KR100442838B1

KR100442838B1 - 프로브의 고정화 검출방법 및 상기 프로브와 표적시료의결합정도 검출방법

Info

Publication number: KR100442838B1
Application number: KR10-2001-0078010A
Authority: KR
Inventors: 임근배; 박진성; 조윤경; 김선희
Original assignee: 삼성전자주식회사
Priority date: 2001-12-11
Filing date: 2001-12-11
Publication date: 2004-08-02
Also published as: KR20030048178A

Abstract

본 발명은 MOSFET형 센서가 내장된 바이오칩에 프로브를 제공하는 단계; 상기 프로브를 MOSFET형 센서의 게이트 전극 상면에 결합시키는 단계; 및, 상기 게이트 전극에 걸리는 전압과 전류의 특성을 측정하는 단계를 포함하는 프로브의 고정화(immobilization)을 정량적으로 검출하는 방법과, 상기 단계들에 표적시료를 제공하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 프로브와 표적 시료의 결합(binding) 정도를 정량적으로 검출하는 방법에 관한 것이다.

본 발명에 따르면, MOSFET형 센서의 게이트 전극에 걸리는 전압과 전류의 특성을 측정함으로써 바이오칩 위에 고정화된 프로브의 양을 정량적으로 측정할 수 있을 뿐만 아니라, 프로브와 표적 시료의 결합정도 또한 정량적으로 측정할 수 있다.

Description

프로브의 고정화 검출방법 및 상기 프로브와 표적시료의 결합정도 검출방법{Method for detecting immobilization of probes and method for detecting binding degree between the probes and target samples}

본 발명은 바이오칩에 사용되는 프로브의 고정화 검출방법 및 상기 프로브와 표적시료의 결합정도 검출방법에 관한 것으로, 더욱 구체적으로 MOSFET형 센서가 내장된 바이오칩에 프로브를 제공하는 단계; 상기 프로브를 MOSFET형 센서의 게이트 전극 상면에 결합시키는 단계; 및, 상기　게이트 전극에 걸리는 전압과 전류의 특성을　측정하는　단계를　포함하는 프로브의　고정화(immobilization)을 정량적으로 검출하는 방법과, 상기 단계들에 표적시료를 제공하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 프로브와 표적 시료의 결합(binding) 정도를 정량적으로 검출하는 방법에 관한 것이다.

바이오칩(bio chip)이란 기질상에 분석하고자 하는 DNA, 단백질 등의 생분자(biomolecules) 프로브를 고밀도로 부착시킨 칩으로서, 샘플내 유전자 발현　양상, 유전자　결함, 단백질 분포, 반응 양상 등을 분석해낼 수 있다. 바이오칩은 프로브의 부착형태에 따라 고체 기질상에 부착된 마이크로어레이 칩(microarray chip)과 미세채널상에 부착된 랩온어칩(lab-on-a-chip)으로 나눌 수 있으며, 프로브의 종류에 따라 DNA 칩, 단백질(protein) 칩 등으로 나눌 수 있다.

현재 DNA 칩 시장의 대부분을 차지하고 있는 것은 스포팅(spotting) 혹은 광석판인쇄술(photolithography) 방법으로 제작된 칩이다. 이것은 이중나선 구조의 분리된 한 쪽 프로브(probe) DNA 만을 특정 재료 위에 화학적인 결합을 이용하여 부착시킨후 표적(target) DNA와 반응을 시키기 위한 장치이다. 이러한 DNA 칩을 제작할　때 프로브 DNA의 고정화(immbilizaion)은 상품의 정확성 및 재현성에 막대한 영향을 끼치므로 보다 정확하게 제어되어져야 하지만 현재까지의 기술로는 정확히 정량화하는 방법을 제시하지 못하고 있다.

종래 사용되는 스포팅 칩이나, 광석판인쇄술 칩은 그 제조방법에 의해 프로브의 양을 어느 정도의 부피(volume)로 제어 가능하지만, 상품화로 되어서 병에 대한 진단 등과 같은 목적으로 사용하기에는 정확성 및 재현성이 떨어진다. 특히 특정 DNA의 발현등을 관찰할때와 같은 경우에는 보다 정확한 프로브 DNA의 고정화(immobilizaion)가 필요하다. 현재 이러한 방법에 대한 필요성은 있으나 제작에 대한 기술적 문제 및 비용에 대한 부담 때문에 현재까지 제안되지 않고 있다.

이에, 본 발명자들은 상기 종래기술들의 문제점들을 극복하기 위하여 예의 연구 노력한 결과, DNA 칩에 내장된 MOSFET형 센서를 이용하여 센서에 흐르는 전압과 전류의 특성을 측정함으로써 프로브 DNA 의 고정화(immobilization) 및 혼성화(hybridization)을 정확하게 검출할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다. 이로써 별도의 제작비가 필요없고 상용화가 가능하며 프로브 DNA의 고정화 및 혼성화를 동시에 측정할 수 있는 DNA 칩의 제작이 가능하게 되었다.

따라서, 본 발명의 주된 목적은 바이오칩에 내장된 MOSFET형 센서를 이용하여 프로브의 고정화(immobilization)을 정량적으로 검출하는 방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 바이오칩에 내장된 MOSFET형 센서를 이용하여 프로브와 표적 시료의 결합(binding) 정도를 정량적으로 검출하는 방법을 제공하는데 있다.

도 1은 본 발명의 한 실시예로서 스포팅(Spotting) 혹은 광석판인쇄술(photolithography) 방법으로 부착된 프로브 DNA의 검출장치의 개략도이고,

도 2는 본 발명의 한 실시예로서 프로브(probe) DNA와 표적(target) DNA의 혼성화(hybridization) 검출장치의 개략도이고,

도 3은　본　발명의 한 실시예에서 DNA의 양을 정량적으로 측정할 수　있는 MOSFET 형 센서(sensor)의 개략도이고,

도 4는 본 발명에 따라 바이오칩에 고정된 프로브 DNA의 양에 따른 전류흐름의 변화를 측정한 그래프이고,

제 5 도 본 발명에 따라 프로브 DNA와 표적 DNA의 혼성화에 따른 전류흐름 변화를 측정한 그래프이다.

본 발명의 주된 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 MOSFET형 센서가 내장된 바이오칩에 프로브를 제공하는 단계; 상기 프로브를 MOSFET형 센서의 게이트 전극 상면에 결합시키는 단계; 및, 상기 게이트 전극에 걸리는 전압과 전류의 특성을 측정하는　단계를 포함하는 프로브의 고정화(immobilization)을 정량적으로 검출하는 방법을 제공한다.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 MOSFET형 센서가 내장된 바이오칩에 프로브를 제공하여 MOSFET형 센서의 게이트 전극 상면에 프로브를 결합시키는 단계; 상기 게이트 전극에 걸리는 전압과 전류의 특성을 측정하는 단계; 상기 바이오칩에 표적 시료를 제공하여 상기 게이트 전극 상면에 결합된 프로브에 표적 시료를 결합시키는 단계; 및 상기 게이트 전극에 걸리는 전압과 전류의 특성을 측정하는 단계를 포함하는 프로브와 표적 시료의 결합(binding) 정도를 정량적으로 검출하는 방법을 제공한다.

본 발명에서, 프로브 또는 표적 시료는 바이오칩에 적용 가능하며, 상호 결합하여 반응 가능한 어떠한 생분자(biomolecules)도 가능하나, 바람직하게는, 핵산(DNA, RNA 또는 PNA), 단백질, 효소 기질, 코팩터 또는 올리고당류인 것을 특징으로 한다. 이러한 프로브 또는 표적 시료는 바이오칩의 유형에 따라 직접 또는 시료 로딩부를 통해 바이오칩에 제공될 수 있다.

본 발명에서, 바이오칩은 기판상에 형성된 MOSFET형 센서의 게이트 전극상면에 스포팅(Spotting) 혹은 광석판인쇄술(photolithography)방법으로 프로브가 부착되어 제작되는 마이크로어레이(microarray)칩이거나, 기판상에 미세가공된 마이크로채널내에 형성된 MOSFET형 센서의 게이트 전극상면에 프로브가 부착되는 랩온어칩(lab-on-a-chip)일 수 있다. 랩온어칩의 경우에, 바람직하게는 프로브는 시료로딩부에 제공된 후 시료로딩부와 직접연결된 미세가공채널을 통과하면서 그 내부에 형성되어 있는 MOSFET형 센서의 게이트 전극 상면에 결합하는 것을 특징으로 한다.

본 발명에서, 프로브 의 고정화 또는 표적 시료의 결합 전후의 전하량(charge)변화를 알아내기　위한 센서로서　MOSFET (Metal-Oxide-Semiconductor Field-Effect-Transistor) 형 센서를 이용하였다. 　본 발명의 MOSFET 센서는 소스(source) 전극 및 드레인(drain) 전극과 그사이의 게이트(gate) 전극으로 구성되며, 이중 게이트 전극 상면에 결합된 프로브 또는 표적 시료의 양에 따라 전류량의 변화가 발생하게 된다.

본 발명에서, MOSFET형　센서는 바람직하게는 소스(source)와 드레인(drain) 영역에　골드 박막이　형성되었으며, 그 골드 표면에 티올기 부착의 프로브가 SAM(self-assembed monolayers)방법으로 고정화되는 것을 특징으로 한다.

본 발명에서, 센서는 소스와 드레인의 두 단자를 가지며 두 단자의 표면에 얇은 산화막을 가지고 있으며, 그 위에 Au를 부착시키면 MOS(Metal-Oxide-Semiconductor)의 구조를 형성하게 된다. 또한, Au와 산화막의 사이에 높은 선택성을 가지면서 핵산 분자가 흡착될 수 있도록 핵산 분자의 끝단에 티올(Thiol)을 부착시킨다. 티올을 부착시킨 핵산 분자는 SAM(Self-Assembled Monolayers)법으로 금 표면에 흡착될 수 있다. SAM은 기질 표면위에 자발적으로 입혀진 규칙적으로잘 정렬된 유기 단 분자 막이란 뜻으로, 기질과 유기분자와의 직접적인 화학결합을 이용하기 때문에 외부의 다른 제작 장치를 필요로 하지 않는다. 현재까지 제작된 생분자(bio molecule) 센서들은 생분자를 특정영역에만 부착시키기 어렵고, 부착력도 약한 단점을 가지고 있다. 그러나 본 발명에서 사용하는 SAM 방법을 이용한 티올기 치환된 생분자의 금에 대한 선택적인 흡착방법은 이와 같은 문제점들을 해결할 뿐만 아니라, 센서의 표면에 직접 부착되므로 반응 전후의 전하량(charge) 변화를 알아내는 데도 우수한 특성을 나타낸다．

본 발명에서, MOSFET형 센서는 바람직하게는 미세가공채널의 측벽 또는 모서리(convex corner)에 위치하는 것을 특징으로 한다（참조：　대한민국　특허출원　제2001-21752호）. 본원발명의 MOSFET형 센서의 제조방법은 본　출원인이　출원한대한민국　특허출원　제2001-21752호를 참고할 수 있다.

현재까지 제작된 FET을 이용한 생분자(bio molecule) 센서는 모두 평면상에 제작되었다. 그러나, 본 발명에서 사용한 생분자 센서는 벌크 미세가공(bulk micromachining) 및 확산(diffusion)을 이용한 3차원 MOSFET 형태로서 주로 미세가공채널의 모서리(convex corner)에 위치한다. 이러한 구조의 생분자 센서는 핵산이 흘러가는 유로에 직접 위치되어 검출시간을 획기적으로 단축시킬 수 있을 뿐만 아니라, 검출기가 차지하는 공간을 크게 줄일 수 있어서 작은　공간에 더 많은 센서를 장착할 수 있다는 장점을 가지고 있다.

이와 같이, 본 발명에 따르면, 바이오칩에 내장된 MOSFET형 센서를 이용하여 센서의 게에트 전극 상면에 걸리는 전압과 전류의 특성을 측정함으로써 프로브의고정화(immobilization)뿐 만 아니라, 프로브 및 표적 시료의 혼성화(hybridization)도 정량적으로 검출할 수 있다. 특히, DNA 칩의 경우 프로브 핵산(단일가닥 DNA, RNA 또는 PNA)의 고정화뿐 만아니라, 프로브 핵산과 표적 핵산의 혼성화(hybridization)정도도 정량적으로 검출할 수 있다

이하, 첨부도면을 참조하여 본 발명을 보다 구체적으로 설명하나, 본 발명의 범위가 이에 한정되는 것으로 해석되지는 않는다.

본 발명에서는 칩(chip) 표면에 DNA를 스포팅 또는 광석판인쇄술 방법으로 부착시킨 DNA 칩에 얼마 만큼의 DNA가 부착되어 있는지를 측정하기 위한 검출부(detection part)로서 MOSFET형 센서가 내장되어져 있다. 도 1 은 스포팅된 각 영역에서 어느 정도 양의 프로브 DNA가 부착되어졌는지를 측정하는 시스템이다. 여기서, A)는 스포팅 또는 광석판인쇄술 방법으로 제작된 DNA 칩을 나타내고, B)는 한 스폿(spot)만을 확대한 영역을 나타내고, C)는 골드 박막이 증착된 MOSFET형 센서의 구조를 나타낸다.

도 2 는 스포팅된 각 영역에서 프로브 DNA와 표적 DNA가 얼마나 반응을 했는지를 측정하기 위한 시스템이다. 여기서, A)는 단일가닥 DNA가 칩위의 골드영역(즉, MOSFET형 센서표면)에만 부착된 형태를 나타내고, B)는 프로브 DNA와 표적 DNA가 혼성화된 형태를 나타낸다.

스포팅 칩 혹은 광석판인쇄술 칩을 제작하는 기판은 일반적으로 유리(glass)가 사용되어 진다. 그러나 본 발명에서는 실리콘 웨이퍼(silicon wafer)를 사용하는 것이 바람직하다. 실리콘 웨이퍼는 유리와 비교해서 매우 우수한 기계적 특성뿐만 아니라 전기적 특성까지 가지고 있으므로 DNA의 부착 및 검출시스템 제작에서도 우수한 특성을 나타낸다. 프로브 DNA 끝에 티올(thiol)을 치환시키면 실리콘 웨이퍼상에 패터닝(patterning)된 골드(gold) 영역에만 특정적으로 부착시킬 수 있다.

도 3은 미세가공채널의 모서리에 MOSFET형 센서가 형성되어 DNA의 양을 정량적으로 측정하기 위한 시스템이다(참조：　대한민국　특허출원　제2001-21752호). 여기서, 실리콘 기판 표면에 미세가공채널이 형성되어 있으며, 이 미세가공채널의 모서리에 MOSFET이 형성되어 있다. MOSFET은 미세가공채널의 측벽에 불순물을 도핑하여 형성한 소스 및 드레인 영역과 그 사이의 미세가공채널의 코너 부분에 정의된 게이트 영역으로 구성된다. 기판 표면에는 소스 영역과 드레인 영역을 소스 전극과 드레인 전극과 연결시키기 위한 배선들이 형성되어 있다. 골드 박막이 증착된 게이트 영역은 소스와 드레인 영역을 통해 전류가 흐를 수 있도록 채널(channel)을 형성시켜 준다. 즉, 채널이 얼마나 형성되는지에 따라 전류의 흐름이 변화되고, 흐르는 전류의 변화는 골드 표면에 부착된 프로브 DNA의 양에 비례하는 것이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.

실시예 1: 프로브 DNA의 고정화의 정량적 측정

프로브 DNA의 고정화를 정량적으로 측정하기 위하여, 도 3에 도시되어 있는랩온어칩에 전압을 인가한 상태에서, 서로 다른 함량(20㎕, 40㎕, 80㎕ 및 160㎕)의 5' 말단에 티올기가 치환된 합성 프로브 DNA(5'-티올-GTTCTTCTCATCATC-3')를 주입한 후 시간 경과에 따른 전류값의 변화를 측정하였다.

실험결과, 도 4에 보여지듯이, 센서에 주입된 프로브 DNA의 양이 많아짐에 따라 센서의 드레인과 소스 사이를 흐르는 전류값이 비례적으로 증가함을 알 수 있다. 즉, 프로브 DNA의 양이 20 ㎕인 경우 전류값은 14 uA이고(A), 프로브 DNA의 양이 40 ㎕인 경우 전류값은 17 uA이고(B), 프로브 DNA의 양이 80 ㎕인 경우 전류값은 20 uA이었다. 다만, DNA의 양이 80 ㎕ 이상에서는 더 이상의 전류값이 많아지지 않았다.

따라서, 센서의 게이트 전극에 걸리는 전류값을 측정함으로써 DNA칩에 고정화된 프로브 DNA의 양을 정량적으로 검출하는 것이 가능하다. 또한, DNA 칩에 부착된 프로브 DNA의 양을 정량적으로 측정하게 되면 보다 정확한 반응 정도를 알아 낼 수 있고, 표적 DNA와 반응할 때에도 반응 정도를 정확하게 측정할 수 있는 기본 데이타를 확보할 수 있다.

실시예 2: 프로브 DNA와 표적 DNA의 혼성화의 정량적 측정

프로브 DNA와 표적 DNA의 혼성화를 정량적으로 측정하기 위하여, 도 3에 도시되어 있는 랩온어칩에 전압을 인가한 상태에서, 5' 말단에 티올기가 치환된 합성 프로브 DNA (5'-티올-GTTCTTCTCATCATC-3')와 이와 상보적인 표적 DNA를 순차적으로 주입하면서 시간 경과에 따른 전류값의 변화를 측정하였다.

실험결과, 도 5에 보여지듯이, 프로브 DNA와 표적 DNA가 반응할 때에는 단일가닥 DNA가 가지고 있는 전하의 양과 이중가닥 DNA가 가지고 있는 전하의 양이 다르기 때문에 하나의 실리콘 칩위에서 고정화(immobilization)된 프로브 DNA의 정량적 검출과, 혼성화(hybridization)된 DNA의 정량적 검출이 가능하다. 가장 먼저 센서에 포스페이트(phosphate) 버퍼를 주입함에 따라 전류의 흐름이 증가한다. 포스페이트 버퍼가 들어있는 상황에서 티올(thiol)이 치환된 DNA가 주입하여 Au 표면에만 선택적으로 흡착되면서 DNA가 가지고 있는 전하(charge)가 MOSFET의 전류흐름에 영향을 주어 전류의 흐름이 감소한다. 센서의 버퍼 및 흡착되지 않고 남은 잔류 DNA를 증류수를 이용하여 세척하고 난 후, TE 버퍼를 주입하여 혼성화(Hybridization)가 가장 잘 일어 날 수 있는 온도까지 가열(heating)시키면 버퍼에 의해 전류값이 감소한다. 마지막으로 표적 DNA를 주입하면서 전류의 흐름이 서서히 감소하기 시작하여 일정한 양만큼 감소하고 난 후, 큰 변화 없이 서서히 감소하는 것은 대부분의 혼성화 반응이 일어나고 나머지 반응이 서서히 일어나기 때문이다.

이상 설명한 바와 같이, 본 발명에 따르면 바이오칩에 내장된 MOSFET형 센서를 이용하여 바이오칩 위에 고정화된 프로브의 양을 정량적으로 측정할 수 있을 뿐만 아니라, 프로브와 표적 시료의 결합정도 또한 정량적으로 측정할 수 있다.

특히, DNA 칩의 경우 MOSFET형 센서를 이용하여 프로브 DNA의 고정화(immobilization) 및 표적 DNA와의 혼성화(hybridization)을 동시에 정확하게 검출하게 됨으로써 별도의 제작비가 필요없고 상용화가 가능한 DNA Chip의 제작이 가능하게 된다.

Claims

① MOSFET형　센서가　내장된　바이오칩에 프로브를 제공하는 단계;

② 상기 프로브를 MOSFET형 센서의 게이트 전극 상면에 결합시키는 단계; 및,

③ 상기 게이트 전극에 걸리는 전압과 전류의 특성을 측정하는 단계를 포함하는 프로브의 고정화(immobilization)을 정량적으로 검출하는 방법.
① MOSFET형 센서가 내장된 바이오칩에 프로브를 제공하여 MOSFET형 센서의 게이트 전극 상면에 프로브를 결합시키는 단계;

② 상기 게이트 전극에 걸리는 전압과 전류의 특성을 측정하는 단계;

③ 상기 바이오칩에 표적 시료를 제공하여 상기 게이트 전극 상면에 결합된 프로브에 표적 시료를 결합시키는 단계; 및

④ 상기 게이트 전극에 걸리는 전압과 전류의 특성을 측정하는 단계를 포함하는 프로브와 표적 시료의 결합(binding) 정도를 정량적으로 검출하는 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 프로브 또는 표적 시료는 시료 로딩부를 통해 바이오칩에 제공되는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, MOSFET형 센서는 소스(source)와 드레인(drain) 영역에 골드 박막이 형성되었으며, 그 골드 표면에 티올기 부착의 프로브가 SAM(self-assembed monolayers)방법으로 고정화되는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 바이오칩은 기판상에 형성된 MOSFET형 센서의 게이트 전극상면에 스포팅(Spotting) 혹은 광석판인쇄술(photolithography)방법으로 프로브가 부착되어 제작되는 마이크로어레이(microarray)칩인 것을 특징으로 하는 방법
제1항 또는 제2항에 있어서, 바이오칩은 미세가공채널내에 형성된 MOSFET형 센서의 게이트 전극상면에 프로브가 부착되는 랩온어칩(lab-on-a-chip)인 것을 특징으로 하는 방법.
제6항에 있어서, MOSFET형 센서는 미세가공채널의 측벽 또는 모서리(convex corner)에 위치하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 프로브 또는 표적 시료는 핵산(DNA, RNA 또는 PNA), 단백질, 효소 기질, 코팩터 또는 올리고당류인 것을 특징으로 하는 방법.
제2항에 있어서, 프로브 핵산과 표적 핵산의 혼성화(hybridization)정도를정량적으로 검출하는 것을 특징으로 하는 방법