KR100490507B1 - 한외 여과, 역 삼투 및 나노 여과를 사용하는 탄수화물의 정제 - Google Patents
한외 여과, 역 삼투 및 나노 여과를 사용하는 탄수화물의 정제 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 한외 여과, 나노 여과 및/또는 역 삼투를 사용하여 올리고사카라이드, 뉴클레오티드 당 및 관련 화합물을 포함하는 탄수화물의 정제 방법을 제공한다. 효소 합성 또는 올리고사카라이드 분해 후에 반응 혼합물에 존재하는 화합물과 같은 목적하지 않은 오염물질로부터 탄수화물을 정제한다.
Description
본 출원은 본원에 참고로 인용되어 있는, 1996년 10월 10일자로 출원된 미국 가특허 출원 제 60/028,226 호의 부분 연속 출원이다.
본 발명은 올리고사카라이드의 합성에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 한외 여과(ultrafiltration), 나노 여과(nanofiltration) 및/또는 역 삼투를 사용하여 올리고사카라이드를 정제하는 개선된 방법에 관한 것이다.
세포 표면 상의 인식 요소로서의 탄수화물의 역할에 대한 이해가 증가됨에 따라 한정된 구조의 탄수화물의 제조에 대한 관심이 증가되어 왔다. 예를 들면, 올리고사카라이드 잔기인 시알릴 락토즈를 포함하는 화합물은 비브리오 콜레라에(Vibrio cholerae), 에스케리치아 콜리(Escherichia coli) 및 살모넬라(Salmonella)와 같은 박테리아로부터의 엔테로톡신(enterotoxin)에 대한 중화제로서 관심을 끈다(예: 미국 특허 제 5,330,975 호 참조). 시알릴 락토즈는 또한 관절염 및 관련된 자가면역 질환의 치료를 위해 연구되고 있다. 특히, 시알릴 락토즈는 IgG상에서 Fc 탄수화물 결합 부위의 점유를 억제 또는 방해하여 면역성 착체를 형성하지 못하게 한다고 생각된다(미국 특허 제 5,164,374 호 참고). 최근에, 시알릴-α(2,3)갈락토사이드, 시알릴 락토즈 및 시알릴 락토즈아민은 궤양의 치료를 위해 제안되었고, I 상 임상 시험(Phase I clinical trial)는 이러한 용도에서 전술된 화합물을 사용하기 시작했다(발코넨(Balkonen) 등의 문헌[FEMS Immunology and Medical Microbiology 7:29 (1993)] 및 문헌[BioWorld Today, p. 5, April 4, 1995] 참조). 다른 예로서, 시알릴 루이스 리간드인 시알릴 루이스x 및 시알릴 루이스a를 포함하는 화합물은 ELAM-1 및 GMP 140 수용체와 같은 수용체에 결합하는 백혈구 및 비-백혈구 세포주에 존재한다[폴리(Polley) 등의 문헌[Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 88:6224(1991)] 및 필립스(Phillips) 등의 문헌[Science, 250:1130(1990)], 및 미국 특허 출원 제 08/063,181 호].
목적하는 탄수화물 구조의 제조에 대한 관심 때문에, 글리코실트란스페라제 및 효소-촉매작용에 의한 탄수화물의 합성에서의 그의 역할은 현재 광범위하게 연구되고 있다. 탄수화물의 효소적 합성을 위한 글리코실트란스페라제의 사용은 효소에 의해 제공된 실질적으로 완벽한 입체선택성 및 결합 특이성 때문에 화학적인 방법보다 우수한 장점을 제공한다(이토(Ito) 등의 문헌[Pure Appl. Chem., 65:753(1993)] 및 미국 특허 제 5,352,670 호 및 미국 특허 제 5,374,541 호). 따라서, 글리코실트란스페라제는 치료 및 다른 목적을 위해 사용된 수많은 탄수화물의 합성에서 효소 촉매로서 사용이 증가한다.
효소적 합성 또는 다른 방법에 의해 제조된 탄수화물 화합물은 종종 목적하는 화합물 뿐만 아니라 반응되지 않은 당, 염, 파이루베이트, 포스페이트, PEP, 뉴클레오시드, 뉴클레오티드 및 단백질과 같은 오염물질을 포함하는 복잡한 혼합물의 형태로 수득된다. 이들 오염물질의 존재는, 탄수화물 화합물이 유용한 많은 용도에 바람직하지 않다. 크로마토그래피, 즉 이온 교환 및 크기 배제 크로마토그래피와 같은 올리고사카라이드를 정제하기 위해 이전에 사용된 방법은 여러 단점이 있었다. 예를 들면, 크로마토그래피 정제 방법은 대규모 정제에 적당하지 않아서, 사카라이드의 상업적 제조에서 이들의 사용을 배제한다. 더구나, 크로마토그래피 정제 방법은 비용이 많이 든다. 따라서, 이전에 사용된 방법보다 빠르고 효과적이고 비용이 덜 드는 정제 방법이 요구되고 있다. 본 발명은 이러한 필요성 및 그밖의 요구를 달성한다.
당-함유 용액으로부터 바람직하지 않은 불순물, 특히 당 결정화를 억제하는 당밀-형성 이온을 제거하기 위해 막의 조합체를 사용하는 방법이 미국 특허 제 5,454,952 호에 기술되어 있다. 한외 여과 후, 나노 여과를 수행하는 방법은, 사탕수수 또는 사탕무의 용액으로부터 결정성 당의 회수를 개선하는데 유용한 것으로서 기술되어 있다.
미국 특허 제 5,403,604 호는 나노 여과법에 의해 과일 쥬스로부터 과일 쥬스 당을 회수하여 다량의 당을 갖는 보유물 및 소량의 당을 갖는 투과물을 수득한 것을 기술하고 있다.
미국 특허 제 5,254,174 호는 이눌라이드 화합물을 함유한 쥬스 또는 시럽으로부터 염 및 글루코즈, 프룩토즈 및 수크로즈를 제거하므로써 일반식 GFn(G는 글루코즈이고, F는 프룩토즈이다)의 이눌라이드 화합물을 정제하는 크로마토그래피 및/또는 나노 여과법의 용도를 기술한다.
미국 특허 제 4,956,458 호는, 글루코즈 무수물 및 푸르알데하이드 유도체 폴리덱스트로즈와 같은 대부분의 풍미상실 구성물인, 글루코즈를 산-촉매작용에 의해 축합시켜 제조된 랜덤하게 가교결합된 글루칸 중합체인 폴리덱스트로즈를 회수하기 위한 역 삼투의 사용을 기술한다.
미국 특허 제 4,806,244 호는, 설페이트를 나노 여과에 의해 물로부터 제거한 후, 막을 통과한 니트레이트를 이온 교환 수지로 흡수에 의해 투과물로부터 제거하는 막 및 흡수법이 조합된 시스템의 사용을 기술한다.
발명의 요약
본 발명은 오염물질을 함유한 공급 용액으로부터 탄수화물 화합물을 정제하는 방법을 제공한다. 이 방법은 대부분의 오염물질이 막을 통과하는 동안, 막이 목적하는 탄수화물 화합물을 보유하도록 하는 조건하에서, 공급 용액을 나노 여과막 또는 역 삼투막과 접촉시키는 것을 포함한다. 본 발명은 시알릴 락토사이드, 시알산, 락토-N-네오테트라오즈(LNnT) 및 GlcNAcβ1,3Galβ1,4Glc(LNT-2), NeuAcα(2→3)Galβ(1→4)(Fucα1→3)Glc(R1)β1-OR2(이때, R1은 OH 또는 NAc이고; R2는 수소, 알콕시, 사카라이드, 올리고사카라이드 또는 탄소수가 1 이상인 아글리콘 기이다); 및 Galα(1→3)Galβ(1→4)Glc(R1)β-O-R3(이때, R1은 OH 또는 NAc이고, R3은 -(CH2)n-COX(이때, X는 OH, OR4 또는 -NHNH2이고, R4는 수소, 사카라이드, 올리고사카라이드 또는 탄소수가 1 이상인 아글리콘 기이고, n은 2 내지 18의 정수이다))와 같은 탄수화물 화합물을 정제하는 방법을 제공한다.
또한, 일반식 NeuAcα(2→3)Galβ(1→4)GlcN(R1)β-OR2, NeuAcα(2→3)Galβ(1→4)GlcN(R1)β(1→3)Galβ-OR2, NeuAcα(2→3)Galβ(1→4)(Fucα1→3)GlcN(R1)β-OR2 또는 NeuAcα(2→3)Galβ(1→4)(Fucα1→3)GlcN(R1)β(1→3)Galβ-OR2(이때, R1은 탄소수가 1 내지 18인 알킬 또는 아실, 5,6,7,8-테트라하이드로-2-나프트아미도; 벤즈아미도; 2-나프트아미도; 4-아미노벤즈아미도; 또는 4-니트로벤즈아미도이고, R2는 수소, 사카라이드, 올리고사카라이드 또는 탄수소가 1 이상인 아글리콘 기이다)를 갖는 탄수화물 화합물을 정제하는 방법이 제공된다.
다른 양태에서, 본 발명은 탄수화물 화합물을 합성하는데 사용된 반응 혼합물을 포함하는 공급 용액으로부터 탄수화물 화합물을 정제하는 방법을 제공한다. 합성은 효소적 합성 또는 화학적 합성 또는 이들의 조합형일 수 있다. 이 방법은 공급 용액을 한외 여과막과 접촉시켜 탄수화물 화합물이 투과물로서 막을 통과하는 동안, 단백질이 막에 보유되도록 하여 공급 용액에 존재하는 임의의 단백질을 제거하는 것을 포함한다. 이어서, 대부분의 바람직하지 않은 오염물질이 막을 통과하는 동안 나노 여과막 또는 역 삼투막이 탄수화물 화합물을 보유하도록 하는 조건하에서, 한외 여과 단계로부터의 투과물을 나노 여과막 또는 역 삼투막과 접촉시킨다.
본 발명의 다른 양태는 대부분의 오염물질이 막을 통과하는 동안 막이 뉴클레오티드 또는 관련 화합물을 보유하도록 하는 조건하에서 뉴클레오티드 또는 관련 화합물을 함유한 공급 용액을 나노 여과막 또는 역 삼투막과 접촉시키므로써 뉴클레오티드들, 뉴클레오시드 및 뉴클레오티드 당을 정제하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 관심 있는 탄수화물을 함유하는 용액으로부터 1종 이상의 오염물질을 제거하는 방법을 제공한다. 이 방법은, 오염물질을 막을 통과시키면서 탄수화물을 보유하는 차단 계수(rejection coefficient)를 갖는 반투과성 막의 제 1 면과 용액을 접촉시키는 것을 포함한다. 막은, 오염물질에 비해 관심 있는 탄수화물의 크기 및 전하에 따라 한외 여과막, 나노 여과막 및 역 삼투막으로 구성된 군으로부터 선택된다. 막은 탄수화물을 함유한 공급 용액을 보유물 부분 및 투과물 부분으로 분리한다. 막의 차단 계수가 오염물질에 대한 계수보다 탄수화물에 대해 더 크면, 보유물 부분은 공급 용액중의 오염물질 농도에 비해 낮은 농도의 오염물질 및 일반적으로 또한 바람직하지 않은 오염물질에 비해 더 높은 비율의 탄수화물을 가질 것이다. 반대로, 오염물질에 대해서보다 탄수화물에 대한 차단 계수가 작은 막은, 오염물질의 농도가 공급 용액에서보다 투과물에서 더 낮고, 투과물이 공급 용액보다 오염물질에 대해 더 높은 비율의 탄수화물을 가지도록 분리될 것이다. 경우에 따라, 탄수화물을 함유한 분획은 추가의 정제를 위해 막 시스템을 통해 재순환될 수 있다.
본 발명의 방법을 사용하여 관심의 화합물을 함유한 용액으로부터 제거될 수 있는 오염물질의 예로는, 반응되지 않은 당, 무기 이온, 파이루베이트, 포스페이트, 포스포엔올파이루베이트 및 단백질을 포함하나 이로써 제한되지 않는다.
정의
다음의 약어가 본원에 사용된다:
Ara = 아라비노실;
Fru = 프룩토실;
Fuc = 푸코실;
Gal = 갈락토실;
GalNAc = N-아세틸갈락토;
Glc = 글루코실;
GlcNAc = N-아세틸글루코;
Man = 만노실; 및
NeuAc = 시알릴(N-아세틸뉴라미닐).
"탄수화물"이라는 용어는 일반식 (CH2O)n을 갖는 화학적 화합물로서, 모노사카라이드, 디사카라이드, 올리고사카라이드 및 폴리사카라이드를 포함한다. 본원에 사용된 "올리고"라는 용어는 2 내지 약 10개의 잔기로 구성된 중합체성 분자, 예를 들면 아미노산(올리고펩타이드), 모노사카라이드(올리고사카라이드) 및 핵산(올리고뉴클레오티드)를 지칭한다. "폴리"란 용어는 약 10개 보다 많은 잔기를 포함하는 중합체성 분자를 지칭한다.
올리고사카라이드는 환원 말단에서 사카라이드가 실제적으로 환원 당인지 여부에 따라 환원 말단 및 비-환원 말단을 갖는다고 생각된다. 허용된 명명법에 따라, 올리고사카라이드는 좌측에 비-환원 말단 및 우측에 환원 말단을 갖는 것으로 기술된다.
본원에 기술된 모든 올리고사카라이드는 비-환원 사카라이드에 대한 명칭 또는 약어(예를 들면, Gal)로 기술되고, 글리코시드 결합의 구조(α 또는 β), 고리 결합, 결합에 수반된 환원 사카라이드의 고리 위치, 이어서 환원 사카라이드의 명칭 또는 약어(예를 들면, GlcNAc)에 따라 기술된다. 2개의 당 사이의 결합은 예를 들면 2,3, 2→3 또는 (2,3)으로서 표현될 수도 있다.
정제 후 목적하지 않은 성분의 농도가, 정제 전의 성분의 농도의 약 40 % 이하이면, 화합물은 용액중에서 목적하지 않은 성분으로부터 "실질적으로 정제"된 것이다. 바람직하게는, 목적하지 않은 성분의 정제-후 농도는 정제-전 농도의 약 20 중량% 미만, 보다 바람직하게는 약 10 중량% 미만일 것이다.
본원에 사용된 "약학적으로 순수한"이란 용어는, 목적하지 않은 오염물질로부터 충분히 정제되어 약학적 제제로서 투여하기에 적합한 화합물을 지칭한다. 바람직하게는, 화합물은 정제 후 공급 용액내 목적하지 않은 오염물질이 오염물질의 정제-전 농도의 약 5 중량% 이하인 양이 되도록 정제된다. 보다 바람직하게는, 오염물질의 정제-후 농도는 정제-전 오염물질 농도의 약 1 % 이하이고, 가장 바람직하게는 정제-전 오염물질 농도의 약 0.5 % 이하이다.
"공급 용액"은 정제될 화합물을 함유한 임의의 용액을 지칭한다. 예를 들면, 올리고사카라이드를 합성하는데 사용된 반응 혼합물은 본 발명의 방법을 사용하여 목적하는 반응 생성물을 정제하는 공급 용액으로서 사용될 수 있다.
발명의 양태
본 발명은 반투과성 막, 예를 들면 역 삼투막 및/또는 나노 여과막을 사용하여 특정한 탄수화물 및 올리고사카라이드를 빠르고 효과적으로 높은 정제도로 정제하는 방법을 제공한다. 이 방법은 올리고사카라이드의 합성 또는 분해 후 반응 혼합물에 남아있는 반응물 및 다른 오염물질로부터 목적하는 올리고사카라이드를 분리하는데 특히 유용하다. 예를 들면, 본 발명은 올리고사카라이드, 뉴클레오티드 당, 당지질, 리포사카라이드, 뉴클레오티드, 뉴클레오시드 및 그밖의 사카라이드-함유 화합물의 효소적 합성 또는 효소적 분해에 사용된 반응 혼합물의 그밖의 성분 및/또는 효소로부터 올리고사카라이드를 분리하는 방법을 제공한다. 또한, 한외 여과, 나노 여과 또는 역 삼투를 사용하여 공급 용액으로부터 염, 당 및 그밖의 성분을 제거하는 방법이 제공된다.
이러한 기술을 이용하여 사카라이드(예를 들어, 시알릴 락토즈, SLex 및 그외 다수)는 본질적으로 100% 순도로 제조될 수 있다. 또한, 본 발명의 정제 방법은 공지된 탄수화물 정제 방법보다 더 효율적이고 신속하며 대규모 정제에 이용될 수 있다.
종종, 바람직한 정제법은 단일 단계로 수행될 수 있어서, 결정화 등과 같은 추가의 정제 단계는 일반적으로 요구되지 않는 것이다. 따라서, 본 발명은 사카라이드-함유 화합물을 정제하기 위한 단일 단계 방법을 제공한다.
본 발명에 따라 사카라이드를 정제하기 위하여, 탄수화물이 정제되는 용액의 목적하지 않는 성분으로부터 목적하는 탄수화물을 분리하는데 적절한 막이 선택된다. 막의 선택 목적은, 특정한 용도를 위해 분자량 하한(MWCO), 막 조성, 투과율 및 차단 특성, 즉 염 및 그외의 일반적으로 더 작거나 반대로 하전된 분자를 통과하게 하면서 특정 분자를 보유하는 막의 총 성능을 최적화하는 것이다. 성분 i의 보유율(Ri)은 식 Ri = (1-Cip/Cir) × 100 %(여기서, Cip는 투과물 중의 성분 i의 농도이고, Cir은 보유물 중의 성분 i의 농도로, 모두 중량%로 표시됨)로 주어진다. 성분의 보유율은 보유 특성 또는 막 차단 계수로도 불리운다.
효과적인 분리를 위해, 분리가 바람직한 화합물의 차단 비율에 비해 관심 대상인 사카라이드에 대해 높은 차단 비율을 갖는 막이 선택된다. 막이 제 2 화합물에 비하여 제 1 화합물에 대해 높은 차단 비율을 갖는다면, 막을 통과한 투과 용액 중의 제 1 화합물의 농도가 제2 화합물에 비해 감소된다. 역으로, 보유물에서 제 1 화합물의 농도가 제 2 화합물의 농도에 비해 증가한다. 막이 화합물을 차단하지 않는다면, 그 화합물의 투과물 부분 및 차단물 부분 중의 농도는, 본질적으로 공급 용액의 농도와 동일할 것이다. 또한, 막이 화합물에 대해 음의 차단율을 가질 수 있다면, 그 화합물의 투과물 중의 농도는 공급 용액 중의 화합물 농도보다 높게 된다. 막 기술에 대한 일반적인 내용은 문헌["Membranes and Membrane Separation Processes" in Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry(VCH, 1990)]에 기술되어 있고, 또한 문헌[Noble and Stern, Membrane Separations Technology:Principle and Applications(Elsevier, 1995)]을 참고할 수도 있다.
출발 점으로서, 공급 스트림 중에 존재하는 목적하지 않는 화합물은 막을 통과되게 하는 반면, 목적하는 화합물은 보유할 것으로 기대되는 분자량 하한(MWCO, 흔히 막의 기공 크기와 관련됨)을 갖는 막이 일반적으로 선택될 것이다. 목적하는 MWCO는 일반적으로 정제할 화합물의 분자량 보다 작고, 전형적으로는 정제할 화합물을 포함하는 용액으로부터 제거될 목적하지 않는 오염물질의 분자량 보다 크다. 예를 들면, 200 Da의 분자량을 갖는 화합물을 정제하기 위하여, 약 200 Da보다 작은 MWCO를 갖는 막이 선택된다. 예를 들어, 100 Da의 MWCO를 갖는 막 또한 적합한 것으로 선택될 수 있다. 본 발명에서 사용되는 막은 그의 MWCO에 근거하여 바람직한 분리에 따라 한외 여과막(UF막), 나노 여과막(NF막) 또는 역 삼투막(RO막)으로 분류된다. 본 발명의 목적상, UF, NF 및 RO막은 문헌[Pure Water Handbook, Osmonics, Inc. (미국 미네소타주 미네톤카 소재)]에 정의되어 있는 바와 같이 분류된다. RO막은 전형적으로 약 200 Da 미만의 공칭 MWCO를 가지고, 대부분의 이온을 차단한다. NF막은 일반적으로 약 150 Da 내지 약 5 kDa 사이의 공칭 MWCO를 가지고, UF막은 일반적으로 약 1 kDa 내지 약 300 kDa 사이의 공칭 MWCO(이 MWCO 범위는 사카라이드와 유사한 분자를 나타낸다)를 갖는다.
특정의 분리에 적합한 막의 선택에 있어 고려되는 제 2 의 변수는 막의 중합체 유형이다. 각각의 영역에서 사용되는 막은, 무기, 유기 또는 무기와 유기의 혼합물의 통상적인 막 재료로 만들어진다. 전형적인 무기 재료로는 유리, 세라믹, 시멘트, 금속 등이 있다. 세라믹 막은 UF 영역에 바람직하고, 예를 들면 미국 특허 제 4,692,354호(Asaeda 등) 및 제 4,562,021호(Alary 등) 등에 기재된 바와 같이 제조될 수 있다. NF 및 RO 영역에 바람직한 유기 재료는, 전형적으로 등방성 또는 비등방성에 관계없이 섬유의 구멍쪽 또는 껍질쪽의 어느 곳에 층 또는 "표피(skin)"를 갖는 중합체이다. 섬유용으로 바람직한 재료는 폴리아미드, 폴리벤즈아미드, 폴리설폰(무엇보다도 설폰화 폴리설폰 및 설폰화 폴리에테르 설폰을 포함), 폴리스티렌(스티렌 함유 공중합체, 예를 들면 아크릴로-니트릴-스티렌, 부타디엔-스티렌 및 스티렌-비닐벤질할라이드 공중합체 포함), 폴리카보네이트, 셀룰로즈 중합체(셀룰로즈 아세테이트 포함), 폴리프로필렌, 폴리(비닐 클로라이드), 폴리(에틸렌 테레프탈레이트), 폴리비닐 알코올, 플루오로카본 등으로 미국 특허 제 4,230,463 호, 제 4,806,244 호 및 제 4,259,183 호에 개시된 것과 같은 것이 있다. NF 및 RO 막은 흔히 중합체 식별층 외에도 다공성 지지 기질로 구성된다.
적합한 막 조성물의 선택에 특히 중요한 것은, 막의 표면 전하이다. 바람직한 MWCO 범위 내에서, 탄수화물 및 오염물질의 이온성 전하에 적합한 표면 전하를 갖는 막이 선택된다. 특정 막에 있어서, MWCO는 일반적으로 변화시킬 수 없지만, 공급 용액의 pH를 변화시켜 막의 표면 전하를 변경시킴으로써 막의 분리 특성에 영향을 미칠 수 있다. 예를 들면, 중성 pH에서 음의 순(net) 표면 전하를 갖는 막이 단순히 용액의 pH를 낮춤으로써 중성 순 전하를 갖도록 조절될 수 있다. 용액 pH 조절의 추가적인 효과는 오염물질 및 관심 대상인 탄수화물 상의 이온 전하를 조절하는 것이다. 따라서, 적합한 막 중합체 유형 및 pH를 선택함으로써, 오염물질과 막이 모두 중성인 시스템이 얻어질 수 있고, 이에 따라 오염물질의 통과가 용이하게 된다. 예를 들어, 오염물질이 중성 pH에서 음으로 하전되어 있다면, 종종 공급 용액의 pH를 낮추어 오염물질을 양성자화시키는 것이 바람직하다. 예를 들면, 포스페이트의 제거는, 용액의 pH를 약 3으로 낮추고 이것이 포스페이트 음이온을 양성자화시켜 막을 통과되게 함으로써 용이하게 된다. 실시예 5에 보여진 바와 같이, 7.5로부터 3.0으로의 pH 감소는 30 분만에 오스모닉스(Osmonics) MX07과 같은 폴리아미드 막을 통과하는 GlcNAc의 비율을 70%에서 28%로 감소시키는 한편, 포스페이트의 통과 비율을 10%에서 46%로 증가시킨다(실시예 6, 다양한 나노 여과막을 통과하는 다른 화합물의 통과율에 대한 pH 변화의 영향에 관한 추가 실시예들의 표 5 참조). 음이온성 탄수화물의 정제에 있어, pH는 일반적으로 약 1 내지 약 7의 범위이다. 역으로, 오염물질이 양의 표면 전하를 갖는다면, 공급 용액의 pH는 약 7 내지 약 14 범위의 pH로 조절될 수 있다. 예를 들면, 아미노기(-NH3
+)를 갖는 오염물질을 포함하는 용액의 pH를 증가시키면, 아미노기를 중성으로 만들어 막의 통과를 용이하게 할 것이다. 따라서, 본 발명의 한가지 양태는 막과 접촉하는 용액의 pH를 조정함으로써 분리를 조절하는 것을 포함하고, 이것은 오염물질의 이온 전하를 변화시킬 수 있으면서 또한 막의 표면 전하에 영향을 미칠 수 있어, 바람직한 탄수화물의 정제를 용이하게 한다. 물론, 막의 손상을 방지하기 위하여 특정 막에 허용가능한 pH 범위에 대해 제조업자의 지시를 따라야 한다.
일부 적용 분야에 있어서는, 혼합물을 한가지 pH에서 나노 여과 또는 역 삼투법을 먼저 수행한 다음, 관심 대상인 사카라이드를 포함하는 보유물을 다른 pH로 조절하고, 추가로 막 정제를 수행한다. 예를 들면, 시알릴 락토즈를 합성하는데 사용되는 반응 혼합물을 pH 3에서 오스모닉스 MX07 막(약 500 Da의 MWCO를 갖는 나노 여과막)을 통해 여과하면, 시알릴 락토즈를 보유하고, 용액으로부터 대부분의 포스페이트, 파이루베이트, 염 및 망간을 제거하는 한편, 또한 일부의 GlcNAc, 락토즈 및 시알산도 제거한다. 보유물의 pH를 7.4로 조절한 후, MX07 막을 통해 추가적으로 재순환시키면, 대부분의 잔류 포스페이트, 모든 파이루베이트, 모든 락토즈, 일부의 시알산 및 상당한 양의 잔류 망간은 제거될 것이다.
목적하는 올리고사카라이드 또는 뉴클레오티드 당을 합성하는데 사용되는 효소와 같은 단백질을 함유하는 혼합물로부터 사카라이드가 정제되는 경우라면, 종종 정제 절차의 제 1 단계로서 단백질을 제거하는 것이 바람직하다. 단백질보다 더 작은 사카라이드의 경우라면, 상기 분리는, 용액으로부터 제거할 단백질 또는 그밖의 거대 분자의 분자량보다 작지만 정제해 낼 올리고사카라이드의 분자량 보다는 큰 MWCO를 갖는 막을 선택함으로써 수행된다(즉, 이 경우에서의 차단 비율은 목적하는 사카라이드보다 단백질에 있어서 더 높다). 따라서, MWCO보다 더 큰 분자량을 갖는 단백질 또는 그밖의 거대분자는 막에 의해 차단되는 한편, 사카라이드는 막을 통과할 것이다. 역으로, 올리고사카라이드 또는 뉴클레오티드 당이 이보다 더 작은 단백질로부터 정제된다면, 단백질의 분자량보다는 크지만, 올리고사카라이드 또는 뉴클레오티드 당 보다는 더 작은 MWCO를 갖는 막이 사용된다. 일반적으로, 탄수화물로부터의 단백질의 분리는 한외 여과막(UF막)으로서 통상적으로 언급되는 막을 사용한다. 본 발명의 방법에 사용하기에 적합한 UF막은 밀리포어 코포레이션(Millipore Corp. (미국 메사츄세츠주 베드포드 소재)), 오스모닉스 인코포레이티드(Osmonics, Inc (미국 미네소타주 미네톤카 소재)), 필름테크(Filmtec (미국 미네소타주 미네아폴리스 소재)), UOP, 데살리네이션 시스템(Desalination Systems), 어드벤스드 멤브레인 테크놀로지(Advanced membrane Technologies), 및 니토(Nitto)을 비롯한 다수의 제조업자로부터 시판중이다.
또한, 본 발명은 나노 여과막(NF막) 또는 역 삼투막(RO막)을 사용함으로써 관심 대상인 사카라이드를 함유하는 혼합물로부터 염 및 그밖의 저분자량 성분을 제거하는 방법을 제공한다. 나노 여과막은 분리가 분자량과 이온 전하 모두에 근거하는 막의 일종이다. 이들 막은 전형적으로 막을 통과하는 종의 크기 측면에서 역 삼투막과 한외 여과막의 중간 정도에 위치한다. 나노 여과막은 전형적으로 팽윤된 중합체 망상의 사슬 사이에 미세기공 또는 개구를 갖는다. 비이온화된 분자의 분자량 하한은 전형적으로 100 - 20,000 달톤의 범위이다. 동일 분자량의 이온에 있어, 막 차단(보유)은 증가하는 전하 밀도로 인해 특정 막의 0, 1, 2, 3 등의 이온 전하에 대해 점진적으로 증가할 것이다.(예컨대 문헌[Eriksson, p., "Nanofiltration Extends the Range of Membrane Filtration", Environmental Progress, 7:58-59 (1988)] 참조). 또한, 나노 여과는 문헌[Chemical Engineering Progress, pp. 68-74 (March 1994)], 문헌[Rautenbach 등, Desalination 77:73 (1990)] 및 미국 특허 제 4,806,244 호에 기술되어 있다. 전형적인 적용에 있어서, 관심 대상인 사카라이드는 나노 여과막에 의해 보유되고, 오염물질인 염 및 다른 목적하지 않는 성분은 통과할 것이다. 본 발명의 방법에 유용한 나노 여과막은 전형적으로 관심 대상인 사카라이드에 대해 약 40% 내지 약 100%, 바람직하게는 약 70 내지 약 100%의 보유 특성을 가질 것이다. 본 발명에 사용되는 나노 여과막은 임의의 통상적인 나노 여과막일 수 있으며, 폴리아미드 막이 특히 적합하다. 특히 밀리포어 코포레이션(미국 메사츄세츠주 베드포드 소재), 오스모닉스 인코포레이티드(미국 미네소타주 미네톤카 소재), 필름텍크, UOP, 어드밴스드 멤브레인 테크놀로지, 데살리네이션 시스템, 및 니토를 비롯한 여러 제조업자들은 본 발명의 방법에 사용하기에 적합한 나노 여과막을 공급한다. 예를 들면, 적합한 막으로는 그중에서 오스모닉스 MX07, YK, GH(G-10), GE(G-5) 및 HL 막을 들 수 있다.
역 삼투(RO)막은 또한 각종 수성 용질을 통과시키는 한편, 선택된 분자를 보유한다. 일반적으로, 삼투란 순수한 액체(일반적으로 물)가 반투과막을 통과해 액체(일반적으로 당 또는 염 및 물)로 유입되어 용액을 희석시키고 두 용액 사이의 삼투 평형을 이루는 과정을 지칭한다. 반대로, 역 삼투는 막 시스템에 대해 외압을 가하여 염수 또는 당 용액 구획으로부터 막 시스템의 순수한 물 구획으로 물 분자가 통과하여 역 유동하게 되는 가압 막 공정이다. 반투과성이고 비다공성인 역 삼투막은 물에 용해된 물질의 삼투압보다 높은 압력으로 수성 공급물을 상기 역 삼투막까지 펌핑시킬 것을 필요로 한다. 역 삼투막은 저분자량 분자(200 달톤 미만)를 효과적으로 제거할 수 있으며, 또한 물로부터 이온을 효과적으로 제거할 수 있다. 바람직하게 역 삼투막은 약 40 내지 약 100%, 바람직하게는 약 70 내지 약 100%의, 목적으로하는 사카라이드에 대해 보유 특성을 갖는다. 적합한 역 삼투막은 다수 중에서 필름텍 BW-30, 필름텍 SW-30, 필름텍 SW-30HR, UOP 역 삼투막, 데잘 역 삼투막, 오스모닉스 역 삼투막, 어드밴스드 멤브레인 테크놀로지스 역 삼투막 및 니토(Nitto) 역 삼투막을 포함하나, 이들에 한정되는 것은 아니다. 적합한 역 삼투막중 하나의 예는 미국 메사츄세츠주 베드포드 소재의 밀리포어 코포레이션사의 밀리포어 카탈로그 번호 CDRN500 60이다.
본 발명에서 사용되는 막은 임의의 공지된 막 구조로 사용될 수 있다. 예컨대, 막은 평면형, 플레이트형, 틀(frame)형, 관형, 나선형, 동공 섬유형 등일 수 있다. 바람직한 양태에서 막은, 나선형이다. 막은 임의의 적합한 형태로 사용될 수 있으며, 예컨대 직교류(cross-flow) 형 또는 깊이 형을 포함한다. 본 발명에 따른 한외 여과, 나노 여과 및 역 삼투 정제에 바람직한 "직교류" 여과에서, 목적 탄수화물을 정제시킬 "공급물" 또는 용액은 막 표면과 평행하게 또는 그와 각을 이루어 막 채널을 통해 유동하며, 보유물(또한 재순환 또는 농축물이라고도 함) 스트림과 투과물 스트림으로 분리된다. 효율적인 막을 유지하기 위해, 공급물 스트림은 충분히 빠른 속도로 막 표면과 평행하게 유동하여서, 막에 의해 차단된 누적 입자를 일소시키는 전단력 및/또는 교란을 발생시킨다. 따라서, 직교류 여과는 3가지 스트림, 즉 공급물, 투과물 및 보유물 스트림의 유동을 수반한다. 반대로 "무기능 말단(dead end)" 또는 "깊이" 필터는 단 2개의 스트림, 즉 공급물과 여액(또는 투과물) 스트림만을 갖는다. 막에 의해 차단된 모든 입자 및 커다란 분자를 보유하는 재순환 또는 보유물 스트림은 재순환 스트림이 발생되는 막 모듈로 완전히 재순환되거나 또는 시스템으로부터 부분적으로 제거될 수 있다. 본 발명의 방법이 저분자량 성분으로부터 사카라이드를 정제하고자 사용될 때, 예컨대 목적하는 사카라이드는 보유물 스트림(깊이 필터의 경우에는 공급물 스트림)에 포함되는 한편, 투과물 스트림은 제거된 오염물질을 함유한다.
본 발명의 정제 방법은 여과가 수행되는 압력, 유속 및 온도를 조정하므로써 더욱 최적화시킬 수 있다. 한외 여과, 나노 여과 및 역 삼투는 일반적으로 용액이 막을 통과하는 삼투압을 극복하기 위해 주위 압력보다 높게 압력을 증가시킬 것을 요구한다. 최대 및 권고 구동 압력에 대한 막 제조자의 지침을 따를 수 있으며, 좀 더 조정하므로써 그 이상의 최적화가 가능하다. 예컨대, 한외 여과에 대한 권고 압력은 일반적으로 약 25 내지 약 100psi이고, 나노 여과의 경우에는 약 50 내지 약 1500psi이고, 역 삼투의 경우에는 약 100 내지 약 1500psi이다. 농축물(공급물 용액) 및 투과물 둘다의 유속을 또한 조정하여서 목적하는 정제를 최적화시킬 수 있다. 또한, 특정 막에 대한 제조자의 지침은, 점증적인 조정함으로써 최적 공정을 개시하는 출발 지점으로 작용한다. 농축물에 대한 전형적인 유속(P0)은 약 1 내지 약 15갤론/분(GPM)이고, 더욱 바람직하게는 약 3 내지 약 7GPM이다. 투과물의 경우, 유속(Pf)는 약 0.05 GPM 내지 약 10GPM이 전형적이고 약 0.2 내지 약 1GPM이 바람직하다. 정제가 수행되는 온도는 또한 정제의 효율 및 속도에 영향을 미칠 수 있다. 약 0 내지 약 100℃의 온도가 전형적이며, 약 20 내지 약 40℃의 온도가 대부분의 용도에 바람직하다. 몇몇 막에 있어서, 온도가 높을수록 막 기공의 크기를 증가시키는 결과를 발생하여, 정제를 최적화시키도록 조정할 수 있는 추가의 변수를 제공한다.
바람직한 양태에서, 유속, 압력, 온도, 및 정제에 영향을 미칠 수 있는 그밖의 변수를 자동 조절할 수 있는 수단을 제공하는 막 정제 기계에서 여과를 수행한다. 예컨대 오스모닉스 213T 막 정제 기계가 본 발명의 방법에서 사용하기에 적합하며, 상기 열거된 다른 회사에서 제조된 기계도 적합하다.
막은, 사용 후에 또는 막 투과성이 감소된 후에 용이하게 세척할 수 있다. 세척은 약간 상승된 온도에서, 필요시에 물 또는 가성 용액으로 세정하므로써 이루어질 수 있다. 스트림이 소량의 효소를 함유하는 경우, 소량의 계면활성제(예컨대, 울트라실(ULTRASIL:등록상표)) 존재하에 세정하는 것이 유용할 수 있다. 또한, 보다 고가인 나노 여과막을 보호하기 위해 예비 필터(100 내지 200㎛)를 사용할 수 있다. 필요시에는 그밖의 세척제를 사용할 수 있다. 세척 방법의 선택은 세척할 막에 따라 좌우되며, 막 제조자의 지침을 참고해야 한다. 세척은 전방 플러싱(flushing) 또는 후방 플러싱으로 이루어질 수 있다.
본 발명의 정제 방법은 단독으로 또는 탄수화물을 정제하기 위한 다른 방법과 함께 사용될 수 있다. 예컨대, 나노 여과/역 삼투 전 또는 후에, 또는 여과 전과 후 둘다에서 목적 사카라이드를 함유한 혼합물로부터 특정한 이온을 제거하기 위해 이온 교환 수지를 사용할 수 있다. 이온 교환은 제 1 회 나노 여과 또는 역 삼투 이후에 남아있는 포스페이트 및 뉴클레오티드와 같은 이온을 제거하고자 할 때 특히 바람직하다. 전술한 바와 같이 시알릴 락토즈 합성의 경우, 이온 교환은 예컨대 AG1X-8(아세테이트 형 바이오라드(BioRad), 예컨대 그밖의 이온 교환 수지에 대해서는 바이오라드 카탈로그를 참고한다)와 같은 음이온 교환 수지를 pH 약 3.0 이하의 보유물에, 포스페이트 농도가 목적하는 바대로 감소할 때까지 첨가하므로써 실시될 수 있다. 이 공정에서 아세트산은 해리되어서 이온 교환후에 나노 여과 또는 역 삼투 시스템을 통한 추가의 정제를 실시할 수 있다. 예컨대, 투과물의 전도도가 낮아져서 안정화될 때까지 오스모닉스 MX07 또는 유사한 막을 통해 pH 3.0 이하의 용액을 순환시킬 수 있다. 이어서, 용액의 pH는 NaOH를 사용하여 7.4까지 증가시켜, 상기 용액을 동일한 막을 통해 재순환시켜 잔류하는 아세트산 나트륨 및 염을 제거할 수 있다. 유사한 방식으로 양이온을 제거할 수 있으며, 예컨대 Mn2+를 제거하기 위해서는 AG50WX8(H+)(바이오라드)와 같은 산성 이온 교환 수지가 사용될 수 있다.
본 발명의 정제 방법은 효소적 합성을 사용하여 제조된 올리고사카라이드를 정제하는데 특히 유용하다. 글리코실트란스페라제를 사용하는 효소적 합성법은 올리고사카라이드를 제조하는데 효과적인 방법을 제공하며, 몇몇 용도에서는 효소, 및 효소적 합성 반응 혼합물중 그밖의 반응물로부터 올리고사카라이드를 정제하는 것이 바람직하다. 다수의 올리고사카라이드를 제조하는데 바람직한 방법은, 글리코실 트란스페라제 사이클을 포함하며, 이는 형성된 생성물 1몰당 무기 파이로포스페이트 1몰 이상을 생성해내며, 이가 금속 이온의 존재하에서 수행되는 것이 보통이다. 글리코실트란스페라제 사이클의 예는 시알릴트란스페라제 사이클이며, 이는 그밖의 반응물 뿐만 아니라 1몰 이상의 효소를 사용한다(미국 특허 제 5,374,541호, WO 9425615 A호, PCT/US96/04790호 및 PCT/US96/04824호 참조). 예컨대, 시알릴화 올리고사카라이드의 합성에 사용되는 반응물은 시알릴트란스페라제, CMP-시알산 합성 효소, 시알산, 시알릴트란스페라제의 수용체, CTP 및 가용성 이가 금속 양이온을 함유할 수 있다. α(2,3)시알트란스페라제(EC 2.4.99.6)로도 불리는 예시적인 α(2,3)시알릴트란스페라제는 시알산을 Galβ1→3Glc 디사카라이드 또는 글리코시드중 비환원성 말단 Gal으로 이동시킨다(에이진덴(Van den Eijinden) 등의 문헌[J. Biol. Chem., 256:3159(1981)], 바인스타인(Weinstein) 등의 문헌[J. Biol. Chem., 257:13845(1982)] 및 벤(Wen) 등의 문헌[J. Biol. Chem., 267:21011(1982)] 참고). 그밖의 예시적인 α2,3-시알릴트란스페라제(EC 2.4.99.4))가 시알산을 디사카라이드 또는 글리코시드의 비-환원 말단 Gal로 이동시킨다(리어릭(Rearick) 등의 문헌[J. Biol. Chem., 254:4444(1979)] 및 길레스피(Gillespie) 등의 문헌[J. Biol. Chem., 267:21004(1992)] 참고). 추가의 예시적인 효소는 Galβ-1,4-GlcNAcα-2,6-시알릴트란스페라제를 들 수 있다(쿠로사와(Kurosawa) 등의 문헌[Eur. J. Biochem. 219:375-381(1994)] 참고). 또한, 반응 혼합물은 시알릴트란스페라제, 바람직하게는 갈락토실 단위를 갖는 시알릴트란스페라제에 대한 수용체를 함유한다. 적합한 수용체는, 예컨대 Galβ1→3GalNAc, 락토-N-테트라오즈, Galβ1→3GlcNAc, Galβ1→3Ara, Galβ1→6GlcNAc, Galβ1→4Glc(락토즈), Galβ1→4Glcβ1-OCH2CH3, Galβ1→4Glcβ1-OCH2CH2CH3, Galβ1→4Glcβ1-OCH2C6H5, Galβ1→4GlcNAc, Galβ1-OCH3, 멜리비오즈, 라피노즈, 스타키오즈 및 락토-N-네오테트라오즈(LNnT)을 포함한다. 반응 혼합물에 존재하는 시알산은 시알산 그 자체(예: 5-N-아세틸뉴아민산; 5-N-아세틸아미노-3,5-디데옥시-D-글리세로-D-갈락토-2-노눌로손산; NeuAc, 때때로는 AcNeu 또는 NANA로 약칭됨) 뿐만 아니라 9-치환된 시알산(예: 9-O-C1-C6 아실-NeuAc(예: 9-O-락틸-NeuAc 또는 9-O-아세틸-NeuAc, 9-데옥시-9-플루오로-NeuAc 및 9-아지도-9-데옥시-NeuAc))을 포함한다. 시알릴화 절차에서 이들 화합물의 합성 및 사용은 1992년 10월 1일자로 공개된 국제특허 공개공보 WO92/16640호에 기재되어 있다.
바람직한 양태에서, 반응 매질은 시알산 1몰당 포스페이트 공여체 2몰 이상과 촉매량의 아데닌 뉴클레오티드를 포함하는 CMP-시알산 재순환 시스템, 포스페이트 공여체로부터 뉴클레오시드 디포스페이트로 포스페이트를 이동시킬 수 있는 키나제, 및 말단 포스페이트를 뉴클레오시드 트리포스페이트로부터 CMP로 이동시킬 수 있는 뉴클레오시드 모노포스페이트 키나제를 추가로 포함할 수 있다. 예컨대, 적합한 CMP-시알산 재생 시스템은 시티딘 모노포스페이트(CMP), 뉴클레오시드 트리포스페이트(예컨대, 아데노신 트리포스페이트(ATP)), 포스페이트 공여체(예컨대, 포스포에놀파이루베이트 또는 아세틸 포스페이트), 포스페이트를 포스페이트 공여체로부터 뉴클레오시드 디포스페이트로 이동시킬 수 있는 키나제(예컨대, 파이루베이트 키나제 또는 아세테이트 키나제), 및 말단 포스페이트를 뉴클레오시드 트리포스페이트로부터 CMP로 이동시킬 수 있는 뉴클레오시드 모노포스페이트 키니아제(예컨대, 미오키나제)를 포함한다. 또한, 전술한 α(2,3)시알릴트란스페라제 및 CMP-시알산 합성 효소는 정식으로는 CMP-시알산 재생 시스템의 일부로서 볼 수 있다. CMP-시알산 재순환 시스템이 사용되지 않는 양태의 경우, 반응 매질은 바람직하게는 포스파타제를 추가로 포함한다.
파이루베이트는 시알릴트란스페라제 사이클의 부산물이며, NeuAc 알도라제(EC 4.1.3.3)의 존재하에 N-아세틸만노즈아민(ManNAc)와 파이루베이트를 반응시켜 시알산을 형성하는 다른 반응에서 이용될 수 있다. 또는, GlcNAc의 ManNAc로의 이성체화를 이용할 수 있으며, 덜 비싼 GlcNAc를 시알산 생성의 출발 물질로서 사용할 수 있다. 따라서, 시알산은 ManNAc(또는 GlcNAc) 및 촉매량의 NeuAc 알도라제에 의해 대체될 수 있다. NeuAc 알도라제도 역반응(NeuAc로부터 ManNAc 및 파이루베이트로의)을 촉진시킬 수 있으나, 생성된 NeuAc는 CMP-시알산 합성 효소에 의해 촉진된 CMP-NeuAc을 거치는 반응 사이클로 비가역적으로 혼입된다. 또한, 출발 물질인 ManNAc는 또한 당해 기술에서 공지된 방법(예컨대, 사이몬(Simon) 등의 문헌[J. Am. Chem. Soc. 110:7159(1988)]을 참고한다)을 사용하여 GlcNAc의 화학적 전환에 의해 제조될 수 있다. 시알산 및 그의 9-치환된 유도체의 효소적 합성법 및 생성된 시알산의, 상이한 시알릴화 반응 방법에서의 용도가 1992년 10월 1일자로 공개된 국제 출원 WO 92/16640호에 기재되어 있으며, 상기 문헌은 본원에서 참고문헌으로 인용된다.
올리고사카라이드의 효소적 합성을 위해 갈락토실트란스페라제가 사용될 때, 반응 매질은 갈락토실트란스페라제, 공여체 기질, 수용체 당 및 이가 금속 양이온 이외에, 수용체 당 1몰당 1몰이상의 글루코즈-1-포스페이트, 포스페이트 공여체, 포스페이트 공여체로부터 뉴클레오시드 디포스페이트로 포스페이트를 이동시킬 수 있는 키나제, 및 UTP와 글루코즈-1-포스페이트로부터 UDP-글루코즈를 형성할 수 있는 피로포스포릴라제를 포함하는 공여체 기질 재순환 시스템, 및 촉매량의 UDP와 UDP-갈락토즈-4-에피머라제를 함유하는 것이 바람직하다. 예시적인 갈락토실트란스페라제는 α(1,3)갈락토실트란스페라제(E.C.No.2.4.1.151, 다코브스키(Dabkowski) 등의 문헌[Transplant Proc. 25:2921(1993)] 및 야마모토(Yamamoto) 등의 문헌[Nature 345:229-233(1990)]을 참고한다) 및 β(1,4)갈락토실트란스페라제 (E.C.No.2.4.1.38)를 포함한다.
다른 효소적 방법에 의해 합성된 올리고사카라이드가 또한 본 발명의 방법에 의해 정제될 수 있다. 예컨대, 본 방법은 사카라이드를 수용체 분자로 이동시키고 이에 결합시키는데 효과적인 조건하에서, 글리코실트란스페라제와 함께 활성화된 사카라이드 및 적절한 수용체 분자의 단순 배양과 같은 비순환적 또는 부분 순환적 반응에서 생성된 올리고사카라이드를 정제하는데 유용하다. 미국 특허 제 5,180,674호 및 국제 특허 공개공보 제 WO93/13198 및 WO95/02683호에 기재된 것들을 포함하는 글리코실트란스페라제는, 나이세리아(Neisseria)속 중 los 유전자좌가 코딩하는 글리코실트란스페라제와 마찬가지로 세포 표면에 결합되거나 비결합될 수 있다. 이러한 글리코실트란스페라제를 사용하여 수득할 수 있는 올리고사카라이드는, 예컨대 다수의 올리고사카라이드 중에서 Galα(1→4)Galβ(1→4)Glc, GlcNAcβ(1,3)Galβ(1,4)Glc, Galβ(1→4)GlcNAcβ(1→3)Galβ(1→4)Glc 및 GalNAcβ(1→3)Galβ(1→4)GlcNAcβ(1→3)Galβ(1→4)Glc를 포함한다.
기술된 방법을 사용하여 정제시킬 수 있는 화합물은 시알산 및 시알산 잔기를 갖는 임의의 당이다. 이들은 하기 화학식을 갖는 화합물 뿐만 아니라 시알릴 락토사이드를 포함하는 시알릴 갈락토사이드를 포함한다:
NeuAcα(2→3)Galβ(1→4)GlcN(R')β-OR 또는
NeuAcα(2→3)Galβ(1→4)GlcN(R')β(1→3)Galβ-OR
상기식에서,
R'는 탄소수 1 내지 18의 알킬 또는 아실, 5,6,7,8-테트라하이드로-2-나프트아미도; 벤즈아미도; 2-나프트아미도; 4-아미노벤즈아미도; 또는 4-니트로벤즈아미도이다. R은 수소, 알킬 C1-C6, 사카라이드, 올리고사카라이드 또는 탄소수가 1 이상인 아글리콘기이다.
탄소수가 1 이상인 아글리콘기"란 용어는 -A-Z 기(여기서, A는 할로겐, 티올, 하이드록시, 산소, 황, 아미노, 이미노 또는 알콕시로 선택적으로 치환된 탄소수 1 내지 18의 알킬렌기이고, Z는 수소, -OH, -SH, -NH2, -NHR1, -N(R1)2, -CO2H, -CO2R1, -CONH2, -CONHR1, -CON(R1)2, -CONHNH2 또는 -OR
1(이때, 각각의 R1은 각각 탄소수 1 내지 5의 알킬이다)이다. 또한, R은 (이때, n,m,o는 1 내지 18임), (CH2)n-R2(이때, n은 0 내지 18이고, R2는 1종 이상의 알콕시기, 바람직하게 메톡시 또는 O(CH2)mCH3(이때, m은 0 내지 18이다)로 치환된, 다양하게 치환된 방향족 고리, 바람직하게 페닐기이다) 또는 이들의 조합이다. R은 또한 3-(3,4,5-트리메톡시페닐)프로필일 수 있다.
본 발명은 또한 셀렉틴-결합 탄수화물 잔기를 포함하는 다양한 화합물을 정제시키기에 유용하다. 이들 셀렉틴-결합 잔기는 하기 화학식 1을 갖는다:
상기식에서,
R0는 (C1-C8 알킬)카보닐, (C1-C8 알콕시)카보닐 또는 (C2-C9 알케닐옥시)카보닐이고, R1은 올리고사카라이드 또는 하기 일반식의 기이다:
상기식에서,
R3 및 R4는 같거나 다를 수 있고, H, C1-C8 알킬, 하이드록시-(C1-C8 알킬), 아릴-(C1-C8 알킬) 또는 (C1-C8 알콕시)-(C1-C8 알킬), 치환되거나 비치환될 수 있다. R2는 H, C1-C8 알킬, 하이드록시-(C1-C8 알킬), 아릴-(C1-C8 알킬), (C1-C8 알킬)-아릴, 알킬티오, α1,2Man, α1,6GalNAc, β1,3Galβ1,4Glc, α1,2Man-R8, α1,6GalNAc-R8 및 β1,3Gal-R8일 수 있다. R8은 H, C1-C8 알킬, C1-C8 알콕시, 하이드록시-(C1-C8 알킬), 아릴-(C1-C8 알킬), (C1-C8 알킬)-아릴 또는 알킬티오일 수 있다. 상기식에서, m 및 n은 정수이고, 3 또는 4일 수 있고; p는 0 또는 1일 수 있다.
전술한 치환기는 하이드록시, 하이드록시(C1-C4 알킬), 폴리하이드록시(C1-C
4 알킬), 알카노아미도 또는 하이드록시알카노아미도 치환체에 의해 치환될 수 있다. 바람직한 치환체는 하이드록시, 폴리하이드록시(C3 알킬), 아세트아미도 및 하이드록시아세트아미도를 포함한다. 치환된 라디칼은 하나 이상의 치환체를 가질 수 있고, 이는 같거나 다를 수 있다.
R1는 올리고사카라이드인 양태에서, 올리고사카라이드는 바람직하게는 트리사카라이드이다. 바람직한 트리사카라이드는 NeuAcα2,3Galβ1,4GlcNAcβ1,3 또는 NeuGcα2,3Galβ1,4GlcNAcβ1,3을 포함한다.
양태에서, R1은 하기 일반식을 갖는 기이다:
상기식에서,
R3 및 R4는 바람직하게 -R5- 또는 -(R6)q-O-(R7)r-(이때, R5는 치환되거나 치환되지 않은 C3-C7이고, R6 및 R7은 같거나 다르고, 치환되거나 비치환된 C1-C6의 2가 알킬이다. 상기식에서, q 및 r은 같거나 다를 수 있는 정수이고, 0 또는 1이다. q 및 r의 합계는 항상 1이상이다)이고,
R3 및 R4에 의해 형성된 단일 라디칼에 대해 보다 바람직한 구조는 하기 일반식을 갖는 구조이다:
-(R6)-O-
상기식에서,
R6은 치환되거나 치환되지 않은 C3-C4 2가 알킬이다. 예컨대, R6은 일반식 -CH2-CH2-CH2-CH2-이고, 바람직하게 치환된다. 라디칼은 하이드록시, 폴리하이드록시(C3 알킬) 및 치환되거나 비치환된 알카노아미도기(예: 아세트아미도 또는 하이드록시아세트아미도)으로 치환될 수 있다. 치환된 구조는 전형적으로 모노사카라이드, 바람직하게 Gal 잔기에 α2,3 결합된 NeuAc 또는 NeuGc과 같은 시알산을 형성할 것이다.
상기식에서, m 및 n은 정수로서, 3 또는 4일 수 있다. 따라서, 한가지 구조에서 Gal은 β1,4 결합되고, Fuc는 GlcNAc에 α1,3 결합된다. 상기 화학식은 SLex 테트라사카라이드를 포함한다. SLex는 화학식 NeuAcα2,3Galβ1,4(Fucα1,3)GlcNAcβ1-를 갖는다. 상기 구조는 LECCAM을 갖는 세포에 의해 선택적으로 인식된다. 본 발명의 방법을 사용하여 정제될 수 있는 SLex 화합물은 NeuAcα2,3Galβ1,4 (Fucα1,3)GlcNAcβ1-Gal-OEt, NeuAcα2,3Galβ1,4(Fucα1,3)GlcNAcβ1,4Galβ1-OEt 및 국제특허 공개공보 WO 91/19502에 기술된 것을 포함한다. 상기 방법을 사용하여 정제시킬 수 있는 다른 화합물은 하기 화학식 2를 갖는 미국 특허 제 5,604,207 호에 기술된 것을 포함한다:
상기식에서,
Z는 수소, C1-C6 아실 또는 이고;
Y는 C(O), SO2, HNC(O), OC(O) 및 SC(O)로 이루어지는 군으로부터 선택되고;
R1은 아릴, 치환된 아릴 및 페닐 C1-C3 알킬렌기로 이루어지는 군으로부터 선택되고, 이때 아릴 치환체는 할로, 트리플루오로메틸, 니트로, C1-C18 알킬, C1-C
18 알콕시, 아미노, 모노-C1-C18 알킬아미노, 디-C1-C18 알킬아미노, 벤질아미노, C1-C18 알킬벤질아미노, C1-C18 티오알킬 및 C1-C18 알킬 카복스아미도기로 이루어지는 군으로부터 선택되고;
R1Y는 알릴옥시카보닐 또는 클로로아세틸이고;
R2는 β1,3Gal-OR(이때, R은 H, 알킬, 아릴 또는 아실이다)을 포함하는 모노사카라이드, 디사카라이드, 수소, C1-C18 직쇄, 분지쇄 또는 환형 하이드로카빌, C1-C6 알킬, 3-(3,4,5-트리메톡시페닐)프로필, C1-C5 알킬렌 ω-카복실레이트, ω-삼치환된 실릴 C2-C4 알킬렌이고, 이때 상기 ω-삼치환된 실릴은 C1-C4 알킬, 페닐로 이루어지는 군으로부터 각각 선택되는 3개의 치환체를 갖는 실릴기이거나;
OR2는 함께 C1-C18 직쇄, 분지쇄 또는 환형 하이드로카빌 카바메이트를 형성하고;
R3는 수소 또는 C1-C6 아실이고;
R4는 수소, C1-C6 알킬 또는 벤질이고;
R5는 수소, 벤질, 메톡시벤질, 디메톡시벤질 및 C1-C6 아실로 이루어지는 군으로부터 선택되고;
R7은 메틸 또는 하이드록시메틸이고; 및
X는 C1-C6 아실옥시, C2-C6 하이드록실아실옥시, 하이드록시, 할로 및 아지도로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
화학식 1에 포함된 구조의 관련 세트는 Gal이 β1,3 결합되고, Fuc가 α1,4 결합된 것이다. 예컨대, 테트라사카라이드, NeuAcα2,3Galβ1,3(Fucα1,4)GlcNAcβ1(본원에서 SLex로 지칭함)는 셀렉틴 수용체로 이해된다. 문헌[Berg 등, J. Biol. Chem., 266:14869-14872(1991)] 참조. 특히, 베르그(Berg) 등은 세포가 SLea를 포함하는 네오글리코프로틴에 선택적으로 결합된 E-셀렉틴 cDNA로 형질변화되는 것을 나타낸다.
본 발명의 방법은, 또한 Galα1,3Galβ1,4Glc(R)β-O-R1(이때, R1은 -(CH2)
n-COX이고, X는 OH, OR2, -NHNH2이고, R은 OH 또는 NAc이고, R2는 수소, 사카라이드, 올리고사카라이드 또는 탄소수가 1 이상인 아글리콘기이고, n은 2 내지 18, 보다 바람직하게 2 내지 10의 정수이다)을 포함하는 일반식 Galα1,3Gal을 갖는 올리고사카라이드 화합물을 정제하기에 유용하다. 예컨대, 실시예 7 내지 8에 기술된 절차를 사용하여, 일반식 Galα1,3Galβ1,4GlcNAcβ-O-(CH2)5-COOH를 갖는 화합물을 정제할 수 있다. 본 발명에 따라 정제될 수 있는 화합물은 또한 락토-N-네오테트라오즈(LNnT), GlcNAcβ1,3Galβ1,4Glc(LNT-2), 시알릴(α2,3)-락토즈 및 시알릴(α2,6)-락토즈이다.
상기 설명에서, 상기 용어들은 일반적으로 그의 표준 의미에 따라 사용된다. 본원에 사용된 바와 같이, "알킬"이란 용어는 메틸, 에틸, n-프로필, 부틸, n-헥실 등과 같은 탄소수 1 내지 8의 저급 알킬, 시클로알킬(탄소수 3 내지 7), 시클로알킬메틸(탄소수 4 내지 8) 및 아릴알킬을 포함하는, 탄소수 1 내지 20을 갖는 분지되거나 분지되지 않은, 포화되거나 불포화된, 1가 또는 2가의 탄화수소 라디칼을 의미한다. "알콕시"란 용어는 산소에 의해 분자의 나머지에 부착된 알킬 라디칼(예, 에톡시, 메톡시 또는 n-프로폭시)을 지칭한다. "알킬티오"란 용어는 황에 의해 분자의 나머지에 부착된 알킬 라디칼을 지칭한다. "아실"이란 용어는 하이드록실기를 제거하여 유기산으로부터 유도된 라디칼을 지칭한다. 예로는 아세틸, 프로피오닐, 올레오일, 미리스토일을 들 수 있다.
"아릴"이란 용어는 한개의 원자를 제거하여 방향족 탄화수소로부터 유도된 라디칼(예, 벤젠으로부터 유도된 페닐)을 지칭한다. 방향족 탄화수소는 1종 이상의 불포화 탄소 고리(예: 나프틸)를 가질 수 있다.
"알콕시"란 용어는 산소에 의해 분자의 나머지에 부착된 알킬 라디칼(예: 에톡시, 메톡시 또는 n-프로폭시)을 지칭한다.
"알킬티오"란 용어는 황에 의해 분자의 나머지에 부착된 알킬 라디칼을 지칭한다.
"알카노아미도"라디칼은 일반식 -NH-CO-(C1-C6 알킬)을 갖고, 치환되거나 치환되지 않을 수 있다. 치환되는 경우에, 치환체는 전형적으로 하이드록실이다. 상기 용어는 구체적으로 2개의 바람직한 구조, 아세트아미도, -NH-CO-CH3 및 하이드록시아세트아미도, -NH-CO-CH2-OH를 포함한다.
"헤테로사이클릭 화합물"이란 용어는 3개 이상의 원자를 갖는 고리 화합물을 지칭하고, 이때 하나 이상의 원자가 탄소 이외의 원자(예: N, O, S, Se, P, 또는 As)이다. 이러한 화합물의 예로는 푸란(푸코즈와 같은 펜토즈의 푸라노즈 형태를 포함함), 피란(글루코즈 및 갈락토즈와 같은 헥소즈의 피라노즈 형태를 포함함), 피리미딘, 푸린, 피라진 등을 포함한다.
본 발명의 방법은 새롭게 합성되는 탄수화물의 정제 뿐만 아니라 분해 생성물(예: 효소 분해)의 정제에 유용하다. 올리고사카라이드의 분해를 촉진하는 효소의 실례로 문헌[Sinnott,M.L., Chem. Rev. 90: 1171-1202(1990)]을 참고로 한다.
본 발명은 또한 뉴클레오티드, 뉴클로오티드 당 및 관련 화합물에 대한 정제 방법을 제공한다. 예컨대, 뉴클레오티드 당(예, GDP-푸코즈, GDP-만노즈, CMP-NeuAc, UDP-글루코즈, UDP-갈락토즈, UDP-N-아세틸갈락토즈아민 등)은 본원에 기술된 방법에 의해 정제될 수 있다. 상기 방법은 또한 뉴클레오티드 및 다양한 상태로 포스포릴화된 뉴클레오티드(예, CMP, CDP, CTP, GMP, GDP, GTP, TMP, TDP, TTP, AMP, ADP, ATP, UMP, UDP, UTP) 뿐만 아니라 이들 및 다른 뉴클레오티드의 데옥시 형태를 정제하기에 유용하다.
하기 실시예는 단지 예시의 목적으로 제공되는 것이지 본 발명을 제한하거나 한정하는 것은 아니다.
실시예 1 내지 5는 시알릴 락토즈의 합성 및 나노 여과 및 이온 교환를 사용한 그의 정제를 설명한다. 요약해서, N-아세틸-D-만노즈아민(ManNAc)은 염기 조건하에서 N-아세틸-D-글루코즈아민(GluNAc)로부터 제조되었다. ManNAc를 파이루브산 나트륨으로 축합하여 시알산을 효소적으로 제조하였다. 시알릴트란스페라제 사이클을 사용하여 시알산을 시알릴 락토즈로 변환시켰고, 이후 이를 나노 여과 및 이온 교환에 의해 정제하였다. 실시예 6은 나노 여과에 의한 유기염 및 무기염의 분리를 설명한다. 실시예 7은 폴리벤즈아미드 나노 여과막의 분리 특징을 설명한다. 실시예 8은 폴리아미드 나노 여과막의 분리 특징을 설명한다.
실시예 1
시알산의 합성 및 정제
본 실시예는 ManNAc 또는 시알산에 비해 상대적으로 값싼 기질인 GlcNAc를 사용하여 시알산을 합성하는 방법을 설명한다. 시몬(Simon) 등의 문헌[J. Am. Chem. Soc. 110; 7159(1998)]에 기재된 바와 유사한 방법을 사용하여 GlcNAc를 ManNAc로 전환하였다. 간단하게 GlcNAc(1000g, 4.52몰)을 물(500ml)에 용해시켰다. 50% NaOH(115ml 이하)로 pH를 12.0으로 조정하였다. 용액을 아르곤하에서 7.5시간동안 교반한 후, 빙욕에서 냉각하고 진한 HCl(200ml 이하)로 pH를 7.7로 조정하였다. 이후 시알산을 ManNAc의 알돌 축합반응으로 제조하였다.
시알산을 수득하기 위해, 이전 단계에서 제조된 ManNAc를 N-아세틸뉴라민산(Neu5Ac) 알돌라제 및 파이루브산으로 매개하여 알돌 축합하였다. 염기 촉매된 에피머화 반응으로부터 약 57g(0.258몰)의 ManNAc 및 193g의 GlcNAc를 함유하는 1.5L 수용액에 123.8g(1.125몰)의 파이루브산 나트륨, 1.5g 소 혈청 알부민, 및 0.75g 나트륨 아자이드를 첨가하였다. pH를 7.5로 조정하였고 시알산 알돌라제를 11,930U 첨가하였다. 용액을 7일동안 37℃에서 배양했다. 아미넥스(Aminex) HPX87H(BioRad) 컬럼(0.004M H2SO4, 0.8ml/분, A220에서 모니터함)에서의 HPLC 분석은 용액이 0.157M 시알산(ManNAc의 91% 변환, 0.235몰)을 함유함을 나타냈다.
실시예 2
시알릴트란스페라제 사이클을 이용한 시알릴 락토즈의 합성
실시예 1에서 제조한 시알산에 락토즈 일수화물(79.2g, 0.22몰), 0.7g의 소 혈청 알부민, 포스포에놀파이루베이트 1칼륨 염(37g, 0.22몰)을 첨가하였고, pH를 7.5로 조정하였다. CMP(2.84g, 0,0088몰), ATP(0.54g, 0.0009몰)을 첨가하였고, pH를 7.5로 재조정하였다. 나트륨 아자이드(0.35g)을 첨가하였고, 효소인 파이루베이트 키나제(19,800U), 미요키나제(13,200U), CMP 시알산 합성효소(440U), 및 시알릴트란스페라제(165U)를 첨가하였다. 1M의 MnCl2 66ml를 첨가하였고 마지막 부피를 2.2L가 되도록 물로 조정하였다. 반응은 실온에서 수행하였다.
반응을 매일 박층 크로마토그래피(TLC)로 점검하였고 [Mn2+]를 이온 크로마토그래피로 결정하였다. 첨가/조정을 하기 표 1에 나타낸 바와 같이 수행하였다:
시알릴 락토즈 수율은 TLC로 결정하는 경우 약 70 내지 80%이었다.
실시예 3
시알릴트란스페라제 사이클을 사용한 시알릴 락토즈의 합성
본 실시예는 망간 이온 농도를 조절하면서 시알릴트란스페라제 사이클을 사용하여 α-N-아세틸뉴라민산(2,3)β-갈락토실(1,4)글루코즈를 제조하는 방법을 설명한다.
폴리프로필렌 용기에 포스포에놀파이루베이트 트리나트륨 염(285.4g, 1.22몰) 및 시알산(197g, 0.637몰)을 물 5L에 용해시키고 6M의 NaOH로 pH를 7.1로 조정하였다. 시티딘-5'-모노포스페이트(5.14g, 15.9밀리몰) 및 염화칼륨(7.9g, 0.106몰)을 첨가하고 6M의 NaOH로 pH를 7.45로 재조정하였다. 파이루베이트 키나제(28,000단위), 미요키나제(17,000단위), 아데노신 트리포스페이트(0.98g, 1.6몰), CMP NeuAc 합성효소(1325단위), α2,3 시알릴트란스페라제(663단위) 및 MnCl2·4H2O(52.4g, 0.265몰)을 첨가하고 혼합하였다. 생성된 혼합물중 3.7L 부분에 락토즈(119g, 0.348몰) 및 나트륨 아자이드(1.75g)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에 유지시키고 매일 박층 크로마토그래피(TLC) 및 이온 크로마토그래피로 점검하였다. 이틀후 추가로 파이루베이트 키나제(38,100단위), 미요키나제(23,700단위), CMP NeuAC 합성효소(935단위), 및 α2,3 시알릴트란스페라제(463단위)를 첨가하였다. 6M의 NaOH로 pH를 7.5로 주기적으로 조정하였다. 추가로, 망간 이온의 농도를 하기 표 2에 나타낸 바와 같이 측정하여 보충하였다.
9일째에, 필수적으로 TLC로 반응을 종결하였다. 표의 결과가 나타내는 바와 같이 Mn++ 이 감소하기 때문에 금속 이온 농도를 유지하기 위해서 거의 매일 추가량의 MnCl2·4H2O를 첨가하였다. 망간 이온은 시알릴트란스페라제 사이클에서 하나 이상의 효소에 요구되는 보조 인자이다. 그러나 생성된 망간 이온과 무기성 포스페이트는 매우 낮은 용해도를 갖는 착체를 형성한다. 이러한 한정된 용해도 때문에트란스페라제 사이클은 계속 진행될 수 있기는 하지만 반응 속도는 감소된다. 피로포스페이트와 함께 침전되어 손실된 망간 이온을 보충함으로써, 반응 속도를 유지시킬 수 있다. 따라서, 망간 이온의 농도가 적정 범위내로 유지될 때, 시알릴트란스페라제 반응 사이클이 완결될 수 있다.
실시예 4
이온 교환 및 역 삼투를 사용한 시알릴락토즈의 정제
본 실시예는 실시예 2에서 제조되어 과아세틸화 및 에스테르화된 트리사카라이드의 후처리 및 정제를 설명한다. 적절한 보조 인자의 존재하에 락토즈(55g)에 대한 시알릴트란스페라제의 반응으로 제조된 나트륨 5-아세트아미도-3,5-디데옥시-α-D-글리세로-D-갈락토-노눌로피라노실로네이트-(2-3)-O-β-D-갈락토피라노실-(1-4)-O-β-D-글루코피라노즈의 용액(2L)을 종이로 여과하였다. 3,000 또는 10,000분자량이 분리하한인 막으로 여액을 통과시켜 목적하는 생성물로부터 단백질을 제거하였다. 용출액을 농축시키고 이것을 적절한 기구(Cat. No. CDRN500 60, 밀리포어(미국 메사츄세츠주 베드포드 소재))의 폴리아미드 역 삼투막에 대해서 작동시켜 탈염하였다. 생성물을 함유하는 잔류물을 뻑뻑한 시럽이 되도록 증발시켰다. 선택적으로 잔류물을 킬레이트화 수지로 처리하여 두자리 배위성 양이온을 제거할 수 있다. 여과후 여액은 실질적으로 염이 없고 1H NMR 분광법에 나타난 바와 같이 고도의 순도를 갖는 목적하는 생성물을 함유하였다. 다르게는 시럽을 피리딘(2×200mL)으로 2회 증발시켰다. 증발 플라스크를 피리딘(1.2L)중의 N,N-디메틸아미노피리딘(2.2g) 용액으로 채웠다. 아세트산 무수물(0.83L)를 1시간동안 첨가하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 천천히 회전시키면서 24 내지 48시간동안 방치하였다. 반응을 TLC(메탄올:디클로로메탄 1:9)로 확인하였다. 반응을 완결할 때 진공을 사용하여 용액을 증발시켜서 잔여물을 수득하였다.
잔여물을 에틸 아세테이트(1.5L)에 용해시켰다. 이 용액을 5% 염산 수용액(1.5L), 포화된 중탄산 나트륨 수용액(1.5L), 물(1.5L)로 차례로 세척하였다. 유기층을 무수 황산 나트륨으로 건조시키고 여과하였다. 여액을 반-고체 잔여물이 되도록 농축하였다. 과산소-아세틸화된 락톤 트리사카라이드(69g)를 메탄올(350mL)에 용해시키고 메톡시화 나트륨(17.5mL, 메탄올중 25% 용액)을 첨가하고, 이어서 물(3.5mL)을 첨가하였다. 7:1:2의 이소프로판올:수산화 암모늄:물로 전개하여 TLC에서 반응이 완결되었음을 나타낼 때, 아세트산(2mL)을 용액에 첨가하였다. 에틸 에테르(180mL)를 용액에 첨가하여 생성물을 침전시켰다. 이 고체를 여과하여 물(350mL)에 용해시켰다. 이 용액에 차콜(24g)을 첨가하여 1시간동안 60℃로 가열하였다. 이 용액을 주변 온도로 냉각시키고 여과하였다. 여액을 증발시켜서 고체 생성물(34g)을 수득하였다. 1H-NMR 분광법은 이 고체가 11중량%의 아세트산 나트륨을 함유하는 순수한 시알릴 락토즈임을 나타냈다.
실시예 5
나노 여과를 사용한 시알릴 락토즈의 정제
실시예 2에서 설명한 것과 유사한 반응 혼합물을 10kDa의 MWCO를 갖는 한외여과막을 사용하여 여과시켜 단백질을 제거하였다. 하기 기재된 표준 포스포러스 분석 방법에 의해 측정한 경우 포스페이트 농도[PO4
3-]는 2.8mM보다 컸다.
진한 염산(약 500ml)으로 용액을 pH 3.0으로 조정하였다. 투과하는 용액의 전도도가 변하지 않고 유지될 때까지 이후 5시간동안 pH 3에서 오스모닉스 213T 막 정제기(막 유형 MX07)로 용액을 정제하였다. 용액을 기계로부터 씻어내고, 합쳐진 헹굼용액 및 공급용액을 pH가 7.4가 될 때까지 NaOH로 처리하였다. Mn2+ 농도를 하기에 기재한 바와 같이 HPLC로 측정하였다. 나노 여과의 변수는 다음과 같다:
구동 압력: Pf=100psi
농축물 유속: Qc=5GPM
투과물 유속: Qf=7GPH
온도 범위: 20 내지 40℃
부피: 5갤론
초기 투과의 전도도는 28.1mS이었고, 5시간의 재순환 후에 전도도는 115μS로 떨어졌고, 포스페이트 농도[PO4
3-]는 770μM으로 감소하였고 망간 농도[Mn2+]는 3.4mM이었다.
이후 용액을 pH7.4로 조정하였고 추가로 막 정제기계(오스모닉스, 막 유형 MX07)로 약 1시간동안 투과 용액의 전도도가 변하지 않고 유지될 때까지 추가로 정제하였다. 용액을 막 기계로부터 씻어내었다. 나노 여과의 변수는 다음과 같다:
구동 압력: Pf=100psi
농축물 유속: Qc=5GPM
투과물 유속: Qf=0.3GPM
온도 범위: 20 내지 40℃
부피: 5갤론
여과의 결과는 다음과 같다:
전도도: 초기 투과 전도도: 2.01mS
5시간 재순환 후: 93.7μS
포스페이트 농도: [PO4
3-]=410μM
망간 농도: [Mn2+]=3.0mM
상기 용액(6갤론)을 AG50WX8(H+) 수지(BioRad, 1.18Kg)으로 처리하고 pH가 2.0이 될 때까지 2시간동안 교반하였다. 수지를 여과하여 매우 밝은 황색 용액을 수득하였다. 단지 소량의 [Mn2+]이 HPLC로 검출되었다. 이후 용액을 pH 7.4로 NaOH(50% w/w)를 사용하여 중화하였다.
수지 처리전: [Mn2+]=3mM; [PO4
3-]=410μM
수지 처리후: pH=3, [Mn2+]=1.23mM; pH=2, [Mn2+]=6.8μM; [PO4
3-]=190μM
상기 용액의 임의의 소량의 부분을 AG1X8(아세테이트 형태) 수지로 추가로 처리하여 포스페이트를 제거하였다. 결과를 하기 표 3에 나타낸다.
용액을 하기 조건하에 5시간 동안 삼투막 정제 기계(오스모닉 MX07)를 사용하여 용액을 재순환시킴으로써 추가로 정화시켰다:
구동 압력: Pf = 100psi
농축물 유속: Qcs = 5GPM
투과물 유속: Qf = 0.2GPM
온도 범위: 20 내지 40℃
부피: 5갤론
이의 결과는 투과 전도도는 초기에 0.136mS이고, 5시간 분리시킨 후에는 45μS이었다.
이어, 용액을 3 내지 4L로 농축시키고, 이후에, 활성탄(J.T. 베이커(Baker), 180g)을 첨가하였다. 현탁액을 2시간 동안 55℃에서 가열하였다. 이어, 활성탄을 여과에 의해 제거하여 매우 밝은 황색 용액을 수득하고, 이를 동결건조시켜 백색 고형물을 수득하였다.
전술한 바와 같이 정제된 시알릴 락토즈 용액에 대한 분석 데이타를 표 4에 제시한다.
미지의 샘플(100μ)을 증류수(775μL)로 희석시켰다. 이어, 용액을 산 몰리브데이트((2.5N의 H2SO4내에 암모늄 몰리브데이트 1.25g을 용해시킴으로써 제조됨) 100μL 및 피스카 수바 로우 용액(Fiska Subba Row Solution)(시그마(Sigma)로부터 분말로서 시판중이고, 제조업자의 지시에 따라 제조됨) 25μL로 처리하였다. 혼합물을 7분 동안 100℃에서 가열하면, 810nm의 흡수도를 기록하였다. 포스페이트 기준 곡선과 흡수도를 비교하여 농도를 측정하였다.
Mn2+ 농도의 측정에 대한 2HPLC 분석을 하기와 같은 조건하에 수행한다:
컬럼: 알테크 유니버살 캐타이온 컬럼(Alltech Universal Cation column), 0.46 × 10cm
검출기: 알테크 모델(Alltech model) 320 전도도 검출기
이동상: 3mM의 프탈산, 0.5mM의 디피콜린산
유속: 1.5mL/분
컬럼 오븐 온도: 35℃
실시예 6
나노 여과에 의한 유기염과 무기염의 분리
다양한 나노 여과막을 다양한 유기 화합물 및 무기염을 수용액으로부터 분리시키는 능력에 대해 시험하였다. 특정 화합물의 이온 전하를 조정함으로써 막의 분리 프로파일이 조절될 수 있는지에 대해 상이한 2가지 pH에서 시험하였다. 이의 결과를 표 5에 제시한다.
시험된 나노 여과막은 미네소타주 미네톤카 소재의 오스모닉스 인코포레이티드에 의해 제조된 MX07, SX12 및 B006 및 오스모닉스 디살리네이션 시스템(Osmonics, DeSalination Systems)에 의해 제조된 DL2540이었다. MX07 막을 상기 실시예 5에 기술된 바와 같이 사용하였다. 나머지 막에 대한 변수를 표 6에 제시하였다.
실시예 7
폴리벤즈아미드 나노 여과막의 분리 특성
본 실시예는 폴리벤즈아미드 막(YK, 오스모닉스)이 편평한 시이트형 및 나선형 둘 모두 당의 정제에 효과적임을 나타내는 실험을 기술한다. pH 수준의 변화에 대한 막에서의 당 및 염의 투과율 및 보유율을 시험하였다.
재료 및 방법
A. 편평한 시이트 및 나선형 기계 작동 및 막의 제조예
막 YK를 갖는 데살 멤브레인 기계(Desal membrane machine)(미국 캘리포니아주 에스콘디도 소재의 오스모닉스 디살리네이션 시스템)를 우선 각각 증류수 약 1L를 사용하여 4 또는 5회 헹궈서 세척하였다. 물을 공급 탱크내로 붓고, 약 1분 동안 순환시키고(약 100psi), 배수 밸브를 사용하여, 즉 이를 개방 위치상태로 시계 반대방향으로 돌려 물을 비웠다. 물을 비운 후, 밸브를 잠그고, 공정을 4 또는 5회 반복 수행하였다. 헹군 후, 물 약 1L 이상을 첨가하였다. 시스템을 30분 동안 압력 150psi에서 재순환시킨 후, 이를 비웠다. 이어, 막을 포함하는 시스템을 하기 실험에 사용하였다.
각각의 실험을 완결시킨 후, 기계를 전술한 바와 같이 3 또는 4회 물로 세척하였다. 이어, 물 약 1L를 100 내지 150psi에서 약 15 내지 20분 동안 재순환시키고, 기계에서 물을 비웠다. 때때로, 시험 화합물의 일부가 장치내에 여전히 남아있을거라 예상되는 경우, 상기 이외의 간단한 세척을 수행한 후 이를 수행하였다. 모든 샘플이 제거되었는지를 확인하기 위해 전도도를 항상 체크하였다. 전도도가 높게 나타나면, 오염물질이 실질적으로 검출되지 않을 때까지 기계를 세척하였다. 대부분의 이온성 화합물(MnCl2를 제외함)은 쉽게 제거되어, 단지 1 또는 2개의 부수적인 짧은 세척과정이 필요하였다.
B. 염의 시험
다양한 염의 보유성을 측정하기 위해, 하기 염중 10mM의 용액을 편평한 시이트 막으로 시험하였다: MnCl2, NaH2PO4, NaC3H3O3, NaOAc, Na4P2O7, 벤조산 나트륨, MgSO4, NaN3 및 NaCl. 염들중 하나의 용액 1L를 공급 탱크내에 붓고, 약 15분 동안 100psi에서 재순환시켰다. 상기 지점에서, 투과물 및 농축물 모두의 샘플을 수거하고, 전도도 측정기를 사용하여 측정하였다. 샘플을 매 5분 마다 수집하여 각각의 샘플에 대한 3개 이상의 수거물의 합계를 구하였다. 막을 통해 통과하는 염의 비(%)("투과율")를 투과물의 전도도를 농축물의 전도도로 나눠 계산하였다.
이어, 처음 수행을 끝낸 후, 용액의 pH를 가능하면 시험하게 될 염의 복합 산을 사용하여 pH 3.0으로 저하시켰다. 기계 내부의 용액이 잘 혼합되었는지를 확인하도록 pH를 조정하면서 용액을 재순환시켰다. 투과물 및 농축물의 전도도를 측정하면서 시험 공정을 반복 수행하였다. 이어, 용액을 공액결합된 염기를 사용하여 pH를 약 7.0으로 조정하고, 새로운 pH에서 이를 다시 반복 수행하였다. 또한, 투과물 및 농축물 모두의 전도도를 측정하였다.
C. 당의 시험
시험하는 당에는 시알릴 락토즈, 락토즈, N-아세틸 글루코즈아민, NeuAcα2,3Galβ1,4(Fucα1,3)GlcNAcβ1,4Galβ1-OEt(화합물 I), Galα1,3Galβ1,4GlcNAcβ-O-(CH2)5-COOH(화합물 II), LNT-2, LNnT, CMP, 시티딘 및 시알산이 포함된다. 당 용액(1L)을 공급 콘테이너내에 붓고, 10분 이상 동안 100psi에서 재순환시켰다. 투과물 및 농축물의 샘플을 10분에 수거하고, 투과물의 다른 샘플을 15분에 수거하였다. 샘플을 TLC에 의해 눈으로 비교하였다. 형성된 임의의 pH를 HCl 및/또는 NaOH를 사용하여 조정하였다.
결과
A. 편평한 시이트형 막
편평한 시이트 폴리벤즈아미드 나노 여과막(YV+페이퍼 백킹(paper backing)상의 YK 002(오스모닉스))의 다양한 염 및 당에 대한 보유성을 표 7에 제시한다. 25 내지 35℃의 온도에서 2 내지 8mL/분의 투과물 유속에서 실험을 수행하였다.
B. 나선형 막
나선형 폴리벤즈아미드 나노 여과막(YK1812CZA, 오스모닉스)의 다양한 염 및 당에 대한 보유성을 표 8에 제시한다. 25 내지 35℃ 온도에서, 3mL/초의 투과물 유속에서 실험을 수행하였다.
이러한 결과를 통해, YK002 편평한 시이트형 막 및 YK1812CZA 나선형을 이룬 막은 시알릴 락토즈 및 화합물 I 및 화합물 II, LNT-2 및 LNnT를 보유하면서, 이온성 화합물을 통과시키기 때문에 이러한 막의 형태는 이러한 사카라이드의 정제를 위한 우수한 선택이 된다.
실시예 8
폴리아미드 나노 여과막의 분리 특성
본 실시예는 당의 정제에 사용하기 위한, 편평한 시이트형 및 나선형의 다수의 폴리아미드 막에 대한 평가를 기술하고 있다. 당 및 염의 투과율 또는 보유율에 대해 다양한 PH에서 막을 시험하였다.
재료 및 방법
A. 편평한 시이트형 및 나선형으로 감긴 형태의 기기의 작동 및 막의 제조.
폴리아미드 막 G-5(GE: 오스모닉스)가 장착되어 있는 데살 막 기기(오스모닉스, 데살리네이션 시스템)을 각각 약 1ℓ의 증류수로 먼저 세척함으로써 완전히 세척하였다. 물을 공급 탱크에 붓고, 약 1 분동안 (약 100 psi) 회전시키고 배수용 밸브를 사용하여 비웠다. 물을 제거한 후 밸브를 잠그고 이러한 과정을 4 내지 5회 되풀이 하였다. 세척한 후, 약 1ℓ 보다 다량의 물을 첨가하였다. 이 시스템을 30분 동안 150 psi의 압력으로 재순환시킨 후, 물을 쏟아버렸다. 그다음, 용도 시험을 위해서 막을 포함하는 시스템을 준비하였다.
각각의 시험 후에, 기기를 전술한 바와 같이 3 내지 4회 세척하였다. 그다음, 약 1ℓ의 물을 약 15 내지 20 분 동안 100 내지 150 psi에서 재순환시킨 후, 기기를 비웠다. 선택적으로, 일부의 화합물이 기구내에 여전히 잔류하는 것이 의심스러운 경우에는 이후에 부가적으로 간단히 세척할 수도 있다. 모든 샘플이 제거되었음을 확인하기 위해서 항상 전도도를 측정하였다. 전도도가 높은 경우, 용기에서 실질적으로 오염물이 감지되지 않을 때까지 기기를 세척하였다. 대부분의 이온성 화합물(MnCl2 제외)은 쉽게 제거되기 때문에, 단지 1회 또는 2회의 부가적인 짧은 세척만이 요구된다.
B. 염의 시험
MnCl2, NaH2PO4, NaC3H3O3 및 NaCl의 10mM의 용액을 편평한 시이트형 막으로 시험하였다. 상기 염중의 하나의 1ℓ의 용액을 공급 탱크에 쏟아붓고 약 15분 동안 100 psi에서 재순환시켰다. 이 시점에서, 투과물 및 농축물 둘다의 샘플을 취해 전도도 계측기를 사용하여 전도도를 측정하였다. 이후에 매 5분마다 샘플을 수집하고, 이때 각각의 샘플에 대해 3개 이상의 샘플을 수집하여 수행하였다. 투과율은 투과물의 전도도를 농축물의 전도도로 나누어 계산하였다. 수행을 완료한 후, 가능한 경우 시험한 염의 복합 산을 사용하여, 용액의 pH를 pH 3.0으로 낮추었다. pH를 조절하면서 용액을 재순환시켜 기기 내부의 용액이 완전히 충분히 혼합하였다. 시험 방법을 되풀이하고 전술한 바와 같이 자료를 수집하였다. 그다음, 복합 염기를 사용하여 용액의 pH를 약 7.0으로 조절하고 신규한 pH에서 전술한 수행을 되풀이하였다. 그다음, 기기를 비우고 전술한 바와 같이 세척하였다.
C. 당의 시험
시험한 당은 시알릴 락토즈, 락토즈, NeuAcα2,3Galβ1,4(Fucα1,3) GlcNAcβ1,4Galβ1-OEt(화합물 I), Galα1,3Galβ1,4GlcNAcβ-O-(CH2)5-COOH(화합물 II), LNT-2 및 LNnT를 포함하였다. 당 용액(1ℓ)를 공급 용기에 쏟아붓고 10분 이상 동안 100 psi에서 재순환하였다. 투과물의 샘플 및 농축물의 샘플을 10분에 취하고 투과물의 다른 샘플을 15분에 취하였다. 샘플을 TLC로 가시적으로 비교하였다. 형성된 임의의 pH를 HCl 및/또는 NaOH를 사용하여 조절하였다. 당을 시험한 후, 이것을 파이렉스 플라스크로 이동시켜 다른 막에 대해 재사용하였다.
결과
A. 편평한 시이트형 막
다양한 염 및 당에 대한 편평한 시이트형 폴리아미드 나노 여과막(G-10(GE: 오스모닉스))의 보유 특성을 표 9에 제시하였다. 막의 A 값은 10.0이고 수돗물에 대한 투과율은 62.8(실온에서 2000 ppm MgSO4를 사용하여 시험함)이었다. 25 내지 35℃의 온도에서 시험을 수행하고 투과물의 유속은 5 내지 8㎖/분이었다.
또다른 시험에서, A-값이 8.0이고 수돗물 투과율이 38.9인 G-10(GH) 폴리아미드 막을 시험하였다. 시험은 25 내지 35℃에서 수행하였고, 투과물의 유속은 6 내지 8 ㎖/분이었다. 결과를 하기 표 10에 기술하였다.
G-5(GE) 폴리아미드 막(A-값: 3.9, 수돗물 투과율: 33.9)도 시험하였다. 시험을 25 내지 35℃에서 수행하고, 이때 투과물의 유속은 3-5 ㎖/분이었다. 결과를 하기 표 11에 제시하였다.
HL(오스모닉스) 폴리아미드 막의 당 및 염 보유 특성을 하기 표 12에 제시하였다. 실험은 25 내지 35℃에서 수행하였고 투과물의 유속은 8 내지 13㎖/분이었다.
B. 나선형 막
다수의 나선형 폴리아미드 막에 대한 당 및 염 보유 특성을 또한 측정하였다. GH1812CZA 막(오스모닉스)을 25 내지 35℃의 온도 및 1.5 내지 2㎖/초의 투과물의 유속에서 측정하였다. 결과를 하기 표 13에서 제시하였다.
GE1812CZA 나선형 폴리아미드 막(오스모닉스)에 대해 25 내지 35℃ 및 0.9㎖/초의 감소된 투과물의 유속에서 수득한 결과를 하기 표 14에 제시하였다.
이러한 결과는 G-10(GH; A 값 = 10) 및 G-10(GH)(A-값: 8)의 편평한 시이트형 막 및 GH1812CZA의 나선형 막이 이온을 통과시키지만 시알릴 락토즈 또는 유사한 트리사카라이드는 효과적으로 보유하지는 못함을 나타낸다. G-5(GE)(A-값: 3.9)의 편평한 시이트형 막 및 GE 1812CZA의 나선형 막은 시알릴 락토즈 뿐만 아니라 화합물 I 및 화합물 II, LNT-2 및 LNnT를 보유하면서 이온성 화합물을 통과시켰다.
본원에서 언급하고 있는 모든 공개공보, 특허 및 특허원이 각각 본원에서 참고로 인용된 것으로 구체적으로 및 개별적으로 나타내는 경우, 본 명세서내의 모든 공개공보, 특허 및 특허원은 동일한 정도로 명세서에 참고로 인용되고 있다.
전술한 설명은 설명하기 위한 것이지 한정하기 위한 것은 아니다. 본 명세서의 내용을 살펴보면 당 분야의 숙련자라면, 본 발명의 다수의 변종이 가능함을 알 것 이다. 본 발명의 요지에서 벗어나지 않으면서 본 발명의 일부로서, 단지 예를 들면 다수의 기질, 효소 및 반응 조건이 글리코실 트란스페라제 사이클로 대체될 수 있다. 따라서, 본 발명의 범주는 전술한 설명을 참고로 하여 결정되는 것이 아니라 첨부된 청구의 범위를 참고로 하여 충분히 동등한 범주로서 결정되어야 한다.
Claims (65)
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- 시알릴화되지 않은(unsialylated) 탄수화물 오염물이 막을 통과하기에 충분한 시간동안 pH 1 내지 7에서 시알릴화되지 않은 탄수화물 오염물 및 시알릴 갈락토사이드를 포함하는 혼합물을 나노여과(nanofiltration)막 또는 역삼투막과 접촉시킴을 포함하는, 상기 혼합물로부터 시알릴화되지 않은 탄수화물 오염물을 제거하는 방법.
- 제 42 항에 있어서,시알릴 갈락토사이드가 시알릴 락토즈인 방법.
- 제 43 항에 있어서,시알릴화되지 않은 탄수화물 오염물이 락토즈인 방법.
- (a) 제 1 pH에서 시알릴화되지 않은 갈락토사이드 오염물과 시알릴 갈락토사이드를 포함하는 제 1 혼합물을 나노여과막 또는 역삼투막과 접촉시킴으로써, 상기 혼합물을 막을 통과한 제 1 투과물 분획 및 막을 통과하지 않은 제 1 보유물 분획으로 분리시키는 단계; 및(b) (a) 단계 후에, 제 1 pH와는 다른 제 2 pH에서 상기 제 1 보유물 분획을 나노여과막 또는 역삼투막과 접촉시켜, 상기 제 1 보유물 분획을 막을 통과한 제 2 투과물 분획 및 정제된 시알릴 갈락토사이드를 포함하고 막을 통과하지 않은 제 2 보유물 분획으로 분리시키는 단계를 포함하는, 시알릴화되지 않은 갈락토사이드 오염물과 시알릴 갈락토사이드를 포함하는 혼합물로부터 시알릴화되지 않은 갈락토사이드 오염물을 제거하는 방법.
- 제 45 항에 있어서,제 1 pH가 제 2 pH보다 더 낮은 방법.
- 제 45 항에 있어서,제 1 pH가 3인 방법.
- 제 45 항에 있어서,제 2 pH가 7.4인 방법.
- 제 45 항에 있어서,시알릴 갈락토사이드가 시알릴 락토즈인 방법.
- 제 45 항에 있어서,시알릴화되지 않은 갈락토사이드 오염물이 락토즈인 방법.
- (a) 글리코실 수용체를, 글리코실 공여체, 및 상기 글리코실 공여체를 상기 글리코실 수용체에 결찰(ligate)시킬 수 있는 글리코실 트란스퍼라제와 접촉시킴으로써 반응 혼합물을 형성하는 단계;(b) 제 1 pH에서 상기 반응 혼합물을 나노여과막 또는 역삼투막과 접촉시켜, 상기 혼합물을 막을 통과한 제 1 투과물 분획 및 막을 통과하지 않은 제 1 보유물 분획으로 분리시키는 단계; 및(c) (b) 단계 후에, 제 1 pH와는 다른 제 2 pH에서 상기 제 1 보유물 분획을 나노여과막 또는 역삼투막과 접촉시켜, 상기 제 1 보유물 분획을 막을 통과한 제 2 투과물 분획 및 시알릴화된 올리고사카라이드를 포함하고 막을 통과하지 않은 제 2 보유물 분획으로 분리시키는 단계를 포함하는, 시알릴화된 올리고사카라이드의 합성 방법.
- 제 51 항에 있어서,시알릴화된 올리고사카라이드가 시알릴화된 갈락토사이드인 방법.
- 시알릴화되지 않은 탄수화물 오염물이 막을 통과하기에 충분한 시간동안 pH 1 내지 7에서, 시알릴 락토사이드, 당지질, 리포사카라이드, NeuAcα2,3Galβ1,4(Fucα1,3)GlcNAcβ1-Gal-OEt, NeuAcα2,3Galβ1,4(Fucα1,3)GlcNAcβ1,4-Galβ1-OEt 및 NeuAcα2,3Galβ1,3-Y(상기 식에서, Y는 사카라이드 또는 올리고사카라이드이다)에서 선택되는 시알릴 갈락토사이드 및 시알릴화되지 않은 탄수화물 오염물을 포함하는 혼합물을 나노여과막 또는 역삼투막과 접촉시킴을 포함하는, 상기 혼합물로부터 시알릴화되지 않은 탄수화물 오염물을 제거하는 방법.
- 제 53 항에 있어서,Y가 -(Fucα1->3)Glc(R5)β-OR6, -GlcN(R1)β-O-R2, -Fucα(1->3)Glc(R1)β-(1->3)Galβ-OR2, -GlcN(R1)β(1->3)Galβ-OR2, GlcN(R1)β-OR 및 -GlcN(R1)β(1->3)Galβ-OR(여기서 R은 수소, C1-C6 알킬, 사카라이드, 올리고사카라이드 및 탄소수가 1이상인 아글리콘 기에서 선택되고, R1은 C1-C18알킬, C1-C18아실, 5,6,7,8-테트라하이드로-2-나프트아미도, 벤즈아미도, 2-나프트아미도, 4-아미노벤즈아미도 및 4-니트로벤즈아미도에서 선택되고, R2는 수소, 사카라이드, 올리고사카라이드 및 탄소수가 1이상인 아글리콘 기에서 선택되고, R5는 OH 및 NAc에서 선택되고, R6은 수소, 알콕시, 사카라이드, 올리고사카라이드 및 탄소수가 1이상인 아글리콘 기에서 선택된다)로 구성된 군에서 선택되는 방법.
- 제 54 항에 있어서,탄소수가 1이상인 아글리콘이 -A-Z(여기서, A는 할로겐, 티올, 하이드록시, 산소, 황, 아미노, 이미노 또는 알콕시로 치환되거나 치환되지 않은 탄소수 1 내지 18의 알킬렌 기로부터 선택되고, Z는 수소, -OH, -SH, -NH2, -NHR1, -N(R1)2, -CO2H, -CO2R1, -CONH2, -CONHR1, -CON(R1)2, -CONHNH2 또는 -OR1(여기서 R1은 각각 독립적으로 탄수소 1 내지 5의 알킬이다))의 구조를 갖는 방법.
- 시알릴화되지 않은 탄수화물 시알산 수용체가 막을 통과하기에 충분한 시간동안 pH 1 내지 7에서 시알릴화되지 않은 시알산 수용체 및 상기 수용체의 시알릴화된 부가물을 포함하는 혼합물을 나노여과막 또는 역삼투막과 접촉시킴을 포함하는, 상기 혼합물로부터 시알릴화되지 않은 시알산 수용체 탄수화물 오염물을 제거하는 방법.
- 제 56 항에 있어서,수용체가 갈락토실 단위를 포함하는 방법.
- 제 56 항에 있어서,시알산 수용체가 Galβ1→3GalNAc, 락토-N-테트라오즈, Galβ1→3GlcNAc, Galβ1→3Ara, Galβ1→6GlcNAc, Galβ1→4Glcβ1-OCH2CH3, Galβ1→4Glcβ1-OCH2CH2CH3, Galβ1→4Glcβ1-OCH2C6H5, Galβ1→4GlcNAc, Galβ1-OCH3, 멜리비오즈, 라피노즈, 스타키오즈 및 락토-N-네오테트라오즈에서 선택되는 방법.
- 제 56 항에 있어서,시알릴화된 부가물이 시알산과, Galβ1→3GalNAc, 락토-N-테트라오즈, Galβ1→3GlcNAc, Galβ1→3Ara, Galβ1→6GlcNAc, Galβ1→4Glcβ1-OCH2CH3, Galβ1→4Glcβ1-OCH2CH2CH3, Galβ1→4Glcβ1-OCH2C6H5, Galβ1→4GlcNAc, Galβ1-OCH3, 멜리비오즈, 라피노즈, 스타키오즈 및 락토-N-네오테트라오즈에서 선택된 성분의 반응에 의해 형성되는 방법.
- 제 56 항에 있어서,시알산이 9-치환된 시알산인 방법.
- 제 60 항에 있어서,9-치환된 시알산이 9-O-C1-C6아실-NeuAc, 9-데옥시-9-플루오로-NeuAc 및 9-아지도-9-데옥시-NeuAc에서 선택되는 방법.
- 제 61 항에 있어서,9-O-C1-C6아실-NeuAc가 9-O-락틸-NeuAc 또는 9-O-아세틸-NeuAc인 방법.
- 시알릴화되지 않은 탄수화물 오염물이 막을 통과하기에 충분한 시간동안 pH 1 내지 7에서 시알릴화되지 않은 탄수화물 오염물 및 하기 화학식 2의 시알릴 갈락토사이드를 포함하는 혼합물을 나노여과막 또는 역삼투막과 접촉시키는 단계를 포함하는, 상기 혼합물로부터 시알릴화되지 않은 탄수화물 오염물을 제거하는 방법:화학식 2상기 식에서,Z는 수소, C1-C6 아실 또는 이고;Y는 C(O), SO2, HNC(O), OC(O) 및 SC(O)로 이루어지는 군으로부터 선택되고;R1은 아릴, 치환된 아릴 및 페닐 C1-C3 알킬렌기로 이루어지는 군으로부터 선택되고, 이때 아릴 치환체는 할로, 트리플루오로메틸, 니트로, C1-C18 알킬, C1-C18 알콕시, 아미노, 모노-C1-C18 알킬아미노, 디-C1-C18 알킬아미노, 벤질아미노, C1-C18 알킬벤질아미노, C1-C18 티오알킬 및 C1-C18 알킬 카복스아미도기로 이루어지는 군으로부터 선택되고;R1Y는 알릴옥시카보닐 또는 클로로아세틸이고;R2는 모노사카라이드, 디사카라이드, 수소, C1-C18 직쇄, 분지쇄 또는 환형 하이드로카빌, C1-C6 알킬, 3-(3,4,5-트리메톡시페닐)프로필, C1-C5 알킬렌 α-카복실레이트, α-삼치환된 실릴 C2-C4 알킬렌이고, 이때 상기 α-삼치환된 실릴은 C1-C4 알킬, 페닐로 이루어지는 군으로부터 각각 선택되는 3개의 치환체를 갖는 실릴기이거나;OR2는 함께 C1-C18 직쇄, 분지쇄 또는 환형 하이드로카빌 카바메이트를 형성하고;R3는 수소 또는 C1-C6 아실이고;R4는 수소, C1-C6 알킬 또는 벤질이고;R5는 수소, 벤질, 메톡시벤질, 디메톡시벤질 및 C1-C6 아실로 이루어지는 군으로부터 선택되고;R7은 메틸 또는 하이드록시메틸이고;X는 C1-C6 아실옥시, C2-C6 하이드록실아실옥시, 하이드록시, 할로 및 아지도로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
- 제 63 항에 있어서,모노사카라이드가 β1,3Gal-OR(여기서 R은 H, 알킬, 아릴 및 아실에서 선택된다)인 방법.
- 시알릴화되지 않은 탄수화물 오염물이 막을 통과하기에 충분한 시간동안 pH 1 내지 7에서 시알릴화되지 않은 탄수화물 오염물 및 하기 화학식 1의 시알릴 갈락토사이드를 포함하는 혼합물을 나노여과막 또는 역삼투막과 접촉시킴을 포함하는, 상기 혼합물로부터 시알릴화되지 않은 탄수화물 오염물을 제거하는 방법:화학식 1R1Galβ1, m(Fucα1,n)GlcNR0(R2)p-상기 식에서,R0는 (C1-C8 알킬)카보닐, (C1-C8 알콕시)카보닐 또는 (C2-C9 알케닐옥시)카보닐이고,R1은 NeuAcα2,3Galβ1,4GlcNAcβ1,3 및 NeuAcα2,3Galβ1,4GlcNAcβ1,3에서 선택되는 올리고사카라이드이고,m 및 n은 각각 독립적으로 3 또는 4이고,p는 0 또는 1이다.
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