KR20110108150A - 잠사 추출물을 포함하는 뇌신경질환 예방 및 치료용 또는 기억력 증진용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 잠사 추출물을 포함하는 뇌신경질환 예방 및 치료용 또는 기억력 증진용 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 잠사 추출물 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 뇌신경질환의 예방 및 치료용 조성물 또는 기억력 증진용 조성물은 신경세포의 성장 및 분화를 유도하고, 생존을 유지시키는 효과를 나타내어 뇌신경질환의 예방 및 치료제로서 또한 기억력 증진제로서 유용하게 사용될 수 있다.

Description

잠사 추출물을 포함하는 뇌신경질환 예방 및 치료용 또는 기억력 증진용 조성물{COMPOSITION FOR PREVENTING AND TREATING NEUROLOGICAL DISEASE OF BRAIN OR FOR THE ENHANCEMENT OF MEMORY COMPRISING AN EXTRACT OF SILK YARN}

본 발명은 잠사 추출물을 포함하는 뇌신경질환 예방 및 치료용 또는 기억력 증진용 조성물에 관한 것이다.

20세기에 들어서며 생명 과학 및 의학의 급속한 발전으로 인간의 평균 수명이 늘어나며 장노년 인구의 비중이 커져서 새로운 사회적 문제들이 부각되고 있으며, 특히 노인성 신경계 질환, 즉 뇌졸중(stroke), 알쯔하이머병(Alzheimer's disease, AD), 파킨슨씨병(Parkinson's disease, PD) 등은 치명적인 신경계의 기능장애로 나타나고 있다.

신경계에서 신경세포의 성장(growth), 분화(differentiation) 및 사멸 (cell death)은 각기 정상적인 발생과 조직의 고유한 기능 확립 및 항상성 유지에 중요한 조절과정이다. 신경세포의 사멸은 두 가지 형태인 신경세포사멸(apoptosis)과 세포괴사(necrosis)가 있는데, 신경괴사는 세포내 이온들의 급격한 불균형을 유도하는 손상에 의하여 일어나며 세포질과 미토콘드리아의 팽창 그리고 세포질의 용해 후 핵막의 파괴에 의해 유도되는데, 국소 빈혈(ischemic), 체온저하(hypothermia), 뇌졸증, 물리적 또는 화학적 외상과 같은 갑작스러운 상해에 의해 세포가 죽는 급성사멸을 말하는 것으로서(Tomei et al.; Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A ., 90 , pp853-857, 1993), 단백질 합성억제제에 의하여 영향을 받지 않으며 신경계에 일어나는 대표적인 예는 신경세포가 이온성 글루탐산 수용체의 활성화에 의해 손상을 입을 때 나타난다. 세포사멸(apoptosis)은 예정화된 세포사멸이라고도 하는데 특징적 형태는 세포 크기의 축소(cell shrinkage), 세포막 팽창(membrane blebbing), 세포골격의 붕괴와 같은 막의 변화와 염색질응축 등과 같은 핵의 변화를 수반한다(Kerr J. F., J. Pathol., 107 (3), pp217-219, 1972 : Arends M. J. amp; Morris R. G., Am. J. Pathol., 136(3), pp593-608, 1990). 미토콘드리아 기능의 상실과 함께 세포는 막으로 둘러싸인 소구조인 세포사멸체(apoptotic body)을 형성하게 되는데, 형성된 세포사멸체는 동물모델에서 이웃하는 세포나 대식세포에 의해 식균(phagocytosis)되어 완전히 제거됨으로써 세포질 내용물의 유출로 인한 염증 반응없이 조직에서 제거된다. 다세포 생물에서 세포의 성장·분화 및 이동 등의 모든 행동은 세포 밖에 존재하는 조절요인에 의해 조절된다. 신경세포 또한 이러한 조절요인이 필요한데 이것이 신경조절인자이며, 표적세포에서 유리되어 중추신경(Central Nervous System, CNS)과 말초신경(Pheriperal Nervous System. PNS)에서 뉴론의 성장 분화 생존에 영향을 미치는 단백질을 모두 신경성장인자들이라 한다. 다섯 가지의 관련된 인자들이 있는데 신경성장인자(NGF; nerve growth factor), 뇌 유래 신경성장인자 BDNF(Brain-derived neurotrophic factor), 신경인자 NT-3(Neurotrophin-3), NT-4, NT-5 등이 있으며, 이러한 신경인자들은 각각 합성되는 곳이나 분화, 발현되는 양상이 다르고 표적장소가 다르나 각각을 구성하는 아민산 배열은 종간에 매우 유사하다. 신경인자는 신경계에서는 신경세포사멸을 억제하는데 신경세포사멸은 신경인자의 결핍상태에 접할 때 일어나며, 대부분 새로운 단백질의 합성(cell death related genes)에 의존하는 세포사멸의 한 형태이다. 신경인자들이 신경계의 발생 동안 일어나는 신경세포의 예정사를 억제한다는 것은 이미 잘 규명되어 있다.

이러한 기능을 하는 신경인자들 중 신경성장인자(NGF)는 레비몬탈치니(Levi- Montalcini)가 1950년 초기에 뱀독이나 마우스육종에서 분리하였는데, 이 추출액 속에서 병아리 교감신경절 뉴론의 조직배양을 하면 뉴론 축색의 성장이 수배나 촉진된다는 보고를 하였다(Levi-Montalcini R., Birth Defects Orig Artic Ser, 19 (4), pp3-22, 1983). 과거에 신경성장인자는 뉴론의 분열을 촉진하는 것으로 생각되었는데 현재 알려진 바에 의하면, 그보다 뉴론의 퇴화 사멸을 억제함으로써 뉴론의 수적 감소를 방지하고 있다. 이 신경성장인자의 수용체는 후근 지각 신경절, 뇌, 교감신경지배장기에 존재하며, 생체내에서 심장과 같은 교감신경 지배장기에서는 신경성장인자를 생합성하고 이것이 신경종말에서 흡수되고 축색에서 역방향으로 수송되어 뉴론 세포에 도달하면 이곳에서 단백질 합성을 촉진한다고 보고되어진 바 있다(Mahalik T. J., Investig Dermatol Symp Proc., Aug; 2 (1), pp14-18, 1997).

중추신경계에서 NGF는 신경세포의 손상에 대하여 보호기능을 한다는 많은 보고가 있는데, 예를 들면 핌브리아-포닉스(Fimbria-fornix)의 절삭 (Cholinergic 축삭돌기 절삭, Choliergic axotomy)은 전뇌 기저의 콜린성 신경세포로부터 해마까지의 콜린성 첨가를 막는데, 이로 인하여 콜린성 신경세포는 서서히 퇴화하게 되며, 절삭후 신경성장인자를 넣어주면 콜린성 신경세포의 퇴화는 거의 완전히 억제되며 고농도의 뇌세포 유래 성장인자(BDNF)를 투여하면 콜린성 적삭에 대하여 신경성장인자와 비슷한 효과를 얻을 수 있다(Hefti F.J., Neurosci, Aug; 6 (8), pp2155-2162, 1986). 또한 신경성장인자와 말초신경과의 관계를 살펴보면, 성숙한 동물에서 신경성장인자의 역할은 아직 명확히 규명되지는 않았으나, 최근 보고에 의하면 신경성장인자의 항체를 주입하면 교감신경절의 파괴가 일어나고 노르에피네프린을 합성하는 효소인 타이로신 하이드록실라아제와 도파민 베타-하이드록실라아제의 활성도 역시 감소한다고 한다(Levi-Montalcinin et al.; Bull. Soc. Sci. Med Grand Duche Luxemb, 115 (2), pp69-74, 1978). 한편, 외부로부터 신경성장인자를 주입해주면 NGF에 민감한 신경의 생존이 증가하고 해당조직에 대한 신경지배정도가 증가하는데 외부에서 주입한 신경성장인자가 말초신경손상 후 발생학적 변화를 약화시킨다는 보고(Zettler C, Head R. J., Rush R.A., Brain Res., 538(2), pp251-262, 1991)에 의하면, 신경성장인자는 신경손상 후 신경 재생과정에 중요한 역할을 할 것으로 여겨지고 있다. 이와 같은 결과들은 조직의 신경성장인자와 교감신경의 지배정도가 상호 밀접한 관계가 있음을 보여준 보고라 할 수 있다. 신경계의 정상적인 발생 과정상의 발생중인 뉴론의 약 50%는 세포사멸에 의해 제거되며(Barres BA, Schmid R, Sendnter M, Raff MC., Development, 118 (1), pp283-95, 1993), 표적 세포에 의해 분비되는 신경인자들이 뉴론의 생존을 결정한다고 알려져 있다. 신경세포가 정상상태에서 생존·성장·분화하기 위해서는 신경성장인자와 같은 성장인자들이 필수적으로 요구된다고 할 수 있다. 그러나 이러한 신경성장인자는 분자량의 크기 때문에 뇌에서의 BBB(Blood brain barrier)를 통과하지 못한다. 그래서 퇴행성 뇌질환에 있어서 치료효과를 보기가 어렵게 되어 있다. 이에 내생하는 신경성장인자의 합성을 더욱 유도해야 하며 나아가서는 신경성장인자와 같은 역할을 하는 물질의 개발이 시급한 실정이다.

퇴행성 뇌질환은 뇌 신경세포의 사멸이 주요한 원인이 되는 질환으로, 치매, 파킨슨병, 뇌졸중, 헌팅턴병 등의 다양한 질환을 포함한다. 또한, 현대사회에서는 노령 인구의 급격한 증가로 인한 노인성 치매(senile dementia) 등의 퇴행성 뇌질환의 증가가 심각한 사회 문제로 대두되고 있으나, 현재까지 이 질환의 예방 및 치료를 위한 효과적인 약제나 치료법은 개발되지 못하고 있다.

대표적인 퇴행성 뇌질환인 치매는 전반적인 인지기능의 장애를 나타내는 뇌질환으로 보통 만성, 또는 진행성 뇌질환에 의해서 발생되고 기억, 사고, 이해, 계산, 학습, 언어 판단 등 다수의 고위 대뇌기능에 장애가 나타난다.

그러나 이러한 치매의 원인은 정확히 밝혀져 있지 않다. 다만 몇 가지 추정되는 원인으로는 대뇌 기저부의 콜린(choline)성 신경세포의 손상, 신경전달물질의 감소, 염증 반응에 의한 베타-아밀로이드(β-amyloid) 단백질 축적, 산화성 스트레스 등이라는 보고가 있다(Davies P., et al., Lancet, 21, 1403(1976); Rocher, A. E., et al., J. Biol. Chem., 273, 29719(1988); Coyle, J. T., et al., Science , 262, 689(1993)). 가장 바람직한 치매 치료제는 뇌세포의 파괴와 노화를 지연시켜 뇌세포를 보호하고, 인지 기능을 회복시키며 뇌세포의 재생을 촉진시켜야 하지만, 이를 모두 충족시키는 약은 현재까지 개발되지 못했다.

따라서 본 발명자들은 치매의 예방과 치료에 효과적인 약물을 개발하기 위해 연구하던 중 안전하고 독성이 없으며 다양한 약리 작용을 하는 잠사 추출물이 신경세포사멸을 억제하고, 신경성장인자의 합성을 증가시킴으로써 인지기능과 학습능력을 높일 수 있음을 발견하여 본 발명을 완성하였다.

잠사는 누에나방과 곤충 집누에나방(Bombyx mori L.)의 유충의 건조한 분변, 즉 똥이다. 이는 6~8월, 잠든 누에의 똥을 주로 수집하여 2~3회 볕에 말린 후 흙을 체로 쳐 버리고 사용한다. 잠사는 맛이 달고 매우며, 성질이 따뜻하다. 또한, 인, 칼륨, 칼슘이 많고, 엽록소가 2% 들어 있다. 약효는 혈액순환을 원활히 하여 풍을 제거하고 통증을 감소시키기 때문에 류마티스, 신경통, 요통, 중풍으로 인한 반신불수에 사용한다. 그외 당뇨, 두드러기, 결막염, 자궁출혈, 소양증 등에 효과가 있다(박영준, 한방동물보감, 푸른물결, 2000) 잠사는 가바(gaba), 천연 비타민 E, 루틴(rutin), 카로테노이드(carotenoid), 티로신(tirocin), 세린, 아스파라긴산(aspartic acid), 알라닌(alanin), 모라신(moracin), 글루코시다아제(알파-glucosidase inhibitor), chlorophyll a, b, mulberrofuran F. G, guanon, moracin, demoracin, phytol, β-sistol, cholesterol, ergosterol과 tetracosanol, lupeol을 함유하고 있고 β-시스톨-β-글루코사이드가 분리되었다(중약대사전, 1990).

그러나, 지금까지 잠분을 유효성분으로 사용하여 수면증강, 진통 완화, 항경련, 체중 감소 및 고지혈증 억제효과를 갖는 약제학적 조성물에 관한 대한민국 특허 제10-0615532호(2006.08.17)와 제10-0592489호(2006.06.15)등이 있으나, 잠사 추출물의 뇌신경질환 예방 및 치료 효과 및 기억력 증진 효과는 아직 보고된 바 없다.

따라서, 본 발명의 목적은 뇌신경질환을 효과적으로 예방 및 치료할 수 있는 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 기억력을 효과적으로 증진시킬 수 있는 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적에 따라, 본 발명에서는 활성성분으로서 잠사의 추출물을 약학적으로 허용되는 담체와 함께 포함하는 뇌신경질환의 예방 및 치료용 조성물이 제공된다.

상기 다른 목적에 따라, 본 발명에서는 잠사의 추출물을 약학적으로 허용되는 담체와 함께 포함하는 기억력 증진용 조성물이 제공된다.

본 발명의 잠사 추출물 및 생약재 함유 잠사 추출물은 신경세포의 성장 및 분화를 유도하고, 생존을 유지시키는 효과를 나타내어, 뇌신경질환 질환, 특히 퇴행성 뇌질환에 중요한 역할을 하는 신경세포 축색돌기 성장 촉진 및 신경세포성장인자의 역할을 대체할 수 있을 뿐만 아니라 독성이 없는 천연약제로 사용할 수 있다.

도 1a 및 1b는 C6 세포를 이용한 실시예 1에서 수득된 잠사 추출물(K1), k2(백복신) 및 실시예 2에서 수득된 생약재 함유 잠사 추출물(K3)의 신경성장인자(NGF) 분비율 및 세포생존률을 평가한 결과이다.
도 2a 및 2b는 일차배양 뇌신경교세포(primary microglia cell)를 이용한 잠사 추출물(K1) 및 생약재 함유 잠사 추출물(K3)의 NO(Nitric oxide) 생성율과 세포생존률을 평가한 결과이다.
도 3은 기관형적 해마 절편을 이용한 잠사추출물(K1) 및 생약재 함유 잠사 추출물(K3)의 프로피디움 요오드화물(PI) 검정 결과이다.
도 4는 ICR mice을 이용한 잠사추출물(K1) 및 생약재 함유 잠사 추출물(K3)의 수동 회피 시험 (passive avoidance test)에서 스코폴라민 (scopolamine)으로 유도된 건망증 모델에 대한 기억력 개선 효과를 평가한 결과이다.
도 5는 ICR mice을 이용한 잠사추출물(K1) 및 생약재 함유 잠사 추출물(K3)의 Y자형 미로 시험 (Y-maze test)에서 스코폴라민 (scopolamine)으로 유도된 건망증 모델에 대한 기억력 개선 효과(변경행동력 (a) 및 진입회수 (b))를 평가한 결과이다.
도 6은 ICR mice을 이용한 잠사 추출물(K1) 및 생약재 함유 잠사 추출물(K3)의 수동 회피 시험 (passive avoidance test)의 결과로서, 잠사 추출물(K1) 및 생약재 함유 잠사 추출물(K3)의 인지능력 향상 효과를 평가한 결과이다.
도 7은 ICR mice을 이용한 잠사 추출물(K1) 및 생약재 함유 잠사 추출물(K3)의 Y자형 미로 시험 (Y-maze test)의 결과로서, 잠사 추출물(K1) 및 생약재 함유 잠사 추출물(K3)의 인지능력 향상 효과(변경행동력 (a) 및 진입회수 (b))를 평가한 결과이다.

본 발명에 사용할 수 있는 잠사로서는 누에나방과 곤충 집누에나방(Bombyx mori L.)의 분변이 있다.

본 발명의 잠사 추출물은 잠사를 물 또는 유기용매로 추출하여 얻을 수 있는데, 물은 3차 증류한 증류수가 바람직하며, 유기용매로는 저급 알콜, 아세톤, 클로로포름, 메틸렌클로라이드, 에테르, 에틸아세테이트, 헥산 등을 예시할 수 있다. 저급 알콜로는 메탄올, 에탄올, 프로판올 및 부탄올을 예시할 수 있으며, 에탄올이 가장 바람직하다.

추출시에 잠사는 건조 잠사 또는 잠사 분말의 형태로 사용할 수 있는데, 잠사 분말을 사용하는 것이 바람직하며, 잠사를 수분 함량 5 % 이하가 되도록 건조한 후 입자 크기 0.6 mm 이하로 분쇄한 분말을 사용하는 것이 더욱 바람직하다.

구체적으로, 잠사 분말에 5 내지 15 배, 바람직하게는 10배의 물을 첨가하여 초음파 추출하여 잠사의 추출물을 제조할 수 있다. 잠사의 유기용매 추출물은 잠사 분말에 1 내지 5배, 바람직하게는 3배의 유기용매를 첨가하고 실온에서 추출한 후 여과하여 얻어진 여액을 감압농축하여 제조할 수 있다. 상기 추출방법들에서 추출공정은 필요에 따라 2회 이상, 바람직하게는 3회 반복하여 실시할 수 있다. 여과 후 얻어진 추출물을 감압건조시켜 분말 형태로 만들 수도 있다.

또한 본 발명의 조성물은 약리효과를 증진시키기 위해 약학적으로 허용되는 다른 생약재 또는 그의 추출물을 추가로 포함할 수 있다. 이 경우, 상기 추출방법에 따라 생약재의 추출물을 제조한 후 조성물에 가하거나 잠사와 생약재를 혼합한 후 상기 방법으로 추출하여 얻어진 추출물을 조성물에 포함시킬 수도 있다.

본 발명의 조성물에 추가될 수 있는 생약재는 약학적으로 허용되는 임의의 생약재일 수 있으며, 예를 들면, 잠사, 대황초, 차전자, 치자, 백복신 및 토사자를 단독 또는 배합하여 사용할 수 있다.

본 발명의 조성물은 잠사 추출물을 조성물 총 중량의 0.1 내지 100 중량%, 바람직하게는 1 내지 70 중량%, 가장 바람직하게는 10 내지 20 중량%의 양으로 포함할 수 있으며, 생약재 추출물은 조성물 총 중량의 0 내지 99.1 중량%, 바람직하게는 30 내지 70 중량%의 양으로 추가할 수 있다.

본 발명의 잠사 추출물은 신경세포의 분화 및 성장을 유도하고, 신경세포의 생존을 유지시킨다. 이러한 역할은 체내에서 합성되는 신경성장인자에 의해 수행되는 것으로, 상기 신경성장인자로는 신경성장인자(NGF; Nerve growth factor), 뇌유래 신경성장인자(BDNF; Brain-derived neurotrophic factor), 신경인자 (NT-3; Neurotrophin-3), NT-4 및 NT-5 등이 있다. 본 발명의 잠사 추출물은 신경성장인자의 역할을 수행할 수 있다. 또한 본 발명의 잠사 추출물은 체내 신경성장인자 단백질 및 신경성장인자 수용체의 합성을 증가시킨다.

따라서, 본 발명의 잠사 추출물은 신경세포의 성장, 분화 및 생존에 관련된 신경성 질환을 치료할 수 있는 치료제로 사용할 수 있다. 특히 신경세포 사멸에 의해 발생되는 뇌신경질환 치료 및 예방제로, 구체적으로는 뇌졸중, 파킨슨병, 노인성 치매 또는 알쯔하이머 등의 퇴행성 뇌질환에 대해 우수한 예방 및 치료 효과를 나타낸다.

또한, 본 발명의 조성물을 투여한 생쥐에서는 학습과 기억력 증진 효과가 현저하게 나타난다.

상기와 같은 유효성에도 불구하고, 잠사 추출물을 함유하는 본 발명의 조성물은 랫트를 사용한 시험에서 급성 독성 등의 독성을 전혀 나타내지 않으며 간 기능에 부작용을 보이지 않는다.

본 발명의 조성물을 이용하여 통상적인 방법에 따라 약학 제형을 제조할 수 있다. 제형의 제조에 있어, 활성 성분인 잠사 추출물을 담체와 함께 혼합 또는 희석하거나, 용기 형태의 담체내에 봉입시키는 것이 바람직하다. 담체가 희석제로 사용되는 경우에는 활성 성분에 대한 비히클, 부형제 또는 메디움으로 작용하는 고형, 반고형 또는 액상의 물질일 수 있다.

따라서, 제형은 정제, 환제, 분제, 새세이, 엘릭시르, 현탁제, 유제, 용액제, 시럽제, 에어로졸, 연질 또는 경질 젤라틴 캅셀제, 멸균 주사제, 멸균 분제 등의 형태일 수 있다. 적합한 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제형은 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제, 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다. 본 발명에 따른 조성물은 포유 동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 잘 알려진 방법을 사용하여 제형화될 수 있다.

본 발명에 따른 조성물은 경구, 경피, 피하, 정맥 또는 근육을 포함한 여러 경로를 통해 투여될 수 있다. 사람의 경우, 통상적인 1일 투여량은 5 내지 500 ㎎/㎏ 체중, 바람직하게는 100 내지 250 ㎎/㎏ 체중의 범위일 수 있고, 1회 또는 수회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나, 실제 투여량은 투여 경로, 환자의 연령, 성별 및 체중, 건강상태 및 질환의 중증도 등의 여러 관련 인자에 비추어 결정되어야 한다.

이하에서 본 발명을 실시예에 의거하여 보다 구체적으로 설명한다. 단, 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이로써 한정되는 것은 아니다.

또한, 하기 실시예에서 고체와 고체 혼합물, 액체와 액체, 및 액체와 고체에 대한 하기 백분율은 각각 중량/중량, 부피/부피 및 중량/부피에 기초한 것이며 특별한 언급이 없는 한 모든 반응은 실온에서 수행하였다.

실시예 1: 잠사 추출물의 제조

건조된 잠사(Silkworm Feces) 40g에 3차 증류된 증류수 500ml를 가한 후 3회 반복하여 초음파 추출하였다. 추출액을 여과한 다음 감압농축 및 건조하여 잠사의 수추출물 2.427g을 수득하였다(수율 6%).

실시예 2: 생약재가 함유된 잠사 추출물의 제조

잠사, 대황초, 차전자, 치자, 백복신, 토사자를 구입하여 1.5 : 0.5 : 1.5 : 1 : 1 : 1의 비율로 섞어 39g이 되게 한 다음, 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 초음파 추출을 3회 반복하여 생약재가 함유된 잠사 수추출물 2.329g을 수득하였다(수율 6%).

실시예 3: 잠사 추출물을 포함하는 조성물 제조

실시예 1 및 2에서 제조된 잠사의 수추출물 및 생약재가 포함된 잠사 수추출물을 PBS(Phosphate buffered saline pH 7.2) 완충용액에 용해시켜 최종농도가 1.0 ㎎/㎖이 되도록 한 후 1회용 주사기를 이용한 막여과지(0.2 ㎛, millipore)로 여과하여 무균화하고 감압 농축하여 조성물을 얻었다.

시험예 1: 잠사 추출물 및 생약재 함유 잠사 추출물의 신경성장인자 분비율 검정

(단계 1)

쥐의 뇌신경세포주인 C6 세포를 10% 소태아 혈청(FBS; Hyclone, South Logan, UT, USA)과 1% 페니실린/스트렙토마이신(GibcoBRL, Life Technologies Inc, Gaitherburg, MD, USA)이 포함된 DMEM(Hyclone) 배지를 배양액으로 하여 37℃, 5% CO₂ 조건에서 배양하였다.

(단계 2)

C6 세포를 24-웰 배양 플레이트(1ㅧ10⁵ cells/well)에서 1㎖ DMEM 배지와 함께 하룻밤 37℃, 5% CO₂ 조건으로 배양한 다음, 여러 농도(0.01, 0.1 및 1 ㎍/㎖)의 잠사 추출물 및 생약재 함유 잠사 추출물을 처리하여 24시간 동안 배양하였다. 하루 경과된 배지를 수거하여 원심분리기에서 조건을 7500rpm, 4℃, 5분으로 하여 돌려준 후, 상층액만 분리하여 Rat β-NGF kit(R&D systems, Duoset, Raf β-NGF)를 이용하여 정량하였다.

C6 세포에서 생성되는 신경성장인자 (NGF; Nerve growth factor)인 β-NGF의 양을 DuoSet (ELISA Development System R & D Systems)을 이용하여 측정하였다. 먼저 1x 인산염완충용액(PBS, pH 7.2-7.4)에 72 ㎍/㎖의 capture mAb를 희석하여 100 ㎕씩 96-웰 플레이트(Nunc coating plate)의 각 웰에 넣은 후 실온에서 하룻밤 반응시켰다. 이를 0.05% Tween-20이 포함된 1x PBS(PBS-T)로 3번 세척한 다음 1% 소혈청 알부민(BSA)이 포함된 희석용액(blocking solution)을 넣어 실온에서 1시간 반응시켜서 코팅되지 않은 부분을 차단(blocking)하였다. 희석용액(차단용액)을 제거한 다음, 약물을 처리하거나 처리하지 않고 배양한 세포 배양액과 여러 농도의 각 NGF에 대한 표준단백질을 100 ㎕씩 넣은 후 2시간 동안 실온에서 반응시켰다. 이를 3번 1x PBS-T로 세척하고 100 ng/㎖의 검출 mAb 100μl를 넣어 2시간 실온에서 반응시켰다. 반응이 끝난 플레이트는 1x PBS-T로 다시 3회 세척한 후에 스트레파비딘(Strepavidin)-HRP mAb를 넣고 20분간 실온에서 암반응시켰다. 이를 다시 1x PBS-T 용액으로 3회 세척하고 테트라메틸 벤시딘(tetramethyl bensidine, TMB) 기질용액을 넣어 20분 실온에서 암반응시켰다. 반응을 종료시키기 위해 2N H₂SO₄ 용액 50㎕를 첨가하고 마이크로플레이트 판독기로 450nm 및 540nm에서 흡광도를 측정하였다. 각 NGF의 농도는 표준단백질의 정량곡선을 기준으로 계산하였다. 이 때 대조군으로 무처리군을 사용하였다.

(단계 3) 잠사 추출물 및 생약재 함유 잠사 추출물의 MTT 검정

상기의 약물을 처리한 배지를 수거한 24-웰 배양 플레이트의 각 웰에 0.1㎎/㎖ 농도의 MTT 용액을 200㎕씩 넣고 1시간 동안 배양하면서 환원반응을 유도한 다음, MTT 용액을 제거하고 400㎕의 DMSO 용액 첨가하여 포르마잔(formazan) 결정을 완전히 용해하였다. 이것을 96-웰 플레이트에 200㎕씩 넣어 주었다. 발색정도는 마이크로플레이트 판독기를 이용하여 570 nm에서 흡광도를 측정하였다. 세포독성은 약물을 처리하지 않고 세포만 배양한 무처리구(control)의 100% 생존율을 기준으로 상대적인 세포생존률(cell viability; %)을 계산하였다. 이 결과를 도 1에 나타내었다. 도 1a 및 b는 C6 세포를 이용한 실시예 1에서 수득된 잠사 추출물(K1), k2(백복신) 및 실시예 2에서 수득된 생약재 함유 잠사 추출물(K3)의 신경성장인자(NGF) 분비율 및 세포생존률을 평가한 결과이다. 여기에서 보듯이, 본 발명의 잠사 추출물 및 생약재가 함유된 잠사 추출물은 대조군에 비해 신경성장인자 분비율이 높으며 이에 따라 세포생존률도 월등히 우수한 것을 알 수 있다.

시험예 2: 잠사 추출물 및 생약재 함유 잠사 추출물의 산화질소 측정

(단계 1)

일차배양 뇌신경교세포(primary microglia cell)는 오리엔트 바이오(Orient Bio, Kyunggido, Korea)에서 구입한 1일령 SD 쥐를 사용하여 실험하였다. 간략히 설명하면, 50℃에서 30분간 비동화된 10% 소태아 혈청(FBS), 1% HEPES, 1% 페니실린/스트렙토마이신, 1% L-글루타민이 첨가된 최소 필수 배지-α(MEM-α)에서 대뇌피질만 분리하여 파스퇴르 파이펫(Pasteur pipettes)으로 단일세포로 떨어뜨려준 후, 나일론 메쉬에 통과시켰다. 모두 통과시킨 후 75-㎠ 조직 배양 플라스크에 37℃, 5% CO₂ 조건으로 배양하였다.

(단계 2)

리포폴리사카라이드(Lipopolysaccharise, LPS; E. coli B0111 : B4 ; Sigma)에 의해 활성화된 소신경교세포(microglia)로부터 생성되는 활성질소종인 산화질소(NO)의 농도를 세포 배양액에 존재하는 NO₂-의 형태로 그리에스(Griess) 시약을 이용하여 검출하였다. 상기의 일차배양 뇌신경교세포(primary microglia cell)를 12일 동안 배양한 후, 뇌신경교세포를 분리하여 3×10⁴ cells/㎖농도로 96-웰 플레이트에 하룻밤 배양하고 잠사 추출물 및 생약재 함유 잠사 추출물을 다양한 농도로 처리한 다음 30분간 배양한 후 1 ㎍/㎖ LPS를 처리하여 24시간 배양하여 세포의 활성화(activation)를 유도하였다. 소신경교세포로부터 생성된 NO의 양은 세포배양액을 수거한 다음 배양액 100 ㎕에 그리에스 시약(0.1% NED & 1% sulfanilamide in 5% H₃PO₄) 100㎕를 넣고 15분간 암반응시킨 후 마이크로플레이트 판독기를 이용하여 570nm에서 흡광도를 측정하였다. 세포 배양액 내 NO의 농도(μM)는 NaNO₂ 표준액의 정량곡선을 기준으로 계산하였다.

(단계 3) 잠사 추출물 및 생약재 함유 잠사 추출물의 MTT 검정

상기의 약물을 처리한 96-웰 배양 플레이트의 각 웰에 1㎎/㎖ 농도의 MTT 용액을 배양액의 2배의 양을 각각 넣고 1시간 동안 배양하면서 환원반응을 유도한 다음, MTT 용액을 제거한 후 100㎕의 DMSO 용액 첨가하여 포르마잔 결정을 완전히 용해하였다. 발색정도를 마이크로플레이트 판독기를 이용하여 570nm에서 흡광도를 측정하였다. 세포독성은 약물을 처리하지 않고 세포만 배양한 무처리구(control)의 100% 생존율을 기준으로 상대적인 세포생존률(cell viability; %)을 계산하였다.

(단계 4) 산화질소 측정

리포폴리사카라이드(LPS; E. coli B0111 : B4 ; Sigma)에 의해 활성화된 소신경교세포로부터 생성되는 활성질소종인 산화질소(NO)의 농도를 세포 배양액에 존재하는 NO₂-의 형태로 그리에스 시약을 이용하여 검출하였다. 즉 소신경교세포를 3×10⁴ cells/㎖농도로 96-웰 플레이트에 하룻밤 배양하고 잠사 추출물 및생약재 함유 잠사 추출물을 다양한 농도로 처리한 다음 30분간 배양한 후 1 ㎍/㎖ LPS를 처리하여 24시간 배양하여 세포의 활성화(activation)를 유도하였다. 소신경교세포로부터 생성된 NO의 양은 세포배양액을 수거한 다음 배양액 100 ㎕에 그리에스 시약(0.1% NED & 1% sulfanilamide in 5% H₃PO₄) 100㎕를 넣고 15분간 암반응시킨 후 마이크로플레이트 판독기를 이용하여 570nm에서 흡광도를 측정하였다. 세포 배양액 내 NO의 농도(μM)는 NaNO₂ 표준액의 정량곡선을 기준으로 계산하였다.

그 결과를 도 2에 나타내었다. 도 2a 및 2b는 일차배양 뇌신경교세포(primary microglia cell)를 이용한 잠사 추출물(K1) 및 생약재 함유 잠사 추출물(K3)의 NO(Nitric oxide) 생성율과 세포생존률을 평가한 결과이다.

시험예 3: 잠사 추출물 및 생약재 함유 추출물의 프로피디움 요오드화물(Propidium iodide, PI) 검정

약물에 따른 효과를 보기 위해서 2주간 배양한 기관형적 해마 절편의 영양배지를 영양분이 없는 배지로 바꾸었다. 이 후에 약물처리는 100μM aβ, aβ +잠사추출물 및 생약재 함유 잠사 추출물 (10μg/ml and 1μg/ml)로 처리하였다. 이 때 각 배지에 잠사추출물 및 생약재 함유 잠사 추출물을 1시간 정도 전처리한 후에 100μM aβ을 처리하여 72시간에 관찰하였다. 관찰은 PI (5 μg /ml)를 각 배지에 넣고, 1-2시간 후에 PI 염색 이미지를 디지탈 CCD 카메라 (Axiocam, Zeiss, Oberko, Germany)가 형광현미경(fluorescence inverted microscope(Axiovert S 100, Zeiss, Oberko, Germany))으로 찍었다. 관찰된 PI 흡수 영역(uptake area)은 영상분석프로그램(Scion image beta 4.02 win, Scion Co., Maryland, USA)에 있는 ‘density slice’로 측정하고, 각 서브필드(subfield)에서 신경세포가 죽은 비율을 계산하였다. 도 3은 기관형적 해마 절편을 이용한 잠사 추출물(K1) 및 생약재 함유 잠사 추출물(K3)의 프로피디움 요오드화물(PI) 검정 결과이다.

시험예 4: 스코폴라민에 의해 유도된 건망증 모델에서의 잠사 추출물 및 생약재 함유 잠사 추출물의 인지능력 개선 효과

(단계 1)

수컷 ICR 마우스 (6주령, 25-28g)를 (주) 대한바이오링크 (Chungbuk, Korea)에서 공급받아 경희대학교 약학대학의 클린 케이지 (clean cage)에 5일 간 사육하여 적응시켜 사용하였으며, 물과 사료 ((주)대한바이오링크, Chungbuk, Korea)는 자유롭게 섭취하도록 하였고, 온도 (22±2 ℃), 습도 (53±3 %) 및 명암주기 (12 시간)는 자동적으로 조절되도록 하였다.

(단계 2)

마우스를 각 군당 10 마리씩 8 군으로 나누었다. 제1, 2군(대조군, 음성대조군)은 생리식염수를 마우스 체중 kg당 5 mL로 1일간 경구 투여하였고, 제3군(양성대조군)은 생리식염수에 녹인 도네페질 (donepezil)을 1 mg/kg의 양으로 1일간 경구　투여하였다. 제4, 5군은 생리식염수에 녹인 잠사 추출물을 각각 20, 100 mg/kg의 양으로 1일간 경구 투여하였고, 제 6, 7, 8군은 생리식염수에 녹인 생약재 함유 잠사 추출물을 각각 50, 100, 200 mg/kg의 양으로 1일간 경구 투여하였다. 1일 1회로 경구 투여하고 경구 투여 1 시간 후 수동 회피 시험(passive avoidance test) 및 Y자형 미로 시험 (Y-maze test)을 다음과 같이 수행하였다.

수동 회피 시험은 내부구조가 두 개의 동일한 공간으로 구분되어 있는 시험 장치에서 시행하였다. 약물투여 30분 후에 생리식염수 5 ml에 스코폴라민 1 mg을 녹여 이를 1 mg/kg의 용량으로 마우스에 복강 투여하고, 밝은 방은 불을 켜놓고 어두운 방은 불을 꺼놓은 상태에서 밝은 방에서 먼저 10초간 머무르게 한 후 길로틴문 (guillotine door)을 열어 어두운 방으로 들어갈 때까지의 시간을 측정하였다. 시험동물이 어두운 공간으로 이동하면 길로틴문이 닫히고 발바닥에 0.7 mA의 전기 자극을 3초간 주었다. 24 시간 후 같은 방법으로 수동 회피 시험을 진행하고 이때 밝은 곳에 머무르는 시간 (Latency time)을 측정하였다.

도 4는 ICR mice을 이용한 잠사추출물(K1) 및 생약재 함유 잠사 추출물(K3)의 수동 회피 시험 (passive avoidance test)에서 스코폴라민 (scopolamine)으로 유도된 건망증 모델에 대한 기억력 개선 효과를 평가한 결과이다. 여기에서 보듯이, 대조군은 266.56±14.17초를 나타내어 전기충격으로 인한 기억력이 유지된 것에 비해 음성대조군의 머무름 시간이 54.86ㅁ3.85초로 통계적으로 유의성 있게 감소하여 기억력이 감퇴되었다. 이러한 감소는 잠사 추출물 및 생약재 함유 잠사 추출물의 투여에 의해 증가하였고 특히, 생약재 함유 잠사 추출물 100 mg/kg 투여군은 158.79ㅁ11.44초를 나타내어 머무름 시간을 유의성 있게 증가시킴으로써 기억력을 개선시켰다.

Y자형 미로 시험은 120ㅀ 간격으로 3개의 가지 (arm)가 있고 각 가지의 길이가 40cm, 높이 12cm, 간격 3cm인 실험장치에서 시행하였다. 약물투여 30분 후에 생리식염수 5 ml에 스코폴라민 1 mg을 녹여 이를 1 mg/kg의 용량으로 마우스에 복강 투여하고, 실험장치의 각 가지를 A, B, C로 정한 후 실험동물을 한 쪽 가지에 놓고 다른 가지로 이동하는 순서를 기록하며 8분간 관찰한다. 이 때 꼬리까지 완전히 들어갔을 경우에 한하며, 갔던 가지에 다시 들어간 경우에도 기록하였다. 결과값은 변경 행동력 (spontaneous alternation, %) = {실제변경 (actual alternation) / 진입횟수 (total arm entries) - 2} x 100로 하여 측정한다.

도 5는 ICR mice을 이용한 잠사추출물(K1) 및 생약재 함유 잠사 추출물(K3)의 Y자형 미로 시험 (Y-maze test)에서 스코폴라민 (scopolamine)으로 유도된 건망증 모델에 대한 기억력 개선 효과(변경 행동력 (a) 및 진입횟수 (b))를 평가한 결과이다. 여기에서 보듯이, 대조군이 73.58±2.04 %의 변경 행동력을 나타내는 것에 비해 스코폴라민의 투여에 의해 변경 행동력이 통계적으로 유의성 있게 감소하였다(52.48±2.79 %). 이러한 변경 행동력의 감소는 생약재 함유 잠사 추출물의 투여에 의해 통계적으로 유의성 있게 증가하였다. 변경 행동력이 증가한다는 것은 학습 및 기억력이 회복되었다는 것을 의미하는 반면, 각 가지로 들어가는 총 횟수를 나타내는 진입횟수에는 변화가 없는 것으로 나타나 변경 행동력이 마우스의 활동성 변화에 의해 나타난 것이 아님을 알 수 있었다.

시험예 5: 잠사 추출물 및 생약재 함유 잠사 추출물의 인지능력 향상 효과

마우스를 각 군당 10 마리씩 7 군으로 나누었다. 제1군(대조군)은 생리식염수를 마우스 체중 kg당 5 mL로 7일간 경구 투여하였고, 제2, 3군은 생리식염수에 녹인 잠사 추출물을 각각 20, 100 mg/kg의 양으로 7일간 경구 투여하였다. 제5, 6, 7군은 생리식염수에 녹인 생약재 함유 잠사 추출물을 50, 100, 200 mg/kg의 양으로 7일간 경구 투여하였다. 1일 1회로 경구 투여하고 경구 투여 1 시간 후 Y자형 미로 시험 (Y-maze test) 및 수동 회피 시험(passive avoidance test)을 시험예 4-1의 스코폴라민의 복강 투여를 제외하고 동일한 방법으로 수행하였다.

도 6은 ICR mice을 이용한 잠사 추출물(K1) 및 생약재 함유 잠사 추출물(K3)의 수동 회피 시험 (passive avoidance test)의 결과로서, 잠사추출물(K1) 및 생약재 함유 잠사 추출물(K3)의 인지능력 향상 효과를 평가한 결과이다. 여기에서 보듯이, 수동 회피 시험에서, 대조군은 116.44±5.61초를 나타내어 전기충격으로 인한 기억력이 유지되었고 잠사 추출물 100 mg/kg 투여군을 제외한 모든 약물 투여군에서 대조군에 비해 통계적으로 유의성 있게 머무름 시간을 증가시킴으로써 기억력을 향상시켰다. 특히, 생약재 함유 잠사 추출물 200 mg/kg 투여군은 296.50±42.50초를 나타내어 대조군의 2배 정도의 기억력 향상 효과를 보였다.

도 7은 ICR mice을 이용한 잠사 추출물(K1) 및 생약재 함유 잠사 추출물물(K3)의 Y자형 미로 시험 (Y-maze test)의 결과로서, 잠사 추출물(K1) 및 생약재 함유 잠사 추출물(K3)의 인지능력 향상 효과(변경 행동력 (a) 및 진입횟수 (b))를 평가한 결과이다. 여기에서 보듯이, Y자형 미로 시험에서, 대조군은 73.58±2.04 %의 변경 행동력을 나타냈고 잠사 추출물 20 mg/kg과 생약재 함유 잠사 추출물 100 mg/kg 투여군은 각각 62.74±2.76, 67.84±2.13 %의 변경 행동력을 나타내어 대조군에 비해 통계적으로 유의성 있게 증가하였다. 반면, 각 가지로 들어가는 총 횟수를 나타내는 진입횟수에는 변화가 없는 것으로 나타나 변경 행동력이 마우스의 활동성 변화에 의해 나타난 것이 아님을 알 수 있었다.

제제 실시예

본 발명의 조성물은 단독으로 또는 약제학적으로 사용되는 부형제들과 함께 통상의 방법에 따라 다양한 제제 형태로 제제화할 수 있다. 하기에 제제예를 예시하나, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.

<제제예 1> 산제의 제조

잠사 추출물 2 g

유당 1 g

상기의 성분을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조하였다.

<제제예 2> 정제의 제조

잠사 추출물 100 ㎎

옥수수전분 100 ㎎

유 당 100 ㎎

스테아린산 마그네슘 2 ㎎

상기의 성분을 혼합한 후 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조하였다.

<제제예 3> 캡슐제의 제조

잠사 추출물 100 ㎎

옥수수전분 100 ㎎

유 당 100 ㎎

스테아린산 마그네슘 2 ㎎

상기의 성분을 혼합한 후 통상의 젤라틴 캡슐의 제조방법에 따라서 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조하였다.

<제제예 4> 주사제의 제조

잠사 추출물 100 ㎎

주사용 증류수 적량

pH 조절제 적량

통상의 주사제의 제조방법에 따라 활성성분을 주사용 증류수에 용해하고 pH를 약 7.5로 조절한 다음 전체를 주사용 증류수로 2 ㎖ 용량의 앰플에 충진하고 멸균시켜서 주사제를 제조하였다.

상술한 바와 같이 잠사 추출물 및 생약재 함유 잠사 추출물은 신경세포의 성장 및 분화를 유도하고, 생존을 유지시키는 효과를 나타내어 뇌신경질환, 특히 퇴행성 뇌질환의 예방 및 치료제로서 또한 기억력 증진제로서 유용하게 사용될 수 있다.

Claims (14)

1. 잠사 추출물 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 뇌신경질환의 예방 또는 치료용 조성물.
   
2. 잠사 추출물 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 기억력 증진용 조성물.
   
3. 제 1 항에 있어서,
   뇌신경질환이 퇴행성 뇌질환인 것을 특징으로 하는 조성물.
   
4. 제 3 항에 있어서,
   퇴행성 뇌질환이 뇌졸중, 파킨슨씨병, 노인성 치매 또는 알쯔하이머인 것을 특징으로 하는 조성물.
   
5. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
   잠사가 누에나방 또는 곤충 집누에나방(Bombyx mori L.)의 분변인 것을 특징으로 하는 조성물.
   
6. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
   잠사 추출물이 잠사를 물 또는 유기용매로 추출한 것인 조성물.
   
7. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
   잠사 추출물이 잠사 분말에 5 내지 15 배의 3차 증류된 증류수를 가하고 3회 초음파 추출하여 수득된 것임을 특징으로 하는 조성물.
   
8. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
   약학적으로 허용되는 생약재 또는 이의 추출물을 추가로 포함하는 조성물.
   
9. 제 8 항에 있어서,
   생약재가 대황초, 차전자, 치자, 백복신 및 토사자로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는 조성물.
   
10. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    잠사 추출물을 0.1 내지 100 중량%의 양으로 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
    
11. 제 10 항에 있어서,
    잠사 추출물을 10 내지 20 중량%의 양으로 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
    
12. 제 8 항에 있어서,
    생약재 추출물을 조성물 총 중량의 0 내지 99.1 중량%의 양으로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
    
13. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    정제, 환제, 분제, 새세이, 엘릭시르, 현탁제, 유제, 용액제, 시럽제, 에어로졸, 연질 또는 경질 젤라틴 캅셀제, 멸균 주사제 또는 멸균 분제의 형태인 조성물.
    
14. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    잠사 추출물의 1일 투여량은 체중 1 kg당 5 mg 내지 500 mg인 것을 특징으로 하는 조성물.

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