KR100464223B1 - A Noble Photosynthetic Bacteria - Google Patents
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Abstract
본 발명은 생체의 소화기관을 활용한 유용균주의 in vivo 획득 방법, 이에 의해 분리된 로도슈도모나스 팔루스트리스(Rhodopsuedomonas palustris) SG315 균주 및 이 균주가 첨가된 가축용, 어류용 생균사료에 관한 것이다.The present invention relates to a method for in vivo acquisition of useful strains utilizing the digestive organs of a living body, Rhodopsuedomonas palustris SG315 strain isolated by the strain, and livestock feed for livestock and fish to which the strain is added.
본 발명의 균주 로도슈도모나스 팔루스트리스 SG315는 광합성 세균으로 가축의 생균사료용 첨가제로 이용될 수 있을 뿐만 아니라 어류의 양식용 생균사료에도 첨가될 수 있어 높은 부가가치를 창출할 수 있다. 또한, 가축의 생장 촉진, 배설물에 의한 환경오염 저감, 가축의 생장률 및 산란율을 증진시킬 수 있어 농가에 큰 도움을 줄 수 있을 것이다.Strain Rhodoshudomonas palistris SG315 of the present invention is a photosynthetic bacteria can be used as additives for livestock feed of livestock, as well as can be added to livestock feed for aquaculture of fish can create high added value. In addition, it is possible to promote the growth of livestock, reduce environmental pollution by excretion, increase the growth rate and spawning rate of livestock, which can greatly help farms.
Description
본 발명은 생체의 소화기관을 활용한 유용균주의 in vivo 획득 방법, 이에 의해 분리된 로도슈도모나스 팔루스트리스(Rhodopsuedomonas palustris) SG315 균주 및 이 균주가 첨가된 가축용, 어류용 생균사료에 관한 것이다.The present invention relates to a method for in vivo acquisition of useful strains utilizing the digestive organs of a living body, Rhodopsuedomonas palustris SG315 strain isolated by the strain, and livestock feed for livestock and fish to which the strain is added.
가축의 생산성 향상을 위하여 사용되는 사료첨가제는 항생물질, 효소제, 효모제 및 생균제 등을 들 수 있으며, 그 중 항생물질이 가장 먼저 실용화되었다. 그러나, 항생물질의 내성 문제 및 축산물내의 잔류 문제 때문에 항생물질 대체용으로 각종 활성제가 사료첨가제로 널리 사용되고 있는 실정이다.Feed additives used to improve the productivity of livestock include antibiotics, enzymes, yeasts and probiotics, among which antibiotics were put to practical use first. However, various active agents are widely used as feed additives to replace antibiotics due to antibiotic resistance and livestock residue.
여러 사료 첨가제 중 생균제는 장내 세균총의 변화를 유도하고 병원성 대장균을 감소시키며, 항생물질을 생성하고, 병원성 미생물이 소화관 장벽에 부착 정주하여 집락을 형성하는 것을 방지하기 때문에 가축에게 급여시 성장촉진 및 사료효율의 개선효과가 있는 것으로 알려지고 있다(Amer. J. Clin. Nutr. 27:1305).Probiotics, among other feed additives, induce changes in the intestinal flora and reduce pathogenic E. coli, produce antibiotics, and prevent pathogenic microbes from colonizing the gut barrier to form colonies, thus accelerating growth and feeding on livestock. It is known to improve the efficiency (Amer. J. Clin. Nutr. 27: 1305).
가축의 사료에 상기와 같은 활성제를 혼합하여 사용하고 있는 반면, 어류를 양식할 때에는 주로 광합성 세균을 사료에 혼합하여 사용하고 있다. 광합성 세균은 토양이 받는 빛과 열을 에너지원으로 하여 뿌리에서 나오는 분비물, 유기물 혹은 유해가스(유화수소)를 기질로 해서, 질소화합물의 아미노산, 핵산이나 생리활성물질, 당류 등 식물의 생육생장을 촉진시키는 다수의 유용물질을 생합성하는 독립 영양 미생물이다. 상기와 같은 특징을 지닌 광합성 세균은 어류의 육질 개선, 채색 향상, 성장 촉진 등의 효과뿐만 아니라 사료의 과다투여에 따는 수질악화를 통한 병원균 번식을 억제하고 유독물질을 해독하는 등의 수질 정화의 효과를 얻을 수 있기 때문에 많이 사용되고 있다.While the above-mentioned activators are mixed and used in livestock feed, photosynthetic bacteria are mainly mixed and used in aquaculture. Photosynthetic bacteria use the light and heat received by the soil as energy sources, and the growth factors of plants such as nitrogen compounds, amino acids, nucleic acids, bioactive substances, and sugars as substrates based on secretions, organics, or harmful gases (hydrogen sulfide) from the roots. It is an autotrophic microorganism that biosynthesizes a number of useful substances that promote it. Photosynthetic bacteria with the above characteristics, such as improving the meat quality of the fish, improving color, promoting growth, etc., as well as the effect of water purification, such as inhibiting the propagation of pathogens through deterioration of water due to overdose of feed and detoxifying toxic substances It is used a lot because it can get.
현재 우리나라 양식업에서 사용되는 광합성 세균 사료는 전량 수입되고 있는 실정이며, 상기와 같은 효능을 지닌 광합성 세균이 일반 생균사료로 쓰이는 예는 극히 드물다. 한국 등록 특허 0143954(출원번호 10-1994-023762)호는 동물의 번식력 및 증체량 증진용 조성물 및 이를 함유하는 제제에 관한 것으로 로도슈도모나스(Rhodopseudomonas)속의 광합성 세균과 아스페르길루(Aspergillus)속, 리조푸스(Rhizopus)속의 진균 발효 농축물을 필수 구성성분으로 하고 있다. 상기 특허에 사용된 로도슈도모나스 속의 세균은 캅술라타(capsulata)로서 본 발명에서 사용된 균과는 상이하며, 광합성 세균을 분리하는 방법 역시 다르다.Currently, all photosynthetic bacteria feed used in aquaculture in Korea is imported, and photosynthetic bacteria having the above-mentioned efficacy are rarely used as general live feed. Korean Patent No. 0143954 (Application No. 10-1994-023762) relates to a composition for enhancing the fertility and weight gain of an animal and a preparation containing the same, photosynthetic bacteria of Rhodopseudomonas genus and Aspergillus genus, lycopus ( Rhizopus ) fungus concentrate of the genus contains essential components. The bacteria of the genus Rhodoshudomonas used in the patent is different from the bacteria used in the present invention as capsulata , and the method of separating photosynthetic bacteria is also different.
따라서, 생장률의 촉진이나 병원균에 대한 저항성을 키울 수 있으며, 광합성 세균 자체의 효능으로 인해 배설물의 처리에도 효과적인, 광합성 세균이면서 생균사료로 사용할 수 있는 미생물이 요구되고 있다.Therefore, there is a demand for microorganisms capable of promoting growth rate and increasing resistance to pathogens, which are effective in the treatment of excretion due to the photosynthetic bacteria themselves, and which can be used as live bacteria feed.
본 발명은 가축 및 어류의 생장률 촉진 및 병원균에 대한 저항성을 키울 수 있는 유용 균주를 효과적으로 분리할 수 있는 in vivo 분리방법을 제공하는데 목적이 있다.An object of the present invention is to provide an in vivo separation method that can effectively isolate useful strains that can promote the growth rate of livestock and fish and increase resistance to pathogens.
또한, 본 발명은 전기한 분리방법에 의해 분리된 유용 균주를 제공하는 것을 목적으로 한다.In addition, an object of the present invention is to provide a useful strain isolated by the aforementioned separation method.
또한 본 발명은 전기 분리된 유용 균주가 첨가된 가축용 및 어류용 생균사료를 제공하는 것을 목적으로 한다.In addition, an object of the present invention is to provide a live feed for livestock and fish to which the useful strain isolated electrically added.
상기의 목적을 달성하기 위한 본 발명은,The present invention for achieving the above object,
생체에 유용하며, 공통된 생리적 특성을 가지는 동일유형의 균총을 분리하는 1차 분리단계; 1차 분리된 상기 균총을 생체에 경구투여하고, 생체의 변으로부터 상기 유형의 생존 균총을 재분리하는 2차 분리단계; 및 상기 2차 분리단계를 거친 균총 중에서 생존률이 가장 우수한 균주를 선별하는 선별단계;를 포함하는 유용 세균의in vivo분리방법에 관한 것이다.A first separation step of separating the same type of flora which is useful for a living body and has common physiological characteristics; A second separation step of orally administering the first isolated flora to the living body and re-separating the viable flora of the type from the stools of the living body; And selecting step of selecting the best strains in colony survival passed through the separation step the secondary; relates to in vivo separation of useful bacteria comprises a.
본 발명에서 "생체"는 살아있는 동물체로서, 소, 닭, 돼지 등의 가축 또는 붕어, 장어, 광어 등의 어류 등이 이에 해당된다.In the present invention, "living" is a live animal, such as cattle, chickens, pigs, such as livestock or fish such as crucian, eel, flatfish, and the like.
본 발명에 의한 방법은, 자연계에 존재하는 것으로서 생체에 유용한 기능을 발휘하는 것으로 알려진 특정 유형의 복합균주 중에서 생체내 적합성(생존율)이 우수한 균주를 효과적이고 간편하게 분리하는 방법이다. 따라서 본 발명의 방법이 적용되는 균총은 기본적으로 공통적인 생리적 특성을 갖는 미생물들이어야 하는데, 구체적으로는 예를 들면, 락토바실러스 속 등과 같은 동일한 속에 속하는 미생물군 또는 광합성 세균 등과 같이 동일한 생존환경을 요구하는 미생물군 등과 같은 범주이어야 한다.The method according to the present invention is a method for effectively and conveniently separating a strain having excellent in vivo compatibility (survival rate) among specific types of complex strains known to exist in nature and exerting useful functions for living organisms. Therefore, the flora to which the method of the present invention is applied should be basically microorganisms having common physiological characteristics, and specifically, require the same living environment such as microorganism group or photosynthetic bacteria belonging to the same genus, for example, genus Lactobacillus. Should be in the same category as the microbial population.
본 발명에서 각 분리단계의 분리조건은 전기한 균총(미생물군)의 공통된 특성에 따라 정해지는데, 예를 들면, 락토바실러스 속의 균총이라면 락토바실러스 분리조건, 광합성 세균 균총이라면 광합성 세균만이 생존할 수 있는 조건이 된다.In the present invention, the separation conditions of each separation step are determined according to the common characteristics of the aforementioned flora (microbial group). For example, if the flora of the genus Lactobacillus, Lactobacillus separation conditions, photosynthetic bacteria if only photosynthetic bacteria can survive. It is a condition.
본 발명에 의하면 분리단계가 반복됨에 따라 생체에 유용한 특성을 가지면서, 그 생체의 소화기관 내에서 생존력이 우수한 균주를 선택할 수 있게 되는 것이다.According to the present invention, as the separation step is repeated, it is possible to select a strain having excellent characteristics in a living body and having excellent viability in the digestive organ of the living body.
또한 본 발명은 보다 구체적으로, 닭을 대상으로 하여, 자연계의 광합성 세균 균총으로부터 유용 세균을 in vivo 분리하는 방법 및 이 방법에 의해 분리된 광합성 세균 로도슈도모나스 팔루스트리스(Rhodopseudomonas palustris)를 제공한다.The present invention more specifically provides a method for separating useful bacteria from natural photosynthetic bacterial flora in vivo, and photosynthetic bacteria Rhodopseudomonas palustris isolated by the method.
광합성 세균은, 가축의 장내에서 타 병원균의 성장을 억제하고, 섭취한 사료의 소화와 흡수를 촉진시키며, 기타영양소의 합성을 효과적으로 도와 가축의 내병성을 증가시키고 성장을 촉진하며, 사료효율을 개선시켜주는 성장촉진제의 기능을하는 것으로 알려져 있다..Photosynthetic bacteria inhibit the growth of other pathogens in the intestines of the livestock, promote digestion and absorption of the feeds eaten, effectively help the synthesis of other nutrients, increase disease resistance, promote growth, and improve feed efficiency in livestock. It is known to act as a growth promoter.
이하 닭을 이용하여 닭의 생장에 유용하며, 생존률이 우수한 광합성 세균을 in vivo 분리하는 과정을 상세히 설명한다.Hereinafter, the process of separating photosynthetic bacteria which are useful for growing chicken and has excellent survival rate in vivo using chicken will be described in detail.
먼저, 토양 등에서 시료를 채취하여 이를 최소 액체배지에 현탁시킨 후 광합성 성장을 할 수 있는 조건 즉, 빛이 조사되는 무산소 조건에서 사전배양하여 광합성 세균총을 1차 분리한다. 광합성 세균을 효과적으로 성장시키기 위해 이스트 추출물을 배지에 첨가할 수도 있고, 광합성 세균만을 부유화시키기 위해 1차 분리단계를 수 회 반복할 수도 있다.First, the sample is taken from soil and suspended in a minimum liquid medium, and then pre-cultured in a condition capable of photosynthetic growth, that is, an anoxic condition in which light is irradiated, to separate the photosynthetic bacterial gun first. Yeast extract may be added to the medium to effectively grow photosynthetic bacteria, or the first separation step may be repeated several times to suspend only photosynthetic bacteria.
사전배양-분리된 세균총을 닭 사료에 적절히 혼합하여 닭의 먹이로 사용하고, 이 사료를 섭취한 닭의 계분 일부를 전기 액체배지에 현탁시킨 후 광합성 성장이 가능한 조건에서 배양하여 광합성 세균총을 2차 분리한다. 이때 역시 광합성 세균을 효과적으로 성장시키기 위해 배지에 이스트 추출물을 첨가할 수 있다. 필요에 따라 이 과정을 수회 반복하여 생존율이 우수한 광합성 세균을 획득할 수도 있다.Pre-cultivation-separated bacterial guns are properly mixed with chicken feed and used as chicken food.Some of the chicken meal consumed with this feed is suspended in an electric liquid medium and cultured under conditions that allow photosynthetic growth. Separate. At this time, yeast extract may be added to the medium to effectively grow photosynthetic bacteria. If necessary, this process may be repeated several times to obtain photosynthetic bacteria with excellent survival rate.
본 발명에서는 전기한 과정을 통해 1 종의 광합성 세균 균주 SG315를 획득하여 이를 동정하였다. DNA 분석, 형태학적, 배양학적, 생리학적 분석결과 위 균주는 로도슈도모나스 팔루스트리스(Rhodopseudomonas palustris)에 속하는 것으로 판정되어, 이를 로도슈도모나스 팔루스트리스 SG315(Rhodopseudomonas palustrisSG315)로 명명하고 한국과학기술연구원 부설 생물공학연구소내의 유전자은행(KCTC)에 2001년 3월 31일 기탁하여 균주번호 KCTC18091P를 부여받았다.In the present invention, one type of photosynthetic bacterial strain SG315 was obtained and identified through the foregoing procedure. DNA analysis, morphological, culture and physiological analysis showed that the strain belonged to Rhodopseudomonas palustris , which was named Rhodopseudomonas palustris SG315 ( Rhodopseudomonas palustris SG315). It was deposited on March 31, 2001 by the Gene Bank (KCTC) in the Institute of Engineering and received the strain number KCTC18091P.
분리동정된 균주 SG315는 1 KU(1×107세포=약 0.004 mg dry weight) 당(건조세포 1㎎당) 각각 27ng 및 4ng 이상의 박테리오클로로필(bacteriochlorophyll) 및 카로티노이드(carotenoid)를 함유하고 있으며, 광합성 색소가 통상의 광합성 세균 보다 높은 특성을 가지고 있다.The isolated strain SG315 contains more than 27ng and 4ng of bacteriochlorophyll and carotenoids per 1 KU (1 × 10 7 cells = approximately 0.004 mg dry weight) (per 1 mg of dry cells), respectively. The pigment has higher properties than ordinary photosynthetic bacteria.
이렇게 분리동정된 본 발명의 균주 로도슈도모나스 팔루스트리스 SG315를 적정 비율로 닭 또는 다른 가축의 사료에 혼합하여 생균사료로 활용할 수 있음은 당업자에게는 매우 용이한 일일 것이다.It is very easy for those skilled in the art that the isolated strain of the present invention, Rhodoschudomonas palustris SG315, can be mixed and used in a feed of chickens or other livestock feeds.
나아가 본 발명의 균주 로도슈도모나스 팔루스트리스 SG315는 바닷물 수준의 염분농도에서도 높은 생존력을 나타내기 때문에, 어류용 사료에 적정 비율로 혼합되어 어류용 생균사료로 활용될 수 있을 것이다.Furthermore, since the strain Rhodoshudomonas palustris SG315 of the present invention exhibits high viability even at salinity levels of seawater, it may be mixed with fish feed at an appropriate ratio and used as a live feed for fish.
본 발명의 균주를 생균사료용 첨가제로 활용하는 경우, 가축 또는 어류의 분에 생존하면서 자연상태에서 분을 영양성분으로 하여 광합성 활동을 하게 되므로 배설물 처리에 유용한 효과를 발휘할 수 있을 것이다.When the strain of the present invention is utilized as an additive for live microbial feed, it will be able to exert a useful effect in the treatment of feces because it will survive in the livestock or fish flour and the photosynthetic activity as a nutrient in the natural state.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples. These examples are only for illustrating the present invention in more detail, it will be apparent to those skilled in the art that the scope of the present invention is not limited to these examples.
실시예에서는 편의상 "생체"를 닭으로, 유용 미생물 광합성 세균으로 선정하였으나, 동일한 방법을 적용하여 다양한 가축 또는 어류에 대하여 다양한 유용 미생물을 분리하는 것은 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 전문가에게는 용이한 일일 것이다.In the embodiment, "living body" is selected as a chicken and a useful microorganism photosynthetic bacterium for convenience, but it is easy for a person skilled in the art to separate various useful microorganisms for various livestock or fish by applying the same method. It will be one day.
실시예 1: 광합성 세균 균총의 1차 분리Example 1 Primary Separation of Photosynthetic Bacteria
경기도 파주시 광탄면 용미리 지역의 논과 개울주변의 토양으로부터 채취한 시료 5g을 10㎖의 액체 최소배지[20mM KH2PO4, 3.78mM (NH4)2SO4, 34mM 석시닉 (succininc)산, 0.67mM L-글루타믹(glutamic)산, 0.25mM L-아스파틱 (aspartic)산, 8.5mM NaCl, 1.05mM 니트릴로트리아세틱(nitrilotriacetic)산, 1.2mM MaCl2·6H2O, 0.23mM CaCl2·7H2O, 7nM FeSO4·7H2O, 0.16nM (NH4)6Mo7O24·4H2O, EDTA 0.1765g, ZnSO4·7H2O 1.095g, FeSO4·7H2O, 0.5g, MnSO4·H2O 0.154g, CuSO4·5H2O 0.0392g, Co(NO3)2·6H2O 0.0248g, H3BO30.0114g, 니코티닉(nicotinic)산 0.1g, 티아민 (thiamine)·HCl 0.05g, 바이오틴(biotin) 0.001g(Sistrom, W. R. 1962. J. Gen. Micorobiol. 28: 607-616)]에 현탁시켰다. 100W, 220V의 백열전구를 사용하여 빛의 밝기가 10 W/m2되는 거리에 위치하도록 한 20㎖ 용량의 유리 tube에 상기 현탁액을 가득 채운 상태로 뚜껑을 막아 더 이상의 산소가 유입되지 않도록하여 무산소조건을 만든 후 28℃에서 배양하였다. 배양은 시료내에 존재하는 광합성 세균들만을 특이적으로 증가시키기 위해서 보통 균주 분리기간보다 길게 5일 동안 수행하였다. 상기 배양액 0.5㎖을 10㎖의 액체 최소배지에 접종하여 동일한 조건과 기간동안 1회 반복 배양하였다.5 g of samples collected from paddy fields and streams around Yongmi-ri, Gwangtan-myeon, Paju-si, Gyeonggi-do, Korea. 10 ml of liquid medium [ 20 mM KH 2 PO 4 , 3.78 mM (NH 4 ) 2 SO 4 , 34 mM Succininc acid, 0.67 mM L-glutamic acid, 0.25 mM L-aspartic acid, 8.5 mM NaCl, 1.05 mM nitrilotriacetic acid, 1.2 mM MaCl 2 .6H 2 O, 0.23 mM CaCl 2 7H 2 O, 7 nM FeSO 4 7H 2 O, 0.16 nM (NH 4 ) 6 Mo 7 O 24 4H 2 O, EDTA 0.1765 g, ZnSO 4 7H 2 O 1.095 g, FeSO 4 7H 2 O, 0.5 g, MnSO 4 H 2 O 0.154 g, CuSO 4 5 H 2 O 0.0392 g, Co (NO 3 ) 2 6H 2 O 0.0248 g, H 3 BO 3 0.0114 g, nicotinic acid 0.1 g, thiamine ) · HCl 0.05g, biotin (biotin) 0.001g (Sistrom, WR 1962. J. Gen. Micorobiol 28:. was suspended in 607-616). Using an incandescent light bulb of 100W, 220V, a 20ml glass tube placed at a distance of 10 W / m 2 of light brightness is filled with the suspension to prevent further oxygen from flowing through the lid. After making the conditions were incubated at 28 ℃. Cultivation was usually performed for 5 days longer than the strain isolation period in order to specifically increase only photosynthetic bacteria present in the sample. 0.5 ml of the culture was inoculated into 10 ml of liquid minimal medium and cultured once in the same condition and period.
최소배지에 0.1% 이스트 추출물을 첨가하였을 때가 첨가하지 않았을 때에 비해 세대시간이 약 11시간에서 4시간으로 그 성장이 약 3배정도 빨라졌으며, 세균의 최대 성장 후 밀도도 밀리리터 배지당 약 5×109세포로 약 4배 가량 높은 밀도로 성장함을 확인하였다. 상기의 세대시간 측정은 흡광계(Spectrophotometer)를 사용하여 흡광도를 측정하여 확인하였다.When the 0.1% yeast extract was added to the minimum medium, the generation time was about 11 to 4 hours and the growth was about 3 times faster, and the density after the maximum growth of bacteria was about 5 × 10 9 per milliliter medium. It was confirmed that the cells grow at about 4 times higher density. The generation time measurement was confirmed by measuring the absorbance using a spectrophotometer.
실시예 2: 닭을 이용한 균총의 2차 분리Example 2: Secondary Separation of Mycelia of Chicken
실시예 1에서 분리된 1차 분리 광합성 세균총을 대상으로 닭의 소화기관 통과 실험을 실시하였다.The chicken digestive organ passage experiment was performed on the primary isolated photosynthetic bacterial gun isolated in Example 1.
실시예 1에서 배양된 분리균과, 사료, 효모, 유산균을 하기 표 1과 같은 비율로 혼합한 혼합사료 1500g을 하루동안 결식시킨 세 마리의 닭에게 3일간 공급하였다. 상기 실험에 사용한 닭은 25주령된 아바에이카(Arbor Acres)이며, 평균 체중이 2.95 kg인 암 2 마리와 수 1마리를 사용하였다.The isolates, cultured in Example 1, feed, yeast, lactic acid bacteria were fed to three chickens fed three days of the mixed feed 1500g mixed for the same ratio as Table 1 below. The chickens used in the experiment were 25-week-old Arbor Acres, and two females and one male of average weight 2.95 kg were used.
혼합사료를 공급한 닭으로부터 회수된 계분은 총 1,882g으로 약 53%의 함습도 상태를 보였다. 혼합사료를 먹은 닭으로부터 얻은 계분 중의 광합성 세균수를 측정한 바, 생존율은 약 0.001%정도였다.The recovered manure from chickens fed the mixed feed was 1,882 g in total, showing a moisture content of about 53%. The number of photosynthetic bacteria in poultry from chickens fed mixed feed was measured, and the survival rate was about 0.001%.
수득된 계분 5g을 채취하여 실시예1과 동일한 방식으로 계분을 얻고, 이로부터 광합성 세균총을 2차 분리하였다. 2번째의 계분 중의 광합성 세균수 측정결과, 생존율이 1번째에 비해 약 400배 증가된 0.43%임을 확인하였다.5 g of the obtained powder was collected to obtain the powder in the same manner as in Example 1, from which the photosynthetic bacterial gun was secondarily separated. As a result of measuring photosynthetic bacteria in the second batch, it was confirmed that the survival rate was 0.43%, which was about 400 times increased compared to the first.
상기의 2차 분리된 광합성 세균총으로부터 생존율이 우수한 것으로 판정된 광합성 세균 1 균주를 선별하였다.One strain of photosynthetic bacteria, which was determined to have excellent survival rate, was selected from the secondary isolated photosynthetic bacterial gun.
생존율을 측정하기 위한 세포수 측정은 agar-embeded 방법을 사용하여, 살아있는 세포만을 측정하였다. 실시예 1의 무산소 광합성 조건 성장과 동일한 조건에서, 1.5% agar를 함유한 배지를 굳지 않는 정도의 온도인 40℃ 내지 50℃로 식힌 후 여기에 약 100 내지 300개의 세포수가 되도록 희석한 세포를 첨가하여 혼합하였다. 상기 혼합물을 유리 tube 안에서 굳힌 다음, 뚜껑을 막아 무산소 조건으로 배양하였다. 상기 배양 후 콜로니를 육안으로 관찰하여 counting하였다.Cell number measurement to measure the survival rate was measured only live cells using the agar-embeded method. Under the same conditions as in the anaerobic photosynthetic growth of Example 1, the medium containing 1.5% agar was cooled to 40 ° C. to 50 ° C., at which the temperature did not solidify, and then the cells diluted to about 100 to 300 cell numbers were added thereto. And mixed. The mixture was hardened in a glass tube and capped to incubate under anoxic conditions. After incubation, colonies were visually observed and counted.
실시예 4 : 선별된 미생물의 동정Example 4 Identification of Selected Microorganisms
실시예 3에서 선별된, 닭의 소화기관 통과율(생존율)이 높은 균주를 동정하였다.Strains with high digestibility (survival rate) of chickens selected in Example 3 were identified.
16S rRNA를 암호화하고 있는 여러 광합성 세균의 rrnB 유전자를 조사하여 상동성이 높은 부분을 선택해 업스트림(unstream) 및 다운스트림(downstream) 프라이머(primer)를 제작하여 PCR로 증폭하여 얻은 약 1.3kb의 DNA 조각을 자동염기서열분석기를 사용하여 분석하였다. 업스트림과 다운스트림의 프라이머의 서열은 다음과 같다.1.3kb DNA fragment obtained by amplification by PCR by investigating rrnB genes of several photosynthetic bacteria encoding 16S rRNA and selecting highly homologous parts to generate upstream and downstream primers Was analyzed using an automatic base sequencer. The sequences of the upstream and downstream primers are as follows.
업스트림 프라이머 : 5´ACA CAT GYA AGT CGA RCG 3´Upstream Primer: 5´ACA CAT GYA AGT CGA RCG 3´
다운스트림 프라이머 : 5´CGA TTA CTA GCG ATT CC 3´Downstream Primer: 5´CGA TTA CTA GCG ATT CC 3´
분석결과 선별된 미생물은 로도슈도모나스 팔루스트리스와 99.95% 일치하였고, 이를 바탕으로 선별된 미생물이 로도슈도모나스 팔루스트리스에 속하는 균주로 확정하고 SG315라 명명하였다. 상기 균주를 한국과학기술연구원 부설 생물공학연구소내의 유전자은행(KCTC)에 기탁하여 균주번호 KCTC 18091P를 부여받았다.As a result, the selected microorganisms were found to be 99.95% identical to Rhodoschudomonas palustasis, and based on this, the selected microorganism was identified as a strain belonging to Rhodoschudomonas palustasis and named SG315. The strain was deposited in the Gene Bank (KCTC) in the Institute of Biotechnology, affiliated with the Korea Institute of Science and Technology, and received the strain number KCTC 18091P.
본 발명에 의한 로도슈도모나스 팔루스트리스 SG315의 형태학적, 배양학적, 생리학적 특성을 표 2에 정리하였다.Table 2 summarizes the morphological, culture, and physiological characteristics of Rhodoschudomonas palustasis SG315 according to the present invention.
실시예 5 :Example 5: 로도슈도모나스 팔루스트리스 SG315의Rhodoshudomonas Fallustris SG315 광합성 색소양을 측정Measure the amount of photosynthetic pigment
실시예 1에서 1차 분리된 세균총과 실시예 2에서 선별된 SG315의 광합성 색소양을 측정하였다.The amount of photosynthetic pigments of the bacterial gun first isolated in Example 1 and SG315 selected in Example 2 was measured.
2×109cells/㎖농도의 균주배양액 1㎖을 원심분리하여 균체를 모으고, 여기에 acetone: methanol(7:2, vol/vol) 혼합용매를 1 ml 가하고 vortexing으로 균체를 분쇄하였다. 분쇄된 균체액을 2분간 원심 분리하여 색소체가 추출된 상층액만을 얻어 각각 468nm, 775nm에서 흡광도를 측정하였다. 흡광도는 UV2041-PC 흡광도계(Shimadzu사 제품, 일본)로 분석하였다.The cells were collected by centrifugation of 1 ml of a strain culture solution of 2 × 10 9 cells / ml, and 1 ml of acetone: methanol (7: 2, vol / vol) mixed solvent was added thereto, and the cells were pulverized by vortexing. The pulverized cell solution was centrifuged for 2 minutes to obtain only the supernatant from which the pigment was extracted, and the absorbance was measured at 468 nm and 775 nm, respectively. Absorbance was analyzed by UV2041-PC absorbance (Shimadzu, Japan).
실험결과, 1차 분리된 광합성 세균총의 경우 박테리오클로로필 14.1ng/KU, 카로티노이드 1.9ng/KU를 함유하고 있으며, 생존율이 증가된 SG315 분리균의 경우, 박테리오클로로필 27.2 ng/KU, 카로티노이드 4.0 ng/KU를 함유하고 있는 것으로 나타났다. 1차 분리된 광합성 세균총에 SG315 분리균의 광합성 색소가 2배 가량 증진되었음을 확인할 수 있었다.Experimental results showed that the primary isolated photosynthetic bacterial gun contained 14.1 ng / KU of bacteriochlorophyll and 1.9 ng / KU of carotenoids. It was found to contain. It was confirmed that the photosynthetic pigments of the SG315 isolates were increased by about two times in the primary photosynthetic bacteria gun isolated.
실시예 6 : 로도슈도모나스 팔루스트리스 SG315의 내염성 측정Example 6 Flame Resistance Measurement of Rhodoshudomonas Fallusris SG315
로도슈도모나스 팔루스트리스 SG315가 어류의 양식에도 사용할 수 있는지 알아보기 위해 바닷물에서 생존율을 측정하였다.Survival was measured in seawater to see if Rhodoshudomonas Fallustris SG315 could be used for fish farming.
바닷물 19㎖에 분리된 미생물 1㎖을 접종한 다음, 각각 5일, 20일이 지난 후에 시료를 다시 적당하게 희석하여 agar-embeded 배양으로 viable count하여 균의 생존정도를 측정하였다.After inoculating 1 ml of isolated microorganisms in 19 ml of seawater, the samples were diluted again after 5 and 20 days, respectively, and viable counted with agar-embeded culture to measure the viability of the bacteria.
5일이 지난 후에는 거의 100%, 20일이 지난 후에도 50%이상의 생존율을 보이며, 이와 같은 결과로 바닷물에서 장기간 생존해 있을 수 있음을 확인하였다(표 3).After 5 days, the survival rate was almost 100%, and even after 20 days, the survival rate was over 50%. As a result, it was confirmed that it could survive long-term in seawater (Table 3).
표 5에서 보이듯이 로도슈도모나스 팔루스트리스 SG315가 내염성을 지님을 확인하였고, 어류 사류로 사용할 수 있음을 알 수 있었다.As shown in Table 5, it was confirmed that Rhodoshudomonas palustris SG315 has flame resistance, and can be used as a fish species.
본 발명에 의한 유용 균주 분리획득 방법에 의해 필요한 특성을 갖는 균주를 보다 편리하고 확실하게 분리할 수 있게 된다.By the useful strain isolation and acquisition method according to the present invention, it is possible to more conveniently and reliably isolate a strain having the necessary characteristics.
본 발명에 의한 방법에 따라 분리한 로도슈도모나스 팔루스트리스 (Rhodopsuedomonas palustris) SG315는 각종 가축 및 어류의 안전하고 안정적인 생균사료로 이용하는 것이 가능해 진다. 또한 본 발명의 균주 로도슈도모나스 팔루스트리스 SG315는 가축의 생장 촉진, 배설물에 의한 환경오염 저감, 가축의 생장률 및 산란율을 증진시킬 수 있어 농가에 큰 도움을 줄 수 있을 것이다. Rhodopsuedomonas palustris SG315 isolated according to the method of the present invention can be used as a safe and stable live feed of various livestock and fish. In addition, the strain Rhodoshudomonas palustris SG315 of the present invention can promote the growth of livestock, reduce environmental pollution by feces, increase the growth rate and spawning rate of livestock can be a great help to the farm.
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