KR100462288B1

KR100462288B1 - 혈장 중의 썰트랄린의 검출방법

Info

Publication number: KR100462288B1
Application number: KR10-2002-0018083A
Authority: KR
Inventors: 정봉철; 정병화; 김경미
Original assignee: 한국과학기술연구원
Priority date: 2002-04-02
Filing date: 2002-04-02
Publication date: 2004-12-17
Also published as: KR20030079218A

Abstract

본 발명은 인간을 포함하는 동물의 혈장 중에 함유된 썰트랄린(sertraline)의 검출방법에 관한 것으로서, 본 발명에 의한 검출방법은, 동물 혈장으로부터 단백질을 제거하는 단계; 상기 단백질이 제거된 혈장의 pH를 11.5 내지 12.5로 조정하는 단계; 상기 pH가 조정된 혈장을 비극성 용매로 추출하는 단계; 상기 추출에 의해 얻어진 썰트랄린을 HFBA(Heptafluoro-butyric anhydride)로 유도체화하는 단계; 및 상기 유도체화된 썰트랄린의 농도를 기체 크로마토그래피/질량분석기로 측정하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 의한 혈장 중 썰트랄린의 검출방법은, 혈장으로부터 썰트랄린을 효과적으로 추출할 수 있도록 하고 신속한 분석이 이루어지도록 함으로써 종래의 이차 추출방법으로 인한 부적절한 분석 과정으로 인해 낭비되는 분석시간을 획기적으로 줄일 수 있으며, 종래와는 다른 새로운 HFBA로 유도체화 함으로써 혈장의 방해를 극복하고 썰트랄린의 분석감도를 높일 수 있는 검출방법을 제공할 수 있다. 또한 낮은 검출한계와 높은 정확도를 나타내어 분석의 신뢰성이 높고, 그 분석 결과를 약물활성분석에 적용할 수 있는 효과가 있다.

Description

혈장 중의 썰트랄린의 검출방법{Method for determination of sertraline in plasma}

본 발명은 인간 및 가축을 포함하는 동물의 혈장 중에 존재하는 썰트랄린(sertraline)의 검출방법에 관한 것으로, 더 상세하게는, 분석하고자 하는 대상의 혈장에서 혈장 단백질을 제거하고 pH를 11.5 내지 12.5로 조절한 후 간단한 일차 용매-용매 추출법을 이용하여 추출하고, 분석 감도를 높이기 위해서 HFBA(heptafluorobutyric anhydride)를 이용하여 유도체화하여 기체 크로마토그래피/질량분석기의 SIM(selectedion-monitoring)을 이용하여 분석함으로써 보다 간단하면서도 분석 감도를 높일 수 있는 썰트랄린의 검출방법에 관한 것이다.

분석하고자 하는 썰트랄린(sertraline)은 선택적인 세레토닌 억제제로서 새로운 항우울제이며, 또한 고전적인 TCA(tricyclic antidepressants)와는 구조적으로 다른 화합물이다[Drug Information, 1497, (1995)]. TCA의 경우, 혈장에서의 그 양이 증가되는 위험성이 있고, 과복용으로 인한 치명적인 영향을 끼칠 수 있는 반면에 썰트랄린은 TCA만큼이나 효과적이면서도 불면증이나 소화불량 등의 부작용을 최소화한다고 알려져 있다[J. Clin. Psychopharmacol., 10, 88, (1990)]. 상기와 같은 이유로 인해서 최근에는 TCA보다 썰트랄린이 널리 복용되고 있다. 최근에 생물학적인 견본에서 썰트랄린의 정량은 대체로 기체 크로마토그래피와 고성능 액체 크로마토그래피에 의해서 분석되었다.

지금까지 보고되어 있는 혈장 중 썰트랄린의 분석법은 혈장 내의 썰트랄린을 분리하기 위해서 서로 다른 유기 용매로 다른 pH에서 두 번의 추출과정을 거치거나[J. Chromatogr. Sci., 36, 365, (1998)], 고체상 추출법을 사용한 것이었다[J. Chromatogr. B., 655, 138, (1994)]. 또한, GC-MS(기체 크로마토그래피/질량분석기)의 분석적인 감도를 높이기 위해서 TFAA(trifluoroacetic anhydride)[J. Chromatogr., 496, 423, (1989)]를 이용한 퍼플루오로아실레이션(perfluoroacylation) 또는 MBTFA(N-Methyl-bis(trifluoroacetamide))[J. Chromatogr. Sci., 36, 365, (1998)]를 이용하는 등의 유도체화 방법을 이용하였다. 그러나 이와 같은 이차 추출 방법을 통해서는 많은 수의 임상학적인 샘플들을 효과적으로 정량하지 못하고, 또한 TFAA로 유도체화하면 블랭크(blank) 혈장의 방해로 인해서 정량화 하는데 영향을 받게 되는 문제점이 있고, MBTFA는 임상적인 샘플의 정량시 요구되는 검출한계를 극복할 수 없는 문제점이 있었다. 그러므로, 위와 같은 문제점들을 극복하기 위해서는, 분석방법론상으로 간단하고 빠르며, 종래와는 다른 유도체화 방법을 사용함으로써 감도가 높아지고, 검출한계도 낮은 검출법의 개발이 요구되고 있다.

상기와 같은 문제점을 해결하기 위하여, 본 발명은 일차 추출방법을 적용하여 신속한 분석이 이루어지도록 함으로써 종래의 이차 추출방법으로 인한 부적절한 분석 과정으로 인해 낭비되는 분석시간을 획기적으로 줄일 수 있으며, 종래와는 다른 새로운 HFBA로 유도체화 함으로써 혈장의 방해를 극복하고 썰트랄린의 분석감도를 높일 수 있는 검출방법을 제공하는 것을 목적으로 한다. 또한 낮은 검출한계와 높은 정확도를 나타내어 분석의 신뢰성이 높고, 그 분석 결과를 약물활성분석에 적용할 수 있는 검출방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

도 1은 본 발명에 의한 검출방법에서와 같이 HFBA를 이용한 퍼플루오로아실레이션(perfluoroacylation) 유도체화 방법(C)을 종래의 (A)TFAA(trifluoroacetic anhydride) 및 (B)PFPA(Pentafluoropropionic anhydride)를 이용한 경우와 비교하기 위하여 나타낸 크로마토그램이다.

도 2는 본 발명에 의한 검출방법을 이용하여 실제 인간의 혈장 내에서의 썰트랄린 농도를 각 시간별로 모니터링한 결과를 나타낸 그래프이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명에 의한 혈장 중 썰트랄린의 검출방법은, 동물 혈장으로부터 단백질을 제거하는 단계; 상기 단백질이 제거된 혈장의 pH를 11.5 내지 12.5로 조정하는 단계; 상기 pH가 조정된 혈장을 비극성 용매로 추출하는 단계; 및 상기 추출된 썰트랄린의 농도를 기체 크로마토그래피/질량분석기로 측정하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.

상기한 본 발명에 의한 혈장 중 썰트랄린의 검출방법은, 상기 추출하는 단계이후에, 상기 추출에 의해 얻어진 썰트랄린을 HFBA(Heptafluoro-butyric anhydride)로 유도체화하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 한다.

상기한 본 발명에 의한 혈장 중 썰트랄린의 검출방법에 있어서, 상기 비극성 용매는 디에틸에테르인 것을 특징으로 한다.

본 발명에 의한 혈장 중 썰트랄린의 검출방법에 있어서, 상기 pH를 조정하는 단계는 Na₂HPO₄-NaOH를 이용하는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 의한 혈장 중 썰트랄린의 검출방법에 있어서, 상기 추출은 1회만 수행되는 단일추출인 것을 특징으로 한다.

본 발명에 의한 혈장 중 썰트랄린의 검출방법에 있어서, 상기 pH는 12로 조정되는 것을 특징으로 한다.

이하 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.

간편하면서도 효과적인 단일 추출을 위해서는 먼저, pH 조건을 확립하는 것이 중요하다. 기존의 방법들은 산으로 용매 조건을 맞춘 후에 다시 역으로 pH 7.6의 염기 조건으로 두 번의 추출과정을 거치고 이를 에틸아세테이트(ethylacetate)로 추출을 하였으며, 그럼에도 불구하고 검출한계는 미량의 수 ng/mL에까지 이르지 못하였다. 이에 반하여 본 발명에서는 Na₂HPO₄-NaOH 등을 이용하여 pH를 처음부터 12.0으로 조정하고 보다 비극성인 용매 디에틸에테르(diethylether)를 이용해서 단 한 번의 추출과정을 거치는 것을 특징으로 한다.

종래에 사용되던 TFAA 유도체화 방법은 혈장내의 썰트랄린을 제외한 기타 여러 가지 방해 물질에 의해서 영향을 많이 받는 경향이 크므로 검출 강도가 좋지 못하였다. 이에 반하여 본 발명은 HFBA 유도체화를 이용함으로써 좋은 검출강도를 얻을 수 있으며 이로써 검출한계를 낮출 수 있다.

이하, 본 발명에 의한 검출방법의 바람직한 일실시예를 들어 본 발명을 더욱 상세히 설명하나 본 발명의 권리범위가 이에 한정되는 것은 아니다.

실시예

<실시예1>

먼저, 아세톤을 이용하여 제단백을 하고 pH 7.0인 인산 완충액과 NaOH를 첨가해서 최종 pH를 12.0으로 맞추고, 비극성 용매인 디에틸에테르를 이용하여 완충액과 에테르간의 보다 완전한 추출을 한 후, 추출 유기 용매를 완전히 건고시켰다. 위와 같은 실험으로 추출한 후 그 농도를 정량하였다. 정량을 위해서 사용된 기기는 휴렛팩커드사의 Model 5890 SERIES Ⅱ 기체 크로마토그래피와 Model 5989B 질량 분석기를 사용하였다. 사용된 컬럼은 융합-실리카 모세관 칼럼(fused-silica capillary column)으로 교차-결합 메틸 실리콘(cross-linked methyl silicone)으로 코팅된 Ultra-1이고, 길이는 17m, 내경이 0.2mm, 필름 두께가 0.11㎛인 것을 이용하였으며, 스플리트-인젝션 모드(split-injection mode) (1:5)에서 온도 조건은 초기 온도 160℃에서 220℃까지 분당 10℃씩 증가시킨 후 220℃에서 10분 동안 온도를 유지시켜 주었다. 최종적으로 320℃까지 50℃씩 올린 후 2분 동안 유지시켰으며, 이때 전자에너지는 70eV, 소스(source) 온도는 200℃, 주입기(injector) 온도는 280℃에서 선택된 이온-모니터링(selected ion-monitoring, SIM) 모드를 이용하여 검출하였다. 그 결과 회수율이 84.5%이었고 검출한계는 0.1ng/mL이었다.

<비교예1>

종래의 일반적인 방법과 같이, pH를 7.6으로 1차적으로 설정한 후, 역으로 염기조건을 2차적으로 형성하여 추출하거나, 1차적으로 산조건에서 추출한 후, 이를 다시 2차적으로 염기 조건에서 재추출하는 이차 추출방법을 사용한 결과, 회수율은 71%로 낮았으며, 검출한계는 1.0ng/mL로 높았다.

<실시예2>

상기 실시예1에서 추출된 썰트랄린을 정량하기 전에 HFBA로 유도체화 하였다. 유도체화 과정은 분석하고자 하는 물질, 여기서는 썰트랄린을 특성화함으로써, 혈장에서의 다른 방해물질을 제거하고, 기체 크로마토그래피/질량분석기(GC-MS)가 선택적으로 썰트랄린만을 분석할 수 있는 조건을 최대화시키기 위한 과정이다. 이를 위해서, 썰트랄린의 수소대신에 퍼플루오로아실레이션(perfluoroacylation) 반응을 시켰다. 퍼플루오로아실레이션 시약으로서 HFBA를 사용하였다. 유도체화한 후 그 유도체의 농도를 정량하였다. 정량을 위해서 사용된 기기는 휴렛팩커드사의 Model 5890 SERIES Ⅱ 기체 크로마토그래피와 Model 5989B 질량 분석기를 사용하였다. 사용된 컬럼은 융합-실리카 모세관 컬럼(fused-silica capillary column)으로 교차-결합 메틸 실리콘(cross-linked methyl silicone)으로 코팅된 Ultra-1이고,길이는 17m, 내경이 0.2mm, 필름 두께가 0.11㎛인 것을 이용하였으며, 스플리트-인젝션 모드(split-injection mode) (1:5)에서 온도 조건은 초기 온도 160℃에서 220℃까지 분당 10℃씩 증가시킨 후 220℃에서 10분 동안 온도를 유지시켜 주었다. 최종적으로 320℃까지 50℃씩 올린 후 2분 동안 유지시켰으며, 이때 전자에너지는 70eV, 소스(source) 온도는 200℃, 주입기(injector) 온도는 280℃에서 선택된 이온-모니터링(selected ion-monitoring, SIM) 모드를 이용하여 검출하였다. 그 결과는 도1의 C에 나타나 있다. C는 검출한계가 0.1ng/mL로서 A(비교예2, TFAA) 및 B(비교예3, PFPA)보다 낮았으며, 혈장에 의한 방해도 최소화할 수 있었다.

<비교예2>

퍼플루오로아실레이션 시약으로서 TFAA를 사용한 것을 제외하고는 상기 실시예2와 동일하게 실시하였다. 그 결과는 도1의 A에 나타나 있다. A는 C(실시예2) 및 B(비교예3)과 크로마토그램 상에서 서로 비슷한 시간대에 피크를 형성하며, 그 형성 이온들도 비슷하였다. 그러나 A는 다른 두가지의 유도체화 방법(실시예2 및 비교예3)에 비해서 방해물질의 영향으로 인해서 높은 검출한계를 나타내었다.

<비교예3>

퍼플루오로아실레이션 시약으로서 PFPA를 사용한 것을 제외하고는 상기 실시예2와 동일하게 실시하였다. 그 결과는 도1의 B에 나타나 있다. B는 A(비교예2) 및 C(실시예2)에 비해서 혈장에 의한 방해를 많이 받아서 좋은 분리를 할 수 없었다.

<실시예3>

상기 실시예2와 같은 방법으로 썰트랄린을 기체 크로마토그래피/질량분석기를 사용하여 정량한 실험에 대한 비준(validation)의 결과를 다음 표에 나타내었다. 이는 본 발명에 의한 검출방법을 바탕으로 그 정확성과 변동계수를 나타낸 것이다.

첨가된 농도(ng/mL)	일내변동(within-day)(n=4)	일간변동(day-to-day)(n=4)
첨가된 농도(ng/mL)	평균±표준편차(ng/mL)	변동계수(%)	정확도(%)	평균±표준편차(ng/mL)	변동계수(%)	정확도(%)
0.2	0.20±0.03	16.39	1.42	0.19±0.04	18.17	2.52
1	1.01±0.12	12.11	0.56	1.02±0.09	9.24	2.47
5	4.95±0.13	2.71	1.04	5.06±0.03	0.56	1.25
10	10.07±0.07	0.72	0.7	10.00±0.24	2.44	0.02
30	29.94±0.01	0.04	0.21	30.01±0.09	0.29	0.02

상기 표에 나타난 바와 같이, 변동계수(Coefficient Variation) 값은 0.04-18.17%를 나타내어 좋은 반복성을 나타내었으며 정확성도 0.02-2.52%로 좋은 결과를 나타내었다.

<실시예 4>

상기 실시예2와 같은 방법으로 인간의 혈장으로부터 실제 썰트랄린을 추출하고 각 시간에 따른 그 농도를 모니터링하였다. 피험자에게 썰트랄린을 50mg 복용하도록 한 후, 0.5, 1, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 25, 48, 72시간동안 혈액을 뽑아서 혈액중의 혈장만을 분리하여 이 혈장내에서의 썰트랄린의 농도를 정량하였다. 정량은 기체 크로마토그래피/질량분석기(GC-MS)을 사용하였으며, 분석 컬럼은 모세관(capillary) 컬럼을 사용하였다. 그 결과는 도2에 나타나 있다. 이는 각 시간에 따른 썰트랄린의 혈장내에서의 모니터링과 약물활성분석에 대한 파라미터를 제공하는 것이다.

즉, 본 발명은 분석 감도의 확보, 정확성, 재현성, 분석의 신속성 및 간편성 등을 만족시킬 수 있으며, 이로 인해 선택적인 세레토닌 억제제인 새로운 항우울제 역할을 하는 썰트랄린의 혈장 모니터링을 통하여 썰트랄린의 정량과 이를 통한 약물활성분석에 효과적으로 널리 이용될 수 있다.

Claims

동물 혈장 중의 썰트랄린(sertraline)의 검출방법에 있어서,

동물 혈장으로부터 단백질을 제거하는 단계;

상기 단백질이 제거된 혈장의 pH를 11.5 내지 12.5로 조정하는 단계;

상기 pH가 조정된 혈장을 비극성 용매로 추출하는 단계; 및

상기 추출된 썰트랄린의 농도를 기체 크로마토그래피/질량분석기로 측정하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 혈장 중의 썰트랄린의 검출방법.
제1항에 있어서, 상기 추출하는 단계 이후에,

상기 추출에 의해 얻어진 썰트랄린을 HFBA(Heptafluoro-butyric anhydride)로 유도체화하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 혈장 중의 썰트랄린의 검출방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 비극성 용매는 디에틸에테르인 것을 특징으로 하는 혈장 중의 썰트랄린의 검출방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 pH를 조정하는 단계는 Na₂HPO₄-NaOH를 이용하는 것을 특징으로 하는 혈장 중의 썰트랄린의 검출방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 추출은 1회만 수행되는 단일추출인 것을 특징으로 하는 혈장 중의 썰트랄린의 검출방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 pH는 12로 조정되는 것을 특징으로 하는 혈장 중의 썰트랄린의 검출방법.