℃에서 30 초 간 어니얼링 및 72℃에서 1 분 간 확장으로 구성된 사이클이 30회 수행되어 증폭되었으며, 그 결과 G-CSF/링커 절편이 제조되었다.

상기와 동일한 과정 및 프라이머 34 및 39를 사용하여, 링커/GM-CSF 절편이 획득되었다.

증폭된 G-CSF/링커와 링커/GM-CSF 절편은 1% 아가로스 겔로부터 정제되었고 G-CSF/링커/GM-CSF DNA 절편의 제조를 위한 하기의 두 번째 SOEing 반응에 사용되었다(도 1a).

먼저, G-CSF/링커와 링커/GM-CSF DNA 절편은 어니얼링되었고, 어떤 프라이머의 사용없이 95℃에서 1 분 동안 변성 및 72℃에서 4 분 동안 확장으로 구성된 사이클이 10회 수행된 후, Taq 폴리머라제를 사용하여 상호 결합되었다. 그 후, 프라이머 31 및 39이 추가되었고, 95℃에서 30 초 동안 어니얼링, 60℃에서 30 초 동안 복원 및 72℃에서 1 분 동안 확장으로 구성된 사이클 30회 수행됨으로써 증폭되었다.

그 결과 서열번호 1의 DNA 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드를 얻을 수 있었다.

반응 후, 상기에서 제조된 대략 1.1kb의 DNA 절편이 1% 아가로스 겔로부터 분리되었고(도 1b), pGEMT 벡터에 클론되었으며, 연속적으로 pelB 리더(leader), His.Taq 및 T7 프로모터를 함유하는 pET-22(+)벡터에 클론되었다.

즉, 1.1 kb DNA 절편은 먼저 pGEMT에 클론되었고, G-CSF/GM-CSF 융합 단백질을 발현하는 pEThGGMCSF 구조체를 제조하기 위하여 pET-22b(+)벡터의 NcoⅠ 및 NotⅠ 위치로 서브클론되었다.

실시예 2: 실시예 1에서 제조한 유전자로부터 단백질의 제조

G-CSF/링커/GM-CSF 융합 단백질의 발현은 구축체의 E. coli BL21(DE)로의 형질전환 후, IPTG 유도에 의해 수행하었다. 글루코스 및 앰피실린이 보충된 50 mL의 배지에서 세포를 배양한 후 클론된 G-CSF/GM-CSF 융합 단백질의 발현을 유도하기 위해 IPTG 및 앰피실린이 보충된 25 mL의 무(無)글루코스배지로 옮겼다.

5시간의 유도 후에 세포를 회수하였고, 김 등(Kim J. K., Tsen, M. F., Ghetie, V. and Ward, E. S. (1994a) Identifying amino acid residues that influence plasma clearance of murine IgG1 fragments by site-directed muTaqenesis. Eur. J. Immunol. 24, 542-547.; McClay EF. Adjuvant therapy for patients with high-risk malignant melanoma. Semin Oncol. 2002 Aug;29(4):389-99.)에 의하여 설명된 바에 의해 주변세포질 공간, 세포질, 세포 봉입체로부터 단백질을 추출하였다. 주변세포질 단백질의 추출을 위하여 세포 펠레트(pellet)를 TES 버퍼(0.5 M 수크로오스, 0.1 mM EDTA, 0.2 M Tris-Cl, pH 7.4)에서 40 분 동안 삼투압 쇼크처리하였다. 잔류 세포 펠레트는 음파처리 버퍼 (0.25M NaCl, 0.05 M Tris, pH 7.5)를 사용하여 음파처리하였고, 불용성 잔류물은 요소 디네이쳐링 버퍼(urea denaturing buffer; 8M urea, 0.1M NaH₂PO₄, 0.01M Tris, pH 8.0)에 녹였다.

추출된 단백질은 제조자(Qiagen)의 지시대로 Ni-NTA 아가로스 정제를 수행하였다.

상기의 재료 및 방법에 의하여 실험한 결과, 요소시료에서 40 kDa의 재조합 인간 G-CSF/GM-CSF 융합 단백질(rhG-CSF/GM-CSF)이 발현됨을 확인할 수 있었다(도 2). 비록 구조체가 주변세포질내에서 발현되는 단백질을 얻고자 pelB 리더 시퀀스(leader sequence)를 보유하고 있었으나, 융합 단백질은 세포 봉입체에서 발현이 되었으며, 이는 대장균 세포 내에서 과도한 발현에 의한 불용성 단백질 응집체의 형성을 의미하였다.

한편, 본 발명자들은 재조합 G-CSF와 GM-CSF 단백질을 각각 pET-22b(+) 벡터를 사용하여 각각 제조하였는데 GM-CSF는 세포 봉입체에서 발현됨을 확인할 수 있었고, G-CSF는 세포질에서 발현됨을 확인할 수 있었다(도 2). 그러나 CSF/GM-CSF 융합 단백질은 비록 GM-CSF가 세포질에서 발현되는 G-CSF에 결합되었다 할지라도 세포 봉입체에서 발현되었다.

또한, 발현된 융합 단백질은 결합된 인간 G-CSF 및 인간 GM-CSF의 크기에 상응하고, 엘리자법 및 웨스턴 블랏을 이용하여 확인되었다.

실험예 1: 실시예 2에서 제조된 단백질의 기능분석

정제된 단백질의 콜로니 자극 활성은 'Garland(1987)'에 의하여 기술된 바에 의하여 검사되었고, 모든 실험은 24 웰 플레이트(well plate)에서 3회 반복으로 수행되었다. 백혈병 환자로부터 추출된 2×10⁶의 골수세포 중 각각은 1 mL의 DMEM/10% FCS 배지에 잠시 보류되었고, 그 후, 각각의 웰로 평판되었다. 각각의 세포 웰에 8 ㎍ 또는 16 ㎍의 Ni-NTA 정제 단백질이 첨가되었고, 2.2%의 저녹는점 아가로스에 의해 정치되었다. 웰은 37℃로 5%의 CO₂를 포함하는 습한 공기에서 배양되었다. 일주일 후 콜로니 숫자는 각각 웰 중 5개의 임의 사이트에서 계수되었고 콜로니의 평균숫자는 상호 비교되었다.

한편, 재조합 G-CSF/GM-CSF 융합 단백질의 콜로니 자극 활성을 조사하기 위해서는, 요소의 높은 농도로 인하여 변성되어 있는 8M의 요소액 내 rhG-CSF/GM-CSF 융합 단백질은 생물학적 활성의 측정 전에 복원되어야 할 필요가 있었다. 단백질의 간단한 투석은 단백질의 침전을 유도하지 않았으나, 단백질을 잘 녹였으며, 이는 단백질이 천연의 형태로 다시 접혀지는(folding) 것을 의미 할 수 있을 것이다.

투석된 rhG-CSF/GM-CSF 융합 단백질의 콜로니 자극 활성은 백혈병 환자로 부터 유래한 골수세포를 가지고 콜리니 형성을 검정하는 것에 의하여 조사하였는데, 정제된 40kDa 단백질 8 및 16 ㎍/mL의 첨가는 음의 대조군(negative control)과 비교하여 유의적으로 콜로니 형성을 증가시켰고(도 3), 이는 요소 시료로부터 유래한 40kDa 단백질이 콜로니 자극 요소로 작용할 뿐만 아니라 간단한 투석에 의하여 생물학적 활성 형태로 다시 접혀질 수 있었음을 의미하였다.

융합 단백질로 처리된 배지의 콜로니 형성 유니트는 동일한 수의 재조합 G-CSF 또는 GM-CSF를 각각 처리한 배지보다 높았다(도 2 및 3). 비록 융합 단백질의 활성이 단지 G-CSF 및 GM-CSF의 부수적 효과인지 또는 단지 첨가하는 것 이상인지가 모호하지만, 실험결과는 융합 단백질로 G-CSF 및 GM-CSF이 융합단백질에서 독립적으로 작용함을 나타내었고, G-CSF 및 GM-CSF의 결합은 각각을 서로 방해하지 않는다는 것을 나타내었다.

한편, 다양한 세포 군락이 골수세포를 구성하고 그리하여 많은 분화 세포가 G-CSF 또는 GM-CSF에 반응하기 때문에, 융합 단백질에 있는 G-CSF 및 GM-CSF가 같은 세포에 함께 작용을 하는지 다른 세포에 각각 작용을 하는지 여부는 불명확하지만, 융합 단백질에서 비록 Gly-Gly-Gly-Gly-Ser의 짧은 GS 링커에 의해 결합되었더라도 양쪽 CSF가 G-CSF와 GM-CSF의 콜리니 자극 활성을 보였다.

이상 상기에서 설명한 바와 같이 본원발명인 서열번호 1의 DNA 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드로부터 코딩되는 서열번호 2의 아미노산 서열로 구성된 폴리펩타이드는 세포 봉입체로부터 추출될 수 있으며, G-CSF 단백질의 기능 및 GM-CSF 단백질의 기능을 둘 다 발휘할 수 있으므로, 골수 간세포의 생체 내 또는 생체 외 확장을 포함하여 G-CSF 단백질 및 GM-CSF 단백질의 기능이 필요한 경우에 보다 간편한 하나의 융합단백질로 제공될 수 있으므로, 생명공학산업상 매우 유용한 발명인 것이다.

도 1a는 인간 G-CSF/링커/GM-CSF 융합 DNA의 구축과정을 보여주는 모식도이다.

도 1b는 인간 G-CSF, GM-CSF 및 링커 시퀀스로 결합된 인간 G-CSF/GM-CSF의 PCR 증폭 산물을 보여주는 사진도이다.

도 2는 정제된 재조합 인간 G-CSF, GM-CSF 및 G-CSF/GM-CSF 융합 단백질의 SDS-PAGE 분석을 보여주는 사진도이다.

도 3은 정제되고, 재겹침(folding)된 G-CSF/GM-CSF 융합 단백질의 콜로니 자극 활성을 보여주는 그래프이다.

<110> YOUN, Hyun Joo KIM, Jin-Kyoo LEE, Dong seok Inje University <120> Recombinant human G-CSF/GM-CSF fusion protein and it's coding gene <160> 2 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 930 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(930) <400> 1 atg gcc acc ccc ctg ggc cct gcc agc tcc ctg ccc cag agc ttc ctg 48 Met Ala Thr Pro Leu Gly Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gln Ser Phe Leu 1 5 10 15 ctc aag tgc tta gag caa gtg agg aag atc cag ggc gat ggc gca gcg 96 Leu Lys Cys Leu Glu Gln Val Arg Lys Ile Gln Gly Asp Gly Ala Ala 20 25 30 ctc cag gag aag ctg tgt gcc acc tac aag ctg tgc cac ccc gag gag 144 Leu Gln Glu Lys Leu Cys Ala Thr Tyr Lys Leu Cys His Pro Glu Glu 35 40 45 ctg gtg ctg ctc gga cac tct ctg ggc atc ccc tgg gct ccc ctg agc 192 Leu Val Leu Leu Gly His Ser Leu Gly Ile Pro Trp Ala Pro Leu Ser 50 55 60 tcc tgc ccc agc cag gcc ctg cag ctg gca ggc tgc ttg agc caa ctc 240 Ser Cys Pro Ser Gln Ala Leu Gln Leu Ala Gly Cys Leu Ser Gln Leu 65 70 75 80 cat agc ggc ctt ttc ctc tac cag ggg ctc ctg cag gcc ctg caa ggg 288 His Ser Gly Leu Phe Leu Tyr Gln Gly Leu Leu Gln Ala Leu Gln Gly 85 90 95 ata tcc ccc gag ttg ggt ccc acc ttg gac aca ctg cag ctg gac gtc 336 Ile Ser Pro Glu Leu Gly Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gln Leu Asp Val 100 105 110 gcc gac ttt gcc acc acc atc tgg cag cag atg gaa gaa ctg gga atg 384 Ala Asp Phe Ala Thr Thr Ile Trp Gln Gln Met Glu Glu Leu Gly Met 115 120 125 gcc cct gcc ctg cag ccc acc cag ggt gcc atg ccg gcc ttc gcc tct 432 Ala Pro Ala Leu Gln Pro Thr Gln Gly Ala Met Pro Ala Phe Ala Ser 130 135 140 gct ttc cag cgc cgg gca gga ggg gtc ctg gtt gct agc cat ctg cag 480 Ala Phe Gln Arg Arg Ala Gly Gly Val Leu Val Ala Ser His Leu Gln 145 150 155 160 agc ttc ctg gag gtg tcg tac cgc gtt cta cgc cac ctt gcg cag ccc 528 Ser Phe Leu Glu Val Ser Tyr Arg Val Leu Arg His Leu Ala Gln Pro 165 170 175 ggt gga ggc gga tcg gca ccc gcc cgc tcg ccc agc ccc agc acg cag 576 Gly Gly Gly Gly Ser Ala Pro Ala Arg Ser Pro Ser Pro Ser Thr Gln 180 185 190 ccc tgg gag cat gtg aat gcc atc cag gag gcc cgg cgt ctc ctg aac 624 Pro Trp Glu His Val Asn Ala Ile Gln Glu Ala Arg Arg Leu Leu Asn 195 200 205 ctg agt aga gac act gct gct gag atg aat gaa aca gta gaa gtc atc 672 Leu Ser Arg Asp Thr Ala Ala Glu Met Asn Glu Thr Val Glu Val Ile 210 215 220 tca gaa atg ttt gac ctc cag gag ccg acc tgc cta cag acc cgc ctg 720 Ser Glu Met Phe Asp Leu Gln Glu Pro Thr Cys Leu Gln Thr Arg Leu 225 230 235 240 gag ctg tac aag cag ggc ctg cgg ggc agc ctc acc aag ctc aag ggc 768 Glu Leu Tyr Lys Gln Gly Leu Arg Gly Ser Leu Thr Lys Leu Lys Gly 245 250 255 ccc ttg acc atg atg gcc agc cac tac aag cag cac tgc cct cca acc 816 Pro Leu Thr Met Met Ala Ser His Tyr Lys Gln His Cys Pro Pro Thr 260 265 270 ccg gaa act tcc tgt gca acc cag act atc acc ttt gaa agt ttc aaa 864 Pro Glu Thr Ser Cys Ala Thr Gln Thr Ile Thr Phe Glu Ser Phe Lys 275 280 285 gag aac ctg aag gac ttt ctg ctt gtc atc ccc ttt gac tgc tgg gag 912 Glu Asn Leu Lys Asp Phe Leu Leu Val Ile Pro Phe Asp Cys Trp Glu 290 295 300 cca gtc cag gag gtc acc 930 Pro Val Gln Glu Val Thr 305 310 <210> 2 <211> 310 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Ala Thr Pro Leu Gly Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gln Ser Phe Leu 1 5 10 15 Leu Lys Cys Leu Glu Gln Val Arg Lys Ile Gln Gly Asp Gly Ala Ala 20 25 30 Leu Gln Glu Lys Leu Cys Ala Thr Tyr Lys Leu Cys His Pro Glu Glu 35 40 45 Leu Val Leu Leu Gly His Ser Leu Gly Ile Pro Trp Ala Pro Leu Ser 50 55 60 Ser Cys Pro Ser Gln Ala Leu Gln Leu Ala Gly Cys Leu Ser Gln Leu 65 70 75 80 His Ser Gly Leu Phe Leu Tyr Gln Gly Leu Leu Gln Ala Leu Gln Gly 85 90 95 Ile Ser Pro Glu Leu Gly Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gln Leu Asp Val 100 105 110 Ala Asp Phe Ala Thr Thr Ile Trp Gln Gln Met Glu Glu Leu Gly Met 115 120 125 Ala Pro Ala Leu Gln Pro Thr Gln Gly Ala Met Pro Ala Phe Ala Ser 130 135 140 Ala Phe Gln Arg Arg Ala Gly Gly Val Leu Val Ala Ser His Leu Gln 145 150 155 160 Ser Phe Leu Glu Val Ser Tyr Arg Val Leu Arg His Leu Ala Gln Pro 165 170 175 Gly Gly Gly Gly Ser Ala Pro Ala Arg Ser Pro Ser Pro Ser Thr Gln 180 185 190 Pro Trp Glu His Val Asn Ala Ile Gln Glu Ala Arg Arg Leu Leu Asn 195 200 205 Leu Ser Arg Asp Thr Ala Ala Glu Met Asn Glu Thr Val Glu Val Ile 210 215 220 Ser Glu Met Phe Asp Leu Gln Glu Pro Thr Cys Leu Gln Thr Arg Leu 225 230 235 240 Glu Leu Tyr Lys Gln Gly Leu Arg Gly Ser Leu Thr Lys Leu Lys Gly 245 250 255 Pro Leu Thr Met Met Ala Ser His Tyr Lys Gln His Cys Pro Pro Thr 260 265 270 Pro Glu Thr Ser Cys Ala Thr Gln Thr Ile Thr Phe Glu Ser Phe Lys 275 280 285 Glu Asn Leu Lys Asp Phe Leu Leu Val Ile Pro Phe Asp Cys Trp Glu 290 295 300 Pro Val Gln Glu Val Thr 305 310

Claims (2)

1. 서열번호 1의 DNA 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드.
2. 서열번호 2의 아미노산 서열로 구성된 폴리펩타이드.