KR100502835B1

KR100502835B1 - 영지추출물, 올레아미드 및 그의 구조적 유사체를유효성분으로 함유하는 치매의 예방 및 치료용 조성물

Info

Publication number: KR100502835B1
Application number: KR10-2002-0028173A
Authority: KR
Inventors: 전길자; 김화정; 한소엽; 조현진; 박호실; 이지선; 김진형; 이정영; 이명희
Original assignee: 전길자; 한소엽; 김화정
Priority date: 2001-05-23
Filing date: 2002-05-21
Publication date: 2005-07-20
Also published as: KR20020090140A; KR20040111240A; KR100500299B1

Abstract

본 발명은 영지추출물, 올레아미드 및 그의 구조적 유사체를 유효성분으로 함유하는 치매의 예방 및 치료용 조성물이다.

본 발명의 조성물은 동물 뇌 조직의 아세틸콜린에스터라제 (acetylcholinesterase, AChE) 활성을 저해하여 뇌 내 아세틸콜린 양의 감소를 방지시킴과 동시에, 뇌허혈에 의해 손상되는 뇌조직에 대한 보호효과를 나타내므로, 알츠하이머성 치매는 물론 혈관성 치매에 대하여 예방 및 치료제로 유용하게 사용할 수 있다.

Description

영지추출물, 올레아미드 및 그의 구조적 유사체를 유효성분으로 함유하는 치매의 예방 및 치료용 조성물{Compositions comprising extract of ganoderma lucidum, oleamide and its structural analogue as an effective component for preventing or treating dementia}

본 발명은 영지추출물, 올레아미드 및 그의 구조적 유사체를 유효성분으로 함유하는 치매의 예방 및 치료용 조성물에 관한 것이다.

치매(dementia)는 정상적인 노화와는 구분해야 할 병적인 현상이며 그 원인에 따라 알츠하이머성 치매(Alzheimer's disease), 혈관성 치매(vascular dementia), 기타 알콜 중독, 외상, 파킨슨병의 후유증으로 오는 치매로 구별된다.

알츠하이머성 치매의 발병기전은 명확히 알려져 있지 않으나, 중추신경계의 아세틸콜린 기능의 감소가 가장 공통적으로 나타나므로, 그 치료를 위해서는 아세틸콜린 전구체를 투여하거나 아세틸콜린의 분해를 저해하는 약물을 투여하여 뇌의 아세틸콜린 농도를 높여주는 치료방법이 사용되어 왔다. 따라서 아세틸콜린에스터라제(이하 'AChE'라 한다) 억제제 단독으로 또는 기존의 콜린 에스터라제 억제제와 병용한 약물들이 그 치료제로 사용되고 있으며, 대표적인 약물로는 타크린 (tacrine), 도네페질 (donepezil), 리바스티그민 (rivastigmine), 갈란타민 (galantamine) 등이다.

혈관성 치매는 대부분 뇌혈관 동맥경화에 의해 뇌의 여러 곳에 혈액공급이 부족하게 되어 뇌세포에 손상을 입음으로서 발생하므로, 그 치료제로는 뇌혈관에 작용하는 고혈압 치료제나 아스피린 또는 손상받은 뇌세포를 보호하는 약제가 바람직하다.

기존의 치매 치료제는 주로 아세틸콜린에스터라제 억제 효과만을 가지고 있으므로 혈관성 치매에도 치료효과를 나타내는 약제의 개발이 요구되고 있다.

영지(Ganoderma lucidum)는 버섯의 일종으로 동양에서 전통적인 약재로 사용되어 왔으며, 항염증효과, 항암효과, 면역조절작용, 에이즈 바이러스 억제효과, 혈압강하 작용 등을 함이 알려져 있다. 이러한 영지의 효능을 연구한 것으로는, 예를 들면, 영지의 물(water) 또는 에틸아세테이트 추출물을 카라게닌(carrageenan)과 크로톤 오일에 의해 부종이 유발된 쥐에 구강 투여하여 두 가지 부종 모두에 효과가 있음을 확인한 연구 논문(Stavihovha W and Slama J, The anti-inflammatory Ganoderma Lucidum Third International Symposium on Ganoderma lucidum: 9-21)과 영지의 물 추출물이 암세포의 성장을 억제시키는 효과를 나타내는 연구 논문(Wang SY et al, The anti-tumor effect of Ganoderma lucidum is mediated by cytokines released from activated macrophages and Tlymphocytes, Int. J Cancer 70:699-705)이 있다. 이외에도 영지에서 분리된 면역조절 단백질인 LZ-8은 시험관내(in vitro)에서 분열 촉진(mitogenic activity)을 나타내며 생체내(in vivo)에서 면역 조절 활성을 나타낸다는 것이 알려져 있다[Kino K et al., Immunomodulator, LZ-8, prevents antibody production in mice, Int J Immunopharmacol 13(8): 1109-1115].

본 발명자들은 알츠하이머성 치매는 물론 혈관성 치매에 대해서도 예방 및 치료효과를 나타낼 수 있는 안전하고 독성이 없는 천연자원을 찾던 중 한국에서 전통적으로 사용되어 오던 영지로부터 AChE의 활성을 저해하면서 동시에 뇌허혈 억제 효과를 나타내는 성분을 추출하였으며, 이와 관련된 물질들이 치매치료제로 유용함을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 알츠하이머성 치매는 물론 혈관성 치매에 대해서도 예방 및 치료효과를 나타내는 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명은 영지추출물, 올레아미드 및 그의 구조적 유사체를 유효성분으로 함유하는 치매의 예방 및 치료용 조성물을 제공한다.

본 발명의 조성물은 알츠하이머성 치매는 물론 혈관성 치매의 예방 및 치료효과를 나타낸다.

본 발명의 조성물은 AChE 활성 저해 효과를 나타내어, 뇌내 아세틸콜린 양의 감소를 회복시킴으로써 알츠하이머성 치매에 대하여 예방 및 치료효과를 나타내며, 동시에 뇌허혈에 의해 손상되는 뇌조직에 대한 보호효과를 나타내므로써 혈관성 치매에 대하여도 예방 및 치료효과를 나타낸다.

이하, 본 발명의 조성물에 대해 상세히 설명한다.

본 발명의 조성물에서 유효성분으로 사용되는 영지 추출물을 추출하는 방법은 다음과 같다.

영지를 헥산으로 추출한 다음 추출잔사를 다시 클로로포름으로 추출하고, 그런 다음 추출잔사를 다시 메탄올로 추출하여 수득한 추출액을 감암 증류하여 영지의 메탄올 추출물(이하 '추출물 GL-M' 이라 한다)을 수득한다. 이때 사용되는 추출 용매인 헥산, 클로로포름 및 메탄올의 양은 각각 사용되는 영지가 잠길 정도의 양이면 충분하며, 일반적으로 영지 1㎏당 헥산, 클로로포름 및 메탄올을 각각 2ℓ정도 사용한다.

상기한 방법에 따라 수득된 영지의 메탄올 추출물인 추출물 GL-M은 계속해서 일련의 실리카겔 컬럼 크로마토그래피 및 HPTLC 방법에 의해 분획화시켜 분리·정제한다. 즉, a) 영지의 메탄올 추출물인 추출물 GL-M을 용리액으로 클로로포름/메탄올(500:1)을 사용하여 실리카겔 컬럼 크로마토그래피하고 수득되는 분획을 HPTLC로 처리하여 Rf치에 따라 추출물 GL-M-1에서 GL-M-14까지의 14가지 추출물을 얻는 단계, b) 상기 단계 a)에서 수득된 추출물 중 추출물 GL-M-8을 용리액으로 클로로포름/메탄올(100:1)을 사용하여 실리카겔 컬럼 크로마토그래피하고 수득되는 분획을 HPTLC로 처리하여 Rf치에 따라 GL-M-8-A에서 GL-M-8-G 7가지 추출물을 얻는 단계, c) 상기 단계 b)에서 수득된 추출물 중 추출물 GL-M-8-F를 용리액으로 클로로포름/메탄올(50:1)을 사용하여 실리카겔 컬럼 크로마토그래피하고 수득되는 분획을 HPTLC로 처리하여 Rf치에 따라 추출물 GL-M-8-F-a에서 GL-M-8-F-e의 5가지 추출물을 얻는 단계, d) 상기 단계 c)에서 수득된 추출물 중 추출물 GL-M-8-F-b를 용리액으로 클로로포름/메탄올(50:1)을 사용하여 실리카겔 컬럼 크로마토그래피하고 수득되는 분획을 HPTLC로 처리하여 Rf치에 따라 추출물 GL-M-8-F-b-I에서 GL-M-8-F-b-IV까지의 4가지 추출물을 얻는 단계, e) 상기 단계 d)에서 수득된 추출물 중 추출물 GL-M-8-F-b-III을 용리액으로 클로로포름/메탄올(30:1)을 사용하여 실리카겔 컬럼 크로마토그래피하고 수득되는 분획을 HPTLC로 처리하여 Rf치에 따라 추출물 GL-M-8-F-b-III-1을 얻는 단계를 포함한다.

상기한 방법에 따라 수득되는 추출물 GL-M-8, GL-M-8-F, GL-M-8-F-b, GL-M-8-F-b-III 및 GL-M-8-F-b-III-1은 각각 후술하는 실시예에 의해 입증되는 바와 같이 AChE 활성을 저해하므로, 본 발명의 조성물에서 활성성분으로 사용될 수 있다.

본 발명의 조성물에서 유효성분으로 사용되는 영지의 메탄올 추출물 중에 함유된 활성 성분을 규명하기 위해 본 발명의 방법에 따라 최종적으로 수득되는 추출물 GL-M-8-F-b-III-1에 대하여 질량분석을 수행하여 이 분획이 9-옥타데센아미드(올레아미드)와 그 구조가 동일함을 확인하였다. 이로써 본 발명에 따른 영지 추출물에는 뇌에 존재하는 수면을 유도하는 물질로 이미 알려져 있는 올레아미드가 활성 성분으로 함유되어 있음을 알 수 있다.

상기 올레아미드 화합물은 다양한 화학적 합성 방법에 따라서도 제조할 수 있으며, 올레아미드 및 그의 구조적 유사체의 제조방법은 다음과 같다.

지방산 화합물(4)을 티오닐클로라이드(SOCl₂)와 70 내지 80℃의 온도에서 반응시킨 후 반응이 완료되면 실온으로 냉각시켜 차가운 암모니아수를 천천히 첨가한다. 생성된 반응생성물을 감압여과한 후 재결정화 시켜 올레아미드 및 그의 구조적 유사체(1)를 얻는다. 반응식은 하기 반응식 1과 같다.

상기 반응식 1에서 R₁은 9-옥타데세노일(올레일), 9-헥사데세노일(팔미토레일) 또는 테트라데카노일(미리스틸)이다.

또한 지방산 화합물(5)을 다이클로로메탄에 용해시킨 후 다이사이클로헥실카르보다이이미드(DCC)와 다이메틸아미노피리딘(DMAP)을 첨가하고 여기에 3-아미노펜탄(3-aminopentane)을 첨가하여 일정시간 반응시킨 다음 생성된 고체를 거르고 남은 모액을 농축시켜 이 농축화합물을 컬럼크로마토그래피하여 올레아미드의 구조적 유사체(2)를 얻는다. 반응식은 하기 반응식 2와 같다.

상기 반응식 2에서 R₂는 9-옥타데세노일(올레일), 9,12-옥타데카디에노일(리놀레일) 또는 테트라데카노일(미리스틸)이다.

또한 리놀레익산(linoleic acid, 6)을 다이클로로메탄에 용해시킨 후 다이사이클로헥실카르보다이이미드와 다이메틸아미노피리딘을 첨가하고 여기에 3-펜탄올(3-pentanol)을 첨가하여 일정시간 반응시킨 다음 생성된 고체를 거르고 남은 모액을 농축시켜 이 농축화합물을 컬럼크로마토그래피하여 올레아미드의 구조적 유사체(3)를 얻는다. 반응식은 하기 반응식 3과 같다.

상기 반응식 3에서 R₃은 9,12-옥타데카디에노일(리놀레일)이다.

이와같이 화학적 합성 방법에 의해 제조된 올레아미드 및 그의 구조적 유사체들은 영지의 추출물과 마찬가지로 알츠하이머성 치매는 물론 혈관성 치매에 대해서도 예방 및 치료 효과를 나타낸다.

본 발명의 조성물은 영지 추출물, 올레아미드 및 그의 구조적 유사체와 같은 유효성분 이외에도 치매 치료 및 기타 다른 질환을 치료할 수 있는 유효성분을 1종 이상 추가로 함유할 수 있다.

본 발명의 조성물은, 투여를 위해서 상기 기재한 유효성분 이외에 추가로 약제학적 또는 식품에서 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 제조할 수 있다.

약제학적 또는 식품에서 허용 가능한 담체는 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 더 나아가 당분야의 적정한 방법으로 또는 Remington's Pharmaceutical Science(최근판), Mack Publishing Company, Easton PA에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 비경구 투여하거나 경구 투여할 수 있으며, 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하나, 일일 투여량이 0.8~3.2㎎/㎏의 양을 일회 내지 수회에 나누어 투여하는 것이 바람직하다.

본 발명의 약제학적 조성물은 알츠하이머성 치매, 혈관성 치매를 예방 및 치료하기 위하여 단독으로, 또는 수술, 방사선 치료, 호르몬 치료, 화학 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.

본 발명의 식품 조성물의 제형은 통상의 방법에 따라 제조하며, 담체와 함께 건조한 후 캡슐화 하거나 기타 정제, 과립, 분말, 음료, 죽 등의 형태로 제형화할 수 있으며, 상기 기재한 것 외에도 모든 형태가 가능하다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 이는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐 이에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1 : 영지 추출물에 의한 AChE 활성 저해 효과 1(in vitro assay)

1. 영지 추출물의 제조

1) 영지 추출물 GL-H, GL-C, GL-M 및 GL-E의 제조

영지 3㎏를 잘게 부숴 비이커에 넣고 영지가 잠길 정도로 2배 정도(약 6ℓ)의 헥산을 가하고 2시간동안 40 내지 50℃에서 가열하여 2회 추출하고 여과하였다. 이를 감압하에 증류시키고 건조시켜 추출물 GL-H을 수득하였다(17.6g).

이 추출물을 분리하고 남은 잔사에 클로로포름을 잠길 정도(약 6ℓ)로 가하고 2시간동안 40 내지 50℃에서 가열하여 2회 추출하고 여과하였다. 이를 감압하에서 증류시키고 건조시켜 추출물 GL-C을 수득하였다(55g).

그런 다음 추출물을 분리하고 남은 잔사에 메탄올(약 6ℓ)을 가하고 이틀동안 상온에서 교반하여 2회 추출하고 여과하였다. 이를 감압하에 증류시켜 추출물 GL-M을 수득하였다(65g).

이 추출물을 분리하고 남은 잔사에 70% 에탄올(약 6ℓ)을 가하고 이틀동안 상온에서 교반하여 가열하여 2회 추출하고 여과하였다. 이를 감압하에 증류시켜 추출물 GL-E을 수득하였다(59g).

2) 영지 추출물 GL-M 으로부터 분리, 정제

상기 1)에서 수득한 추출물 GL-M 60g을 클로로포름/메탄올(500:1)을 용매로 하여 실리카겔이 충진된 컬럼(10×100㎝)에서 용출시켰다. 용출분획을 100㎖씩 받아 이를 HPTLC(전개용매 클로로포름/메탄올 30:1)로 전개하여 요오드로 발색시킨 후 Rf치에 따라 14개의 분획을 분리하였다. 분리된 각각의 분획을 감압 증류하여 건조시켜 추출물 GL-M-1 내지 GL-M-14를 수득하였다.

이들 중 GL-M-8 300㎎을 클로로포름/메탄올(100:1)을 용매로 하여 실리카겔이 충진된 컬럼(4×40㎝)에서 용출시켰다. 용출분획을 50㎖씩 받아 이를 HPTLC(전개용매 클로로포름/메탄올 30:1)로 전개하여 요오드로 발색시킨 후 Rf치에 따라 7개의 분획으로 분리하였다. 분리된 각각의 분획을 감압 증류하여 건조시켜 추출물 GL-M-8-A 내지 GL-M-8-G를 수득하였다.

그런 다음 추출물 GL-M-8-F 86㎎을 클로로포름/메탄올(50:1)을 용매로 하여 실리카겔이 충진된 컬럼(1.5×35㎝)에서 용출시켰다. 용출분획을 30㎖씩 받아 이를 HPTLC(전개용매 클로로포름/메탄올 30:1)로 전개하여 요오드로 발색시킨 후 Rf치에 따라 5개의 분획으로 분리하였다. 분리된 각각의 분획을 감압 증류하여 건조시켜 추출물 GL-M-8-F-a 내지 GL-M-8-F-e를 수득하였다.

이렇게 분리, 정제한 추출물 중 GL-M-8-F-b 60㎎을 클로로포름/메탄올(50:1)을 용매로 하여 실리카겔이 충진된 컬럼(1.2×30㎝)에서 용출시켰다. 용출분획을 10㎖씩 받아 이를 HPTLC(전개용매 클로로포름/메탄올 30:1)로 전개하여 요오드로 발색시킨 후 Rf치에 따라 4개의 분획으로 분리하였다. 분리된 각각의 분획을 감압 증류하여 건조시켜 추출물 GL-M-8-F-b-I 내지 GL-M-8-F-b-IV를 수득하였다.

그런 다음 GL-M-8-F-b-III 40㎎을 클로로포름/메탄올(30:1)을 용매로 하여 실리카겔이 충진된 컬럼(1×25㎝)에서 용출시켰다. 용출분획을 5㎖씩 받아 이를 HPTLC(전개용매 클로로포름/메탄올 30:1)로 전개하여 요오드로 발색시킨 후 Rf치에 따라 3개의 분획으로 분리하였다. 분리된 각각의 분획을 감압 증류하여 건조시켜 추출물 GL-M-8-F-b-III-1 내지 GL-M-8-F-b-III-3을 수득하였다.

2. AChE 활성 저해 효과

1) AChE의 분리

AChE는 ICR 쥐(20~25g)의 뇌로부터 분리하였다. ICR 쥐를 단두해서 뇌를 꺼낸 후 무게를 측정하였다. 그 무게의 2배 정도 부피로 12.5mM 인산나트륨 완충액 (sodium phosphate buffer)을 첨가하였다. 균질화 시킨 후 4℃에서 10분간 원심분리(×1000g) 하였다. 상층액을 취한 후, 그 부피의 3배가 되도록 0.5% 트리톤 엑스(Triton X)-100 균질화 완충액(homogenation buffer)을 첨가하고 4℃에서 30분간 교반시킨 후 4℃에서 10분간 원심분리(×10,000g) 하였다. 상층액을 1.5㎖ 튜브에 1㎖씩 분취한 후 급속 냉동 냉장고(deep freezer)에 보관하였다.

뇌 적출시 손상이 가지 않도록 주의하였고, 분리 전과정은 신속하게 수행하였다.

2) AChE 활성 저해 측정

상기 1에 의해 수득한 각각의 영지 추출물 50㎕에 925㎕의 완충액 I(0.1 M 인산나트륨 완충액, pH : 8.0), 25㎕ 트윈(Tween)-20을 혼합하였다. 그런 다음 33㎕의 엘만(Ellman) 시료를 첨가하고 10분 동안 25℃로 유지한 후 기질인 25mM 아세틸티오콜린 요오드(acetylthiocholine iodide) 용액 20㎕와 상기 1)의 방법에 따라 준비해 둔 AChE 33㎕를 첨가하였다. 그런 다음 412㎚에서 5분 동안 AChE의 초기반응속도를 측정하였다. 시료가 없을 때의 초기반응속도를 기준으로 하여 시료가 있는 경우에 초기반응속도를 비교하였다. 그 결과는 저해 백분율로 나타내었다.

이러한 방법으로 실시예 1에서 수득한 각각의 영지 추출물의 AChE 저해도를 측정하였다. 그 결과는 도 1 및 도 2에 나타내었다.

도 1에서 보는 바와 같이, 영지 추출물 중 GL-M이 AChE 활성 저해 효과가 가장 좋았으며, 영지의 메탄올 추출물(GL-M)로 부터 분리·정제된 분획의 수득율 및 AChE 활성 저해는 도 2에 나타내었다.

본 발명에 따른 영지의 최종 분리 물질인 GL-M-8-F-b-III-1은 올레아미드의 구조와 동일하였고, 이의 AChE 활성 저해를 측정한 결과는 도 3에 나타내었다.

도 3에서 보는 바와 같이, 올레아미드의 농도가 증가함에 따라 AChE의 활성 저해가 증가하였다.

3) AChE/BuChE에 대한 선택성 측정

현재 사용되는 알츠하이머 치료 약물인 타크린(tacrine)은 AChE/BuChE 선택성이 거의 없기 때문에 둘 다 저해시킨다. 그런데 부티릴콜린에스터라제 (butyrylcholinesterase, BuChE)는 중추신경계에서의 콜린성 전달(cholinergic transmission)과는 관련이 없기 때문에, 타크린의 치료 효과가 적고 부작용도 크다. 이에 본 발명에 따른 영지 추출물의 최종 분리 물질인 GL-M-8-F-b-III-1의 AChE/BuChE의 선택성을 측정하였다. BuChE는 사람의 혈장으로부터 분리하여 사용하였고 이것의 저해도는 기질로 부티릴티오콜린 요오드를 사용한 것 외에는 AChE 활성 저해 측정과 동일한 방법으로 측정하였다.

측정 결과는 도 4에 나타내었다.

도 4에서 보는 바와 같이, GL-M-8-F-b-III-1의 농도가 증가함에 따라 BuChE 활성저해가 거의 없었고, 10% 이내의 낮은 저해효과를 나타내었다. 이에 비하여 AChE는 70% 까지 활성저해를 보였다. 이로부터 본 발명에 따른 영지 추출물은 AChE만 선택적으로 저해하는 것을 확인할 수 있었다.

실시예 2 : 영지 추출물에 의한 AChE 활성 저해 효과 2( in vivo assay)

5주령의 ICR 쥐에 실시예 1에 따라 수득한 GL-M-8-F-b-III-1와 합성한 올레아미드를 10% 에탄올에 녹인 1㎎/㎏, 10㎎/㎏을 복강투여하고, 1시간 후에 뇌조직에서 AChE를 분리하였다. 뇌에서 분리한 AChE의 활성저해 효과를 in vitro AChE 활성저해 측정방법과 동일한 방법으로 수행하였다.

결과를 도 5에 나타내었다.

도 5에서 보는 바와 같이, 기준(control)에 비하여 1㎎/㎏의 농도에서는 39%, 10㎎/㎏농도에서는 52%의 AChE 활성이 저해되었으며, 영지로 부터 추출한 GL-M-8-F-b-III-1과 합성한 올레아미드의 AChE의 활성 저해 효과가 동일함을 확인하였다.

실시예 3 : 영지 추출물에 의한 AChE 활성 저해 효과 3(수동회피실험)

본 발명에 따른 영지의 GL-M-8-F-b-III-1 추출물이 in vivo에서 기억 및 학습능력을 향상시킬 수 있는지 스텝쓰루(step-through) 수동회피 실험을 세 가지 프로토콜(수동회피실험 I, II, III)로 수행하여 조사하였다.

체중 20~30g(약 6주)의 ICR계 웅성 쥐를 실내온도 22℃, 상대습도 50~60%로 유지하고 12시간씩 명암을 자동조절장치를 이용하여 조절하는 동물실에 일주일 이상 적응시킨 후 실험에 사용하였다. 스텝쓰루 수동회피반응 측정장치(O'HARA Co. Ltd., Model PAM5, France)는 2개의 공간으로 나누어져 그 사이 칸막이에 구멍이 내어져 있어 쥐가 쉽게 통과할 수 있도록 하고 있다. 상자의 한쪽 부분(12×10×10㎝)은 투명한 아크릴판으로 만들어져 상자 안이 밝게, 다른 한쪽 부분(16×10×10㎝)은 검은 아크릴판으로 만들어져 상자 안이 어둡게 되어 있다. 어두운 상자 바닥에는 7㎜ 간격으로 격자가 설치되어 있어 쥐가 어두운 부분으로 들어갔을 때 바닥의 격자를 통해 100 볼트의 전기가 주어지도록 되어 있다.

1) 수동회피실험 I

실험 첫날, 쥐를 실험상자의 밝은 부분에 넣어, 쥐가 구멍을 통해 어두운 부분으로 자유롭게 왔다갔다하며 탐색, 적응하도록 하였다. 이때, 실험상자의 밝은 부분에서 어두운 부분으로 들어갈 때까지의 시간(latency time, 지연시간)을 측정, 지연시간이 30초 이내인 쥐만을 실험에 사용하였다.

실험 둘째 날, 쥐를 비히클(식염수 또는 10% 에탄올) 투여군, 스코폴아민(1 ㎎/㎏) 투여군, 스코폴아민(1 ㎎/㎏)과 영지의 GL-M-8-F-b-III-1 추출물(0.5 ㎎/㎏, 2 ㎎/㎏)의 동시투여군, 스코폴아민과 타크린(2 ㎎/㎏)의 동시투여군으로 나누어 각 군별로 쥐에 약물을 복강내 투여하였다. 약물 투여 30분 후에 쥐를 실험상자의 밝은 부분에 넣고 지연시간을 측정하고, 쥐가 어두운 부분으로 들어간 후 3초가 지났을 때 3초 동안 전기자극(100 볼트)을 주었다. 훈련 15분 후에 다시 실험상자에 넣어, 지연시간을 측정하고 최대 300초까지 측정하였다.

실험 셋째 날(전기자극 24시간 후)은 실험 둘째 날과 마찬가지로, 각 쥐에 약물을 투여한 후, 30분 경과하였을 때, 다시 지연시간을 측정하였다. 둘째 날 얻은 각 군에 대한 평균 지연시간(15분; 1st training trial)과 셋째 날의 평균 지연시간(24시간; retention trial)은 비히클과 스코폴아민 투여 대조군의 평균 지연시간과 분산분석(ANOVA; Analysis of Variance) 시험으로 비교하였다.

이 실험에서 스코폴아민에 의해 기억상실을 유도시킨 쥐를 이용하여 영지 추출물의 기억 재생능력에 대한 효과를 수동회피반응을 통하여 조사된 결과는 도 6에 나타내었다.

도 6에서 보는 바와 같이, 전기자극이 주어지기 전의 적응 시 측정된 지연시간(6~11분)은 서로 다른 약물 처치 군간의 차이가 관찰되지 않았다(A). 전기자극 훈련 15분 후에 다시 측정된 지연시간은 식염수 대조군(274±17분)과 영지 추출물의 용매인 10% 에탄올을 처리한 비히클 대조군(290±9분)에서 유의적으로 크게 증가된 결과로부터 이들 대조군 동물들의 정상적인 기억 능력이 확인되었다. 스코폴아민 투여군은 정상대조군에 비해, 전기자극에 대한 수동회피반응(103분)이 유의적으로 감소(62%)하였으며 이 결과로부터 본 실험조건 하에서 스코폴아민에 의한 기억상실 동물모델이 예상대로 만들어 졌음을 확인할 수 있다. 영지의 GL-M-8-F-b-III-1 추출물 투여에 의해서 스코폴아민에 의해 억제되었던 지연시간이 증가하였고 이 효과는 잘 알려진 아세틸콜린에스터라제 억제제인 타크린 투여군과 유사하였다. 영지 추출물의 용매인 10% 에탄올 처리군에서는 둘째 날의 15분 훈련 지연(training latency)에 대한 영향은 없었으나, 전기자극 24시간 후에는 식염수 대조군에 비해 통계학적으로 유의적인 변화는 아니나 지연시간(retention latency)이 약 33% 감소되었다. 영지 추출물 0.5㎎/㎏ 투여시 24시간 후의 지연시간은 스코폴아민에 의해 억제된 스텝쓰루 지연이 10% 에탄올 비히클 대조군과 같은 정도까지 회복되었다(B, C).

이와 같이 본 발명에 따른 영지의 GL-M-8-F-b-III-1 추출물은 마우스에서 스코폴아민에 의해 억제된 스텝쓰루 수동회피반응을 회복시키는 효과를 나타내었으며 이 효과는 양성 대조군으로서 조사된 타크린(2 mg/kg)의 효과와 유사하였다.

2) 수동회피실험 II

실험 첫날은 실험 I과 동일하게 쥐를 적응시키고, 실험 둘째 날, 쥐를 비히클[식염수 또는 0.2% methylcellulose(MC)] 투여군, 스코폴아민(1㎎/㎏) 투여군, 스코폴아민(1㎎/㎏)과 영지의 GL-M-8-F-b-III-1 추출물(0.5㎎/㎏, 2㎎/㎏, 10㎎/㎏)의 동시투여군, 스코폴아민과 타크린(2㎎/㎏)의 동시투여군, 스코폴아민과 도네페질(아리셉트 ; 0.5㎎/㎏)의 동시투여군, 영지의 GL-M-8-F-b-III-1 추출물(0.5㎎/㎏, 2㎎/㎏, 10㎎/㎏) 단독투여군, 타크린(2㎎/㎏) 단독투여군 및 도네페질(0.5㎎/㎏) 단독투여군으로 나누어 각 군별로 쥐에 약물을 투여(모두 복강내 투여)하였다. 약물 투여 30분 후에 쥐를 실험상자의 밝은 부분에 넣고 지연시간을 측정하고, 쥐가 어두운 부분으로 들어간 후 3초가 지났을 때 3초 동안 전기자극을 주었다. 훈련 15분 후에 다시 실험상자에 넣어, 지연시간을 측정하고 최대 300초까지 측정하였다. 전기자극 24시간 후(셋째 날)와 48시간 후(넷째 날)에 약물 투여나 전기 자극 없이 지연시간을 측정하였다. 이 실험에서 조사된 결과는 도 7에 나타내었다.

영지 추출물의 용매인 0.2% MC를 처리한 비히클 대조군에서 전기자극 훈련 15분, 24시간, 48시간 후에 측정된 지연시간은 식염수 대조군과 거의 차이를 나타내지 않았다. 스코폴아민과 시험 약물들의 동시 투여 시, 전기자극 15분 후의 영지의 추출물에 의해서 스코폴아민으로 유도된 지연시간의 감소(기억력 저하)가 부분적으로 회복되었고(10㎎/㎏의 용량에서 가장 큰 증가효과), 이 효과는 잘 알려진 아세틸콜린에스터라제 억제제인 타크린 및 도네페질(donepezil)의 효과와 유사하였다. 전기자극 24시간 후에는 도네페질이 거의 대조군 수준으로 스코폴아민으로 유도된 기억력 저하를 회복시켰으며, 영지 추출물은 조사된 세 농도에서 모두 타크린과 유사한 정도인 약 30~50%의 회복효과를 나타내었다. 전기자극 24시간 후에는 영지 추출물 2㎎/㎏ 투여군에서 가장 큰 회복효과를 보였으며 이 효과는 타크린 2㎎/㎏의 효과와 유사하였고 도네페질의 효과에는 약간 미치지 못하였다.

이 실험에서는 영지 추출물이 정상적인 기억력에도 영향을 미치는 지도 조사하기 위하여 스코폴아민을 투여하지 않고 시험 약물만을 투여한 후 위와 동일한 방법으로 수동회피 실험을 수행하였다.

도 7의 왼쪽 부분에서 보는 바와 같이 영지 추출물과 양성 대조약물들인 타크린 및 도네페질 모두 정상적인 기억력에 큰 영향을 미치지 않았으며 전기자극 24시간 후에는 오히려 정상적인 기억력을 더욱 향상시키는 경향을 보였다.

3) 수동회피실험 III

이 실험에서는 영지 추출물의 연속 투여효과를 조사하기 위하여 실험 첫날은 실험 I, II 와 동일하게 쥐를 적응시키고, 실험 둘째 날, 쥐를 비히클[식염수 또는 0.2% methylcellulose(MC)] 투여군, 스코폴아민(1㎎/㎏) 투여군, 스코폴아민(1㎎/㎏)과 영지의 GL-M-8-F-b-III-1 추출물(0.5㎎/㎏, 2㎎/㎏, 10㎎/㎏)의 동시투여군, 스코폴아민과 타크린(2㎎/㎏)의 동시투여군 및 스코폴아민과 도네페질(0.5㎎/㎏)의 동시투여군으로 나누어 각 군별로 쥐에 약물을 투여(모두 복강내 투여)하였다. 약물 투여 30분 후에 위와 동일한 전기자극 훈련을 시행하고 15분 후에 다시 실험상자에 넣어 지연시간을 측정하고 두번째 전기자극 훈련을 시행하였다. 실험 셋째 날부터 5일간 영지 추출물(0.5㎎/㎏, 2㎎/㎏, 10㎎/㎏), 타크린(2㎎/㎏) 및 도네페질(0.5㎎/㎏)을 전기자극 없이 연속투여 하였다.

결과는 도 8에 나타내었다.

도 8에서 보는 바와 같이, 본 발명에 따른 영지 추출물의 연속투여 후에 스코폴아민에 의해 현저하게 저하된 기억력을 대조군 수준으로 회복시켰다.

실시예 4 : 영지 추출물에 의한 뇌허혈(cerebral ischemia)에 의해 유발되는 뇌손상 조직의 보호 효과

뇌허혈에 의해 유발된 뇌조직 손상(infarction)에 대한 영지 추출물의 보호효과를 관찰하기 위하여 쥐의 중관상동맥을 폐쇄(middle coronary artery occlusion; MCAO)하여 뇌허혈 동물모델을 만들었다(Longa et al., 1986).

체중 250~300g의 웅성 흰쥐(Sprague-Dawley)를 사용하였으며, 뇌허혈 유발 전후 물과 먹이는 자유롭게 섭취하도록 하였으며, 약 1주일간의 순응기간을 거친 후 실험에 사용하였다.

마취 챔버에 N₂O와 O₂ 혼합가스하에서 3.0~3.5%의 엔플로란(enflurane, 중외제약)을 도입하여 마취 유도후 수술대에 고정시키고, 다시 마스크로 1.5~2.0%의 엔플로란을 도입하여 수술 중 마취가 지속되도록 하였다. 체온저하를 막기 위해 수술시 전기담요(heating pad)를 이용하여 체온을 37±0.5℃로 유지하였다. 목의 중앙선을 따라 경부를 1cm 정도 절개한 후 오른쪽 총경동맥(common carotid artery)을 조심스럽게 미주신경(vagus nerve)과 분리시켜 노출시켰다. 총경동맥으로부터 외경동맥(external carotid artery)과 내경동맥(internal carotid artery)을 주변의 신경으로부터 분리해내고 박리한 총경동맥, 외경동맥 및 내경동맥에 미리 실을 느슨하게 걸어 놓았다. 총경동맥 및 외경동맥에 건 실을 묶어 총경동맥 및 외경동맥을 결찰하고 내경동맥 기시부에 주사침으로 구멍을 낸 다음 절개부위를 통해 내경동맥 쪽으로 17mm 길이의 프로브(probe)를 밀어 넣어 중대뇌동맥을 폐쇄하고, 내경동맥에 걸어 둔 실을 묶어 프로브를 고정하여 허혈을 유발시켰다. 이 때 프로브는 4~0 나일론 수술용 실(nylon surgical thread)의 한쪽 끝을 인두 가까이에서 열을 가해 그 끝의 직경이 0.3mm가 되도록 하여 마개(stopper)로 사용하고, 길이가 17mm 정도 되도록 자른 다음 경화제(Optosil, Bayer Dental)를 첨가한 실리콘(Xantopren, Bayer Dental)으로 코팅한 것을 사용하였다. 수술부위를 봉합하고 마취에서 깨어날 때까지 다른 케이지(cage)에 두었다. 뇌허혈 유발 후 일정시간(약 30분)이 경과했을 때 신경학적 결손을 확인하였다. 신경학적 결손은 공중에서 흰 쥐의 꼬리를 완전히 들었을 때 좌측부전마비(left hemiparesis)가 일어나는지와 꼬리를 위로 들었을 때 또는 자발적으로 왼쪽으로의 회선병(circling)이 일어나는지 관찰하였다(Bederson et al., 1986). 본 실험에서는 영지의 GL-M-8-F-b-III-1 추출물(0.5㎎/㎏, 2㎎/㎏, 10㎎/㎏)을 복강내 전투여(pre-treatment)한 후 30분 후에 중대뇌동맥을 폐쇄시켜 9시간 동안 뇌허혈을 유발시킨 후 단두하여 신속하게 뇌를 적출하였다. Brain matrix(Neurotec. 한국)를 이용하여 전두극(frontal pole)으로부터 1㎜ 되는 지점부터 2㎜ 두께의 연속적으로 구분되어진 신선한 뇌관측 조각(fresh brain coronal slice) 중 세번째 조각(5~7㎜)에 0.9% 생리식염수로 제조된 2% TTC(2,3,5-triphenyltetrazolium chloride) 용액을 가하고 37℃에서 30분간 염색하여 뇌손상 정도를 측정하였다.

측정 결과는 도 9에 나타내었다.

도 9에서 보는 바와 같이, 9시간 허혈로 인해 유도된 대뇌피질과 선조체에서의 손상범위(희게 보이는 부위)가 본 발명에 따른 영지의 GL-M-8-F-b-III-1 추출물 투여에 의해 감소됨을 알 수 있다.

실시예 5 : 올레아미드 및 그의 구조적 유사체에 의한 AChE 활성 저해 효과

올레아미드 및 그의 구조적 유사체인 팔미톨레일아미드 [CH₃(CH₂)₅CH=CH(CH₂)₇-CONH₂], 미리스틸아미드 [CH₃(CH₂)₁₂-CONH₂], 노말-펜틸오레오아미드 [CH₃(CH₂)₇CH=CH(CH₂)₇-CONHCH(CH₂CH ₃)₂], 노말-펜틸-리놀레오아미드 [CH₃(CH₂)₄CH=CHCH₂CH=CH(CH₂)₇-CONHCH(CH ₂CH₃)₂], 노말-펜틸-미리스트아미드 [CH₃(CH₂)₁₂-CONHCH(CH₂CH₃)₂], 펜틸리놀레이트 [CH₃(CH₂)₄CH=CHCH₂CH=CH(CH₂)₇-COOCH(CH₂CH₃)₂]에 대하여 AChE 활성 저해 효과를 실시예 1의 2와 동일한 방법으로 확인하였다.

대조군으로 도네페질과 타크린을 사용하였다.

측정 결과는 표 1에 나타내었다.

			저해율(%)
			10^-2(M)	10^-3(M)	10^-4(M)	10^-5(M)	10^-6(M)	10^-7(M)	10^-8(M)
	R₁	올레일		98	60	8	-	-	-
		팔미토레일	99	58	44	-	-	-	-
		미리스틸	-	75	10	-	-	-	-
	R₂	올레일	-	96	42	0.2	-	-	-
		리놀레일	-	70	3	-	-	-	-
		미리스틸	-	97	44	5	-	-	-
			96	32	0.5	-	-	-	-
대조군		도네페질	-	-	-	-	96	74	8
대조군		타크린	-	-	-	99	83	43

표 1에 나타난 바와 같이, 올레아미드 및 그의 구조적 유사체는 농도가 증가함에 따라 AChE 활성 저해 효과가 증가하였다.

본 발명의 조성물은 동물 뇌 조직의 AChE의 활성을 저해하여 뇌내 아세틸콜린 양의 감소를 방지시킴과 동시에 뇌허혈에 의해 손상되는 뇌조직에 대한 보호효과를 나타내므로, 알츠하이머성 치매는 물론 혈관성 치매에 대해서도 예방 및 치료효과를 나타낸다.

도 1은 본 발명에 따른 영지 추출물(GL-H: 영지의 헥산 추출물, GL-C: 영지의 클로로포름 추출물, GL-M: 영지의 메탄올 추출물, GL-E: 영지의 에탄올 추출물)의 AChE 활성 저해를 나타낸 도이다.

도 2는 본 발명에 따른 영지의 메탄올 추출물로부터 분리·정제된 분획의 수득율 및 AChE 활성 저해를 나타낸 도이다.

도 3은 합성한 올레아미드의 AChE 활성 저해를 농도별로 나타낸 도이다.

도 4는 본 발명에 따른 영지의 메탄올 추출물의 최종 분리 정제 분획인 GL-M-8-F-b-III-1의 AChE/BuChE의 선택성을 측정한 도이다.

도 5는 본 발명에 따른 GL-M-8-F-b-III-1과 합성한 올레아미드 투여 후 AChE 활성 저해를 측정한 도이다(in vivo assay).

도 6 내지 도 8은 본 발명에 따른 영지의 추출물 GL-M-8-F-b-III-1을 투여한 수동회피실험에 대한 결과를 나타낸 도이다.

도 9는 본 발명에 따른 영지의 추출물 GL-M-8-F-b-III-1이 뇌허혈에 미치는 영향을 나타낸 도이다.

Claims

삭제
삭제
삭제
GL-M, GL-M-8, GL-M-8-F, GL-M-8-F-b, GL-M-8-F-b-III, GL-M-8-F-b-III-1 중에서 선택된 하나이상의 유효분획을 포함하는 영지추출물을 함유하는 치매의 예방 및 치료용 조성물
제 4항에 있어서, 상기 영지 추출물은 GL-M-8-F-b-III-1 임을 특징으로 하는 치매의 예방 및 치료용 조성물
하기 화학식 1의 화합물을 유효성분으로 함유하는 치매의 예방 및 치료용 조성물

상기 화학식 1에서 R₁은 9-옥타데세노일(올레일), 9-헥사데세노일(팔미토레일) 또는 테트라데카노일(미리스틸)이다.
하기 화학식 2의 화합물을 유효성분으로 함유하는 치매의 예방 및 치료용 조성물

상기 화학식 2에서 R₂는 9-옥타데세노일(올레일), 9,12-옥타데카디에노일(리놀레일) 또는 테트라데카노일(미리스틸)이다.
하기 화학식 3의 화합물을 유효성분으로 함유하는 치매의 예방 및 치료용 조성물
제4항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 알츠하이머성 치매와 혈관성 치매를 동시에 예방 및 치료하는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물
삭제
영지를 헥산으로 추출한 후, 그 추출 잔사를 클로로포름으로 추출하고, 다시 그 추출 잔사를 메탄올로 추출하여 얻은 영지의 메탄올 추출물(GL-M)을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피 및 HPTLC에 의해 더 분리·정제하는 것을 특징으로 하는 치매의 예방 및 치료용 영지 추출물의 추출방법