KR100460177B1 - 탄수화물칩 제작방법 - Google Patents

Abstract

유리, 실리콘, 종이 및 고분자 등의 재질로 된 기판 위에 탄수화물이 일정한 간격으로 고정화된 탄수화물칩을 제작하는 방법이 제공된다. 본 발명에 따른 탄수화물칩 제작방법은 티올기가 붙은 기판에 말리이미드기가 부착된 탄수화물 탐침을 마이크로피펫이나 마이크로어레이어를 사용하여 기판에 점적하는 단계와, 상기 기판을 실온에서 2시간 이상 반응시키는 단계와, 상기 기판을 엔에틸말리이미드나 엔히드록시말리이미드가 함유된 버퍼 용액에 담그는 단계와, 상기 기판을 BSA가 포함된 버퍼용액에 한시간 동안 담그는 단계를 구비한다. 이때, 탄수화물 탐침은 말리이미드기가 붙은 링커와 글리코실아민을 결합시켜 만든다.

Description

탄수화물칩 제작방법{Carbohydrate chip manufacturing process}

본 발명은 탄수화물칩 제작방법에 관한 것으로서, 특히 유리, 실리콘, 종이 및 고분자 등의 재질로 된 기판 위에 탄수화물이 일정한 간격으로 고정화된 탄수화물칩을 제작하는 방법에 관한 것이다.

일반적으로 당단백질이나 당지질에 결합된 탄수화물은 단백질과의 상호작용을 통하여 세포의 성장 및 분화, 수정과 같은 생물학적으로 중요한 과정에 관여하는 것으로 알려져 있다. 또한, 탄수화물은 단백질과의 결합을 통하여 독소, 박테리아 또는 바이러스가 세포를 감염시키는 과정에도 관련이 있는 것으로 조사되었다. 이외에도, 암세포 표면에 있는 탄수화물은 암전이에도 관계하며, 백혈구 표면에 붙은 탄수화물은 내피세포의 단백질과의 결합을 통하여 염증을 유발시키기도 한다. 특히, 암세포 표면에 있는 비정상적인 탄수화물은 암세포만의 특이성으로서, 암세포 진단에 이용되기도 한다. 따라서, 단백질과 탄수화물 사이의 상호작용 연구는생명현상 이해라는 기초과학 측면 뿐만 아니라, 항암제, 항바이러스제, 항염증제 개발에도 도움을 주며, 또한 암진단법 개발에도 중요하다.

이들 상호작용에 대한 지금까지의 연구 접근 방법은 생물리학적 방법이나 생화학적 방법이 주를 이루었다.

첫째, 엑스선 결정법(X-ray crystallography)을 이용하여 단백질-탄수화물 결합체의 구조를 밝혀내어 그들의 상호작용을 분자 수준에서 이해하였다.

둘째, 단백질 내의 탄수화물 결합에 중요한 특정 아미노산을 위치선택적 아미노산 치환법(site-directed mutagenesis)을 통하여 다른 아미노산으로 바꾸고, 이를 이용하여 탄수화물 결합에 중요한 단백질의 아미노산을 조사하였다.

셋째, 변형된 탄수화물을 유기화학적 방법을 통하여 합성한 후, 그들과 단백질과의 결합력을 조사하여 탄수화물 내의 중요한 작용기를 밝혔다.

이와 같이, 지금까지는 전술한 방법을 이용하여 단백질과 탄수화물 사이의 상호작용에 대해 연구하였지만, 단백질과 탄수화물 사이의 상호작용을 총체적으로 한번에 조사할 수 있는 방법은 아직까지 개발된 적이 없다.

따라서, 적은 양의 샘플을 사용하여 빠른 시간내에 단백질과 탄수화물 사이의 상호작용을 총체적으로 조사할 수 있는 탄수화물칩에 대한 요구가 있다.

탄수화물칩이란, 단당류 및 다당류의 탄수화물을 고밀도로 유리, 실리콘, 종이, 또는 고분자의 표면에 일정한 간격으로 고정화시킨 마이크로칩을 의미한다.

일반적으로 탄수화물 결합단백질은 당지질이나 당단백질의 말단 탄수화물과 강하게 결합하는 것으로 알려져 있고, 또한 이들은 한 분자의 탄수화물과는 약하게결합하지만 무리를 이루고 있는 탄수화물과는 강한 결합을 형성(클러스터 효과)하는 것으로 알려져 있다. 따라서, 단당류 및 이당류(경우에 따라서는 삼당류도 포함)가 적당한 간격으로 고체 표면에 고정화된 탄수화물칩은 단백질-탄수화물 상호작용 연구에 적합하다.

본 발명은 이러한 점을 감안하여 이루어진 것으로서, 유리, 실리콘, 종이 및 고분자 등의 재질로 된 기판 위에 탄수화물이 일정한 간격으로 고정화된 탄수화물칩의 제작 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 말단 탄수화물과 고체 표면과의 거리가 단백질과의 결합에 적당하도록 조절된 탄수화물칩의 제작 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

도 1은 본 발명의 원리를 설명하기 위한 도면이다.

도 2는 본 발명에 따른 탄수화물칩 제작방법을 보여주는 도면이다.

본 발명에 따른 탄수화물칩 제작방법은 티올기가 붙은 기판에 말리이미드기가 부착된 탄수화물 탐침을 마이크로피펫이나 마이크로어레이어를 사용하여 기판에 점적하는 단계, 상기 기판을 실온에서 2시간 이상 반응시키는 단계, 상기 기판을 티올기와 반응할 수 있는 화합물(엔에틸말리이미드, 엔히드록시말리이미드 등)이 녹아있는 버퍼 용액에 담그는 단계, 상기 기판을 BSA가 포함된 버퍼용액에 한시간 이상 담그는 단계를 구비한다. 이때, 탄수화물 탐침은 말리이미드기가 붙은 링커와 글리코실아민을 결합시켜 만든다.

이하, 도면을 참조하여 본 발명의 바람직한 실시예를 상세히 설명한다.

도 1은 본 발명의 원리를 설명하기 위한 도면이다.

본 발명에서는 티올과 말리이미드 사이의 화학선택적 연결반응을 이용하여 티올기가 붙어있는 기판에 탄수화물 탐침을 표면에 고정화시킨다. 이때 말단 탄수화물과 고체 표면 사이의 길이를 조절하기 위해 도 1에서 보여 주는 것과 같이 다양한 길이의 연결자를 이용한다.

본 발명에 따른 탄수화물칩 제작방법에 대해서 도 2를 참조하여 상세히 설명한다.

먼저, 티올기가 붙어있는 기판에 마이크로피펫이나 마이크로어레이어를 사용하여 탄수화물 탐침이 녹은 용액 (10%-50% 글리세롤이 첨가된 버퍼) 0.1μL-1nL을 점적한다. 이때 마이크로 스팟의 직경은 스팟팅한 용액의 부피에 따라 다르다.

티올기가 붙어있는 기판은 시중에서 구할 수 있으며, 탄수화물 탐침은 이미 알려져 있는 방법에 따라 글리코실아민을 합성한 후, 이를 말리이미드기가 붙은 링커와 결합시켜 얻을 수 있다. 글리코실아민의 합성법에 대해서는 Bioconjugate Chem. 1995, Vol 6, 316-318에 언급되어 있다. 말리이미드기가 붙은 링커의 제작방법에 대해서는 후술한다.

스팟팅이 끝나면 기판을 실온에서 2시간 이상 반응시킨 후, 반응하지 않은 기판 위의 티올은 이들과 반응할 수 있는 화합물(엔에틸말레이미드, 엔히드록시말리이미드 등, 이 화합물의 농도는 1 - 5% 정도인 것이 바람직하다)이 포함된 버퍼 용액에 15분 또는 그 이상 담근다. 이때, 버퍼 용액은 pH 6.8의 PBS 버퍼 용액인것이 바람직하지만 이에 한정되는 것은 아니다.

반응이 끝난 후 기판을 세정한다. 세정 방법으로는 기판을 0.1 - 1% 트윈20이 포함된 PBS 버퍼용액에 한시간 동안 담근 후, 증류수로 간단히 씻는 방법을 사용할 수 있다. 세정된 기판은 아르곤 가스 등의 불활성 가스를 이용하여 건조시킨다.

다음으로, 기판에 단백질이 비특이적으로 흡착되는 것을 막기 위해 기판을 0.2 - 1% 트윈20, 1 - 5% BSA가 포함된 PBS 버퍼용액(pH 6.8)에 한시간 담근 후에, 0.2 - 1% 트윈20이 포함된 PBS 버퍼용액(pH 6.8)로 씻어줌으로써 탄수화물칩이 생성된다.

이와 같이 제작된 탄수화물칩을 이용하여 단백질-탄수화물 상호작용을 검사하였다. 이 검사에서는 형광탐침으로 플루오레신이 붙은 탄수화물 결합단백질(일명, 렉틴이라고도 함)을 사용하였다. 형광탐침이 붙은 렉틴은 시중에서 구입하여 사용하거나, 렉틴을 이소티오시아네이트(isothiocyanate)가 붙은 형광탐침과 반응하여 얻을 수 있다.

0.1% 트윈20이 포함된 PBS 버퍼 용액에 녹은 형광탐침이 결합된 렉틴을 제조된 탄수화물칩 위에 뿌린다. 1시간 후에 결합되지 않은 렉틴을 제거하기 위해 5 - 10분씩 3번 0.1-1% 트윈20이 포함된 PBS 버퍼 용액으로 씻어내었다. 이때 0.1-1% 트윈20이 포함되지 않은 PBS 버퍼용액을 사용하면 비특이적으로 결합된 렉틴이 완전히 제거되지 않아 배경 형광이 강하게 나타난다.

다음은 말리이미드기가 붙은 링커의 합성 절차이다.

1. 6-Aminocarproic acid (20 g, 152 mmol)과 아세트산 400 mL를 둥근바닥 플라스크에 넣고 교반 시킨다.

2. Maleic anhydride (14.95 g, 152 mmol)을 가한다.

3. 5시간 후에 고체를 여과한 후 얻어진 고체를 진공상태에서 말린다.

4. 정제과정 없이 다음 반응에 이용한다.

1. 출발물질 (5 g, 22 mmol)을 1 L 둥근 바닥 플라스크에 넣고 DMF 40 mL에 녹인다.

2. 염화아연 (9 g, 66 mmol)을 넣는다.

3. 벤젠 400 mL와 hexamethyldisilazane (18.5 ml, 88 mmol)를 넣은 후 5시간 동안 환류시키고, 반응이 완결되면 식힌 다음 여과한다.

4. 진공하에서 벤젠를 제거한 후 남은 물질을 분액 깔때기에 옮긴 후 1N HCl로 pH 6을 맞추고 메틸렌클로라이드로 추출한다.

5. 추출된 유기층을 MgSO₄로 건조시킨 후 여과, 농축시켜 원하는 화합물을 얻는다.

1. 출발물질과 pentafluorophenol을 플라스크에 담고 아세톤을 가한 후 교반한다.

2. N-ethylmorpholine (NEM)과 diphenylchlorophosphate를 50℃로 가열한다.

3. 4시간이 지난 후 진공하에서 용매를 모두 제거한다.

4. 에틸아세테이트로 묽히고 물로 씻어준 후 여과하고 농축시킨다.

1. 출발물질 (8.5 g, 27.6 mmol)을 40 mL 아세톤에 녹여 격렬하게 교반시킨다.

2. 6-aminocaproic acid (7.25 g, 55.3 mmol)를 증류수 25 mL에 녹인 후 반응 플라스크에 가한다.

3. 24시간 후에 반응물을 1N HCl로 산성화시킨 후 메틸렌클로라이드로 여러번 추출한다.

4. 모아진 유기층을 소금물로 씻어준 후 여과, 농축시킨다.

5. 농축된 화합물을 메틸렌클로라이드 60 mL에 녹인 후 교반한다. Pentafluorophenol (2.4 g, 13.0 mmol)과 EDC (2.4 g, 13.0 mmol)을 반응플라스크에 가하고 실온에서 24시간 교반시킨다.

6. 반응이 완결되면 메틸렌클로라이드로 추출하고 증류수로 씻어준 후 여과 농축한다.

7. 더 이상의 정제없이 다음 반응에 이용한다.

4번과 같은 방법으로 합성한다.

위와 같은 방법에 의해서 생성된 링커와 글리코실아민과의 결합방법은 다음과 같다.

1. 글리코실아민 (150 mg)과 위에서 합성된 링커(1.2 당량)를 1 mL DMF에 녹인 후 교반시키고 diisopropylethylamine (DIEA, 1.2 당량)를 실온에서 가한다.

2. 24시간이 지난 후에 반응 혼합물을 아세톤/에테르 (1:2)용액을 천천히 가하면서 침전시키고 원심분리하여 고체 화합물을 얻는다. 이 고체 화합물은 관크로마토그래피로 정제 분리한다.

이상의 방법으로 글루코오스(glucose), N-아세틸글루코사민(N-acetylglucosamine), N-아세틸갈락토사민(N-acetylgalactosamine), 푸코오즈(fucose), 락토스(lactose), 말토스(maltose), 셀로비오스(cellobiose)가 붙은 탄수화물 탐침을 합성할 수 있다. 그러나, 이외에도 다양한 탄수화물 탐침을 합성할 수 있으며, 본 발명은 특정 탄수화물 탐침 또는 탄수화물 탐침 제조방법에 한정되는 것은 아니다.

이상 설명한 것처럼, 본 발명에 따르면 기판 위에 탄수화물이 일정한 간격으로 고정화된 탄수화물칩을 얻을 수 있다. 이 탄수화물칩은 생물학적으로 중요한 단백질-탄수화물 상호작용을 총체적으로 연구하는데 이용될 수 있다. 또한, 의약학적으로 중요한 탄수화물 결합 단백질의 저해제를 제조된 탄수화물칩을 사용하여 효과적으로 검색할 수 있다. 또한, 질병 관련 환자와 정상인의 탄수화물 결합 단백질의 발현 차이를 조사할 수 있어서, 질병 관련 진단에 이용할 수 있다는 효과가 있다.

Claims (6)

1. ⒜ 티올기가 붙은 기판에 말리이미드기가 부착된 탄수화물 탐침을 마이크로피펫이나 마이크로어레이어를 사용하여 기판에 점적하는 단계;

   ⒝ 단계 ⒜의 기판을 실온에서 2시간 이상 반응시키는 단계;

   ⒞ 단계 ⒝의 기판을 엔에틸말리이미드나 엔히드록시말리이미드가 함유된 버퍼용액에 담그는 단계; 및

   ⒟ 단계 ⒞의 기판을 소 혈청 알부민이 포함된 버퍼용액에 한시간 동안 담그는 단계를 구비하는 탄수화물칩 제조방법.
2. 제1항에 있어서, 상기 탄수화물 탐침은 말리이미드기를 포함하는 링커와 글리코실아민을 결합시켜 만든 것임을 특징으로 하는 탄수화물칩 제조방법.
3. 제1항에 있어서, 상기 탄수화물 탐침을 기판에 점적하는 단계에서 탄수화물 탐침의 용량은 0.1 μL-1nL 인 것을 특징으로 하는 탄수화물칩 제조방법.
4. 제1항에 있어서, 상기 엔에틸말리이미드나 엔히드록시말리이미드가 함유된 버퍼 용액은 엔에틸말리이미드나 엔히드록시말리이미드가 1∼5% 함유되어 있는 버퍼 용액인 것을 특징으로 하는 탄수화물칩 제조방법.
5. 제 1항에 있어서, 단계 ⒞에서 소 혈청 알부민이 포함된 버퍼용액은 0.2 내지 1% 트윈20, 1 내지 5% 소 혈청 알부민이 포함된 인산염 버퍼용액인 것을 특징으로 하는 탄수화물칩 제조방법.
6. 제 1항에 있어서, 기판을 엔에틸말리이미드나 엔히드록시말리이미드가 함유된 버퍼 용액에 담그는 단계 이후에, 상기 기판을 0.1 내지 1% 트윈20이 포함된 인산염 버퍼용액에 한시간 동안 담근 후 증류수로 씻고 아르곤 등과 같은 불활성 가스를 이용하여 기판을 말려주는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 탄수화물칩 제조방법.