KR100471131B1

KR100471131B1 - ＧＬＯａｓｅ 유전자 및 ＰＭＩ 유전자를 함유한 재조합벡터, 상기 벡터로 형질전환된 식물 및 그 식물의 생산방법

Info

Publication number: KR100471131B1
Application number: KR10-2002-0054295A
Authority: KR
Inventors: 민병환; 홍주연; 조이남; 박영수; 양승균
Original assignee: 주식회사 농우바이오
Priority date: 2002-09-09
Filing date: 2002-09-09
Publication date: 2005-03-10
Also published as: KR20040022680A

Abstract

본 발명은 GLOase(L-gulono-γ-lactone oxidase) 유전자 및 PMI(Phospho mannose isomerase) 유전자를 함유한 재조합 벡터, 상기 벡터로 형질전환된 식물 및 그 식물의 생산방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로 본 발명은 Ubp3(At) 프로모터, PMI(Phosphomannose isomerase) 유전자 및 NOS 터미네이터가 순차적으로 작동가능하게 연결되어 있으며, 상기 Ubp3(At) 프로모터에 대해 역방향으로 CsVMV 프로모터, GLOase(L-gulono-γ-lactone oxidase) 유전자 및 NOS 터미네이터가 순차적으로 작동가능하게 연결되어 있고 도 1에 기재된 개열 지도를 갖는 재조합 벡터 pNWB-GLOase, 상기 벡터로 형질전환된 십자화과 식물 및 재조합 벡터에 의해 형질전환된 숙주 미생물로 십자화과 식물을 형질전환시킨 다음, 만노스가 함유된 선발배지에서 선발하는 것을 특징으로 하는 비타민 C 함량이 증진된 형질전환 십자화과 식물의 생산방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 재조합 벡터 및 이를 이용한 형질전환 십자화과 식물의 생산방법은 GLOase 유전자를 식물의 게놈 내에 안정적으로 도입할 수 있는 효과가 있다. 또한, 선발 표지 유전자로서 PMI 유전자를 사용함으로써 생체에 안전한 특징이 있다.

Description

ＧＬＯａｓｅ 유전자 및 ＰＭＩ 유전자를 함유한 재조합 벡터, 상기 벡터로 형질전환된 식물 및 그 식물의 생산방법{Recombinant vector containing a GLOase gene and a PMI gene, plant transformed thereby and method for production of the plant}

본 발명은 GLOase(L-gulono-γ-lactone oxidase) 유전자 및 PMI(Phospho mannose isomerase) 유전자를 함유한 재조합 벡터, 상기 벡터로 형질전환된 식물 및 그 식물의 생산 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로 본 발명은 Ubp3(At) 프로모터, PMI(Phosphomannose isomerase) 유전자 및 NOS 터미네이터가 순차적으로 작동가능하게 연결되어 있으며 상기 Ubp3(At) 프로모터에 대해 역방향으로 CsVMV 프로모터, GLOase(L- gulono-γ-lactone oxidase) 유전자 및 NOS 터미네이터가 순차적으로 작동가능하게 연결되어 있고 도 1에 기재된 개열 지도를 갖는 재조합 벡터 pNWB-GLOase, 상기 벡터로 형질전환된 십자화과 식물 및 재조합 벡터 pNWB-GLOase에 의해 형질전환된 숙주 미생물로 십자화과 식물을 형질전환시킨 다음 만노스가 함유된 선발배지에서 선발하는 것을 특징으로 하는 비타민 C 함량이 증진된 형질전환 십자화과 식물의 생산방법에 관한 것이다.

십자화과 식물(Brassica)은 식물 분류학적으로 꽃잎이 십자꼴로 피는 식물을 말한다. 그 종류로는 배추(Brassica campestris L. pekinensis), 무(Raphanus sat ivus), 양배추(Brassica oleracea L. var. capoitata), 컬리플라워(Brassica olera cea var. botrytis), 브로컬리(Brassica oleracea italica) 및 케일(Brassica oler acea L. var. acephala Alef) 등이 이에 속한다.

십자화과 식물 중에서 배추(Brassica campestris L. pekinensis)는 2년생 초본식물로 호냉성 채소이다. 배추는 김치의 주원료로 우리나라에서 가장 많이 이용된다. 지난 수십 년 간 배추의 품질 향상을 위해 필요한 형질들을 종속간에 유용한 형질을 옮기는 재래 교잡방법이 시도되어 왔다. 그러나, 최근에는 유전공학기술의 급속한 발전으로 재래 교잡방법으로는 불가능했던 종속간의 개념을 초월한 형질도입이 가능하게 되었다.

현재까지, 십자화과 식물(Brassica)의 형질전환은 유채(B. napus) (Radke et al., Theor. Appl. Genet., 75: 685-694, 1988; De Block et al., Plant physiol, 91: 694-701, 1989; Moloney et al., Plant Cell Rep , 8: 238-242, 1989), 꽃양배추(B. oleracea) (De Block et al., Plant Physiol., 91: 694-701, 1989), 황겨자(B. juncea)(Mathews et al., Plant Sci., 72: 245-252, 1990), 아비시니아 겨자(B. carinata)(Babic et al., Plant Cell Rep., 17: 183-188, 1998) 및 순무(B. campestris) (Mukhopadhyay et al., Plant Cell Rep., 11: 506-513, 1992; Radke et al. Plant Cell Rep., 11: 499-505, 1992; Takasaki et al., Breed Sci., 47: 127-134, 1997)등에서 보고된 바 있다. 그러나, 배추(B. campestris ssp. pekinensis)의 형질전환은 재분화율이 매우 낮고 유전자형에 따라 차이를 나타나며, 발현효율이 낮은 단점 있다. 또한, 항생제의 영향에 매우 민감하여 카나마이신으로 선발할 경우 백화현상이 많이 나타나고, 하이그로마이신의 경우는 비정상적인 재분화체가 나타나는 단점이 있다.

최근, 배추의 형질전환과 관련하여 대한민국특허 공개 제2002-6263호에는 배추의 형질전환시 발현효율을 높이기 위해, 배추의 자엽 조직 대신 배축을 사용하는 방법이 개시된 바 있다.

한편, GLOase(L-gulono-γ-lactone oxidase) 유전자는 락톤(lactone)을 아스코르브산(ascorbic acid)으로 전환시키는 비타민 C 생합성 효소를 코딩하는 유전자이다. GLOase 유전자는 사람을 포함한 영장류, 코끼리, 원숭이, 기니피그, 몇몇 조류와 어류, 무척추동물 및 곤충에 유전적으로 존재하지 않는다. 따라서, 상기의 동물은 비타민 C를 체내에서 합성 할 수 없으며 외부로부터 섭취해야 한다. 반면에, 쥐, 개, 토끼 등에는 GLOase 유전자가 존재하기 때문에 비타민 C를 체내에서 합성할 수 있다. GLOase 유전자에 대한 연구로는 쥐의 간으로부터 GLOase의 cDNA가 분리되었고(Koshizaka T. et al., J. Biol. Chem., 263(4), 1619-21, 1988), 쥐의 GLOase 유전자를 기니피그 및 무지개송어에 형질전환한 바 있으며(Krasnov A. et al., Biochem Biophys Acta, 1381(2):241-8, 1998), 송사리에 GLOase 유전자를 형질전환한 바 있다(Toyohara H. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 223(3), 650-3, 1996). 또한, GLOase 유전자를 담배와 상추에 형질전환시켜 비타민 C의 함량이 6배 내지 7배 향상된 담배와 상추를 생산한 바 있다(Jain et al., Molecular Breeding, 6: 73-78, 2000). 그러나, 아직까지 십자화과 식물에 GLOase (L-gulono-γ-lactone oxidase) 유전자를 형질 전환한 보고는 없었다.

식물의 형질전환에는 목적 유전자가 식물의 게놈 내에 안정적으로 도입되었음을 확인하기 위해 가나마이신이나 하이그로마이신과 같은 항생제 내성 유전자나 bar와 같은 제초제 내성 유전자 등의 선발 표지 유전자(selectable marker gene)를 사용하는 것이 일반적이다. 최근에 형질전환 식물체내에 항생제 내성 유전자 또는 제초제 내성 유전자와 상기 유전자 산물에 대한 식품으로서의 안전성, 생태계에의 전파로 인한 생태계 교란 및 항생제 내성 미생물의 출현 가능성 등 잠재적 위해성이 제기되고 있다. 이는 형질전환 식물체를 상업화하는데 매우 큰 문제점이 되고 있다. 이러한 문제점을 극복하기 위하여 다국적 종묘회사인 노바티스사(Novartis AG)에서는 형질전환 식물의 선발 표지 유전자로서 PMI(Phosphomannose Isomerase)를 사용하는 방법을 개발하였다(미국특허 제5767378호). 식물체 내에는 만노스를 분해할 수 있는 효소가 존재하지 않기 때문에 식물체는 만노스를 탄소원으로 사용할 수 없다. 선발 표지 유전자로 만노스를 과당(fructose)으로 분해할 수 있는 PMI를 사용하면, 목적 유전자가 안정적으로 도입된 형질전환 식물체는 만노스를 탄소원으로 하는 선발 배지에서 생장할 수 있다. 최근에, E. coli로부터 수득한 PMI 유전자를 사탕무, 밀, 옥수수 및 카사바 등에 성공적으로 전이시켰음이 보고된 바 있다.

이에 본 발명자들은 현재까지 시도된 바 없는 십자화과 식물에 비타민 C 생합성 유전자인 GLOase를 안정적으로 도입하기 위하여, 목적유전자로서 GLOase 유전자와 선발 표지 유전자로서 PMI 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 구축하고 십자화과 식물에 형질전환하여 비타민 C가 풍부하며 생체에 안전한 형질전환 식물체를 수득함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 Ubp3(At) 프로모터, PMI(Phosphomannose isome rase) 유전자 및 NOS 터미네이터가 순차적으로 작동가능하게 연결되어 있으며, 상기 Ubp(At) 프로모터에 대해 역방향으로 CsVMV 프로모터, GLOase(L-gulono-γ-lactone oxidase) 유전자 및 NOS 터미네이터가 순차적으로 작동가능하게 연결되어 있고 도 1에 기재된 개열 지도를 갖는 재조합 벡터 pNWB-GLOase를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 재조합 벡터 pNWB-GLOase로 형질전환된 아그로박테리움 속 미생물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 재조합 벡터 pNWB-GLOase로 형질 전환한 다음 만노스가 첨가된 선발배지에서 캘러스를 유도한 후 발근 및 토양 순화를 거쳐 재분화된 십자화과 식물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 재조합 벡터 pNWB-GLOase에 의해 형질전환된 숙주 미생물로 십자화과 식물을 형질전환시킨 다음 만노스가 함유된 선발배지에서 선발함을 특징으로 하는 비타민 C 함량이 증진된 형질전환 십자화과 식물의 생산방법을 제공하는 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 Ubp3(At) 프로모터, PMI(Phosphomannose isomerase) 유전자 및 NOS 터미네이터가 순차적으로 작동가능하게 연결되어 있으며, 상기 Ubp3(At) 프로모터에 대해 역방향으로 CsVMV 프로모터, GLOase(L-gulono-γ-lactone oxidase) 유전자 및 NOS 터미네이터가 순차적으로 작동가능하게 연결되어 있고 도 1에 기재된 개열 지도를 갖는 재조합 벡터 pNWB-GLOase를 제공한다.

또한, 본 발명은 재조합 벡터 pNWB-GLOase로 형질전환된 아그로박테리움 속 미생물을 제공한다.

본 발명은 재조합 벡터 pNWB-GLOase로 형질 전환한 다음 만노스가 첨가된 선발배지에서 캘러스를 유도한 후 발근 및 토양 순화를 거쳐 재분화시킨 십자화과 식물을 제공한다.

본 발명은 재조합 벡터 pNWB-GLOase에 의해 형질전환된 숙주 미생물로 십자화과 식물을 형질전환시킨 다음 만노스가 함유된 선발배지에서 선발하는 것을 특징으로 하는 비타민 C 함량이 증진된 형질전환 십자화과 식물의 생산방법을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 Ubp3(At) 프로모터, PMI(Phosphomannose isomerase) 유전자 및 NOS 터미네이터가 순차적으로 작동가능하게 연결되어 있으며, 상기 Ubp3(At) 프로모터에 대해 역방향으로 CsVMV 프로모터, GLOase(L-gulono-γ-lactone oxidase) 유전자 및 NOS 터미네이터가 순차적으로 작동가능하게 연결되어 있고 도 1에 기재된 개열 지도를 갖는 재조합 벡터 pNWB-GLOase를 제공한다.

보다 구체적으로, 본 발명은 pMBP-1 벡터의 35S 프로모터를 잘라내고 CsVMV 프로모터를 삽입한 다음, 터미네이터의 말단에 존재하는 EcoRI 부위를 잘라 낸 후 AscI 부위를 올리고 합성하여 EcoRI-AscI-EcoRI의 형태로 연결하여 pMBP-CA를 제조하고, 상기 pMBP-CA의 XbaI-KpnI부위에 GLOase 유전자를 삽입한 다음 CsVMV 프로모터/GLOase 유전자/터미네이터를 포함하는 절편을 HindIII-AscI으로 잘라낸 후 pNOV3635 벡터의 HindIII-AscI 부위에 삽입하여 제조한 재조합 벡터 pNWB-GLOase를 제공한다.

본 발명에 따른 재조합 벡터 pNWB-GLOase는 목적 유전자로서 GLOase 유전자와 선발 표지 유전자로서 PMI 유전자를 함유함을 특징으로 한다.

GLOase(L-gulono-γ-lactone oxdiase) 유전자는 비타민 C 생합성 효소를 코딩하는 유전자이다. 비타민 C의 생합성 경로는 D-글루코오스에서 D-글루크론산, L-글론산을 거쳐 L-글론산-γ-락톤이 생성되며 GLOase가 여기에 작용하여 비타민 C가 생성된다. GLOase 유전자는 쥐의 간세포로부터 전체 RNA를 분리한 다음 RT-PCR를 수행함으로써 cDNA를 합성 할 수 있다. 쥐의 GLOase 유전자의 염기서열은 공지되어 있으며 서열번호 1에 나타낸 바와 같다(NCBI bank: NM_022220).

PMI(Phosphomannose isomerase) 유전자는 만노스-6-포스페이트(mannose-6-phosphate)를 프럭토스-6-포스페이트(fructose-6-phosphate)로 전환하는 효소를 암호화하는 유전자이다. 상기 PMI 유전자는 사람, 박테리아 및 효모에서 클로닝된 바 있다(Miles and Guest, Gene, 32:41-48, 1984; Darzines et al., Gene, 42:293-302, 1986; Shinabarger et al., J. Biol. Chem., 266:2080-2088, 1991; Collins and Hackett, Gene, 103:135-136, 1991). PMI 유전자는 콩(soybean)에 존재한다고 알려져 있으나, 대부분의 식물체에서는 존재하지 않는다(Goldsworthy and Street, Ann. of Botany 29: 45-58, 1965; Lee and Matherson, Phytochem. 23:983-987, 1984). 따라서, PMI 유전자가 존재하지 않는 식물은 만노스가 함유된 배지에서 성장할 수 없으나 PMI 유전자로 형질전환된 식물세포는 만노스가 함유된 배지에서 성장할 수 있다. 본 발명에서 PMI 유전자는 E. coli로부터 유래된 것을 사용할 수 있다. 바람직하게는, 노바티스사로부터 PMI 유전자가 함유된 벡터 pNOV3635를 분양 받아 사용할 수 있다

본 발명에 따른 재조합 벡터 pNWB-GLOase는 유전자 발현을 조절하는 조절서열에 GLOase 유전자와 PMI 유전자가 작동 가능하게 연결되어 있다. 상기 조절서열은 유전자 발현을 촉진하는 프로모터 및 유전자 발현을 종료하는 터미네이터가 포함된다.

바람직하게는, 본 발명에 따른 재조합 벡터는 PMI 유전자를 함유한 벡터 pNOV3635(노바티스사)를 벡터 구축의 기본틀로 사용하여 제조할 수 있다. 상기 pNOV3635는 Ubp3(At) 프로모터(ubiquitin-specific protease gene from Arabidopsis thaliana flower), PMI(Phospho mannose isomerase) 유전자 및 NOS 터미네이터가 순차적으로 작동가능하게 연결되어 있다. 또한, pNOV3635는 벡터 자체 내에 모든 중요한 제한효소 부위를 전부 가지고 있어 GLOase 유전자의 클로닝이 불가능하다. 즉, 클로닝 하는 GLOase 유전자 내에 pNOV3635 벡터 내에 존재하는 제한 효소 절단 부위가 포함되어 있어 클로닝이 어려운 단점이 있다.

이에 본 발명자들은 pMBP-1 벡터의 35S 프로모터를 HindIII와 XbaI으로 잘라내고 그 대신 식물체에서 강하게 발현하는 CsVMV(Cassava Vein mosaic virus) 프로모터를 연결하여 삽입하였으며 터미네이터의 말단에 존재하는 EcoRI 부위를 잘라내고 새로운 부위인 AscI 부위를 올리고 합성을 통하여 합성함으로써 EcoRI-AscI-EcoRI의 형태로 연결하여 pMBP-CA를 작제하였다.

상기 pMBP-CA의 XbaI-KpnI부위에 GLOase 유전자를 삽입한 다음 CsVMV 프로모터/GLOase 유전자/터미네이터를 포함하는 절편을 HindIII-AscI으로 잘라 내었다. 이를 pNOV3635의 HindIII-AscI 부위에 역방향으로 연결하여 재조합 벡터를 구축하였다. 이렇게 작제한 재조합 벡터를 pNWB-GLOase로 명명하였다. 상기 본 발명에 따른 재조합 벡터 pNWB-GLOase의 개열지도는 도 1에 나타낸 바와 같다.

본 발명에 따른 재조합 벡터 pNWB-GLOase를 식물에 도입하기 위해서는 당 분야에 공지된 방법을 사용할 수 있다. 예를 들면, 이에 한정되지는 않으나 아그로박테리움(Agrobacterium sp.) 속 미생물을 이용한 형질전환, 입자 총 충격 (particle gun bombardment), 실리콘 탄화물 위스커(Silicon carbide whiskers), 초음파 처리(sonication), 일렉트로포레이션(electroporation)법 및 PEG(Poly ethylenglycol) 방법을 사용할 수 있다. 바람직하게는, 아그로박테리움 속 미생물을 이용한 형질전환방법을 사용할 수 있다. 아그로박테리움 속 미생물로는 당업계에 공지된 아그로박테움 투마파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) LBA4404을 사용할 수 있다. 따라서, 본 발명은 본 발명의 재조합 벡터 pNWB-GLOase로 형질전환된 아그로박테리움 속 미생물을 제공한다. 바람직하게는, 본 발명의 재조합 벡터 pNWB-GLOase로 형질전환된 아그로박테리움 투마파시엔스 LBA4404를 제공한다. 본 발명에 따른 재조합 벡터 pNWB-GLOase로 형질전환된 아그로박테리움 투마파시엔스 LBA4404(Agrobacterium tumefaciens LBA4404/pNWB-GLOase)는 부다페스트 조약하의 국제기탁기관인 한국생명공학원 유전자원센터 유전자은행(KCTC)에 2002년 8월 29일자로 기탁번호 KCTC-10330BP로 기탁하였다.

또한, 본 발명은 재조합 벡터 pNWB-GLOase로 형질 전환한 다음 만노스가 첨가된 선발배지에서 캘러스를 유도한 후 발근 및 토양 순화를 거쳐 재분화시킨 십자화과 식물을 제공한다.

본 발명에 따른 재조합 벡터를 도입할 수 있는 십자화과 식물로는 배추 (Brassica campestris L. pekinensis), 무(Raphanus sativus), 컬리플라워 (Brassica oleracea var. botrytis) 및 브로컬리(Brassica oleracea italica)가 포함된다. 바람직하게는 배추(Brassica campestris L. peki nensis)를 사용한다.

형질전환된 식물의 선발배지로는 MS 배지에 캘러스의 효율적인 유도를 위하여 AgNO₃ 1∼5mg/L를 첨가하고 형질 전환된 배추의 선발을 위해 만노스 0.5∼1%(5.00 ∼10g/L)를 첨가한 배지를 사용할 수 있다. 바람직하게는 MS 배지에 AgNO₃2∼3mg/L, 만노스 0.6∼0.8%(6∼8g/L)를 첨가하여 사용한다.

본 발명자들은 선발 배지 중의 만노스 농도를 결정하기 위해 만노스 (mannose)와 서당(sucrose)이 여러 농도로 첨가된 조합배지에 형질전환되지 않은 배추를 치상한 다음 재분화를 유도하였다. 그 결과, 배추의 자엽과 엽병 모두 만노스가 5g/L 이상일 경우에 캘러스(calluse) 형성을 보이지 않았다. 이로부터 만노스를 분해할 수 있는 PMI 유전자가 도입되지 않은 일반식물 세포의 경우 만노스에 대한 생장저해 작용이 있음을 확인할 수 있었다. 따라서, PMI 유전자가 도입된 식물세포를 효율적으로 선발 할 수 있는 배지에 만노스를 5g/L 내지 10g/L 첨가한다. 바람직하게는, 6g/L 내지 7g/L를 첨가한다. 이때, 상기 선발배지에 서당을 20g/L 내지 40g/L 첨가한다. 바람직하게는, 25g/L 내지 35g/L를 첨가한다.

본 발명에 따른 형질전환된 십자화과 식물은 통상적으로 방법에 따라 캘러스의 유도, 발근 및 토양 순화의 과정을 통해 수득할 수 있다. 즉, 만노스가 포함된 선발배지에 재조합 벡터 pNWB-GLOase로 형질전화된 십자화과 식물의 절편체를 치상한 다음 적정 조건으로 배양하여 캘러스의 형성을 유도하고, 신초가 형성되면 호르몬 무첨가 배지로 옮겨 배양한다. 약 2주 후 상기 신초를 발근용 배지에 옮겨서 뿌리를 유도한다. 뿌리가 유도된 다음 이를 순화시킴으로써 재조합 벡터 pNWB-GLOase로 형질 전환된 십자화과 식물을 수득할 수 있다. 상기 호르몬 무첨가 배지는 MS에 릴아실린 100 mg/L를 첨가한 배지를 사용한다. 발근용 배지는 상기 호르몬 무첨가 배지에 0.5mg/L의 NAA(Naphthalene aectic acid)를 추가로 첨가한 것을 사용한다.

또한, 본 발명은 재조합 벡터 pNWB-GLOase에 의해 형질전환된 숙주 미생물로 십자화과 식물을 형질전환시킨 다음 만노스가 함유된 선발배지에서 선발하는 것을 특징으로 하는 비타민 C 함량이 증진된 형질전환 십자화과 식물의 생산방법을 제공한다.

상기 숙주 미생물로는 아그로박테리움 속 미생물을 사용하는 것이 바람직하다. 더욱 바람직하게는, 아그로박테리움 투마파시엔스 LBA4404를 사용한다.

본 발명의 재조합 벡터를 도입할 수 있는 십자화과 식물로는 상기에서 정의한 바와 같다.

본 발명의 벡터가 도입된 아그로박테리움 투마파시엔스로 형질전환된 식물은 만노스가 함유된 선발배지에 치상하여 생장하는 식물만을 선발한다. 만노스가 함유된 선발배지는 상기에서 기재한 바와 같다. 선발된 식물은 만노스가 제거된 배지인 호르몬 무첨가 배지에 옮겨 재분화를 용이하게 한다. 여기에서 생장한 신초를 발근용 배지에 옮겨 뿌리를 유도한다.

본 발명의 형질전환 방법에 따라 선발된 형질전환 식물체에서의 외래 유전자의 발현 여부는 PCR, 노던블럿(Northern blot) 및 서던블럿(Southern blot) 등을 통해 확인 할 수 있다. 즉, GLOase 유전자가 식물체의 게놈(genome)에 도입되었는지의 여부는 PCR을 통해 확인할 수 있다. 또한, 상기 유전자의 전사 여부는 노던블럿을 실시함으로써 확인할 수 있으며 몇 개의 유전자 카피 (copy)가 존재하는가는 서던블럿을 통하여 확인할 수 있다. 본 발명자들은 배추를 pNWB-GLOase로 형질전환 한 다음 만노스가 함유된 선발배지에서 성장한 형질전환 배추를 GLOase 유전자의 특이적 프라이머(primer)를 제작하여 PCR 증폭하거나 또는 GLOase 유전자를 프로브로하여 노던블롯 및 서던블롯을 실시한 결과, 선발된 형질전환 배추에서 모두 GLOase유전자의 도입을 확인할 수 있었다.

이외에 본 발명에서 사용된 유전공학적 방법은 당업계에 공지된 방법을 사용할 수 있다(Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Second edition, 1989).

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1>

GLOase 유전자의 전체 RNA의 분리

GLOase 유전자의 전체 RNA(total RNA)는 쥐의 간세포로부터 분리하였다. GLOase 유전자의 RNA 분리는 트라이졸(Trizol)을 이용한 추출법을 사용하였다.

50㎎의 간조직에 약 1mL 트라이졸을 넣고 마쇄기(homogenizer)로 균질화한 다음 5분간 20℃에 인큐베이션 하였다. 0.2mL의 클로로포름을 첨가하고 15초 동안 잘 흔들어 준 다음 다시 20℃에 3분간 인큐베이션 하였다. 상기 시료를 12000rpm, 4℃에서 15분간 원심분리하여 상층액을 수득하였다. 수득한 상층액을 새로운 튜브로 옮기고 여기에 0.5mL의 이소프로판올을 첨가하여 20℃에서 10분간 인큐베이션을 하였다. 이를 12000rpm, 4℃에서 10분간 원심분리 하여 RNA 펠렛을 수득하였다. 상기 RNA 펠렛을 75% 에탄올로 세척한 다음 DEPC(diethy lpyrocarbonate)가 처리된 물에 현탁하였다. 이를 60℃에서 10분간 인큐베이션 한 후 -70℃에 보관하였다.

<실시예 2>

GLOase 유전자의 cDNA 합성

상기 실시예 1에서 수득한 GLOase 유전자의 전체 RNA를 주형으로 하여 RT-PCR을 수행함으로서 cDNA를 합성하였다. 이때, 프라이머는 공지된 GLOase 유전자의 염기서열(NCBI bank: accession no. NM_022220; 서열번호 1)을 기초로 하여 제작하였다.

프라이머 1: 정방향 (서열번호 2)

5'-GGAACCATGGTCCACGGGTAC-3'

프라이머 2: 역방향 (서열번호 3)

5'-TTAGTAGAAGACTTTCTCCAGGTA-3'

상기 프라이머와 RT-PCR 시스템(Titan one Tube RT-PCR system, Roche, USA)을 사용하여 GLOase 유전자의 cDNA를 합성하였다.

상기 PCR 산물을 버티컬 전기영동장치(Bio-Rad사)상의 0.8% 아가로즈겔 (Agarose gel)에 로딩(loading)하고 50V, 30mA에서 전기 영동하여 1323bp크기의 DNA를 분리하였다.

<실시예 3>

GLOase 유전자 및 PMI 유전자를 함유한 재조합 벡터 pNWB-GLOase의 구축

선발 표지 유전자로서 PMI 유전자와 목적 유전자로서 GLOase 유전자를 함유한 재조합 벡터를 구축하였다. 이를 위해 상기 실시예 2에서 수득한 GLOase 유전자의 cDNA를 pMBP-CA 벡터에 클로닝 한 다음 전체 프로모터-GLOase 유전자-터미네이터를 잘라내어 PMI 유전자를 함유한 pNOV3635 벡터(Novartis사로부터 분양 받음)에 삽입함으로서 pNWB-GLOase 재조합 벡터를 구축하였다.

pMBP-CA는 pMBP-1(한국생명공학연구원)의 35S 프로모터를 HindIII와 XbaI으로 잘라내고 그 대신 식물체에서 강하게 발현하는 CsVMV 프로모터(Cassava vein mosaic virus)를 연결하여 삽입하였으며 터미네이터 뒷 부분의 EcoRI 부위를 잘라 새롭게 AscI 부위를 올리고 합성을 통하여 합성하여 EcoRI-AscI-EcoRI의 형태로 연결하여 작제하였다.

상기 pMBP-CA의 XbaI-KpnI 부위에 실시예 2에서 합성한 GLOase 유전자의 cDNA를 클로닝한 다음 서열분석에 의해 GLOase 유전자의 염기서열을 확인하였다.

GLOase 유전자가 클로닝된 벡터 pMBP-CA의 전체 프로모터-GLOase 유전자-터미네이터를 Hind III와 ASC I으로 잘라낸 후 PMI 유전자를 함유한 pNOV3635 (Novartis)의 클로닝 부위 중 Hind III-AscI에 다시 클로닝하여 GLOase 유전자와 PMI 유전자를 함유하는 재조합 벡터를 구축하였다.

상기 재조합 벡터를 염화칼슘 방법에 의해 대장균(DH 5 α)에 형질 전환하였다(Maniatis et al., Molecular Cloning, A laboratory manual, 2nd ed. 1. 82-1. 84, CHS, 1989). 형질전환된 대장균을 엠피실린을 100㎍/ml 함유한 LB 고체배지에 도말하여 37℃ 에서 12 내지 16시간 배양하여 재조합 벡터를 포함하는 콜로니를 선발하였다.

선발한 콜로니로부터 알카리 용해법에 의해 플라스미드를 분리하였으며, CaCl₂ 농도구배 초원심분리 방법에 의해 순수 정제하였다. 분리 정제한 플라스미드를 pNWB-GLOase라 명명하였다(도 1).

<실시예 4>

본 발명에 따른 재조합 벡터 pNWB-GLOase에 의한 아그로박테리움의 형질전환

본 발명에 따른 재조합 벡터 pNWB-GLOase를 아그로박테리움 튜마파시엔스 (Agrobacterium tumefaciences) LBA4404에 동결-용해법(freeze-thaw method)을 사용하여 형질전환하였다(An G, Methods Enzymol., 153: 292-305, 1987). 아그로박테리움 튜마파시엔스를 YEP 아가 플레이트에 도말 한 다음 28℃ 배양기에서 2일간 배양하였다. YEP 아가 플레이트에서 배양된 콜로니를 선발하여 5mL의 YEP 액체배지에 접종한 다음 28℃, 200rpm의 배양기에서 24시간 배양하였다. 상기에서 수득한 배양액 2mL를 50mL YEP 배지에 접종한 다음 250rpm으로 교반하면서 28℃에서 흡광도(OD₆₀₀)가 0.5-1.0이 될 때까지 배양하였다. 이를 얼음에 방치한 다음 3000g, 4℃에서 5분간 원심분리하여 세포를 회수하였다. 상기 세포를 20mM CaCl₂ 용액 1mL에 재현탁한 다음 1μg의 재조합 벡터 pNWB-GLOase를 첨가하여 혼합하였다. 상기 세포를 액체질소로 동결시킨 다음 37℃ 항온수조에서 5분간 용해시켰다. 여기에 YEP 배지 1mL를 첨가하고 28℃ 배양기에서 가볍게 교반하면서 2시간 동안 배양하였다. 상기 배양액을 30초간 초원심분리한 다음 세포를 수득하였다. 상기 세포를 YEP 배지 0.1mL로 재현탁하였다. 상기 세포를 스펙티노마이신 100 ㎍/mL 가 함유된 YEP 플레이트에 도말 한 다음 28℃에서 배양하였다.

아그로박테리움의 형질전환 여부는 제한효소를 이용하여 확인하였다(Stanton et al., Plant Molec. Biology Manual, Kluwer Academic Publishers, 1988). 상기의 pNWB-GLOase로 형질전환된 아그로박테리움 투마파시엔스 LBA4404(Agrobacterium tumefaciens LBA4404/pNWB-GLOase)는 부다페스트 조약하의 국제기탁기관인 한국생명공학원 유전자원센터 유전자은행(KCTC)에 2002년 8월 29일자로 기탁번호 KCTC-10330BP로 기탁하였다.

<실시예 5>

형질 전환된 배추의 선발을 위한 만노스 농도 결정

본 발명에 따른 형질 전환 배추를 선발하기 위한 선발 배지 중의 만노스 농도를 결정하였다. 이를 위해 만노스가 여러 농도로 첨가된 조합배지에 배추를 치상한 다음 식물체의 재분화를 유도하였다.

실험에 사용한 종자는 매력배추 품종(주식회사 농우바이오)을 사용하였고 파종 후 5일 된 자엽과 엽병을 절단하여 서당(sucrose) 0, 10, 20 및 30g/L, 만노스(Mannose) 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 및 10g/L의 조합배지에 각각 치상하였다. 또한, 상기 조합 배지에 2.0mg/L BAP(Benzyl amino purine), 0.5mg/L NAA(Naphthalene aectic acid), 1.0mg/L 지아틴(Zeatin) 및 0.5mg/L 질산은(AgNO₃)을첨가하여 식물체의 재분화를 유도하였다. 약 6주 후에 절편체에 나타난 반응을 확인하여 선발 배지 내 만노스의 농도를 결정하였다.

실험 결과, 서당과 만노스의 모든 조합에서 자엽에서의 신초(shoot) 형성율이 엽병에서 보다 높게 나타났다. 또한, 자엽과 엽병 모두 만노스가 5 g/L 이상일 경우에 캘러스(calluse) 형성을 보이지 않았다. 이는 만노스를 분해할 수 있는 PMI 유전자가 도입되지 않은 일반식물 세포의 경우 만노스에 대한 생장저해 작용이 있음을 확인한 결과이다. 따라서, PMI 유전자가 도입된 식물세포를 효율적으로 선발 할 수 있는 배지 중의 만노스 농도를 5g/L 내지 10g/L로 결정하였다. 이때, 배지 중의 서당 농도는 30g/L로 결정하였다.

<실시예 6>

본 발명의 재조합 벡터 pNWB-GLOase를 이용한 배추의 형질전환

형질전환에 사용한 배추는 매력배추(농우바이오)를 사용하였다. 상기 배추 종자를 70% 에탄올로 20초간 소독한 후 50% 유한락스 (약 2% sodium hypochlorite)에 12분간 침적하였다. 이를 멸균수로 3회 이상 세척하였다. 표면 살균된 종자는 무균 작업대에서 1/2농도의 MS(Murashige and Skoog, 1962) 배지, 서당(sucrose) 1%(w/v), 한천(agar) 0.8%(w/v)가 첨가된 배지에 치상하여 암상태 (25±1℃)에서 발아시켰다. 치상 후 5일째 된 식물체의 엽병을 약 1㎝정도로 절단한 후 , MS 분말(Duchefa) 4.4g/L, 서당 3%(w/v), 한천 0.8%(w/v), 3㎎/L BAP 및 1㎎/L NAA를 첨가한 배지에 치상하여 25±1℃, 16시간의 조명주기/8시간의 암주기(16h light/ 8h dark) 조건의 배양실에서 2일 동안 전배양(pre-culture)하였다.

한편, 상기 실시예 4의 본 발명 벡터로 형질전환된 아그로박테리움을 스펙티노마이신(Spectinomycin) 100mg/L가 첨가된 YEP (pH 7.0) 고체배지에 도말 (streaking)하였다. 5일 후에 상기 고체 배지에 생성된 단일 콜로니(single colony)를 멸균된 이쑤시개를 이용하여 5mL의 YEP(pH 7.0) 액체배지에 접종하였다. 이를 24시간 동안 배양한 후 pH 5.6의 YEP 액체배지로 옮겨 아그로박테리움을 2차 배양(subculture)하였다. 상기 현탁 배양한 아그로박테리움에 10mg/L의 아세토시린곤(acetosyringone)을 첨가한 후 배추의 절편체를 넣어 8분 간 감염시켰다. 상기 절편체를 건져낸 후 멸균된 여과지(filter paper) 위에서 수분간 건조시킨 다음 서당 3%, 한천 0.8%, 3mg/L BAP, 1mg/L NAA, 10mg/L 아세토시린곤이 첨가된 MS 배지(pH 5.2)위에 절편체를 올려놓고 암상태(20±1℃)에서 2일 동안 공배양(Co-culture)하였다. 공배양 후 릴아실린(Lilacillin) 300mg/L가 첨가된 멸균수로 절편체의 표면에 아그로박테리움이 남지 않도록 세척하였다.

<실시예 7>

형질전환된 배추의 선발

상기 실시예 6에서 아그로박테리움과 공배양한 배추의 절편체 중에서 GLOase 유전자가 안정적으로 도입된 형질전환 배추를 선발하였다. 형질전환 배추의 선발배지로는 캘러스의 효율적인 유도를 위하여 AgNO₃2mg/L를 첨가하였고, 형질전환된 배추의 선발을 위해서 만노스 0.6%(6.00g/L)를 첨가한 MS 배지(MS 분말, 서당 3%, 한천 0.8%, pH 5.8, 3mg/L BAP, 1mg/L NAA, 릴아실린 300mg/L)를 사용하였다.

상기 선발배지에 아그로박테리움과 공배양한 배추의 절편체를 치상한 다음 25℃, 16시간의 조명주기/8시간의 암주기(16h light/ 8h dark) 조건하에서 2주간 배양하였다. 약 2주 후 배축의 끝 부분으로부터 0.5㎝정도 크기의 캘러스가 형성되었고, 약 3주 후 신초가 형성(shooting)되었다. 상기 형성된 신초를 호르몬 무첨가(hormone free) 배지(MS, 릴아실린 100 mg/L)에 옮겨서 배양하였다. 2주일 후 상기 형질전환 배추를 호르몬 무첨가 배지에 0.5mg/L 의 NAA를 첨가한 발근용 배지로 옮겨서 뿌리를 유도하였다. 이로부터 2주일 후 피트모스 펠렛(peatmoss pellet)인 Jiffy-9((주)한국농자재)으로 이식하여 순화시킨 후 2주일 후 새로운 잎과 뿌리가 안정적으로 나왔을 때 상토에 이식하였다(도 2 A: 아그로박테리움과 공배양한 후 배추 자엽으로부터 형성된 신초, B: 자엽으로부터 분리한 신초, C: 상기 신초로부터 뿌리의 유도, D: 순화중인 형질전환 배추). 안정적으로 재분화된 형질전환 배추는 하우스에 격리 재배하였다(도 3).

<실시예 8>

본 발명에 따른 형질전환 배추의 PCR 분석

실시예 7에서 선발한 형질전환 배추에서 GLOase 유전자가 게놈 내로 안정적으로 도입되었는지를 확인하기 위하여 PCR 분석을 실시하였다. PCR 반응의 주형으로는 상기 실시예 7에서 발근용 배지에서 뿌리를 유도한 다음 이 시기에 나온 엽을 약 0.5cm을 채취한 후 이로부터 추출한 DNA를 사용하였다. 또한, 상기 실시예 7에서 상토에 이식하여 새로 뻗어 나온 엽을 약 0.5cm 채취한 후 이로부터 추출한 DNA를 사용하였다. 대조군으로는 본 발명에 따른 재조합 벡터 pNWB-GLOase의 DNA를 사용하였다. PCR은 100mM Tris-HCl, 500mM KCl, 1.0% 트립톤X-100, 25mM MgCl, 0.1mM dNTP, 50pmole 프라이머 및 4unit의 Tag 폴리머라제를 혼합한 다음 94℃에서 1분간 변성, 60℃에서 1분간 결합, 72℃에서 2분간 연장을 35회 실시하였다. PCR에 사용한 프라이머는 상기 실시예 2에서 합성한 서열번호 2 및 서열번호 3의 프라이머를 사용하였다. PCR 반응 산물을 버틸컬 전기영동장치(Bio-Rad사)상의 0.8% 아가로스겔에 로딩하고 50V, 30mA에서 전기 영동하였다.

실험 결과, 본 발명에 따라 선발된 형질 전환 배추에서 모두 1.4 kb 크기의 밴드를 확인할 수 있었다. 대조군인 본 발명에 따른 재조합 벡터 pNWB-GLOase의 DNA의 전기영동 결과에서도 1.4kb 크기의 밴드를 확인할 수 있었다. 따라서, 상기 형질 전환 배추는 모두 GLOase 유전자가 안정하게 도입되었음을 확인할 수 있었다(도 4 C: 대조군, 래인 1∼래인 4: 형질 전환된 배추, M: 크기 마커).

<실시예 9>

본 발명에 따른 형질 전환 배추의 서던 블럿

본 발명에 따라 형질 전환된 배추에 몇 개의 유전자 카피 (copy)가 존재하는지를 확인하기 위하여 서던 블럿을 실시하였다. 상기 실시예 7의 형질전환 배추를 상토에 이식하여 새로 뻗어 나온 잎을 10g 채취하여 게노믹 DNA 10μg을 분리하였다. 대조군으로는 형질전환하지 않은 배추의 잎으로부터 분리한 DNA를 사용하였다. 상기 게노믹 DNA를 제한효소 BamH I으로 자른 후 0.7% 아가로스 겔에 로딩하고 100V 전압을 걸고 2시간 동안 전기영동하였다. 전기영동이 끝난 겔을 변성용액(1.5 M NaCl, 0.5 M NaOH)으로 25분간 처리하여 겔 내부의 DNA를 변성시킨 다음 중화 용액(121g 트리스마 염기, 175.3g NaCl/L, pH 7.0)으로 25분간 처리하여 중화시켰다. 겔의 DNA를 20X SSC 용액(3M NaCl, 0.3M 구연산 나트륨, pH 7.0)과 모세관 현상을 이용하여 나일론 막에 이동시켰다. 이를 적당히 건조시킨 후 68℃에서 1시간 동안 고정시켰다. 상기 나일론 막을 증류수로 적신 후, 혼성화 (hybridization) 용액[6X SSC(0.9M NaCl, 0.09M 구연산 나트륨), 0.5% SDS, 0.02% BSA, 0.02% Picoll, 0.02% PVP]에 옮겨 68℃에서 2시간 동안 전혼성화 (prehybridization)를 실시하였다. 여기에 프로브를 넣어 준 후 68℃에서 16시간 동안 혼성화 반응을 시켰다. 상기 프로브로는 GLOase 유전자를 XbaI과 KpnI 으로 자른 다음 1.4 kb 크기의 유전자 단편을 ³²P로 표지한 것을 사용하였다. 반응 후 3X SSC/0.5% SDS 용액으로 68℃에서 30분간 세척한 후 이를 다시 1X SSC/0.167% SDS로 68℃에서 30분간 세척하였다. 세척이 완료된 나일론 막을 건조시킨 다음 X-레이 필름에 -70℃에서 24시간 이상 노출시킨 후 필름을 현상하였다.

실험 결과, 본 발명에 따른 형질전환 배추에서는 1개 내지 2개의 밴드가 존재함을 확인하였다. 반면에 대조군으로 사용한 형질전환하지 않은 배추에서는 밴드를 확인할 수 없었다(도 5 C: 대조군, 래인 1∼4: 형질전환 배추). 따라서, 상기 형질전환한 배추 내에 GLOase 유전자가 안정하게 도입되었음을 확인할 수 있었다.

<실시예 10>

본 발명에 따른 형질전환 배추의 노던 블럿

본 발명에 따라 형질 전환된 배추 유전자의 전사율을 확인하기 위하여 서던 블럿을 실시하였다. 상기 실시예 7의 형질전환 배추를 상토에 이식하여 새로 뻗어 나온 잎을 10g 채취하여 전체 RNA(total RNA)를 분리한 다음(Tri-Reagent, Molecular Research Center., USA) 분리한 전체 RNA로부터 올리고-(dt)- 셀룰로스(oligo-(dt)-cellulose) 컬럼을 사용하여 mRNA를 분리하였다. 상기 mRNA를 1% 아가로스 겔에 각 래인 당 2㎍을 로딩하여 100V 전압을 걸고 2시간 동안 전기영동하였다. 상기 겔상에 전개된 RNA를 나일론 막(HybondTM-N; Amersham, UK)으로 옮긴 다음 GLOase 유전자를 프로브로 하여 혼성화하였다. 나일론 막을 세척 후 건조시킨 다음 X-레이 필름에 -70℃에서 12시간 노출시킨 후 필름을 현상하였다. 이때, 대조군으로는 형질전환하지 않은 배추의 RNA를 사용하였다.

실험 결과, 본 발명에 따라 형질전환 후 선발된 배추의 경우 1.4kb 크기의 밴드를 확인할 수 있었다. 반면, 형질전환하지 않은 배추에서는 밴드를 확인할 수 없었다(도 6, C: 대조군, 래인 1∼4: 형질전환한 배추). 따라서, 본 발명의 형질전환 배추에 GLOase 유전자가 안정적으로 발현되고 있음을 확인할 수 있었다.

본 발명에 따른 재조합 벡터 및 이를 이용한 형질전환 십자화과 식물의 생산방법은 GLOase 유전자를 식물의 게놈 내에 안정적으로 도입할 수 있는 효과가 있다. 또한, 선발 표지 유전자로서 PMI 유전자를 사용함으로써 생체에 안전한 특징이 있다.

도 1은 본 발명에 따른 재조합 벡터 pNWB-GLOase의 개열지도이다.

도 2는 본 발명에 따른 재조합 벡터 pNWB-GLOase로 형질전환된 배추의 재분화 사진이다(A: 형질전환된 배추 자엽으로부터 형성된 신초, B: 상기 자엽으로부터 분리한 신초의 배양, C: 상기 신초로부터 뿌리의 유도, D: 형질전환된 배추의 순화).

도 3은 본 발명에 따른 형질전환 배추의 하우스 재배 사진이다.

도 4는 본 발명에 따른 형질전환 배추의 PCR 분석 결과를 나타낸 것이다(C: 대조군, 래인 1∼래인 4: 형질 전환된 배추, M: 크기 마커).

도 5는 본 발명에 따른 형질전환 배추의 서던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이다(C: 대조군, 래인 1∼4: 형질전환 배추).

도 6은 본 발명에 따른 형질전환 배추의 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이다(C: 대조군, 래인 1∼4: 형질전환 배추).

<110> NONG WOO BIO CO., LTD <120> Recombinant vector containing a GLOase gene and a PMI gene, plant transformed thereby and method for production of the plant <160> 3 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1323 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> L-gulono-gamma-lactone oxidase gene <400> 1 atggtccatg ggtacaaagg ggtccagttc caaaattggg caaagaccta tggttgcagt 60 ccagaggtgt actaccagcc cacctccgtg gaggaggtca gagaggtgct ggccctggcc 120 cgggagcaga agaagaaagt gaaggtggtg ggtggtggcc actcgccttc agacattgcc 180 tgcactgacg gtttcatgat ccacatgggc aagatgaacc gggttctcca ggtggacaag 240 gagaagaagc agataacagt ggaagccggt atcctcctgg ctgacctgca cccacagctg 300 gatgagcatg gcctggccat gtccaatctg ggagcagtgt ctgatgtgac agttgctggt 360 gtcattggat ccggaacaca taacacaggg atcaagcacg gcatcctggc cactcaggtg 420 gtggccctga ccctgatgac agctgatgga gaagttctgg aatgttctga gtcaagaaat 480 gcagatgtgt tccaggctgc acgggtgcac ctgggttgcc tgggcatcat cctcaccgtc 540 accctgcagt gtgtgcctca gtttcagctt caggagacat ccttcccttc gaccctcaaa 600 gaggtccttg acaacctaga cagccacctg aagaggtctg agtacttccg cttcctctgg 660 tttcctcaca ctgagaacgt cagcatcatc taccaagacc acaccaacaa ggccccctcc 720 tctgcatcta actggttttg ggactatgcc atcgggttct acctactgga gttcttgctc 780 tggaccagca cctacctgcc atgcctcgtg ggctggatca accgcttctt cttctggatg 840 ctgttcaact gcaagaagga gagcagcaac ctcagtcaca agatcttcac ctacgagtgt 900 cgcttcaagc agcatgtaca agactgggcc atccctaggg agaagaccaa ggaggcccta 960 ctggagctaa aggccatgct ggaggcccac cccaaagtgg tagcccacta ccccgtagag 1020 gtgcgcttca cccgaggcga tgacattctg ctgagcccct gcttccagag ggacagctgc 1080 tacatgaaca tcattatgta caggccctat ggaaaggacg tgcctcggct agactactgg 1140 ctggcctatg agaccatcat gaagaagttt ggaggaagac cccactgggc aaaggcccac 1200 aattgcaccc agaaggactt tgaggaaatg taccccacct ttcacaagtt ctgtgacatc 1260 cgtgagaagc tggaccccac tggaatgttc ttgaattcgt acctggagaa agtcttctac 1320 taa 1323 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 ggaaccatgg tccacgggta c 21 <210> 3 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 ttagtagaag actttctcca ggta 24

Claims

Ubp3(At) 프로모터, PMI(Phospho mannose isomerase) 유전자 및 NOS 터미네이터가 순차적으로 작동가능하게 연결되어 있으며, 상기 Ubp3(At) 프로모터에 대해 역방향으로 CsVMV 프로모터(Cassava Vein mosaic virus promoter), GLOase (L-gulono-γ-lactone oxidase) 유전자 및 NOS 터미네이터가 순차적으로 작동가능하게 연결되어 있고 도 1에 기재된 개열 지도를 갖는 재조합 벡터 pNWB-GLOase.
제1항에 있어서, pMBP-1 벡터의 35S 프로모터를 잘라내고 CsVMV 프로모터를 삽입한 다음, 터미네이터의 말단에 존재하는 EcoRI 부위를 잘라 낸 후 AscI 부위를 올리고 합성하여 EcoRI-AscI-EcoRI의 형태로 연결하여 pMBP-CA를 제조하고, 상기 pMBP-CA의 XbaI-KpnI부위에 GLOase 유전자를 삽입한 다음 CsVMV 프로모터/GLOase 유전자/터미네이터를 포함하는 절편을 HindIII-AscI으로 잘라낸 후 pNOV3635 벡터의 HindIII-AscI 부위에 삽입하여 제조한 재조합 벡터 pNWB- GLOase.
제1항에 있어서, 상기 GLOase 유전자는 쥐의 간세포로부터 유래된 것임을 특징으로 하는 재조합 벡터 pNWB-GLOase.
제3항에 있어서, GLOase 유전자가 서열번호 1로 표시됨을 특징으로 하는 재조합 벡터 pNWB-GLOase.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 재조합 벡터로 형질전환된 아그로박테리움 속 미생물.
제5항에 있어서, 상기 미생물이 아그로박테리움 튜마파시엔스LBA4404(KCTC-10330BP)임을 특징으로 하는 아그로박테움 속 미생물.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 재조합 벡터로 형질 전환한 다음 만노스가 첨가된 선발배지에서 캘러스를 유도한 후 발근 및 토양 순화를 거쳐 재분화된 십자화과 식물.
제7항에 있어서, 상기 십자화과 식물이 배추(Brassica campestris L. pekinensis), 무(Raphanus sativus), 컬리플라워 (Brassica oleracea var. botrytis) 및 브로컬리 (Brassica oleracea italica)로 이루어진 그룹 중에서 선택된 것임을 특징으로 하는 식물.
제8항에 있어서, 상기 십자화과 식물이 배추(Brassica campestris L. pekinensis)인 식물.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 재조합 벡터에 의해 형질전환된 숙주 미생물로 십자화과 식물을 형질전환시킨 다음, 만노스가 함유된 선발배지에서 선발하는 것을 특징으로 하는 비타민 C 함량이 증진된 형질전환 십자화과 식물의 생산방법.
제10항에 있어서, 상기 선발배지에 함유된 만노스의 농도가 5∼10g/L 임을 특징으로 하는 형질전환 십자화과 식물의 생산방법
제10항에 있어서, 상기 숙주 미생물이 아그로박테리움 속 미생물임을 특징으로 하는 형질전환 십자화과 식물의 생산방법.
제12항에 있어서, 상기 아그로박테리움 속 미생물이 아그로박테리움 투마파시엔스(KCTC-10330BP)임을 특징으로 하는 형질전환 십자화과 식물의 생산방법.
제10항에 있어서, 상기 십자화과 식물이 배추(Brassica campestris L. pekinensis), 무(Raphanus sativus), 컬리플라워(Brassica oleracea var. botrytis) 및 브로컬리(Brassica oleracea italica)로 이루어진 그룹 중에서 선택된 것임을 특징으로 하는 형질전환 십자화과 식물의 생산방법.
제14항에 있어서, 상기 십자화과 식물이 배추(Brassica campestris L. pekinensis)임을 특징으로 하는 형질전환 십자화과 식물의 생산방법.