KR100500700B1

KR100500700B1 - 갈조류를 원료로 하는 고순도 라미나란의 제조방법

Info

Publication number: KR100500700B1
Application number: KR10-2003-0065522A
Authority: KR
Inventors: 김영명; 김동수; 도정룡; 최용석
Original assignee: 한국식품연구원
Priority date: 2003-09-22
Filing date: 2003-09-22
Publication date: 2005-07-12
Also published as: KR20050029759A

Abstract

본 발명은 라미나란 함유 갈조류의 건조분말을 산성 또는 중성 용액으로 추출하는 단계; 상기 갈조류 추출액에 저급알코올을 가하여 조라미나란을 침전시키는 단계; 조라미나란 침전물의 수용액에 4급 암모늄염 용액을 가하여 불용성 산성다당 침전물과 가용성 중성다당 상등액으로 정치분리하는 단계; 상기 중성다당 용액에 저급알코올을 가하여 라미나란을 침전시키는 단계; 및 잔존 염류와 저분자 불순물을 제거한 후 건조하는 단계를 포함하는 라미나란의 제조방법을 제공한다.

Description

갈조류를 원료로 하는 고순도 라미나란의 제조방법{Preparation Method of Purified Laminaran from Brown Algae}

본 발명은 갈조류 추출액으로부터 고순도 라미나란을 제조하는 방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 라미나란 함유 갈조류 원료를 라미나란 함유 갈조류의 건조분말을 산성 또는 중성 용액으로 추출하는 단계; 상기 갈조류 추출액에 저급알코올을 가하여 조라미나란을 침전시키는 단계; 조라미나란 침전물의 수용액에 4급 암모늄염 용액을 가하여 불용성 산성다당 침전물과 가용성 중성다당 상등액으로 정치분리하는 단계; 상기 중성다당 용액에 저급알코올을 가하여 라미나란을 침전시키는 단계; 및 잔존 염류와 저분자 불순물을 제거한 후 건조하는 단계를 포함하는 라미나란의 제조방법에 관한 것이다.

라미나란(Laminaran)은 하기 화학구조식에서와 같이 갈조류에 다량 함유되어 있는 저장다당인 β-1,3-글루칸을 기본 구조로 하며, 1,6 사슬결합을 함유하고 있는 직쇄상의 중성 다당이다.

이와 같은 라미나란은 현재 어류의 면역 활성 인자로 활발히 연구되고 있으나 식품으로서의 연구는 거의 전무하다. 라미나란과 유사한 다당으로는 현재 일본에서 항암제의 보조제로 사용하고 있는 스키조필란(schizophyllan) 등이 있으며, 이들은 강한 면역증진작용이 보고 되고 있다. 또한, 효모 및 버섯류에도 알려져 있는 강한 면역 활성은 β-글루칸에 기인하는 것으로 알려져 있다. 현재까지 β-1,3-글루칸(1,6 사슬함유)과 관련하여 보고된 바에 의하면, 다당의 사슬의 3중 헬릭스(helix) 구조 여부, 1,6 결합 사슬의 치환 위치 및 분자량의 크기에 따라 활성의 차이가 매우 큰 것으로 알려져 있으며, 이들 다당의 면역활성은 비특이 면역세포인 매크로파지(macrophage)의 활성이 주요 요인인 것으로 여겨진다. 이와 같은 생리활성 특성을 갖는 β-글루칸인 라미나란은 국내 연안에 대량 번식하거나 양식에 의해 대량 생산되고 있는 다시마, 미역, 감태, 대황 등 각종 갈조류에 다량 함유되어 있는 것으로 알려지고 있다. 하지만, 아직까지 함량분석 수준의 기초적 연구에 그치고 있을 뿐 생리활성 소재로서 항암소재 등에 제공될 수 있을 정도의 효과적인 분리 정제방법은 개발되고 있지 못한 실정이다.

라미나란의 분리 정제와 관련한 종래의 연구로서는 주요 갈조류를 대상으로 한 조라미나란(Crude laminaran)의 함량을 분석 조사한 선행 연구결과(표 2, Black, 1965)가 있으나 이들 연구에 의한 조라미나란은 다량의 우론산과 황산기 등 산성당 및 무기질과 단백질 등 불순물을 다량 함유하고 있어 라미나란의 특성 발현을 기대하기 어려운 문제점이 있다.

<표 1 > 조라미나란(Crude laminaran)의 수율 및 일반성분 조성(％)

		미역	다시마	곰피	대황	톳
수율		2.6	11.3	11.0	19.6	9.4
회분		42.4	28.8	31.0	7.5	39.3
단백질		1.7	2.5	17.2	14.0	12.6
총당		51.2	66.2	52.2	82.3	43.0
우론산		17.2	21.3	11.9	8.9	9.9
황산기		9.1	9.7	17.5	3.5	11.4
구성당	Fuc	25.0	22.1	28.7	3.1	27.3
	Rib	0.0	0.0	0.0	0.0	0.0
	Xyl	0.0	3.2	3.7	0.0	0.0
	Man	58.8	59.7	16.5	4.9	7.4
	Gal	16.2	9.1	8.8	8.5	49.6
	Glc	0.0	5.8	42.4	83.5	15.7

조라미나란의 추출 및 정제방법에 관한 종래의 연구로서 가장 보편적으로 알려진 방법은 라미나란을 함유한 갈조류의 건조분말을 0.09N HCl 용액으로 20℃에서 2시간 동안 교반하여 추출한 후 원심분리(8,000g×10분)시켜 잔사는 다시 0.05N HCl 용액으로 2차 추출한 후 원심분리하여 얻은 상층액을 모액과 합한 후 여기에 에탄올을 가하여 조라미나란을 침전시켜 조라미나란 수용액을 얻을 수 있으며, 이렇게 얻은 조라미나란의 수용액을 강산성 양이온교환수지인 Zeo-Karb 225(H⁺) 컬럼으로 처리하여 분리 용출된 액에 에탄올을 가하여 정제한 라미나란을 침전시킨 후 다시 에탄올과 에테르로 수세하고 감압 건조하여 정제 라미나란을 얻는 방법[W.A.P. Black, Methods carbohyd. Chem., 5, 159, (1965)]이 보고되어 있으나, 처리공정의 번거로움, 높은 처리비용, 분리정제된 라미나란의 낮은 순도 등의 품질상의 문제점을 내포하고 있는 것으로 알려지고 있다.

이외에도 갈조류의 건조분말을 포름알데히드(1ml/L)를 함유한 0.4％ 염산 1L에 담그고 4시간 동안 실온에 보관하고, 조류를 짜내어 0.5L 물에 담궈 50∼60℃에서 3시간 동안 가열하는 방법으로 조라미나란 추출물을 얻은 후 폴리크롬-1 이라는 특별한 이온교환 수지로 라마나란만을 분리 정제하는 공정 특허(T.N. Zvyagintseva, E.V. Sundukova, L.A. Elyakova, Russian Federation Patent no. 1642725. Chem. Abstr., 126(1997) 590. 특허)가 보고되어 있으나 처리 공정 비용, 안전성 및 정 라미나란의 품질 측면에서 상당한 문제점을 내포하고 있어 산업적 적용성이 낮은 문제점이 있었다.

이 외에도, 갈조류 해조류를 인산염 용액으로 추출한 후 알칼리탄산염 또는 가성알칼리를 가하여 인산의 알칼리금속염으로 변화시켜 용액의 pH 값을 변화시킴으로써 알칼리 금속염 용액의 pH 값에 따른 해조 다당성분들의 용해도 차이에 의하여 연속적으로 후코이단과 라미나란을 분리한 다음 최종적으로 묽은 탄산나트륨용액을 가하여 알긴산을 추출하는 처리공정에 관한 선행 기술(후코이단과 라미나란 및 알긴산의 단리 및 조알긴산의 정제법, 한국특허 1981-0000029, 1981년 2월 2일)이 보고된 바 있으나, 이 기술에 의하면 분리된 다당류의 순도가 지나치게 낮아 다당류 특성 발현을 기대하기 어려운 문제점이 있었다.

본 발명은 상기한 바와 같이 종래기술이 지니는 문제를 해결하기 위해 안출된 것으로, 그 목적은 라미나란 함유 해조류로부터 산성다당 등 불순물의 함량이 낮은 고순도의 라미나란을 효과적으로 제조하는 방법을 제공함에 있다.

상기한 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 (1) 라미나란 함유 갈조류의 건조분말을 산성 또는 중성 용액으로 추출하는 단계; (2) 상기 갈조류 추출액에 저급알코올을 가하여 조라미나란을 침전시키는 단계; (3) 조라미나란 침전물의 수용액에 4급 암모늄염 용액을 가하여 불용성 산성다당 침전물과 가용성 중성다당 상등액으로 정치분리하는 단계; (4) 상기 중성다당 용액에 저급알코올을 가하여 라미나란을 침전시키는 단계; 및 (5) 잔존 염류와 저분자 불순물을 제거한 후 건조하는 단계를 포함하는 라미나란의 제조방법을 제공한다.

상기 단계 (1)은 갈조류를 추출하기 이전 단계로 갈조류 원료를 담수로 세척건조하여 입도 20∼80메쉬 크기로 분쇄한 후 60∼150℃를 유지하여 열처리하는 단계를 구비하는 것이 바람직하다.

상기 단계 (1)은 갈조류 건조분말을 pH 2.0 ∼ 8.0의 용액으로 20 ∼ 60℃에서 추출하는 과정을 포함하는 것이 바람직하다.

상기 단계 (2)는 저급알코올은 에탄올 또는 95％ 이상의 에탄올을 포함하는 주정으로 함이 바람직하다.

상기 단계 (3)의 4급암모늄 염류는 특별한 한정을 요하는 것은 아니나, 세틸피리디니움 클로라이드, 세틸피리디니움 브로마이드, 세틸트리메틸암모니움 브로마이드에서 선택되어지는 것이 바람직하다.

상기 단계 (3)은 조라미나란 수용액에 0.2∼10％의 4급암모늄 용액을 가하여 10∼50℃에서 교반하는 과정을 포함하는 것이 바람직하다.

상기 단계 (4)의 저급알코올은 에탄올 또는 95％ 이상의 에탄올을 포함하는 주정으로 하는 것이 바람직하다

상기 단계 (4)의 저분자 불순물은 5000달톤 이하인 것으로 함이 바람직하다.

이하 발명의 내용을 바람직한 정제예를 통해 보다 상세하게 설명하면 다음과 같다.

상기 단계 (1)의 추출단계는 바람직하게는, 라미나란 함유 갈조류 원료를 담수로 세척하고 건조하여 입도 20∼80메쉬 크기로 분쇄한 후 60∼150℃에서 2∼30분간 유지시키는 1차 열처리단계를 수행하고, 상기 1차 열처리를 마친 갈조류 분말을 20∼60배량의 pH 2.0 ∼ 8.0의 용액으로 20 ∼ 60℃에서 1∼6시간 추출한 후 원심분리하거나 여과하여 추출액과 잔사로 분리하고 잔사를 동일한 용액으로 1∼2회 다시 추출한 후 원심분리 또는 여과하여 추출액을 얻는 과정에 의해 달성될 수 있다.

상기 단계 (2)의 조라미나란의 침전단계는 바람직하게는, 상기 단계 (1)의 추출액에 1∼5배량의 저급알콜, 바람직하게는 에탄올을 가하여 조라미나란을 침전시켜 조라미나란을 얻는 과정에 의해 달성될 수 있다.

상기 단계 (3)의 가용성 중성다당 용액을 획득하는 단계는 바람직하게는, 0.1∼10％의 조라미나란 수용액에 0.2∼10％의 CPC(세틸피리디니움 클로라이드) 등 4급 암모늄용액을 가하여 10∼50℃에서 30분∼6시간 동안 교반하여 CPC 등 4급 암모늄염과 결합하는 산성다당의 불용성염 침전물과 중성다당의 상등액으로 정치 분액한 후 여과하거나 원심분리하여 중성다당과 산성다당으로 분리하는 단계를 통해 달성될 수 있다.

상기 단계 (4)의 라미나란의 침전단계 및 단계 (5)의 건조단계는 단계 (3)에서 얻은 중성다당용액에 1∼5배량의 저급 알코올, 바람직하게는 에탄올을 가하여 라미나란을 침전시킨 다음 여과하여 얻은 라미나란을 증류수에 용해한 후 투석(MWCO 5,000)하거나 한외여과하여 잔존 염류와 저분자 불순물을 제거시킨 후 건조하는 단계를 통해 달성될 수 있다. (도 1 참조)

상기에서 언급한 본 발명의 갈조류로부터 고순도 라미나란의 분리정제방법을 공정에 따라 더욱 상세하게 설명하기로 한다.

1. 원료 해조류의 선별

원료 해조류로서는 라미나란 함량이 많은 갈조류가 이용된다. 이러한 갈조류로는 다시마, 미역, 곰피, 감태, 대황, 톳, 모지반 등이 있으며, 바람직하게는 조체중의 다당류 함량이 높은 시기의 것을 채취한다. 그런 다음, 노쇄옆, 미성숙 조체 등을 선별 제거한 후 담수로 세척하고, 수분함량 15％ 이하가 되도록 충분히 건조하여 저장한 것을 원료로 사용한다. 원료의 종류에 따라 감태, 대황 등은 채취 시기와 조체성분 함량의 차이가 크지 않으나 미역과 다시마 등 여타 갈조류는 성숙도에 따른 조체중의 다당함량의 차이가 큰 편이므로 가능한 한 조체가 충분히 성숙한 시기에 채취한 원료를 사용하는 것이 좋다.

2. 원료 해조류의 분쇄 및 열처리

건조한 해조류는 20∼80메쉬의 입도가 되도록 조분쇄한 후 60∼150℃에서 2∼30분간 가열처리하여 엽록소 및 단백질 성분을 응고시켜 이후 추출공정에서 수용성 당질 성분의 추출을 용이하게 한다.

3. 1차 추출

원료해조분말에 20∼60배량의 산성 또는 중성용액(pH 2.0∼8.0 수준의 천연수 또는 식품공업용 염산이나 유기산의 희박한 용액)을 가한 후 20∼60℃에서 1∼6시간 교반 추출하여 함유 다당성분을 추출시킨 후 원심분리(3,000g×10분) 또는 여과하여 1차 추출액과 잔사를 얻는다.

4. 2차 추출

1차 추출에서 얻은 잔사를 원료로 하여 1차 추출과 동일한 조건으로 추출한 후 원심분리 또는 여과하여 2차 추출액과 잔사를 얻는다.

5. 알콜침전

1차 추출액과 2차 추출액을 합한 후 1∼5배량의 에탄올(또는 알콜농도 95％ 이상의 주정)을 가하고 정치하여 추출액 중의 산성다당과 중성다당으로 이루어진 고분자획분을 침전시킨다. 이때 지용성 색소 및 각종 저분자 물질들은 침전되지 않은 채 상층액 중에 용존상태로 존재하게 된다.

6. 조라미나란의 회수

알콜침전에 의해 얻은 고분자 획분을 원심분리(3,000g×10분) 또는 여과하여 대부분 산성다당과 중성다당으로 이루어진 조라미나란을 회수한다. 회수한 조라미나란은 건조(60℃ 이하에서 열풍건조, 감압건조 또는 진공동결건조) 하여 잔존하는 에탄올 성분을 휘발 제거시킨다.

7. 조란미나란의 가용화

물을 가하여 고형물 함량 1∼10％ 농도의 조라미나란 수용액을 만든다.

8. 라미나란의 분리정제

조라미나란 수용액에 1∼8％ 농도의 4급 암모늄 염류용액(CPC: 세틸피리디니움 클로라이드, C₂₁H₃₈ClN.H₂₀, FW 358.0)을 가하고 20∼40℃에서 30분∼5시간 동안 교반 반응시키므로서 수용액중에 공존하는 산성 다당성분과 결합하여 만들어진 불용성 침전물과 상층액인 중성다당성분으로 분리한 후 여과하고 여액에 1∼5배량의 에탄올을 가하여 중성다당인 라미나란을 분리 침전시킨다. 이때 산성다당과의 결합반응 촉진물질로 사용되는 4급암모늄 염류로서는 상기 CPC 외에 CTAB(세틸트리메틸암모니움 브로마이드: CH₃(CH₂)15N(Br)(CH3)_3,FW364.5)나 CPB(세틸피리디니움 브로마이드: C₂₁H₃₈NBr,FW 384.4)도 사용될 수 있다.

9. 정제라미나란으로부터 미량의 불순물 제거

산성다당과 분리하여 얻은 라미나란을 증류수에 용해한 후 투석막(MWCO 5,000)을 사용하여 유수중에서 5∼24시간 투석하거나 한외여과하여 잔존하는 미량의 염류 등 각종 저분자 불순물질을 제거한 후 건조 또는 동결건조하여 순수 라미나란을 얻는다.

이하 본 발명의 내용을 실시예에 의해 보다 상세하게 설명하기로 한다. 다만 이들 실시예는 본 발명의 내용을 이해하기 위해 제시되는 것일 뿐 본 발명의 권리범위가 이들 실시예에 한정되어지는 것으로 해석되어져서는 아니된다.

<실시예 1> : 다시마로부터 조라미나란의 추출

본 실시예는 갈조류로부터 고순도 라미나란을 분리 정제함에 있어 다시마를 원료로 한 라미나란의 분리공정에 관한 것이다. 신선한 상태의 양식다시마(2002년 7월 완도산, 폭 25cm, 길이 1.8m, 두께 3mm 내외)를 원료로 하여 5kg을 75L의 청정한 담수중에 침지하고 가끔 교반하면서 3시간 동한 침지하여 탈염시켰다. 그런 다음, 60℃의 열풍건조기로 4시간 건조하고 이를 조분쇄하여 수분함량 12％, 입도 30메쉬의 건조다시마분말 550g을 얻었다. 건조다시마 분말 500g에 pH 3.0의 염산용액 15L을 가한 후 20℃에서 4시간 교반 침출하고 원심분리하고 그 잔사를 동일한 조건으로 2차 추출하였다. 2차 추출로 얻은 산성 추출액 약 22L에 60L의 주정을 가하여 조라미나란을 침전시켰으며 침전물을 3,000g에서 10분간 원심분리하고 동결건조하여 수분함량 2.5％의 조라미나란 51.5g을 얻었다.

<실시예 2> 라미나란의 정제

본 실시예는 감태를 원료로 하여 얻은 조라미나란으로부터 순수 라미나란을 분리정제하는 공정을 개시한다. 탈염 건조 세절한 감태분말 500g에 pH 3.0의 식품공업용 염산용액 18L를 가한 후 25℃에서 3시간 교반 침출한 후 원심분리하는 공정을 2회 반복하였다. 원심분리하여 얻은 1차 및 2차 산성 해조추출액 약 30L에 95％ 에탄올(주정) 80L을 가하고 실온에서 교반 정치하여 조라미나란을 침전시켰다. 침전물을 여과포로 여과하고 동결건조하여 조라미나란 57g을 얻었다. 이어서 물 1.5L에 조라미나란을 용해한 후 4가 암모늄염의 일종인 CPC 5％ 용액을 침전이 형성되지 않을 때까지 가한 다음 35℃에서 3시간 교반하여 침전물인 산성다당과 상층액인 중성다당으로 분리하였다. 그런 다음, 여과포로 여과하고 상기 여과액에 3배량의 에탄올을 가하여 라미나란을 침전시켰다. 이 라미나란을 소량의 증류수에 용해한 후 12시간 투석(MWCO 5,000)하고 동결 건조하여 정제 라미나란 23.5g을 얻었다.

<실험예 1> 추출용매 비율별 추출 수율

라미나란 함유 해조류로부터 라미나란을 추출함에 있어 적정 추출 용매비율 및 추출횟수를 결정하기 위해 다음과 같이 추출시험을 수행하였다. 즉, 분쇄한 해조류(다시마) 시료에 시료와 용매의 비율이 1:20 ∼ 1:50 (w/v)이 되도록 희석한 염산(pH 2)용액을 가한 후 20℃에서 3시간동안 교반 추출하였다. 추출물을 1차 여과포(Filter cloth) 및 2차 여과용 패드(Filter pad)를 사용하여 감압 여과하여 1차 추출물을 얻었다. 여과 잔사를 1차 추출과 동일한 조건으로 2차 및 3차 추출을 수행하였다. 그리고 각각의 추출액에 3배량의 에탄올을 가해 하룻밤 정치시킨 후 원심분리(3,000g×15분)하였다. 침전된 조라미나란을 소량의 증류수에 용해시키고 동결 건조하여 조라미나란을 제조한 후 추출조건별 수율을 조사한 결과 추출용매의 비가 1:20, 1:30, 1:40 및 1:50일 때 1차, 2차 및 3차 추출액을 합한 전체 조라미나란의 수율은 각각 15.7％, 23.9％, 23.8％, 24.9％로 추출용매비율 1:30에서 대부분의 라미나란이 추출되었으며 추출수용매의 비율이 1:30 이상에서는 추출수율의 증가가 미미하였다.

추출횟수에 따른 조라미나란의 수율은 시료에 대한 추출용매비가 1:20, 1:30, 1:40, 1:50일 경우, 1차 추출시 각각 전체 수율의 56.7％, 48.5％, 52.5％, 52.2％가 추출되었고, 2차 추출시 각각 30.6％, 38.5％, 35.3％, 39.4％였으며, 3차 추출할 때 8.4∼13.0％로 거의 대부분이 1, 2차에서 추출됨을 알 수 있었다.

이상의 결과로 볼 때 추출 수율과 추출 소요시간을 고려할 때 추출용매 비율 1:30 ∼ 1:40에서 2회 추출하는 것이 적당한 것으로 생각되었다. (도 2, 표 2 참조)

<표 2> 건조다시마의 추출용매 비율 및 추출회수별 조미나란의 추출수율(％)

추출수율	다시마 : 추출용매 비율(W/V)
추출수율	1 : 20	1 : 30	1 : 40	1 : 50
1차 추출수율	8.9	11.6	12.5	13.0
2차 추출수율	4.8	9.2	8.4	9.8
3차 추출수율	2.0	3.1	2.9	2.1
Total 수율	15.7	23.9	23.8	24.9

<실험예 2> 추출시간의 검토

갈조류로부터 최적의 추출시간을 설정하기 위해서 추출시간을 2∼5시간으로 달리하면서 조라미나란을 제조하고 수율을 검토하였다. 즉, 추출 용매비는 1:40, 추출 온도는 30℃, 그리고 추출 pH는 pH 2로 일정하게 하고 추출시간을 2∼5시간으로 달리하면서 조라미나란을 제조하여 수율을 검토하였다. 추출 2시간째의 수율이 7.7％였으며, 추출 3, 4, 5시간째의 수율이 각각 12.4％, 12.7％, 12.9％로 추출 3시간째에 수율이 급격히 증가하고 그 이후에는 소량씩 증가하였으나 큰 증가차이는 없었다. 따라서 3시간 추출하는 것이 가장 단시간에 효과적으로 추출할 수 있을 것으로 보인다. (도 3참조)

<실험예 3> 조라미나란 추출수율에 미치는 pH의 영향

갈조류로부터 pH를 달리하면서 추출하였을 때 조라미나란의 추출 수율과 화학적 조성을 살펴보았다. 즉, 추출용매비율을 1:40으로 하고 30℃에서 추출시간을 3시간 일정하게 조절한 다음 pH를 달리하면서 추출시험을 수행한 결과 도 4에서와 같이 pH를 1∼7로 각각 달리 추출하였을 때 조라미나란의 추출수율은 각각 10.3％, 14.5％, 15.8％, 11.0％, 8.5％, 7.8％ 및 7.2％로 나타나므로서 pH 3에서 추출하였을 때 추출수율이 가장 높았다. pH 7.0의 중성 pH 영역에서 산성영역으로 갈수록 가수분해로 인하여 추출수율이 증가하다가 pH 3 이하부터는 가수분해가 과도하게 진행되어 추출 수율이 오히려 감소하는 경향을 보였다. 이처럼 중성영역보다 산성영역에서 조라미나란의 추출수율이 높으나 강산성 영역에서는 다시 추출수율이 감소하는 경향은 조라미나란이 상당량의 산성다당류(Fucose 함유 다당)를 함유하고 하고 있는 것과 관련이 있으며 이 때문에 원료 해조류의 성분 조성과도 밀접한 관련이 있을 것으로 사료된다.

<실험예 4> 조라미나란 추출수율에 미치는 추출온도의 영향

갈조류에 속하는 대황을 원료로 하여 추출 온도를 달리하면서 추출하였을 때 조라미나란의 수율과 화학적 조성을 살펴보았다. 즉, 추출용매비를 1:40으로 하고 pH 3에서 추출시간을 3시간으로 일정하게 조절한 다음 pH를 달리하면서 추출한 결과 하기 표 4에서와 같이 조라미나란의 추출수율은 50℃에서 추출했을 때 14.3％로 가장 좋았고 30∼70℃까지 수율에는 큰차이 없이 소량 증가하다가 감소하였다. 그리고 80℃이상부터 고온으로 갈수록 수율이 감소하였는데 이는 가수분해로 인한 추출성분의 과분해로 보인다.

또한, 추출온도가 높을수록 추출성분의 조성은 대체적으로 단백질의 함량이 감소하고 우론산 및 황산기 등 산성다당의 농도는 증가하며 총당 중 라미나란의 구성당류인 글루코스(Glucose) 함량이 감소하는 특성을 보였다. 이러한 특성으로 보아 조라미나란의 추출을 위한 적정 온도대는 추출물의 성분조성 및 추출수율을 감안할 때 50℃ 이하가 적절할 것으로 사료되었다.(도 5)

<표 3> 추출온도 조건별 대황추출물의 조라미나란 수율 및 성분조성

구 분		추출온도(℃)
구 분		30	50	70	90
조라미나란 수율(％)		13.2	14.3	12.9	11.5
단백질(％)		8.3	8.1	7.9	7.5
총 당(％)		70.8	73.4	71.4	70.6
우론산(％)		10.3	12.3	13.1	14.2
황산기(％)		7.7	8.0	8.2	8.3
구성당조성(％)	Fucose	7.0	7.5	8.1	8.7
	Ribose	1.0	1.2	1.2	1.2
	Xylose	1.1	1.2	1.2	1.4
	Mannose	1.9	2.2	2.1	2.3
	Galactose	0.0	0.0	0.0	0.0
	Glucose	89.0	86.2	85.7	85.3
	Rhamnose	0.0	0.0	0.0	0.0
	Arabinose	0.0	0.0	0.0	0.0

<실험예 5> 조라미나란 정제조건

갈조류중 대황의 건조분말 500g에 pH 3.0의 식품공업용 염산용액 18L를 가한 후 25℃에서 3시간 교반 침출한 후 원심분리하는 공정을 2회 반복하여 얻은 1차 및 2차 추출액에 주정 75L를 가하고 60분간 정치하여 조라미나란을 침전시켰다. 그런 다음 원심분리하여 얻은 침전물을 동결건조하여 조라미나란 89g을 얻었다. 이어서 물 2L에 조라미나란을 용해한 후 CPC 등 4급암모늄염류 용액 3종의 5％ 수용액을 천천히 가하고 35℃에서 3시간 교반하여 공존하는 산성다당을 결합 침전시켰다. 이를 여과하여 얻은 중성다당 성분의 여과액에 약 5L의 주정을 가하여 침전 분리된 라미나란을 여과 회수한 후 200ml의 증류수에 용해하고 투석막(MWCO 5,000)에 넣어 12시간 동안 흐르는 물 속에서 투석하여 잔존하는 염류 및 저분자량물질 등 불순물을 제거한 후 동결건조하여 정제라미나란을 얻었다. 이때 산성다당의 결합침전 촉진제로서 사용된 4급암모늄염은 CPC, CPB 및 CTAB였으며 염류의 종류에 따른 정제라미나란의 수율은 침전물의 경우 각각 33.2％(CPC), 34.5％(CPB) 및 35.4％(CTAB) 로서 염류의 종류에 따라 CTAB > CPB > CPC 순으로 높게 나타났으며, 상층액 중의 라미나란 수율은 각각 CPC(44.6％), CPB(44.5％) 및 CTAB(43.7％)로 나타나 약간의 차이가 있었다. 또한, 4급암모늄염 침전법에 의하여 얻은 중성다당획(4급 암모늄 처리 후 침전하지 않은 상층액)으로부터 알콜침전 및 투석법으로 정제하여 얻은 라미나란의 정제 순도는 CPC 처리시 92.7％(총당함량 기준), CPB 처리시 92.3％ 및 CTAB 처리시 93.4％로서 모두 유사하였다. 이때 라미나란 이외의 유기성분은 미량의 단백질과 우론산 및 황산기 등 산성다당류 성분이었다. 이와 같은 실험결과로 보아 암모늄염의 종류에 따른 해조류 추출물의 산성다당 제거 및 중성다당인 라미나란의 분리회수 효과에는 큰 차이가 없는 것으로 나타남으로써 실제 정제과정에서는 원가, 취급의 용이성 및 투석처리효과 등을 고려하여 적절한 염류를 사용할 수 있을 것으로 사료되었다.(표 4)

<표 4> 4급 암모늄염으로 처리한 대황추출물의 라미나란 제조수율 및 화학적 성분조성 (단위: dry base, ％)

성 분	암모늄염 처리후 침전물			암모늄염 처리후 상층액
성 분	CPC처리	CPB처리	CTAB처리	CPC처리	CPB처리	CTAB처리
수 율(Yield)	33.2	34.5	35.4	44.6	44.5	43.7
총당(Total sugar)	33.4	33.8	34.6	92.7	92.3	93.4
단백질(Protein)	10.8	11.7	12.2	1.8	1.6	1.8
우론산(Uronic acid)	27.6	28.0	29.6	1.5	1.4	1.5
황산기(Sulfate)	10.5	11.2	12.4	1.2	1.1	1.2
람노스(Rhamnose)	1.3	1.4	1.4	-	-	-
휴코스(Fucose)	49.1	50.0	50.7	-	-	-
라이보스(Ribose)	-	-	-	3.5	3.3	3.2
아라비노스(Arabinose)	-	-	-	1.0	1.0	0.9
자일로스(Xylose)	5.0	5.2	5.3	-	-	-
만노스(Mannose)	13.4	14.3	13.9	2.5	2.6	2.5
갈락토스(Galactose)	8.1	7.8	8.5	-	-	-
글루코스(Glucose)	20.5	21.0	19.4	93.3	94.7	93.8

주: CPC: C₂₁H₃₈NCl, FW:340.0_, CPB: C₂₁H₃₈NBr,FW 384.4, CTAB: CH₃(CH₂)15N(Br)(CH3)_3,FW364.5

울트라하이드로겔 1000 칼럼을 사용하여 덱스트란을 분자량 측정용 표준물질로 하여 RI 검출기를 장착한 HPLC로 CPC 정제 갈조류 유래 라미나란의 분자량을 조사한 결과 평균 분자량은 19,700 달톤으로 조사되었으며 그 조성은 주로 글루코오스 만의 결합체인 글루칸(분자량 26,000달톤)과 글루코오스와 단백질로 구성된 라미나란(분자량 12,900달톤)으로 구성된 물질이었다. 가스크로마토그라피로 동정한 CPC 정제 갈조류 라미나란의 크로마토그람은 도 6에, CPC 정제 라미나란의 분자결합 위치를 보인 이온크로마토그램은 도 7에 각각 제시된 바와 같다.

본 발명에 의하면, 라미나란 함유 해조류로부터 산성다당 등 불순물의 함량이 낮은 고순도의 라미나란을 효과적으로 분리정제할 수 있다. 따라서, 강력한 면역활성 및 암세포주에 대한 세포독성 활성을 갖고 있어 항암보조제의 원료 또는 유사 생리기능활성을 갖는 기능성식품 소재로 이용이 가능한 라미나란을 국내에 널리 부존하거나 대량으로 양식생산되는 갈조류 자원으로부터 고순도로 분리해냄으로써 자원의 유효활용에 의한 고부가가치 창출 및 대체의학 소재로서의 해조류 천연성분의 유효활용의 기술기반의 구축에 크게 기여할 수 있을 것으로 기대된다.

도 1은 본 발명의 바람직한 실시예로서 갈조류로부터 고순도 라미나란(Laminaran)의 제조공정도이다.

도 2는 본 발명에 따른 바람직한 실시예로서 추출횟수 및 추출용매의 비율에 따라 건조다시마에 함유된 조라미나란의 추출수율을 나타내는 그래프

도 3은 본 발명에 따른 바람직한 실시예로서 추출시간에 따라 건조다시마에 함유된 조라미나란의 추출수율을 나타내는 그래프

도 4는 본 발명에 따른 바람직한 실시예로서 다시마로부터 조라미나란을 추출하는 경우 추출수율에 미치는 pH의 영향을 나타내는 그래프

도 5는 본 발명에 따른 바람직한 실시예로서 대황에 함유된 조라미나란을 추출하는 경우 추출온도가 추출수율에 미치는 영향을 나타내는 그래프

도 6은 본 발명에 따른 바람직한 실시예로서 CPC로 정제한 갈조류 라미나란의 가스크로마토그램[a: 글루코오스, b: 마이오-이노시톨(내부표준물질)]

도 7은 본 발명에 따른 바람직한 실시예로서 정제 라미나란의 총이온크로마터그램[A: 2,3,4,6-Me₄-Glc(라미나란 분자중 탄소원자 1번 위치에 결합한 글루코오스를 나타냄), B: 2,4,6-Me₃-Glc(글루코오스의 β-1,3 결합물로서 라미나란의 단위 구성당을 나타냄), C: 2,3,4-Me₃-Glc(글루코오스의 β-1,6 결합물로서 라미나란의 단위 구성당을 나타냄), D: 2,4-Me₂-Glc(글루코오스의 β-1,3 및 β-1,6 결합물로서 라미나란 구성당을 나타냄), E: 마이오-이노시톨-(OAC)_{6 :}내부표준물질]

Claims

(1) 라미나란 함유 갈조류의 건조분말을 산성 또는 중성 용액으로 추출하는 단계; (2) 상기 갈조류 추출액에 저급알코올을 가하여 조라미나란을 침전시키는 단계; (3) 조라미나란 침전물의 수용액에 4급 암모늄염 용액을 가하여 불용성 산성다당 침전물과 가용성 중성다당 상등액으로 정치분리하는 단계; (4) 상기 중성다당 용액에 저급알코올을 가하여 라미나란을 침전시키는 단계; 및 (5) 잔존 염류와 저분자 불순물을 제거한 후 건조하는 단계를 포함하는 라미나란의 제조방법
제 1항에 있어서, 단계 (1)에서 갈조류를 추출하기 이전 단계로 갈조류 원료를 담수로 세척건조하여 입도 20∼80메쉬 크기로 분쇄한 후 60∼150℃를 유지하여 열처리하는 단계를 구비함을 특징으로 하는 라미나란의 제조방법
제 1항에 있어서, 상기 단계 (1)은 갈조류 건조분말을 pH 2.0 ∼ 8.0의 용액으로 20 ∼ 60℃에서 추출하는 과정을 포함함을 특징으로 하는 라미나란의 제조방법
제 1항에 있어서, 상기 단계 (2)는 저급알코올은 에탄올 또는 95％ 이상의 에탄올을 포함하는 주정으로 함을 특징으로 하는 라미나란의 제조방법
제 1항에 있어서, 단계 (3)의 4급암모늄 염류는 세틸피리디니움 클로라이드, 세틸피리디니움 브로마이드, 세틸트리메틸암모니움 브로마이드에서 선택됨을 특징으로 하는 라미나란의 제조방법
제 1항 또는 제 5항에 있어서, 상기 단계 (3)은 조라미나란 수용액에 0.2∼10％의 4급암모늄 용액을 가하여 10∼50℃에서 교반하는 과정을 포함함을 특징으로 하는 라미나란의 제조방법
제 1항에 있어서, 단계 (4)의 저급알코올은 에탄올 또는 95％ 이상의 에탄올을 포함하는 주정으로 함을 특징으로 하는 라미나란의 제조방법
제 1항에 있어서, 단계 (4)의 저분자 불순물은 5000달톤 이하임을 특징으로 하는 라미나란의 제조방법