KR100486070B1 - 인간 적혈구 형성 자극인자(ｅｐｏ) 발현 벡터 및 이를이용한 ｅｐｏ의 대량 생산방법 - Google Patents

인간 적혈구 형성 자극인자(ｅｐｏ) 발현 벡터 및 이를이용한 ｅｐｏ의 대량 생산방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 인간 적혈구 형성 자극인자(erythropoietin(EPO))의 대량 생산용 벡터 및 이를 이용한 EPO의 생산 방법에 관한 것으로, 티오레독신(thioredoxin, Trx)을 코드하는 DNA, 단백질 분해효소의 인식부위 및 EPO를 코드하는 DNA를 순서대로 포함하는 본 발명의 발현 벡터로 형질전환된 대장균을 배양하여 가용화된 상태로 Trx-EPO 융합 단백질을 대량 생산한 후 이를 단백질 분해효소로 절단함으로써 EPO를 수득할 수 있다.

Description

인간 적혈구 형성 자극인자(ＥＰＯ) 발현 벡터 및 이를 이용한 ＥＰＯ의 대량 생산방법{EXPRESSION VECTOR FOR HUMAN ERYTHROPOIETIN AND PPRCESS FOR THE MASS-PRODUCTION OF EPO EMPLOYING SAME}
본 발명은 인간 적혈구 형성 자극인자(erythropoietin(EPO)) 발현벡터 및 이를 이용한 EPO의 대량 생산 방법에 관한 것이다.
EPO는 고등생물에서 적혈구 형성을 촉진하는 호르몬으로서 166개의 아미노산과 여러 종류의 당으로 구성된 당단백질이다(Carnot, et al., Compt. Rend., 143, 384, 1906). 또한, EPO는 혈액내 적혈구 형성에 필수불가결한 인자로서 빈혈 등 혈액관련 질병의 진단 및 치료에 이용되고 있다.
천연형 인간 EPO는 단일형(monomer)의 산성 당단백질(acid glycoprotein)로서 전체 분자량이 약 34 kDa 정도이며, 당을 제외한 단백질 분자량은 약 18 kDa이다. 또한, 아미노산 Asn 24, Asn 38 및 Asn 83의 위치에 3개의 N-결합 당쇄와 Ser 126 위치에 하나의 뮤신형(mucin-type) O-결합 당쇄를 포함하며, 이 같은 당쇄부분은 생체 활성에 필수적인 역할을 하므로, EPO의 당함량이 감소하면 이의 생물학적 반감기가 급격히 감소되어 생물학적 활성을 소실하게 된다.
정상인의 경우에 EPO는 혈액 1 ㎖당 약 15 내지 30 ｍU, 즉 0.01 mM 수준으로 유지되지만(Gaarcia, J.F., Lab. Clin. Med., 99, 624-635, 1982), 재생 불량성 빈혈 등과 같은 질병을 앓고 있는 환자에서는 정상인보다 높은 농도의 EPO가 생성되므로 이들의 혈액이나 뇨에서 EPO를 분리 생산하기도 한다(White et al., Rec. Progr. Horm. Res., 16, 219, 1960; Espada et al., Biochem. Med., 3, 475, 1970; Fisher, Pharmacol. Rev., 24, 459, 1972). 그러나, 이러한 방법은 EPO를 대량생산하기 위한 원료의 공급이 제한되어 있고, 정상인의 뇨에서는 EPO의 농도가 낮을 뿐만 아니라 활성 저해제가 있어 이를 제거하기 위해 고도의 정제 기술이 요구된다는 단점이 있다(미국특허 제 4,397,840 호, 제 4,303,650 호 및 제 3,865,810 호). 또한, 양의 혈장에서 EPO를 추출하는 방법이 개발되었으나, 양의 EPO가 사람에게 항원으로 작용할 수 있다는 단점이 있는 것으로 알려져 있다(Goldwasser, Control cell. Dif. Develop., Part A, 487-494, 1981). 수기모토(Sugimoto)등은 나말바(Namalva), BALL-1, NALL-1, TALL-1 및 JBL을 포함한 인간 임파구를 동물체내에서 증식시킴으로써 EPO를 생산하는 방법을 보고한 바 있으나(미국특허 제 4,377,513 호), 이 방법은 인간 종양세포를 사용하므로 안전성 확보를 위한 연구가 요구된다.
또한, 사람의 EPO 유전자를 클로닝하여 동물세포(대한민국 특허공고 제89-1011 호 및 제 93-5917 호) 및 효모 또는 곤충세포(대한민국 특허공개 제 95-5988 호)에서 발현시키는 방법들이 개발되었다. 그러나, 효모 또는 곤충세포는 주로 고만노즈형(high mannose type)의 당단백질을 생성하고 당화능이 낮아서 인간 EPO와 같은 복합형(complex type)의 당단백질을 생성하지 못하며, 이 같은 형태로 생성된 당쇄구조는 인체 내에서 항원성을 유발시킬 위험이 있으므로 인간 EPO를 발현시키기 위한 숙주세포로는 적절하지 못하다. 또한 동물세포를 이용하여 인간 EPO를 제조하면 천연형과 가장 유사한 EPO를 생산할 수 있으나 발현율이 매우 낮으며, 생산비용이 고가인 단점이 있다.
단백질에 있어서 당쇄는 생체내의 수용성을 높이거나 화학적, 물리적 공격으로부터 단백질의 보호 등을 통해 생체내 반감기를 증가시켜 생물학적 활성에 기여한다.
인간 EPO의 4개의 당쇄구조 중에서 Ser 126 위치의 O-결합 당쇄는 생체내(in vivo)에서와 시험관내(in vitro)에서 아무런 역할을 하지 않았으며, 3개의 N-결합 당쇄를 제거하였을 때 생체내 활성이 급격하게 감소하였지만 시험관내에서의 활성은 그대로 유지되는 것으로 밝혀졌다(Masato H. et al., J. Biol. Chem., 267, 7703-7709, 1992). 이러한 사실은 인간 EPO의 당쇄가 생체내에서 수용체와의 결합에 관여하는 것이 아니라 구조적인 안정성에만 기여한다는 것을 나타낸다. 따라서, 당화 기능이 전혀 없는 대장균을 숙주세포로 하여 인간 EPO를 생산한 후에 적절한 변형을 가해 구조적인 안정성을 높임으로써 EPO를 대량 생산하기 위한 많은 연구가 있었으나 순수한 EPO만을 가용화된 상태로 발현시키는데는 실패하였다. 예를 들어, 보이셀 등은 EPO의 아미노 말단에 10개의 히스티딘을 접합시키므로써 대장균에서 EPO를 융합 단백질의 형태로 발현시켰으며(Boissel J.P. et al., J. Biol. Chem., 268(21), 15983-93, 1993), 빌 등은 4가지 대장균 발현벡터를 이용하여 EPO의 아미노 말단에 글루타티온-S-전이효소가 결합된 융합 단백질을 발현시킨 바 있다(Bill R.M., et al., Biochem., Biophys. Acta, 1261, 35, 1995). 그러나 상기와 같은 방법으로 얻어진 EPO는 발현율이 매우 낮아서 순수한 EPO를 얻기 힘들거나, 수용성이 매우 낮아 봉입체 형태로 발현되므로 대량생산에는 많은 어려움이 있다.
이에 본 발명자들은 대장균으로부터 EPO 단백질을 대량 생산하는 방법을 개발하기 위해, 수용성이 높은 이종 단백질 유전자의 일부를 EPO 유전자의 5'-말단에 융합시켜서 제조한 벡터를 대장균에 형질전환시킨 후, 이를 배양하여 가용화된 상태로 융합 단백질을 발현시키고, 얻어진 융합 단백질을 단백질 분해효소로 절단하여 천연형과 동일한 아미노산 서열을 갖는 EPO 단백질을 생산함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 대장균에서 인간 적혈구 형성 자극인자를 가용화된 상태로 발현하기 위한 발현용 벡터 및 이 벡터로 형질전환된 미생물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 미생물을 배양하여 인간 적혈구 형성 자극인자를 대량 생산하는 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적에 따라 본 발명에서는, 대장균에서 인간 적혈구 형성 자극인자(EPO)를 가용화된 상태로 대량 발현하기 위한 벡터로서 티오레독신을 코드하는 DNA, 단백질 분해효소를 인식하는 부위 및 서열번호 1의 EPO를 코드하는 DNA를 순서대로 포함하는 발현 벡터를 제공한다.
본 발명의 벡터에 사용할 수 있는 티오레독신을 코드하는 DNA는 티오레독신을 코드하는 DNA의 전체 또는 일부분일 수 있으며, 바람직하게는 티오레독신의 N-말단의 109 아미노산을 코드하는 DNA, 가장 바람직하게는 서열번호: 7을 사용할 수 있다.
또한, 본 발명에서 EPO를 코드하는 DNA는 천연형 또는 변이형 EPO를 코드하는 DNA의 어느 것이나 사용할 수 있으며, 특히, 서열번호: 1로 표시되는 DNA를 바람직하게 사용할 수 있다.
본 발명의 벡터에서 단백질 분해효소 인식 부위는 발현된 티오레독신-EPO 융합 단백질로부터 EPO를 용이하게 분리해 내기 위해 포함되는 것으로서, 당 분야의 공지된 인자(factor) Xa, 트롬빈 및 엔테로키나아제 인식부위를 사용할 수 있으며, 엔테로키나아제 인식부위가 바람직하다. 엔테로키나아제는 Asp-Asp-Asp-Asp-Lys 서열(D4K, 서열번호: 8)을 인식하여 이의 C-말단을 절단하므로, 벡터내에 상기 서열을 코드하는 DNA를 삽입하면 발현된 융합 단백질로부터 EPO를 용이하게 회수할 수 있다.
본 발명의 벡터로부터 발현되는 티오레독신-EPO 융합 단백질의 정제를 보다 용이하게 하기 위해, 본 발명의 벡터는 히스티딘 태그를 코드하는 DNA를 추가로 포함할 수 있다.
상기 DNA들은 통상적인 클로닝 방법에 따라 용이하게 하나의 벡터내에 도입할 수 있으며, 특히 히스티딘 태그와 티오레독신 유전자를 포함하고 있는 벡터 pET 31a(Novagen)를 이용하면 보다 편리하게 발현벡터를 제조할 수 있다.
본 발명의 벡터에서 프로모터로서는 대장균에서 이종 단백질의 발현에 통상적으로 사용하는 임의의 프로모터도 사용할 수 있으며, T7 프로모터, Tac 프로모터, 아라비노즈 프로모터 등을 예로 들 수 있다.
본 발명의 벡터는 예를 들어 다음과 같이 제조할 수 있다.
우선, 인간 신장 cDNA 라이브러리(Clonetech Ca. No. HL5031t)를 주형으로 하고, 서열번호: 3 및 서열번호: 4의 프라이머를 사용하여 통상적인 중합효소 연쇄 반응(PCR)으로 EPO cDNA를 합성하고, 이를 NcoI 및 BamHI으로 절단한 후 이를 적절한 발현벡터, 예를 들어 대장균 발현벡터인 pET 31a(Novagen)의 NcoI-BamHI 위치에 클로닝하여 발현벡터 pTEPO를 제조한다(도 1).
발현벡터 pTEPO로 형질전환된 대장균을 배양하여 얻은 티오레독신-EPO 융합 단백질을 단백질 분해효소로 절단하면 인간 적혈구 형성 자극인자의 첫번째 아미노산인 알라닌 앞에 알라닌과 메티오닌이 부가된 형태의 EPO가 얻어지므로 PCR을 이용한 국부돌연변이(site-directed mutagenesis)를 실시하여 부가된 알라닌-메티오닌에 해당하는 코돈을 제거함으로써 천연형과 동일한 아미노산 서열을 갖는 EPO를 발현시키는 플라스미드 pThEPO를 제조한다.
본 발명에서는 상기의 발현벡터로 대장균, 바람직하게는 대장균 BL21(DE3)(Novagen), Top10(Invitrogen) 또는 XL-l blue(Novagen), 가장 바람직하게는 T7 프로모터를 포함하는 벡터를 발현시킬 수 있는 BL21(DE3)을 형질전환시켜서 티오레독신-EPO 융합 단백질을 가용화된 상태로 발현하는 대장균 형질 전환체를 얻을 수 있다. 이러한 대장균 형질전환체 중 하나인 HM 11215는 2002년 6월 21일자로 한국미생물보존센터에 KCCM-10391로 기탁하였다. 얻어진 형질 전환체를 발현에 적합한 조건에서 배양하면 가용화된 상태로 티오레독신-EPO 융합 단백질을 얻을 수 있다.
상기에서 얻어진 티오레독신-EPO 융합 단백질을 친화성 결합 크로마토그래피, 바람직하게는 융합 단백질 내에 존재하는 히스티딘 잔기와의 친화성을 이용한 Ni-NTA(nitrilotriacetic acid) 친화성 결합 크로마토그래피로 정제할 수 있다. 정제된 융합 단백질을 벡터 내에 존재하는 인식부위를 인식하는 적당한 단백질 분해효소, 바람직하게는 인자 Xa(factor Xa), 트롬빈 또는 엔테로키나아제로 절단하여 천연형과 동일한 아미노산 서열(서열번호: 2) 또는 변이형 아미노산 서열을 갖는 인간 EPO를 대량으로 생산할 수 있다.
이하 본 발명의 구체적인 구성과 작용을 실시예를 들어 설명하지만 본 발명의 권리범위가 하기 실시예에만 제한되는 것은 아니다.
실시예 1: 인간 EPO 융합 단백질 발현 벡터의 제작
인간 EPO cDNA 유전자를 얻기 위해, 인간 EPO의 5'-말단에 대응하며 EPO의 첫번째 아미노산인 알라닌 앞에 NcoI 제한효소 인식서열을 포함하도록 고안된 서열번호: 3의 올리고뉴클레오티드 및 EPO의 3'-말단에 대응하며 종결코돈 및 BamHI 제한효소 인식서열을 포함하도록 고안된 서열번호: 4의 올리고뉴클레오티드를 제작하였다. 인간 신장 cDNA 라이브러리(Clonetech Cat. No. HL5031t)를 주형으로 하고, 상기에서 제작된 서열번호: 3 및 서열번호: 4의 올리고뉴클레오티드를 프라이머로 사용하여 중합효소 연쇄 반응(PCR)에 의해 인간 EPO cDNA를 합성하였다.
PCR을 위해서는 1 ㎕의 주형, 1 ㎕의 각 프라이머(50 pmole/㎕), 5 ㎕의 각 2 mM dNTP, 0.5 ㎕의 Pfu DNA 중합효소(Stratagen), 및 5 ㎕의 Pfu 반응 완충용액(100 mM 트리스-HCl(pH 8.3), 15 mM MgCl2, 500 mM KCl)의 반응 혼합물에 물을 가하여 최종 부피 50 ㎕로 조절한 후, 온도 순환기(DNA thermocycler, Perkin-Elmer U.S.A)를 이용하여 94 ℃에서 5분 동안 예비 변성시킨 후, 94 ℃에서 60초, 60 ℃에서 60초, 72 ℃에서 60초의 반응을 30회 수행하였다.
생성된 PCR 산물을 제한효소 NcoI과 BamHI으로 절단하여, 티오레독신 유전자의 일부를 포함하는 플라스미드 pET32a(Novagen, Ca. No. 69015-3)의 NcoI-BamHI 절단부위에 클로닝하고, 제작된 플라스미드를 pTEPO라고 명명하였다.
상기에서 제작된 플라스미드 pTEPO를 대장균에서 발현시키면 티오레독신과 EPO의 융합 단백질이 발현되며, 이를 단백질 분해효소로 절단하면 EPO의 첫번째 아미노산인 알라닌 앞에 알라닌과 메티오닌이 부가된 형태의 EPO가 생산된다.
따라서, 천연형과 동일한 아미노산 서열을 갖는 EPO를 발현시키는 벡터를 제조하기 위해 PCR을 이용한 국부돌연변이(site-directed mutagenesis) 방법을 실시하였다. 주형으로 상기에서 얻은 pTEPO를 이용하고 서열번호: 5와 서열번호: 6을 프라이머로 사용하여 중합효소 연쇄반응을 수행하였다.
PCR은 중합효소로서 2.5 단위의 Pfu turbo DNA 중합효소(Stratagen, Ca. No. 200518)를 사용하고 95 ℃에서 5분 동안 예비 변성시킨 후, 95 ℃에 서 30초, 55 ℃에서 60초, 68 ℃에서 2분의 반응을 18회 수행하는 것을 제외하고는 상기와 동일하게 실시하였다.
PCR 산물을 회수하고 제한효소 DpnI을 첨가하여 PCR 반응시 넣어준 기존의 플라스미드를 완전히 제거하였다. 얻어진 플라스미드로 통상의 방법에 따라 대장균 XL-l blue(Novagen) 균주를 형질전환시키고, 형질전환된 균주로부터 DNA 벡터를 회수한 후, 국부돌연변이된 염기서열을 DNA 서열분석법에 의해 확인하여 천연형 EPO를 생산하는 플라스미드 pThEPO를 얻었다. 이어서, 상기와 같은 방법으로 벡터 pThEPO로 대장균 BL21(DE3)을 형질전환시켜 대장균 형질전환주 HM 11215를 얻었다. 대장균 HM 11215는 2002년 6월 21일자로 한국미생물보존센터에 기탁번호 KCCM-10391로 기탁하였다.
실시예 2: 융합 단백질의 발현 및 가용성 여부 확인
상기 실시예 1에서 수득한 대장균 형질전환체 HM 11215를 5 ㎖의 LB 배지(효모 추출물 5 g, 트립톤 10 g, 염화칼슘 5g/ℓ)에 접종한 후 배양하여 600 nm에서 흡광도가 1 정도가 되었을 때 IPTG를 가하여 3시간 동안 배양하여 융합 단백질의 발현을 유도하였다. 얻어진 배양액 1 ㎖을 취하여 12,000 x g로 5분 동안 원심분리하여 세포 침전물을 얻었다. 얻어진 세포 침전물을 100 ㎕의 단백질 시료 완충용액(5 % 글리세린, 12 mM 트리스-HCl(pH 6.8), 0.4 % SDS, 0.05 % 브로모페놀 블루, 3 mM 2-메르캅토에탄올)에 용존시키고 끓는 물에서 5분 동안 반응시킨 후 12,000 x g로 10 분 동안 원심분리하여 상층액을 얻었다. 얻어진 상층액을 15 % SDS 폴리아크릴아마이드 젤 전기영동하여 EPO 융합 단백질이 발현되는 것을 확인하였다 (도 2). 도 2에서, 제 1열은 분자량 마커 (Benchmarker, Invitrogen)이며, 제 2열은 발현에 이용한 숙주 세포의 세포 침전물의 단백질이고, 제 3열은 EPO 융합 단백질을 발현시킨 세포 침전물을 전기영동한 것이다.
발현된 EPO 융합 단백질이 가용화 상태로 발현되었는지를 확인하기 위해 상기와 같은 방법으로 얻은 형질전환체 HM 11215의 세포 침전물 0.5 g을 20 ㎖의 세포파쇄 완충용액(10 mM NaH2PO4ㆍH2O(pH 8.0), 10 mM 이미다졸, 300 mM 염화칼슘)에 녹인 후 라이소자임과 트리톤 X-100을 가하여 얼음에서 30분 동안 방치하였다. 얻어진 세포액을 초음파 파쇄기(Misonix XL2020, U.S.A.)를 사용하여 파쇄시킨 후 20,000ⅹg에서 15분 동안 원심분리하여 불용성 및 수용성 분획을 얻었다. 얻어진 각 분획으로 15 % SDS 폴리아크릴아마이드 젤 전기영동을 실시하였다(도 3). 도 3의 제 1열은 발현된 숙주의 배양액을 원심분리하여 얻은 세포 침전물을 단백질 시료 완충용액과 섞어서 젤에 점적한 것이고, 제 2열 및 3열은 각각 세포 파쇄액의 수용성 및 불용성 분획으로서, 발현된 EPO 융합 단백질은 약 70 % 정도가 가용화 상태로 존재하는 것이 확인되었다.
실시예 3: 융합 단백질로부터 EPO의 정제
EPO 융합 단백질은 히스티딘 잔기를 포함하는데, 히스티딘은 Ni-NTA(nitrilotriacetic acid)에 강한 결합력이 있으므로 Ni-NTA 친화성 결합 크로마토그래피를 실시하여 EPO 융합 단백질을 정제하였다. 먼저 Ni-NTA가 고정화되어 있는 수지(Novagen) 20 ㎖을 컬럼에 충진한 후에 컬럼 결합 완충용액(상기 세포 파쇄 완충용액과 조성이 동일함)으로 세척하였다. 실시예 2에서 얻은 가용화된 EPO 융합 단백질 분획을 컬럼에 가하여 결합시킨 후 상기와 동일한 완충용액 및 이미다졸(imidazol) 농도를 50 mM로 증가시킨 상기 완충용액으로 차례로 세척하였다. 컬럼에 결합된 EPO 융합 단백질은 100 mM 이미다졸이 포함된 상기 완충용액으로 하여 용출하였다.
상기와 같은 방법으로 부분 정제된 EPO 융합 단백질을 엔테로키나아제(enterokinase, Novagen)로 절단하기 위해 세파덱스 G-25 수지(Phramacia biotech)로 엔테로키나아제 완충용액(20 mM 트리스-HCl(pH 7.4), 50 mM NaCl, 2 mM CaCl2)으로 치환한 후, 융합단백질 1.5 mg당 20 U의 엔테로키나아제(Novagen)를 첨가한 후 25 ℃에서 16시간 동안 반응시켜 융합단백질을 절단하였다. 엔테로키나아제 절단 반응용액에서 절단되어 유리된 EPO 만을 얻기 위해 Ni-NTA 컬럼에 점적하였다. 컬럼을 평형화 완충용액 (50 mM NaH2PO4, pH 8.0, 0.3 M NaCl, 10 mM Imidazol)으로 평형화시킨 후 엔테로키나아제 절단 반응용액을 점적하였다. EPO가 엔테로키나제로 절단되면 히스티딘 태그가 존재하지 않기 때문에 컬럼을 평형화 완충용액과 동일한 완충용액으로 세척하면 유리 EPO만이 용출되어 나오며 절단되지 않은 융합단백질과 절단된 Trx 단백질은 컬럼의 금속이온에 결합을 하여 유리된 EPO만을 얻을 수 있다.
상기 실시예 2 및 3의 정제 과정 중 각 단계에서 얻어진 시료를 이용하여 할로우 등의 방법(Ed Harlow 및 David Lane, Antibodies, A Laborative Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988)에 따라 다음과 같이 웨스턴 블랏팅(Western blotting)을 실시하였다. 니트로셀룰로즈 막(Amersham, U.S.A.)을 블랏팅용 완충용액(170 mM 글리신, 25 mM 트리스-HCl(pH 8), 20 % 메탄올)에 충분히 적신 후 15 % SDS-PAGE를 실시한 젤을 블랏팅 키트를 이용하여 1시간 동안 블랏팅을 수행하였다. 그리고 나서, 니트로셀룰로즈 막을 0.5 % 스킴밀크(DIFCO, U.S.A.) 용액에 1시간 동안 방치하고, 토끼 항-EPO 항체(R&D systems, U.S.A.) 및 0.05 % 트윈 20을 포함하는 PBST 용액(0.14M NaCl, 2.7mM KCl, 1.5mM KH2PO4, 8.1mM Na2HPO4, 3% BSA)에 담궈 상온에서 1시간 동안 반응시켰다. 반응이 끝난 후 막을 PBST 용액으로 3회 세척하여 반응하지 않은 항체를 제거하고, 5,000배 희석된 HRP(horseradish peroxidase)-결합된 염소 항-토끼 IgG(Amersham, U.S.A.) PBST 용액에 가한 후 상온에서 1시간 동안 반응시켰다. 그리고 나서, 막을 PBST 용액으로 세척하고 페록시다아제 기질 키트(Amersham, U.S.A) 용액을 가하여 발색시켰다(도 4). 도 4의 제 1열은 발현벡터만 형질전환된 세포 침전물)이고, 제 2열은 배양된 대장균 MH11215 세포를 초음파 파쇄하여 얻은 수용성 분획이고, 제 3열은 EPO 융합 단백질 분획을 Ni-NTA 컬럼에 통과시킨 후 컬럼에 결합하지 않은 분획이고, 제 4열 및 제 5열은 각각 10mM 및 50 mM 이미다졸로 컬럼을 세척한 분획이고, 제 6열은Ni-NTA 컬럼으로부터 용출된 티오레독신-EPO 융합 단백질 분획이며, 제 7열은 엔테로키나아제로 절단한 분획이고, 제 8열은 Ni-NTA 컬럼을 한번 더 통과시켜 정제한 EPO의 분획이다. 상기 결과로부터 본 발명의 방법에 따라 천연형 EPO 단백질이 순수하게 정제되었음을 확인할 수 있었다.
본 발명의 방법에 따라 천연형과 동일한 아미노산 서열 또는 변이형 아미노산을 갖는 인간 적혈구 형성 자극인자를 대장균을 이용하여 대량으로 생산할 수 있다.
도 1은 인간 EPO cDNA를 함유한 대장균 발현벡터 pThEPO의 제조 과정을 나타낸 것이고,
도 2는 인간 EPO 융합 단백질이 대장균에서 가용화된 상태로 발현되는 것을 확인한 SDS-폴리아크릴아마이드 젤 사진이고,
도 3은 대장균에서 발현된 인간 EPO 융합 단백질로부터 정제된 EPO를 얻기 위한 정제 방법의 각 단계에서 얻은 시료를 웨스턴 블럿팅으로 분석한 사진이다.
<110> HANMI PHARM. IND. CO., LTD. <120> Expression vector for human erythropoietin and process for the mass-production of EPO employing same <130> 200207-0048 <160> 8 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 501 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(498) <400> 1 gcc cca cca cgc ctc atc tgt gac agc cga gtc ctg gag agg tac ctc 48 Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu 1 5 10 15 ttg gag gcc aag gag gcc gag aat atc acg acg ggc tgt gct gaa cac 96 Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His 20 25 30 tgc agc ttg aat gag aat atc act gtc cca gac acc aaa gtt aat ttc 144 Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe 35 40 45 tat gcc tgg aag agg atg gag gtc ggg cag cag gcc gta gaa gtc tgg 192 Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp 50 55 60 cag ggc ctg gcc ctg ctg tcg gaa gct gtc ctg cgg ggc cag gcc ctg 240 Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu 65 70 75 80 ttg gtc aac tct tcc cag ccg tgg gag ccc ctg cag ctg cat gtg gat 288 Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp 85 90 95 aaa gcc gtc agt ggc ctt cgc agc ctc acc act ctg ctt cgg gct ctg 336 Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu 100 105 110 cct tgg cag aag gaa gcc atc tcc cct cca gat gcg gcc tca gct gct 384 Pro Trp Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala 115 120 125 cca ctc cga aca atc act gct gac act ttc cgc aaa ctc ttc cga gtc 432 Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val 130 135 140 tac tcc aat ttc ctc cgg gga aag ctg aag ctg tac aca ggg gag gcc 480 Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160 tgc agg aca ggg gac aga tg a 501 Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165 <210> 2 <211> 166 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu 1 5 10 15 Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His 20 25 30 Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe 35 40 45 Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp 50 55 60 Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu 65 70 75 80 Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp 85 90 95 Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu 100 105 110 Pro Trp Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala 115 120 125 Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val 130 135 140 Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160 Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165 <210> 3 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for cloning EPO <400> 3 gccgccatgg ccccaccacg cctcatctgt 30 <210> 4 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for cloning EPO <400> 4 gggggatcct atcatctgtc ccctgtc 27 <210> 5 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for cloning EPO <400> 5 ggtaccgacg acgacgacaa ggccccacca cgcctcatct gt 42 <210> 6 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for cloning EPO <400> 6 acagatgagg cgtggtgggg ccttgtcgtc gtcgtcggta cc 42 <210> 7 <211> 327 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide coding for N-terminal 109 a.a of Thioredoxin <400> 7 atgagcgata aaattattca cctgactgac gacagttttg acacggatgt actcaaagcg 60 gacggggcga tcctcgtcga tttctgggca gagtggtgcg gtccgtgcaa aatgatcgcc 120 ccgattctgg atgaaatcgc tgacgaatat cagggcaaac tgaccgttgc aaaactgaac 180 atcgatcaaa accctggcac tgcgccgaaa tatggcatcc gtggtatccc gactctgctg 240 ctgttcaaaa acggtgaagt ggcggcaacc aaagtgggtg cactgtctaa aggtcagttg 300 aaagagttcc tcgacgctaa cctggcc 327 <210> 8 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Enterokinase recognition site <400> 8 Asp Asp Asp Asp Lys 1 5

Claims (10)

  1. 도 1에 기재된 개열지도를 갖는 플라스미드 pThEPO.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 제 1항의 플라스미드로 형질전환된 대장균.
  8. 제 7항에 있어서,
    대장균 HM 11215(KCCM-10391)인 대장균.
  9. 1) 제 7항의 형질전환된 대장균을 인간 적혈구 형성 자극인자의 발현에 적합한 조건에서 배양하는 단계;
    2) 배양된 대장균의 세포파쇄액으로부터 융합단백질을 친화성 결합 크로마토그래피로 정제하는 단계; 및
    3) 정제된 단백질을 단백질 분해효소로 절단한 후 인간 적혈구 형성 자극인자를 분리하는 단계를 포함하는, 천연형 인간 적혈구 형성 자극인자의 생산방법.
  10. 삭제
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