KR100454098B1

KR100454098B1 - 그늘쑥으로부터 분리한 신규 화합물, 이의 분리방법 및 용도

Info

Publication number: KR100454098B1
Application number: KR10-2002-0052017A
Authority: KR
Inventors: 권병목; 손광희; 한동초; 김종한; 강현미; 전순복
Original assignee: 한국생명공학연구원
Priority date: 2002-08-30
Filing date: 2002-08-30
Publication date: 2004-10-26
Also published as: KR20040020418A; US6808724B2; US20040044068A1

Abstract

본 발명은 그늘쑥으로부터 분리한 신규 화합물, 이의 분리방법 및 용도에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 그늘쑥(Artemisia sylvatica)으로부터 분리된 다음 화학식 1로 표시되는 신규 화합물, 이 화합물의 분리방법 및 이 화합물이 라스(Ras) 발암유전자 활성화에 필수적인 파네실 전달효소(farnesyl transferase)의 활성을 저해 및 암세포성장을 억제하는 신규 화합물의 용도에 관한 것이다.

Description

그늘쑥으로부터 분리한 신규 화합물, 이의 분리방법 및 용도{Artemisolide compound isolated from the aerial parts of Artemisia sylvatica, preparation the compound, and use thereof}

본 발명은 그늘쑥으로부터 분리한 신규 화합물, 이의 분리방법 및 용도에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 그늘쑥(Artemisia sylvatica)으로부터 분리된 신규 화합물, 이 화합물의 분리방법 및 이 화합물이 라스(Ras) 발암유전자 활성화에 필수적인 파네실 전달효소(farnesyl transferase)의 활성을 저해 및 암세포성장을 억제하는 신규 화합물의 용도에 관한 것이다.

대부분의 암은 그 발생 원인을 모른다. 단지 여러 연구를 통해 그 원인이 될 가능성이 있는 발암물질 혹은 소인은 알려졌다. 태어나면서 암에 잘 걸릴 소인을 갖고 있다가 성장하면서 여러 발암 환경에 노출되면서 돌연 변이가 생기고 쌓여 최종적으로 암으로 발전하게 된다. 발암 원인을 알고 이의 노출을 방지함으로써 암을 예방하고, 암에 걸릴 가능성이 많은 그룹을 선별하여 적극적으로 조기진단을 실시하는데 의의가 있다.

암의 3대 치료법은 수술, 방사선 치료, 그리고 항암화학요법이 있으며, 그 외 면역요법, 호르몬요법, 혹은 생물학적 치료(생물학적 치료법에는 전이, CDK 저해제, 혈관형성 저해제, 신호전달 저해제 등) 등이 있다. 병에 따라 한 가지 방법을 사용하기도 하고 여러 방법을 복합하기도 한다. 암의 종류, 그 생긴 위치, 전이 유무, 환자의 나이와 건강 상태, 그리고 기타 여러 요인을 종합해서 그 환자에 가장 적절한 방법을 택하여 치료한다.

지난 10여 년 동안 분자생물학에서 정상세포와 변이된 세포에 관한 연구는 놀라울 정도의 커다란 결과들을 가져왔다. 특히, 발암유전자(oncogene)의 기능에 관해서는 어떻게 정상적인 전구발암유전자(proto-oncogene)들이 작용하고 있으며 또한 이들이 어떻게 발암유전자로 변화되는가를 잘 설명하고 있을 뿐만 아니라 신호전달에 의해서 세포의 분열, 분화, 그리고 죽음이 조절되고 있다는 것은 근대에 이르러 명확하게 잘 설명되고 있다.

암을 간단히 설명하면 세포의 성장과 분화가 조절되지 않고 세포분열이 비정상적으로 계속 일어나는 것이라 할 수 있는데, 정상세포에서의 세포분열은 세포 내부 성장인자들과 외부 성장인자들이 어떠한 신호체계에 의해서 정교하게 조절되어 진행되지만, 암(cancer)세포에서는 성장 조절인자들 중 적어도 한 곳 이상이 활성화되거나(switch on) 또는 비 활성화(switch off)된 상태로 되어있다. 세포분열에 관여하는 이러한 세포 내부에서의 신호는 단백질-단백질간의 상호작용을 통해서 전달된다.

암은 세포의 분열에 관여하는 단백질들의 돌연변이에 의하여 발생하는데, 이러한 많은 발암 관련 단백질 중 라스(Ras) 단백질은 인간에게서 발생하는 모든 암의 30% 이상에서 돌연변이된 형태로 나타난다.

세포의 성장에 관여하는 성장 조절인자들의 신호 전달과정에서 가장 중요한 역할을 하는 라스 단백질은 188-189개의 아미노산으로 구성되고 21 kDa의 분자량을 가지는 단백질로서 구아닌 뉴클레오타이드(guanine nucleotide)인 GDP 및 GTP와 결합할 수 있는 특성이 있다. 라스 단백질은 세포의 증식과 분화를 조절하는 역할을 하는 세포내 신호 전달자이며, 다른 많은 G-단백질들과 마찬가지로 라스 단백질도 GTP와 결합된 형태(switch "on")일 때 신호 전달자로 작용하고 GTP가 본래의 GTP 가수분해 활성 또는 GTP 가수분해를 돕는 단백질인 GAP(GTPase ActivatingProtein)에 의해서 GDP로 가수분해될 때 비활성화(switch "off") 상태가 된다.

라스 단백질은 지질과 결합하여 세포내벽(plasma membrane)에 위치하면서 그 신호를 다음 단계로 연결해주게 된다. 이때, 라스 단백질의 186번째 아미노산인 시스테인(Cys-186) 과 지질(탄소수, 15 또는 20개)이 티오에스테르 결합(thioester linkages) 형태의 공유결합을 하게되며, 이러한 지질은 GAP, GTPase 활성화 단백질들에 의해 자극을 받는 고유한 GTPase 활성을 가지고 있다. 이 과정이 연속적으로 일어나는 반응들 중 한 단계이며 이것에 의해 라스 단백질은 세포내벽의 안쪽 표면에 부착이 된다. 이 과정에서 GTP와의 결합 및 가수분해가 일어나며 세포성장을 조절하는 것을 도와준다. 이러한 지질화 반응이 일어나는 시스테인은 라스 단백질의 카복실 즉, C-터미날로부터 네 번째 잔기이며, 이로부터 두 개의 지방족 아미노산이 존재한다. 그리고 마지막은 주로 메티오닌(methionine) 이나 세린이 결합된 형태의 단백질이다. 주로 "Cys-AAX 모티프" 라고 명명된 이곳은 지질 전이효소가 인지하는 부분이며 이곳(cysteine, -SH group)으로 탄소수 15 또는 20개의 지질을 전이효소가 전달 시켜준다. 여기서 C₁₅-탄소 이소프레노이드 그룹(farnesyl group)은 파네실 전달효소(farnesyl transferase)가 전달 시켜주고 만약, 라스 단백질의 아미노산 말단에 위치한 X가 루신인 경우에는 어떤 특정의 가용성 효소에 의해 C₂₀-탄소 이소프레노이드 그룹 (geranylgeranyl group)이 전달된다[Joseph L. Goldstein, et al., "Nonfarnesylated Tetrapeptide Inhi-bitors of proteinFarnesyltransferase" The Journal of Biological Chemistry, 266, 15575-15578, (1991). John A. Glomset and Christopher C. Farnsworth., "Role of Protein Modification Reactions in Programming Interactions between RAS-related GTPases and Cell Membranes", Annu. Rev. Cell Biol, 10, 181-205, (1994)].

지질이 결합된 기질과 친화적으로 반응하는 세포벽에 결합되어 있는 엔도프로테아제는 지질화된 -CysAAX 서열로부터 -AAX 펩티드의 분리(proteolytic cleavage)를 촉매화하고, 또한 이와 같은 성질을 가지는 메틸트랜스퍼라제는 분리가 이루어진 시스테인 잔기의 카복실기에 메틸에스테르화(methylesterification)를 촉매화한다. 이 과정에서 라스 단백질의 COOH 말단이 친유성(lipophilic)의 단백질로 전환되어 세포내벽과 결합하게 되고 다음 단계의 신호 전달체인 라프(Raf) 단백질과의 근접이 용이하게 되어 그 신호를 전달하게 된다. 라스 단백질에 결합하는 지질체들은 모두 트랜스형태의 FPP(farnesyl pyrophosphate)로 콜레스테롤 생합성 과정의 중간체인 메발로네이트(mevalonate)로부터 형성된다.

이러한 연속적인 지질화 반응인 -AAX 펩티드 가수분해반응 및 메틸레이션반응을 번역후과정(post-translation) 과정이라 한다. 만약, 이러한 세 가지 효소 관련반응 즉, 신호 전달과정을 효과적으로 조절할 수 있는 약제의 개발이 실현된다면 새로운 항암제의 개발을 기대할 수 있을 것이다. 비록 라스 단백질이 오랜 시간 활성화된 형태로 변이 되었더라도 세포의 성장이나 분화를 일으키는데 필요한 신호전달을 하기 위해서는 프레닐레이션(farnesyl 또는 geranylgeranyl lipid)을 통한 세포내벽으로 고정이 되어야 한다. 그리고 라프 단백질로 그 신호를 전달해주는 것을 막기 위해서는 위에서 언급한 세 가지 효소의 조절이 그 타겟 사이트가 될 수 있다[Yimin, Q.; Sebti, S. M; Andrew, D. H. Biopoly. 1997, 43, 25-41, Christoph, W. M.; Morgan, M. A.; Lothar, B. Blood. 2000, 96, 1655-1669.,Cox A. D.; Garcia, A. M.; Westwick, J. K.; Kowalczyk, J. J.; Lewis, M. A.; Brenner, D. A.; Der, C. J. J. Biol. Chem. 1994, 269, 19203-19206.,Lebowitz P. F.; Sakamuro, D.; Prendergast, G. C. Cancer Res. 1997, 57, 708-713.,Mark, M.; Moasser M. M.; Sepp-Lorenzio, L.; Kohl, N. C.; Oliff, A.; Balog, A.; Su, D. S.; Danishefsky, S. J.; Rosen, N. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1998, 95, 1369-1374.]

상기와 같이 항암제의 원료로 쓰이는 기존의 약용식물로는 주목나무, 빙카 등이 있으며, 이들의 유효성분은 파실리탁셀(paclitaxel)[상품명 Taxol], 빈블라스틴(vinblastine)으로 밝혀졌다[Natural product report 2000, 17, 215-234].

이에, 본 발명자들은 약용식물 소재로부터 항암 물질을 탐색하던 중 그늘쑥에서 항암 활성을 보이는 물질을 밝혀내어 이 물질을 분리하여 구조를 분석한 결과, 상기 화학식 1로 표시되는 신규 화합물을 제조함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명은 그늘쑥으로부터 분리한 신규 화합물 및 이의 분리방법을 제공하는데 그 목적이 있다.

또한, 본 발명은 신규 화합물을 유효성분으로 함유하는 암의 예방 및 치료용 약제 조성물을 제공하는데 또 다른 목적이 있다.

도 1은 화학식 1의 화합물에 대한 자외선-가시광선 분광기에 의한 흡광도 분석 스펙트럼을 나타낸 것이다.

도 2는 화학식 1의 화합물에 대한 분자량 분석 스펙트럼을 나타낸 것이다.

도 3은 화학식 1의 화합물에 대한 수소 NMR 스펙트럼을 나타낸 것이다.

도 4는 화학식 1의 화합물에 대한 탄소 NMR 스펙트럼을 나타낸 것이다.

도 5는 화학식 1의 화합물에 대한 충실성 종양세포의 성장저해 활성 실험 결과를 나타낸 그래프이다.

도 6은 화학식 1의 화합물에 대한 백혈병 세포 성장저해 활성 실험 결과를 나타낸 그래프이다.

본 발명은 그늘쑥으로부터 분리한 항암 활성을 갖는 다음 화학식 1로 표시되는 신규 화합물 및 이의 분리방법을 그 특징으로 한다.

[화학식 1]

또한, 상기 화합물을 유효성분으로 함유하는 암의 예방 및 치료용 약제 조성물을 포함한다.

이와 같은 본 발명을 더욱 상세히 설명하면 다음과 같다.

본 발명은 그늘쑥(Artemisia sylvatica)으로부터 분리된 상기 화학식 1로 표시되는 신규 화합물, 이 화합물의 분리방법 및 이 화합물이 라스(Ras) 발암유전자 활성화에 필수적인 파네실 전달효소(farnesyl transferase)의 활성을 저해 및 암세포성장을 억제하는 신규 화합물의 용도에 관한 것이다.

건조된 그늘쑥의 잎과 줄기를 유기용매 중에서 추출한 후 여과하여 액상의 추출액을 얻는다. 이때 유기용매로는 10 ∼ 100% 메탄올, 에탄올, 프로판올,부탄올을 들 수 있으며, 바람직하게는 100% 메탄올을 사용한다. 이 추출액을 감압 농축한 후 에칠아세테이트에 녹인 후 물을 넣어 분획한다. 이때 파네실 전이효소 저해 활성은 유기용매층에서 확인된다. 유기용매를 감암하에 농축한 후 이 농축액으로 컬럼 크로마토그래피를 수행하여 활성분획을 분리한다. 예를 들어 상기 농축액을 칼럼에 가하여 흡착시킨 후 헥산과 에틸 아세테이트를 100 : 0 내지 0 : 100의 비율로 변화시키면서 가하여 비극성 물질과 극성물질을 제거한 후 헥산과 에틸 아세테이트 50 : 50에서 분리되어 나오는 활성 물질을 부분정제한다. 얻어진 부분 정제된 활성 분획을 더욱 정제하기 위해 칼럼 크로마토그래피(C18, 실리카 겔, LH-20)를 한번 더 수행한다. 정제된 활성 분획으로 박막 크로마토그래피를 수행하여 파네실 전이효소 저해 활성이 가장 우수한 분획을 분리한 후 고압 칼럼 크로마토그래피(HPLC)로 정제하여 얻는다.

이렇게 얻은 활성분획을 정제하여 신규 화합물의 구조를 NMR로 분석한 결과, 흰색 분말 형태를 하고 있는 화합물로서 분자식은 C₂₅H₃₂O₄로 분자량은 396.52이며, 상기 화학식 1로 표시되며, 이 화합물의 이화학적 성질은 다음 표 1과 같다.

외형(appearance)	백색 결정
분자식	C₂₅H₃₂O₄
분자량	396.52
자외선 흡광(UV)	207
융점(℃)	200
가용성	MeOH, Acetone, EtOAc
불용성	Hexane

이 화합물에 대한 항암 활성은 종양세포주의 성장 저해정도를 측정하고, 이 화합물의 파네실 전달효소 저해활성을 측정함으로써 신규 화합물이 항암제, 발암유전자 발현 억제제로 유용하게 이용될 수 있음을 확인하였다.

본 발명의 화합물은 항암 활성 및 파네실 전이효소 저해 활성을 가지므로, 약제학적으로 허용되는 담체와 혼합하여 암 예방 및 치료용 약제 조성물로 제조될 수 있다. 본 발명의 화합물의 파네실 전이효소에 대한 IC₅₀(50%활성 저해농도) 값은 약 100 ㎍/㎖ 이다. 본 발명의 화합물은 라스 단백질과 같은 발암 단백질의 파네실화 반응을 저해함으로써 이 발암 단백질이 원형질막에 부착하는 것을 방지하여 발암 단백질의 발현을 방지하므로, 이 화합물을 함유하는 본 발명의 조성물은라스 단백질 등의 발암 단백질이 관련된 암의 예방 및 치료제로 유용하게 사용될 수 있다.

상기 약학 조성물은 캅셀제, 산제, 과립, 현탁액, 유화액 또는 비경구 투여용 제제와 같은 단위투여형 또는 수회투여형제제로 제형화될 수 있다.

본 발명의 화합물을 유효성분으로 함유하는 약제 조성물은 목적하는 바에 따라 비경구 투여하거나 경구 투여할 수 있으며, 하루에 체중 1 kg 당 2 ㎎ 내지 15 ㎎, 바람직하게는 5 mg 내지 10 mg의 양을 1회 내지 수회에 나누어 투여할 수 있다. 단, 특정 환자에 대한 투여용량 수준은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율, 질환의 중증도 등에 따라 변화될 수 있다.

본 발명의 화합물은 오래 전부터 한약제로 사용되어온 그늘쑥으로부터 분리 정제된 것이므로 안전하며, 실험 동물에서도 급성 독성을 나타내지 않았다.

이와 같은 상기 화학식 1로 표시되는 화합물을 포함하는 약제 조성물은 항암제 또는 발암 유전자 발현 억제제로 매우 유용하다.

이하, 본 발명을 다음 실시예에 의거하여 더욱 상세히 설명하겠는 바, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 그늘쑥으로부터 신규 물질의 분리

대한민국 중부 지방에 자생하는 그늘쑥(Maximowicz)의 잎 1 kg을 잘게 분쇄한 후 여기에 100% 메탄올 2 ℓ을 가하고 상온에서 48 시간 동안 방치한 다음 여과하여 액상과 고체 부분을 분리하였다. 액상을 모아서 감압하에 농축한 후 이 농축액에 1 ℓ의 에틸아세테이트 가하여 용해시키고 물 1 ℓ을 가하여 유기용매 층과 물층으로 분리시켰다. 용해된 부분(유기용매층)을 합한 후 참조예의 방법에 따라 파네실 전이효소 저해 활성을 측정하여 유기용매층에 활성 물질이 포함되어 있음을 확인하였다.

활성 물질이 포함된 유기용매층을 모아 감압하에 농축한 후 메칠렌 클로라이드에 용해시킨 후 이 용액을 실리카겔(Merck, Art No.9385)에 가하여 활성물질을 흡착시킨 다음, 헥산과 에틸 아세테이트의 비율을 9 : 1에서 3 : 7로 변화시키면서 일차 실리카겔 컬럼 크로마토그래피하여 비극성 물질들을 제거하고, 헥산과 에틸 아세테이트의 비율을 5 : 5에 용출되는 활성 분획을 분리하였다. 얻어진 활성 분획들을 합한 후 이 혼합물을 C18 컬럼에 흡착시킨 다음 메탄올과 물로 용출시켜 부분정제된 활성물질을 얻었다. 이어서 이 물질을 박막 크로마토그래피하여 여러 분획으로 나눈 후, 가장 높은 활성을 보이는 분획을 최종적으로 고압 액체 크로마토그래피(HPLC)하여 본 발명의 화합물을 얻었다. 이때 HPLC 컬럼으로는 페노메넥스(phenomenex)사의 울트라카브(ultracarb) 10 ODS(250 ×21.2 mm)를 사용하였으며 활성물질은 50 내지 70 메탄올과 50 내지 30 물로 용출하였다. 이때 수율은 그늘쑥 꽃 1 kg 당 20 mg이었다.

실시예 2 : 신규 화합물의 구조분석

본 실험에서 분리된 화합물의 분자량 및 분자식 결정을 위해 핵자기공명(Varian UNITY 300 MHz, 500 MHz NMR)을 이용하여¹H,¹³C, Cosy, HMQC, HMBC, NOESY 스펙트럼을 얻었다. 또한 UV 흡광도 분석, IR(infrared) 흡광도 분석 및 고 해상도 MS 분석을 실시하였다. 구체적으로, UV 흡광도 분석은 UV-가시화 분광 시스템(UV-visible spectroscopy system, Agilent 8453, HEWLETT PACKARD)을 사용하여 측정하였으며, IR 흡광도는 Digilab Division FTS-80 분광기(Bio-Rad)를 사용하여 측정하였고, 질량 분석기(mass spectrometry, JMS-HX 110A/HX 100A)를 이용하여 고 해상도(high resolution) MS를 측정하여 분자량 및 분자식을 결정하였으며 재결정을 한 후 X-ray를 이용하여 스펙트럼결과와 일치함을 알 수 있었다. 그 결과는 도 1 내지 4 및 다음 표 2에 나타내었다.

Atom no.	¹³C-NMR, δ	¹H-NMR, δ
1	80.27	4.0 t, (J = 10.0 Hz)
2	65.07	2.67 d, (J = 10.0 Hz)
3	63.96
4	72.99
5	34.98	1.83 m
6	24.01	2.24 m
		1.41 m
7	43.40	3.29 m
8	141.50
9	170.96
10	60.27
11	64.44
12	41.78	2.23 d, (J = 8.0 Hz); 1.27 d, (J = 8.0 Hz)
13	220.69
14	45.02	2.49 dd, (J = 2.4, 18.4 Hz); 2.26 dd, (J = 2.4, 18.4 Hz)
15	28.46
16	27.59	1.23 dd, (J = 3.6, 8.0 Hz)
17	138.35	6.0 d, (J = 5.6 Hz)
18	137.99	5.97 d, (J = 5.6 Hz)
19	15.45	0.55 m; -0.12 dd, (J = 3.6, 5.6 Hz)
20	118.64	6.04 d, (J = 3.4 Hz); 5.31 d, (J = 3.4 Hz)
21	30.07	1.29 s
22	15.04	1.35 s
23	32.44	1.54 m
24	19.64	0.84 d, (J = 7.2 Hz)
25	20.35	1.02 d, (J = 6.4 Hz)

상기 분리 정제된 물질은 백색의 분말을 형성하고 있는 화합물로서 분자식은 C₂₅H₃₂O₄로 분자량은 396.52이다. 상기 화합물을 아테미소라이드(Artemisolide)로 명명하였고, 그 구조는 다음 화학식 1과 같다.

[화학식 1]

실시예 3: 신규 화합물의 항암활성 검정

항암활성의 검정은 충실성 종양 세포주(solid tumor cell lines)인 NIH3T3(Mouse fibroblast), K-ras(K-ras gene transformed NIH3T3 cell), H-ras(H-ras gene transformed NIH3T3 cell), SW620(Human colon cancer cell)을 10% 소혈청알부민 또는 RPMI 1640 배지(L-글루타임은 포함되고 중탄산나트륨은 들어있지 않음. Gibco Cat. No 31800-022)를 사용하여 37 ℃, 5% CO₂배양기에서 배양하였으며 계대배양은 1주일에 2회 실시하였다. 0.5% 트립신 및 5.3 mM EDTA(ethylenediamine tetra acetic acid)를 인산염 완충용액(PBS)에 녹인 용액을 사용하여 세포들을 부착면으로부터 분리하였다. 96 웰(well) 플레이트(Falcon)의 각 웰에 3 ×10³내지 6 ×10³개의 각 세포를 가하여 37 ℃, 5% CO₂배양기에서 24시간 동안 배양하여 세포를 안정화시켰다. 신규 화합물은 적정량의 디메틸설폭사이드(DMSO)에 녹여 실험에 필요한 농도까지 실험용 배지로 희석하여 최종 DMSO 농도가 0.5% 이하가 되도록 하였다.

96 웰 플레이트에서 24시간 배양시킨 각 세포배양액으로부터 배지를 모두 제거한 후 각 농도로 제조한 신규 화합물을 각웰에 1 ㎕씩 가한 후 48시간 동안 배양한 후 분석 시약인 WST-1을 각 웰에 처리하여 37 ℃, 5% CO₂배양기에서 3시간동안 반응시켰다. 반응이 완결되면 ELISA 리더를 이용하여 흡광도(A450 ∼ 690 nm)를 측정하여 암세포 성장 저해 효과를 확인한 결과, 암세포의 성장을 50% 저해하는농도, 즉 GI₅₀는 NIH3T3 세포에서 약 5.5 ㎍/㎖, K-Ras 세포에서 약 0.8 ㎍/㎖, H-Ras 세포에서 1.2 ㎍/㎖, SW620 세포에서 2.5 ㎍/㎖ 이었고, Molt-4 세포에서 3.2 μM, HL-60 세포에서 약 1.5 μM 이었다[도 5 및 도 6].

실시예 4: 파네실 전달효소 저해활성 측정

본 발명자들은 100 내지 150 g의 수컷 래트(Sprague Dowley)의 뇌를 분리하여 생리식염수로 세척하고 균질화한 후, 상기 균질액을 원심분리 및 Q 세파로즈 빠른 유속 칼럼(Sepharose Fast Flow column)을 이용하여 부분 정제함으로써 파네실 전달효소의 효소원을 분리하였다. 또한, 효소의 활성은³H-파네실 파이로포스페이트(³H-Farnesyl pyrophosphate, FPP)를 기질로 하여 섬광 근접 분석(scintillation proximity assay, SPA) 방법을 이용하여 측정하였다.

구체적으로, Michael S. Brown 등의 방법(Yuval Reiss, Joseph L. Goldstein, Miguel C. Seabra, Patrick J. Casey and Michael S. Brown,. 1990, Inhibition of Purified p21ras Farnesyl:Protein Transferase by Cys-AAX Tetrapeptides, 62, 81-88)을 일부 수정하여 사용하였는데, 10 ㎕ 시료액, 10 ㎕ 분석 완충용액(50 mM Tris-HCL pH7.5, 25 mM MgCl2, 2 mM KCl, 5 mM DTT, 5 mM Na₂HPO₄, 0.01% Triton X-100), 20 ㎕ 희석된³H-FPP, 20 ㎕ 바이오틴-라민 B 펩타이드(biotin-lamin B peptide) 및 40 ㎕ 파네실 전달효소를 잘 혼합한 후 상온에서30분간 반응시켰다. 150 ㎕의 SPA 구슬과 반응용액(bead/stop reagent solution)을 가한 다음 바이오틴-라민 B 펩타이드의 파네실화 정도를 액체 섬광계수기(scintillation counter)를 이용하여 CPM(count per minute) 단위로 측정하였다. 파네실 전달효소의 활성저해도는 다음 수학식 1로 계산하였다.

상기 수학식에서 공시료는 효소 및 저해제 시료를 첨가하지 않은 경우이고, 대조시료는 저해제 시료를 첨가하지 않은 상태에서 최적조건으로 반응시킨 후 CPM을 측정한 것이다.

그 결과, 본 발명에 따른 신규 화합물의 파네실 전달효소 억제 활성은 100 ㎍/㎖에서 50% 정도 파네실 전달효소의 활성을 억제하는 것을 확인하였다.

실시예 5: 독성시험

본 발명의 화합물에 대하여 독성실험을 다음과 같이 수행하였다.

상기 화학식 1로 표시되는 화합물을 디메틸설폭사이드(dimethylsulfoxide, DMSO)에 용해하고 물로 희석한 후 이를 마우스(군당 10마리)에 각각 100 ㎎/㎏을 투여한 다음 7일간 관찰하였으나 사망하는 쥐는 없었다.

제조예 1: 정제의 제조

유효성분 10 g

락토스 70 g

결정성 셀룰로오스 15 g

마그네슘 스테아레이트 5 g

총 량 100 g

상기에서 나열된 성분들을 잘게 부숴 혼합한 후 직타법(direct tableting method)에 의해 정제를 제조하였다. 각 정제의 총량은 100 ㎎이고, 그 중 유효성분의 함량은 10 ㎎이다.

제조예 2: 분말제의 제조

유효성분 10 g

옥수수 전분 50 g

카르복시 셀룰로오스 40 g

총 량 100 g

상기에서 나열된 성분들을 잘게 부숴 혼합하여 분말을 제조하였다. 경질 캡슐에 분말 100 ㎎을 넣어 캡슐제를 제조하였다.

제조예 3 : 주사제의 제조

본 발명의 신규 화합물 200 ㎎을 폴리옥시에틸렌 수소화 카스트로 오일을 함유하는 생리 식염수 200 ㎎에 가열 용해시켜 혼합 추출물을 0.1의 농도로 함유하는주사제를 제조하였다.

이상에서 상술한 바와 같이, 본 발명에 따른 그늘쑥으로부터 분리한 상기 화학식 1로 표시되는 신규 화합물을 포함하는 약제 조성물은 항암제 또는 발암 유전자 발현 억제제로 매우 유용하다.

Claims

다음 화학식 1로 표시되는 것을 특징으로 하는 화합물.

[화학식 1]
1) 그늘쑥(Artemisia sylvatica)의 잎과 줄기를 알콜로 추출하여 유기용매층을 분리하는 단계;

2) 상기 유기용매층을 칼럼 크로마토그래피(실리카 또는 C18)에 적용시켜 활성분획을 분리하는 단계;

3) 분리된 활성 혼합물을 칼럼 크로마토그래피(C18, 실리카 겔 또는 LH-20)에 흡착시킨 후 용출시켜 부분 정제한 활성물질을 얻는 단계; 및

4) 박막크로마토그래피를 이용하여 가장 좋은 활성을 보이는 분획을 분리한 후 칼럼 크로마토그래피(HPLC)으로 정제하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 그늘쑥으로부터 다음 화학식 1로 표시되는 화합물의 분리방법.

[화학식 1]
다음 화학식 1로 표시되는 화합물을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 암 예방 및 치료용 약제 조성물.

[화학식 1]